CN106880838A - 一种干细胞制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物治疗领域，公开了一种干细胞制剂及其制备方法和应用，所述干细胞制剂对黄斑性病变具有良好的疗效。本发明公开的干细胞制剂，包括如下组分：骨髓间充质干细胞1×10⁶～5×10⁶个/ml、表皮细胞生长因子5～30ng/mL、转化生长因子‑β5～30ng/mL、质量浓度为5％的白蛋白和溶剂。本发明公开了所述干细胞制剂的制备方法，包括以下步骤：a1)、白蛋白和溶剂混合，配制白蛋白悬液；b1)、往步骤a1)制备得到的白蛋白悬液中添加表皮细胞生长因子和转化生长因子‑β；c1)、用步骤b1)制得的悬液重悬骨髓间充质干细胞，制得所述干细胞制剂。

Description

一种干细胞制剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物治疗领域，特别涉及一种干细胞制剂及其制备方法和应用。

背景技术

黄斑区是视网膜的一个重要区域，位于眼后极部，主要与精细视觉及色觉等视功能有关。一旦黄斑区出现病变，常常出现视力下降、眼前黑影或视物变形。黄斑病变通常有两种类型。一种是干性黄斑病变，一种是湿性黄斑病变。湿性黄斑变性占总发病率的10％，是由于视网膜下有异常的血管生长，新生血管破裂出血，并引起疤痕组织生长，使视力突然下降，会迅速严重地影响患者的中心视力，甚至导致中心视力丧失。湿性黄斑病变的主要症状表现为：中央视力快速减弱，视物变形，纸上字句弯曲，视觉中央出现黑影或模糊区域。目前对于黄斑病变的治疗常常采用中医或临床手术等方法，但是该类方法仅能起到延缓病情，而不能起到根治的作用。此外，现有治疗方法复发率高，长期致盲率高。

目前，越来越多的研究者将骨髓间充质干细胞(BMSCs)应用于视网膜病变(ROP)的治疗。BMSCs治疗ROP的机制表现如下：1.细胞迁移聚集到损伤区域，当视网膜血管损伤后，BMSCS会产生大量的生长因子，如血管内皮生长因子、血小板衍生因子和细胞间黏附因子等，在改善血管形成微环境方面起到重要作用；2.细胞移植参与修复：①被移植的干细胞向病变组织迁移、增殖、融合而补充已经受损的神经节细胞，并与宿主的神经细胞形成紧密的的突触联系，重建神经通路，完善相应功能；②通过自分泌及旁分泌的功能，发挥其移植后神经保护及营养作用；③免疫调节作用及下调炎症反应，在一定程度上抑制相关炎性因子对视网膜血管细胞及神经组织的损伤，且减低了临床移植后相关并发症的发生概率。因此，研发一种对黄斑性病变具有良好疗效的干细胞制剂是本领域技术人员亟待解决的技术问题。

发明内容

有鉴于此，本发明公开了一种干细胞制剂及其制备方法和应用，所述干细胞制剂对黄斑性病变有良好的疗效。

本发明公开了一种干细胞制剂，包括如下组分：骨髓间充质干细胞1～5×10⁶个/ml、表皮细胞生长因子5～30ng/mL、转化生长因子-β5～30ng/mL和质量浓度为5％的白蛋白。

优选地，所述干细胞制剂还包括溶剂，所述溶剂为生理盐水。

优选地，所述骨髓间充质干细胞按照以下步骤获得：

(1)将骨髓采用Ficoll密度梯度离心方法分离出骨髓间充质干细胞，用DMEM+10％FBS完全培养基对分离出的骨髓间充质干细胞进行培养，获得可传代的原代细胞；

(2)将步骤(1)获得的可传代的原代骨髓间充质干细胞进行传代培养，取第二代(P2)至第五代(P5)的骨髓间充质干细胞用作所述干细胞制剂的组分。

本发明还公开了所述干细胞制剂的制备方法，包括以下步骤：

a1)、将白蛋白和生理盐水混合，配制白蛋白悬液；

b1)、往步骤a1)制备得到的白蛋白悬液中添加表皮细胞生长因子和转化生长因子-β；

c1)、用步骤b1)制得的悬液重悬骨髓间充质干细胞，制得所述干细胞制剂。

优选的，本发明还公开了所述的干细胞制剂或根据所述的制备方法制得的干细胞制剂在治疗黄斑性病变中的应用。

本发明干细胞制剂组分中的骨髓间充质干细胞可通过分泌多种细胞因子直接参与损伤组织的修复，增强未损伤组织的抵抗能力，起到连续性的修复作用，大大缩短组织修复的时间。

所述干细胞制剂中的表皮细胞生长因子和转化生长因子-β可直接参与损伤组织的替代修复，大大减少治愈期限。

人血清白蛋白(Human Serum Albumin，简称HSA)是人血浆中的蛋白质，其非糖基化的单链多肽包含585个氨基酸，分子量为66kD。细胞提供了稳定的、直接的营养供给，保证了细胞存活率。

