CN106929477A - 一株抗前列腺素F2α的特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株WXX‑2及其应用 - Google Patents
一株抗前列腺素F2α的特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株WXX‑2及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106929477A CN106929477A CN201710164486.6A CN201710164486A CN106929477A CN 106929477 A CN106929477 A CN 106929477A CN 201710164486 A CN201710164486 A CN 201710164486A CN 106929477 A CN106929477 A CN 106929477A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- antiprostaglandin
- monoclonal antibody
- wxx
- antibody specific
- hybridoma cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 230000003431 anti-prostaglandin Effects 0.000 title claims abstract description 24
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 title claims abstract description 21
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 16
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims abstract description 3
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 5
- PXGPLTODNUVGFL-BRIYLRKRSA-N (E,Z)-(1R,2R,3R,5S)-7-(3,5-Dihydroxy-2-((3S)-(3-hydroxy-1-octenyl))cyclopentyl)-5-heptenoic acid Chemical compound CCCCC[C@H](O)C=C[C@H]1[C@H](O)C[C@H](O)[C@@H]1CC=CCCCC(O)=O PXGPLTODNUVGFL-BRIYLRKRSA-N 0.000 claims description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 claims 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 abstract description 3
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 description 14
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 7
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 7
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 6
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 5
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 4
- -1 unsaturated Hydroxy fatty acid Chemical class 0.000 description 4
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 3
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 238000002290 gas chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 229940094443 oxytocics prostaglandins Drugs 0.000 description 3
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N arachidonic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 2
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004945 emulsification Methods 0.000 description 2
- 210000004696 endometrium Anatomy 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 2
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 2
- 201000007094 prostatitis Diseases 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 16-Epiaffinine Natural products C1C(C2=CC=CC=C2N2)=C2C(=O)CC2C(=CC)CN(C)C1C2CO PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 239000005662 Paraffin oil Substances 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical class N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 229940114079 arachidonic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000021342 arachidonic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 229960001342 dinoprost Drugs 0.000 description 1
- XEYBRNLFEZDVAW-ARSRFYASSA-N dinoprostone Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@H]1[C@H](O)CC(=O)[C@@H]1C\C=C/CCCC(O)=O XEYBRNLFEZDVAW-ARSRFYASSA-N 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- DCPMPXBYPZGNDC-UHFFFAOYSA-N hydron;methanediimine;chloride Chemical compound Cl.N=C=N DCPMPXBYPZGNDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 1
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- HOGDNTQCSIKEEV-UHFFFAOYSA-N n'-hydroxybutanediamide Chemical compound NC(=O)CCC(=O)NO HOGDNTQCSIKEEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- BHMBVRSPMRCCGG-OUTUXVNYSA-N prostaglandin D2 Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@@H]1[C@@H](C\C=C/CCCC(O)=O)[C@@H](O)CC1=O BHMBVRSPMRCCGG-OUTUXVNYSA-N 0.000 description 1