所述人血清白蛋白为细胞提供了稳定的、直接的营养供给，保证了细胞存活率。

综上所述，本发明公开了一种干细胞制剂及其制备方法和应用，该干细胞制剂包括骨髓间充质干细胞、表皮细胞生长因子、转化生长因子和白蛋白。本发明公开的干细胞制剂具有如下有益效果：

1、制剂中的骨髓间充质干细胞可以分泌多种细胞因子直接参与损伤组织的修复，增强未损伤组织的抵抗能力，起到连续性的修复作用，缩短组织修复时间；

2、制剂中的表皮细胞生长因子和转化生长因子-β可直接参与损伤组织的替代修复，大大减少治愈期限。

3、所述干细胞制剂对黄斑性视网膜病变具有良好的疗效。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例中骨髓间充质干细胞的光学显微镜图；

图2A为本发明实施例中骨髓间充质干细胞的对照管流式检测结果图；

图2B为本发明实施例中骨髓间充质干细胞的样品管流式检测结果图。

具体实施方式

本发明公开了一种干细胞制剂及其制备方法和应用，该干细胞制剂能够避免血液流动而造成外泌体的损失，增强未损伤组织的抵抗能力，缩短修复时间，对黄斑性病变具有良好的疗效。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

下面结合实施例，进一步阐述本发明。

实施例1制备骨髓间充质干细胞

1、骨髓间充质干细胞的原代培养

取收集好的骨髓，在超净台中采用ficoll密度梯度离心方法，分离出骨髓间充质干细胞；用DMEM+10％FBS完全培养基重悬后接种至15cm规格的平皿中，转移至5％CO₂、37℃的环境中培养。

培养48h后换液，补充新的完全培养基继续培养，获得可传代的原代细胞；2、骨髓间充质干细胞的传代培养

1)取可传代的原代(P0)细胞，弃掉皿内原培养液，加入10mL PBS缓冲液轻轻冲洗细胞生长面，弃去洗液；

2)加入2mL0.25％胰蛋白酶，左右摇晃平皿使胰酶均匀覆盖于皿底，在显微镜下观察可见细胞间隙增大，胞质回缩，当长梭形细胞变圆变亮时，立即加入10倍体积的完全培养基终止消化；

3)用移液枪反复吹打，直至细胞全部脱落成单细胞悬液，将悬液转移至离心管中，1500rpm室温离心5min；

4)弃上清，加入DMEM+10％FBS完全培养基重悬细胞，细胞密度调至1×10⁵cells，置于37℃、5％二氧化碳和饱和湿度的细胞培养箱中培养；

5)待细胞生长至融合时，重复操作2)获得本实施例所用的第二代(P2)至第五代(P5)骨髓间充质干细胞。图1A为第二代(P2)骨髓间充质干细胞放大40倍的显微镜图，图1B为第二代(P2)骨髓间充质干细胞放大100倍的显微镜图。

3、骨髓间充质干细胞的鉴定

收集传代培养的骨髓间充质干细胞P₃代细胞3×10⁶cell，均分至三个EP管中，加入10％FBS+PBS吹打均匀后，1500rpm离心5min，弃上清。清洗2次后，每管细胞加入10％FBS+PBS各200uL，分别标记为对照管(C)、样品管1(S1)、样品管2(S2)。其中C管不添加任何东西，S1管添加CD45、CD73、CD90、HLA-DR；S2管添加CD105、CD11b、CD19、CD90；吹打均匀后，避光4℃孵育20min，孵育完加入10％FBS+PBS吹打均匀后，1500rpm离心5min后，弃上清。清洗2次后，用70um的滤网过滤，上流式仪检测表面抗原。流式结果如图2所示，图2A为对照管(C)的流式检测结果，图2B为样品管1(S1)和样品管2(S2)的流式检测结果。

根据2006年ISCT颁布的《间充质干细胞鉴定的最低标准》，CD73、CD90、CD105三种表面抗原的表达不低于95.0％；CD34、CD45、CD11b、CD19、HLA-DR的表达不高于2.0％。图2A是骨髓间充质干细胞8种抗原相应的同型对照。图2B是8种抗原的表达情况：CD73、CD90、CD105表达高于95.0％；HLA-DR、CD45、CD19、CD34、CD11b表达低于2.0％，符合干细胞的表面抗原特征，说明了骨髓干细胞并没有出现分化的现象，仍维持着干细胞的特点。

实施例2干细胞制剂的制备

将白蛋白与生理盐水混合，配制得到质量浓度为5％的白蛋白悬液；

往所配制的白蛋白悬液中添加EGF和TGF-β，调整浓度均为10ng/mL；

收集实施例1制备的第二代至第五代任意一代的骨髓间充质干细胞，用生理盐水清洗2遍，用上述配制的悬液重悬收集到的骨髓间充质干细胞，将骨髓间充质干细胞的含量调整至3×10⁶cells，获得骨髓间充质干细胞制剂，置于4℃环境中保存备用。

实施例3干细胞制剂的制备

将白蛋白与生理盐水混合，配制得到质量浓度为5％的白蛋白悬液；

往所配制的白蛋白悬液中添加EGF和TGF-β，调整浓度均为5ng/mL；

收集实施例1制备的第二代至第五代的骨髓间充质干细胞，用生理盐水清洗2遍，用上述配制的白蛋白悬液重悬收集到的骨髓间充质干细胞，将骨髓间充质干细胞的含量调整至1×10⁶cells，获得骨髓间充质干细胞制剂，置于4℃环境中保存备用。

实施例4干细胞制剂的制备

将白蛋白与生理盐水混合，配制得到浓度为5％的白蛋白悬液；

往所配制的白蛋白悬液中添加EGF和TGF-β，调整浓度均为30ng/mL；

收集实施例1制备的第二代至第五代的骨髓间充质干细胞，用生理盐水清洗2遍，用上述配制的白蛋白悬液重悬收集到的骨髓间充质干细胞，将骨髓间充质干细胞的密度调整至5×10⁶cells获得骨髓间充质干细胞制剂，置于4℃环境中保存备用。

实施例5动物试验

黄斑性病变的大鼠模型的建模方法为：将成年SD大鼠(2-3月龄)使用剂量为40mg/Kg盐酸氯胺酮和6mg/Kg甲苯噻嗪肌肉注射全身麻醉后，将微量注射器插入到视网膜下腔，注入1.2μL基底膜基质凝胶(基底膜基质凝胶经PBS3:1稀释)，构建大鼠黄斑性病变模型。

1.动物：选取湿性黄斑病变的大鼠模型，体重相近，部分雌雄，共40只。

2.实验分组：湿性黄斑病变的大鼠均分为4组，每组各10只；分组如表1所示，每组制剂移植的体积为50uL，2周后进行检测。

3.采用3D Topcon OCT-1000进行检查，检查参数为：扫描深度6.0mm×6.0mm，扫描长度随病变范围而调整。扫描方式为垂直或水平线形扫描。试验结果见表1。

表1试验分组及试验结果

从结果可知，使用实施例2～5制备的干细胞制剂进行回注，其对湿性黄斑病变的取得较为明显的改善作用，治愈率为80.0％～95.0％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种干细胞制剂，其特征在于，包括：骨髓间充质干细胞1×10⁶～5×10⁶个/ml、表皮细胞生长因子5～30ng/mL、转化生长因子-β5～30ng/mL和质量浓度为5％的白蛋白。

2.根据权利要求1所述的干细胞制剂，其特征在于，所述干细胞制剂还包括溶剂，所述溶剂为生理盐水。

3.根据权利要求1所述的干细胞制剂，其特征在于，所述骨髓间充质干细胞按照以下步骤获得：

(1)将骨髓采用ficoll密度梯度离心方法分离出骨髓间充质干细胞，用DMEM+10％FBS完全培养基对分离出的骨髓间充质干细胞进行培养，获得可传代的原代细胞；

(2)将步骤(1)获得的可传代的原代骨髓间充质干细胞进行传代培养，取第二代至第五代的骨髓间充质干细胞用作所述干细胞制剂的组分。

4.一种权利要求1至3任意一项所述的干细胞制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

a1)、将白蛋白和生理盐水混合，配制白蛋白悬液；

b1)、往步骤a1)制备得到的白蛋白悬液中添加表皮细胞生长因子和转化生长因子-β；

c1)、用步骤b1)制得的悬液重悬骨髓间充质干细胞，制得所述干细胞制剂。

5.权利要求1至3任意一项所述的干细胞制剂或权利要求4所述的制备方法制得的干细胞制剂在制备治疗黄斑性病变药物制剂中的应用。