- PXGPLTODNUVGFL-YNNPMVKQSA-N prostaglandin F2alpha Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@H]1[C@H](O)C[C@H](O)[C@@H]1C\C=C/CCCC(O)=O PXGPLTODNUVGFL-YNNPMVKQSA-N 0.000 description 1
- PXGPLTODNUVGFL-UHFFFAOYSA-N prostaglandin F2alpha Natural products CCCCCC(O)C=CC1C(O)CC(O)C1CC=CCCCC(O)=O PXGPLTODNUVGFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M sodium bicarbonate Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L sodium carbonate Substances [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- DSNBHJFQCNUKMA-SCKDECHMSA-N thromboxane A2 Chemical compound OC(=O)CCC\C=C/C[C@@H]1[C@@H](/C=C/[C@@H](O)CCCCC)O[C@@H]2O[C@H]1C2 DSNBHJFQCNUKMA-SCKDECHMSA-N 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/26—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against hormones ; against hormone releasing or inhibiting factors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/76—Albumins
- C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/88—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving prostaglandins or their receptors
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
一株抗前列腺素F2α的特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株WXX‑2及其应用，属于临床检测技术领域。本发明抗前列腺素F2α特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株WXX‑2，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13087。抗前列腺素F2α特异性单克隆抗体，它由所述抗前列腺素F2α特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株WXX‑2分泌产生。所述杂交瘤细胞株WXX‑2可以分泌产生对前列腺素F2α具有较好的特异性和较高灵敏度的单克隆抗体，对前列腺素F2α的50%抑制浓度IC50为1.80 μg/L，可以用于临床检测中前列腺素F2α的特异性检测。
Description
技术领域
本发明一株抗前列腺素F2α的特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株WXX-2及其应用，涉及前列腺素F2α的杂交瘤细胞株及其产生的抗特异性单克隆抗体，属于临床检测技术领域。
背景技术
前列腺素(Prostaglandins，PGs)是一类化学组成相似，且生物活性广泛的不饱和羟基脂肪酸。PGs家族主要包括：前列腺素D2、前列腺素E2、前列腺素F2α、前列腺素I2和TXA2，前列腺素在组织内含量甚微，但活性极强。子宫内膜是合成前列腺素的重要部位之一，前列腺素的E2和F2α是子宫内膜合成的主要花生四烯酸产物。
目前前列腺素检测多采用免疫亲和色谱-气质联用测定法（Immuno-GC -MS）、液相色谱与质谱联用法（LC-MS）、气质联用法（GC-MS）等。上述检测方法可进行定量分析并具有较低的检测限，但是通常需要昂贵的仪器和复杂的操作，前处理及检测时间长，严重制约了这些检测方法的推广，无法达到现场大批量快速检测的要求。而免疫分析方法具有低成本、高通量、高灵敏、对技术人员相对要求低等特点，因此适用于大量样品的快速筛查。本发明的目的在于提供一种对前列腺素F2α具有较高亲和力和检测灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备方法，为间接竞争 ELISA 试剂盒以及胶体金试纸条的研发推广奠定基础。
发明内容
本发明的目的是提供一株抗前列腺素F2α特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株WXX-2，由该细胞株制备的抗体对前列腺素F2α具有较好特异性和检测灵敏度，可以用来建立前列腺素F2α的免疫学检测方法。
本发明的技术方案：一株抗前列腺素F2α特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株WXX-2，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCCNo.13087。
抗前列腺素F2α特异性单克隆抗体，它由所述保藏编号为CGMCC No.13087的抗前列腺素F2α特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株WXX-2分泌产生。
所述抗前列腺素F2α特异性单克隆抗体的应用，其在前列腺素F2α临床检测中的应用。
所述抗前列腺素F2α特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株WXX-2的制备步骤为：
（1）免疫原的制备与鉴定：前列腺素F2α通过碳化二亚胺法（EDC法）与蛋白载体的氨基相连，反应结束后，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，完全抗原通过紫外吸收扫描方法鉴定；
（2）小鼠的免疫：将免疫原与福氏佐剂乳化完全后，通过皮下多点注射免疫BALB/c小鼠。首次免疫采用福氏完全佐剂，加强免疫使用福氏不完全佐剂，冲刺免疫时免疫剂量为前一次免疫剂量的一半，与生理盐水混合均匀后直接进行腹腔注射；各次免疫间隔为三周。第三次免疫后，间隔一周采血检测血清效价和抑制；
（3）细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（PEG 2000）法，使小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得抗前列腺素F2α特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株WXX-2；
（4）杂交瘤细胞株性质的鉴定：采用小鼠单抗Ig类/亚类鉴定用酶标二抗套装测定；IC50值和亲和力的测定通过ELISA法。
本发明的有益效果：本发明获得的抗前列腺素F2α单克隆抗体杂交瘤细胞株，对前列腺素F2α有较好的检测灵敏度和亲和力；本发明还提供了一种新的合成前列腺素F2α免疫原的方法，半抗原的合成步骤更加简化，有效，为今后人们的研究提供了合成免疫原的思路与方法。
生物材料样品保藏：单克隆细胞株WXX-2，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.13087，保藏日期2016年10月31日。
附图说明
图1 免疫原的紫外吸收光谱表征。
图2 抗前列腺素F2α特异性单克隆抗体对前列腺素F2α的标准抑制曲线。
具体实施方式
本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。
本发明通过将前列腺素F2α完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过间接ELISA和间接竞争ELISA筛选细胞上清，最终得到了对前列腺素F2α有较好亲和力和灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株。
实施例1抗前列腺素F2α特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株WXX-2的制备
（1）完全抗原的合成 ：
完全抗原的合成：取4mg半抗原F2α，再加入5.0 mg EDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）和3.7mg NHS（N-羟基琥珀酰亚胺），使用DMF（N,N-二甲基甲酰胺）溶解，室温搅拌，活化6h；另取15mg BSA（牛血清白蛋白）溶解于3mL、0.05M、pH9.6的CBS（碳酸盐缓冲溶液）溶液中；将上述活化液逐滴加入BSA溶液中，室温搅拌反应过夜后，取出免疫原PBS透析3天，-20℃分装保存。
（2）动物免疫：选择健康的6～8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。取前列腺素F2α完全抗原（1mg/mL）与等量福氏佐剂乳化均匀后，通过皮下多点注射免疫BALB/c小鼠，每只100μL。首次免疫采用福氏完全佐剂，加强免疫使用福氏不完全佐剂，冲刺免疫时免疫剂量为前一次免疫剂量的一半，与生理盐水混合均匀后直接进行腹腔注射；各次免疫间隔为三周。第三次免疫后，间隔一周采血检测血清效价和抑制；选择抑制最好的小鼠，在五免后18天冲刺免疫，准备融合。
（3）细胞融合：在冲刺免疫三天后，按照常规PEG（聚乙二醇，分子量为2000）方法进行细胞融合，具体步骤如下：
无菌取小鼠脾脏，研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，并进行细胞计数；
收集SP2/0细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；
将脾细胞和SP2/0细胞按照2-10:1的计数比例混合，离心后用PEG融合，时间1min，之后按照从慢到快，加入RPMI-1640基础培养液，离心后悬浮于含20% 胎牛血清、2%的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，加到96孔细胞培养板，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
（4）细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合的第三天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20% 胎牛血清、1%的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用间接ELISA筛选出阳性细胞孔，第二步选用前列腺素F2α为标准品，用间接竞争ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对前列腺素F2α有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，获得抗前列腺素F2α特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株WXX-2。
（5）抗前列腺素F2α特异性单克隆抗体的制备与鉴定：取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×106杂交瘤细胞WXX-2，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-饱和硫酸铵法纯化，获得的单抗置于-20℃保存。
使用小鼠单抗亚型鉴定试剂盒对腹水纯化获得的单克隆抗体进行免疫球蛋白亚型鉴定，其亚型为IgG1型，具体如表1所示。
表1 前列腺素F2α单克隆抗体的亚型鉴定
使用间接竞争ELISA法，测定单克隆抗体对前列腺素F2α的IC50为 1.8 μg/L，可用于前列腺素F2α的特异性快速检测，具体如图2所示。
（6）抗体应用：将抗前列腺素F2α特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株WXX-2通过体内腹水制备的单克隆抗体应用于前列腺素F2α 样品测定试验，具体步骤如下：
6.1用碳酸盐缓冲液（CBS）稀释好的0.1μg/mL的前列腺素F2α包被作为包被原包被96孔酶标板，每孔100μL，37℃包被2h后，用PBST洗液洗板三次，每次每孔200μL，每次3 min，拍干；
6.2用含0.2%明胶的CBS进行封闭，每孔200μL，37℃封闭2h，用PBST洗液洗板三次，每次每孔200μL，每次3 min，拍干；
6.3用磷酸盐缓冲液（PBS）分别配置0，0.01，0.02，0.05，0.1，0.2，0.5，1μg/L的前列腺素F2α标准溶液。将标准溶液以及待检测样品提取液，分别加入到已经封闭好的酶标板中，每孔50μL，每个样品重复3个孔，再每孔加入50μL 1︰16000稀释的抗前列腺素F2α单克隆抗体，37℃反应0.5h后，洗板拍干；
6.4每孔加入100μL 用含0.1% 明胶的PBS 1︰3000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃反应0.5h后，洗板拍干；
6.5每孔加入100μL TMB显色液，37℃显色15min后，每孔加入50μL 2M H2SO4终止液，450 nm测吸光值。
溶液的配置：
碳酸盐缓冲液（CBS）：称取Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用；
磷酸盐缓冲液（PBS）：8.00g NaCl，0.2g KCl，0.24g KH2PO4，3.62g Na2HPO4·12 H2O，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000mL；
PBST：含0.05% Tween20的PBS；
TMB显色液：A液：Na2HPO4·12H2O 18.43g，柠檬酸 9.33g，纯水定容至1000mL；B液：60mgTMB 溶于100mL乙二醇中。A、B液按体积比1︰5混合即为TMB显色液，现用现混。
综上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明的实施范围。即凡依本发明申请专利范围的内容所作的等效变化与修饰，都应为本发明的技术范畴。
Claims (3)
1.一株抗前列腺素F2α特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株WXX-2，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.13087。
2.抗前列腺素F2α特异性单克隆抗体，其特征在于：它由所述保藏编号为CGMCCNo.13087的抗前列腺素F2α特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株WXX-2分泌产生。
3.权利要求2所述抗前列腺素F2α特异性单克隆抗体的应用，特征在于：其在前列腺素F2α临床检测中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710164486.6A CN106929477B (zh) | 2017-03-20 | 2017-03-20 | 一株抗前列腺素F2α的特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株WXX-2及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710164486.6A CN106929477B (zh) | 2017-03-20 | 2017-03-20 | 一株抗前列腺素F2α的特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株WXX-2及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN106929477A true CN106929477A (zh) | 2017-07-07 |
| CN106929477B CN106929477B (zh) | 2020-01-10 |
Family
ID=59433374
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201710164486.6A Active CN106929477B (zh) | 2017-03-20 | 2017-03-20 | 一株抗前列腺素F2α的特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株WXX-2及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN106929477B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108866010A (zh) * | 2018-08-16 | 2018-11-23 | 江南大学 | 一株抗呋喃苯烯酸钠单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101175496A (zh) * | 2004-12-24 | 2008-05-07 | 参天制药株式会社 | 含有前列腺素F2α衍生物的制品 |
| CN101594872A (zh) * | 2006-09-28 | 2009-12-02 | 森托科尔奥索生物科技公司 | 在单克隆抗体生成中作为佐剂的前列腺素e2（pge2） |
| CN103459595A (zh) * | 2010-09-29 | 2013-12-18 | 株式会社Nb健康研究所 | 针对人前列腺素e2 受体ep4 的抗体 |
| CN105658221A (zh) * | 2013-09-26 | 2016-06-08 | 高德美国际公司 | 用于治疗萎缩性皮肤瘢痕形成的前列腺素F2α及其类似物 |
-
2017
- 2017-03-20 CN CN201710164486.6A patent/CN106929477B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101175496A (zh) * | 2004-12-24 | 2008-05-07 | 参天制药株式会社 | 含有前列腺素F2α衍生物的制品 |
| CN101594872A (zh) * | 2006-09-28 | 2009-12-02 | 森托科尔奥索生物科技公司 | 在单克隆抗体生成中作为佐剂的前列腺素e2（pge2） |
| CN103459595A (zh) * | 2010-09-29 | 2013-12-18 | 株式会社Nb健康研究所 | 针对人前列腺素e2 受体ep4 的抗体 |
| CN105658221A (zh) * | 2013-09-26 | 2016-06-08 | 高德美国际公司 | 用于治疗萎缩性皮肤瘢痕形成的前列腺素F2α及其类似物 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| FRANCOIS DAVID 等: "CHARACTERIZATION OF MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST PROSTAGLANDIN E2： FINE SPECIFICITY AND NEUTRALIZATION OF BIOLOGICAL EFFECTS", 《MOLECULAR IMMUNOLOGY》 * |
| 陈德宇 等: "前列腺素D合成酶单克隆抗体的制备及其在精子中的定位", 《中国免疫学杂志》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108866010A (zh) * | 2018-08-16 | 2018-11-23 | 江南大学 | 一株抗呋喃苯烯酸钠单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN106929477B (zh) | 2020-01-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105200013B (zh) | 一株抗万古霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用 | |
| CN105838681B (zh) | 一株抗地塞米松特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株c3及其应用 | |
| CN107022527A (zh) | 可分泌抗c反应蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞、c反应蛋白检测试剂及其制备方法和应用 | |
| CN104312978B (zh) | 一种妥布霉素单克隆抗体及其制备方法与应用 | |
| CN113637081A (zh) | 一株分泌抗二甲戊灵单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 | |
| CN109280646A (zh) | 一株抗地克珠利特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用 | |
| CN104862284B (zh) | 一株抗四溴双酚a单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用 | |
| CN105087498B (zh) | 一株苯噻氰单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用 | |
| US20220010029A1 (en) | Hybridoma cell strain that secrets anti-dinitolmide monoclonal antibodies and the application of hybridoma cell strain | |
| CN110724192B (zh) | 一株分泌蛇形菌素单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 | |
| CN108456661A (zh) | 一株抗苯并芘特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用 | |
| CN104004718B (zh) | 一株抗吡利霉素通用单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用 | |
| CN110343669A (zh) | 一株分泌抗三氯苯达唑单克隆抗体的杂交瘤细胞株dnc及其应用 | |
| CN106929477A (zh) | 一株抗前列腺素F2α的特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株WXX‑2及其应用 | |
| CN109705220A (zh) | 一株分泌抗氯丙嗪单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 | |
| CN104560886A (zh) | 一株抗纳他霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用 | |
| CN105907725B (zh) | 一株抗氢化可的松特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株yh7及其应用 | |
| CN105838680B (zh) | 一株抗雌三醇特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株NaN-2及其应用 | |
| CN114058594B (zh) | 一种分泌维生素a单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用 | |
| CN109022366A (zh) | 一株分泌抗左旋咪唑单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 | |
| CN105505886B (zh) | 一株特异性抗头孢噻呋单克隆抗体杂交瘤细胞株2e5及其应用 | |
| CN107043752A (zh) | 杂交瘤细胞株及基于杂交瘤细胞株的抗crh抗体n‑d19及其检测方面的应用 | |
| CN107177559B (zh) | 一株分泌潮霉素b特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株zxl-1及其应用 | |
| CN105087499A (zh) | 一株多溴联苯醚单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用 | |
| CN105567645B (zh) | 一株特异性抗头孢喹肟单克隆抗体杂交瘤细胞株2d4及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |