CN106854231B - 一种硫巯化多肽的富集方法 - Google Patents

一种硫巯化多肽的富集方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106854231B
CN106854231B CN201510902151.0A CN201510902151A CN106854231B CN 106854231 B CN106854231 B CN 106854231B CN 201510902151 A CN201510902151 A CN 201510902151A CN 106854231 B CN106854231 B CN 106854231B
Authority
CN
China
Prior art keywords
polypeptide
sulfhydrylation
water
enrichment
compound
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201510902151.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106854231A (zh
Inventor
张丽华
袁辉明
朱旭东
杨开广
张玉奎
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Original Assignee
Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dalian Institute of Chemical Physics of CAS filed Critical Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority to CN201510902151.0A priority Critical patent/CN106854231B/zh
Publication of CN106854231A publication Critical patent/CN106854231A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106854231B publication Critical patent/CN106854231B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Landscapes

  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种硫巯化多肽富集方法及应用，以多氨基树枝状聚合物为载体，通过共价修饰碘乙酸‑N‑琥珀酰胺酯，制备成选择性与含巯基多肽反应的水溶性高分子化合物，通过将该化合物与蛋白质酶解产物充分混合，并置于超滤膜上，在高速离心下，选择性将含巯基多肽截留在膜上，最后在膜上加入二硫键还原剂在一定温度下选择性将硫巯化多肽从高分子化合物上释放，通过高速离心，即获得硫巯化多肽。该方法具有操作简单、通量高，选择性好等优点，应用于复杂蛋白质组样品中规模化硫巯化修饰多肽的富集。

Description

一种硫巯化多肽的富集方法
技术领域
本发明涉及一种硫巯化多肽富集方法及其在细胞、组织及体液等蛋白质组样品中规模化硫巯化多肽分析中的应用。
背景技术
大量研究结果表明，氧化应激在衰老相关多种重大疾病中都扮演了关键的病理角色。活性氧(ROS)、活性氮(RNS)通过攻击脂质大分子、蛋白质分子和DNA分子等，引起细胞生理功能的紊乱，进一步导致细胞凋亡和坏死。蛋白质的含硫氨基酸残基，包括半胱氨酸(cysteine，Cys)残基和蛋氨酸(methionine，Met)残基，都是活性氧发挥氧化-还原调节的重要作用位点。活性氧结合到这些氨基酸残基上以后，产生一种氧化-还原依赖的翻译后修饰，改变蛋白分子的结构和功能，从而进一步引起各种生物学效应。最近，硫巯化修饰是作为蛋白质半胱氨酸残基上一种新的氧化修饰得到广泛关注。目前，硫巯化修饰的富集主要集中在蛋白质水平上，尚未有大规模的组学富集方法(Angew.Chem.Int.Ed,2014,53,575-581；Sci.Signaling,2009,2,ra72)。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种可用于复杂蛋白质组样品中规模化富集硫巯化多肽的方法。为了实现该目的，本发明的技术方案是：
1)多氨基树枝状聚合物、甲醇、磷酸缓冲盐、以及碘乙酸-N-琥珀酰胺酯充分混合后，避光振荡反应0.5-24小时；
其中碘乙酸-N-琥珀酰胺酯加入摩尔量为多氨基树枝状聚合物的1-100倍，甲醇加入量为总体积的50％-80％，磷酸缓冲盐浓度为0.01-0.5M,pH为7-9，多氨基树枝状聚合物为以1,4-丁二胺为核心的氨基乙醇树枝状聚合物中的一种或二种以上，分子量范围为30000Da-100000Da。
2)制备的水溶性高分子化合物与蛋白质酶解产物充分混合后，室温避光振荡反应0.5-24小时，形成水溶性高分子-巯基多肽复合物。
其中蛋白质酶解产物加入量为水溶性高分子化合物的0.1-1倍；
3)超滤膜的截留分子量为3000Da至10000Da；使用超滤膜的离心转速为5000rpm至20000rpm。
4)二硫键还原剂为巯基乙醇、二硫苏糖醇、磷酸三氯乙酯。
其中二硫键还原剂加入摩尔量为蛋白质酶解产物摩尔量的0.5％-2％；
5)二硫键还原剂25℃-90℃温度下反应0.5-3小时，断裂硫巯化多肽上的二硫键，进而释放出多肽。
6)该硫巯化多肽富集方法应用于细胞、组织及体液等蛋白质组样品中规模化硫巯化多肽的富集。
本发明具有如下优点：
1、采用多氨基树枝状聚合物，可提供多个活性反应位点，提高巯基多肽的键合量；
2、采用超滤膜截留的方式，操作简单快速、适用面广；
3、发展的硫巯化多肽富集方法可用于复杂蛋白质组样品中规模化硫巯化多肽的富集方法。
附图说明
图1为可选择性与含巯基多肽反应的水溶性高分子化合物的合成示意图(a)及硫巯化多肽富集流程图(b)；
图2为巯基肽段富集性能评价(a)为富集前，(b)为富集后；
图3为复杂样品中硫巯化多肽的富集。
具体实施方式
实施例1
选择性与含巯基多肽反应的水溶性高分子化合物的制备：称取3mg碘乙酸-N-琥珀酰胺酯，溶于400μL甲醇和200μL pH 8.0磷酸缓冲盐的混合溶液中，配置成反应溶液A；称取16mg氨基乙醇树枝状聚合物(丁二胺核，6代)，分子量为58000Da,并加入反应溶液A中，混匀后，室温振荡避光反应3小时，反应产物置于超滤膜上，截留分子量为10000Da，16000rpm离心40min，除去未反应完的碘乙酸-N-琥珀酰胺酯，再用磷酸缓冲盐清洗两次，即制成选择性与含巯基多肽反应的水溶性高分子化合物1，制备流程图如图1(a)所示。
称取3mg转铁蛋白,并用50mM磷酸缓冲盐稀释至0.2mg/mL,然后放入95℃水浴锅中热变性30min,加入1M磷酸三氯乙酯10μL 56℃反应1.5h,取400μL转铁蛋白溶液，加入2μg胰蛋白酶酶解，获得的酶解产物与制备的水溶性高分子化合物1混匀后，室温避光反应12h,然后再置于超滤膜上，16000rpm离心40min,离心获得溶液采用nano-RPLC-ESI/MS/MS分析，富集流程如图1(b)所示，富集前的效果如图2(a)，富集后的效果如图2(b)所示。通过数据库匹配，富集前，转铁蛋白序列覆盖率为62％，有19条巯基多肽被检测。富集后，转铁蛋白序列覆盖率为37％，且无巯基多肽被检测，说明所制备的水溶性高分子化合物1具有较好的巯基多肽富集能力。
实施例2
选择性与含巯基多肽反应的水溶性高分子化合物的制备：称取10mg碘乙酸-N-琥珀酰胺酯，溶于480μL甲醇和120μL pH 7.5磷酸缓冲盐的混合溶液中，配置成反应溶液A；称取16mg氨基乙醇树枝状聚合物(丁二胺核，6代)，分子量为58000Da,并加入反应溶液A中，混匀后，室温振荡避光反应10小时，反应产物置于超滤膜上，截留分子量为10000Da，16000rpm离心40min，除去未反应完的碘乙酸-N-琥珀酰胺酯，再用磷酸缓冲盐清洗两次，即制成选择性与含巯基多肽反应的水溶性高分子化合物2，制备流程图如图1(a)所示。
取200μg HeLa细胞提取蛋白质酶解产物，依次进行95℃热变性30min,酶解24h,然后加入制备的水溶性高分子化合物2混匀，室温避光反应12h,然后再置于超滤膜上，16000rpm离心40min,再用磷酸缓冲盐清洗两次，再加入1M磷酸三氯乙酯10μL 56℃反应1.5h后,16000rpm离心40min获得产物采用nano-RPLC-ESI/MS/MS分析，如图3所示，通过数据库匹配，共鉴定1000种硫巯化多肽，说明该方法具有优异的巯基多肽富集能力。
实施例3
称取3mg碘乙酸-N-琥珀酰胺酯，溶于400μL甲醇和200μL pH 8.0磷酸缓冲盐的混合溶液中，配置成反应溶液A；
称取16mg氨基乙醇树枝状聚合物(丁二胺核，4代)(分子量为30000Da),并加入反应溶液A中，制得制成选择性与含巯基多肽反应的水溶性高分子化合物，然后将其用于HeLa细胞提取蛋白质酶解产物中硫巯肽段的富集，共鉴定出1200种硫巯化多肽，说明该方法具有优异的巯基多肽富集能力。
实施例4
称取3mg碘乙酸-N-琥珀酰胺酯，溶于400μL甲醇和200μL pH 8.0磷酸缓冲盐的混合溶液中，配置成反应溶液A；
称取16mg氨基乙醇树枝状聚合物(丁二胺核，10代,分子量为100000Da),并加入反应溶液A中，制得制成选择性与含巯基多肽反应的水溶性高分子化合物，然后将其用于HeLa细胞提取蛋白质酶解产物中硫巯肽段的富集，共鉴定出980种硫巯化多肽，说明该方法具有优异的巯基多肽富集能力。
实施例5
称取3mg碘乙酸-N-琥珀酰胺酯，溶于400μL甲醇和200μL pH 8.0磷酸缓冲盐的混合溶液中，配置成反应溶液A；
称取16mg氨基乙醇树枝状聚合物(丁二胺核，8代,分子量为80000Da),并加入反应溶液A中，制得制成选择性与含巯基多肽反应的水溶性高分子化合物，然后将其用于HeLa细胞提取蛋白质酶解产物中硫巯肽段的富集，共鉴定出1040种硫巯化多肽，说明该方法具有优异的巯基多肽富集能力。

Claims (8)

1.一种硫巯化多肽的富集方法，其特征在于：
步骤1）以多氨基树枝状聚合物为载体，通过共价修饰碘乙酸N-琥珀酰亚胺酯，反应产物置于超滤膜上，离心，除去未反应完的碘乙酸N-琥珀酰亚胺酯，再用磷酸缓冲盐清洗，制备成选择性与含巯基多肽反应的水溶性高分子化合物，其中在步骤1）体系中，碘乙酸N-琥珀酰亚胺酯加入摩尔量为多氨基树枝状聚合物的1-100倍；
步骤2）通过将制备得到的水溶性高分子化合物与蛋白质酶解产物充分混合，室温避光反应后置于超滤膜上，离心，选择性将含巯基多肽截留在膜上；
步骤3）在膜上加入二硫键还原剂，选择性将硫巯化多肽从高分子化合物上释放，通过离心，获得硫巯化多肽。
2.按照权利要求1所述的富集方法，其特征在于：
步骤1）所述选择性与含巯基多肽反应的水溶性高分子化合物的制备步骤为将多氨基树枝状聚合物、甲醇、磷酸缓冲盐、以及碘乙酸N-琥珀酰亚胺酯充分混合后，避光振荡反应0.5-24小时；离心转速为5000 rpm至20000 rpm，离心时间为0.5小时以上；
在步骤1）体系中，甲醇加入量为步骤1）体系总体积的50%-80%，磷酸缓冲盐浓度为0.01-0.5M, pH为7-9；步骤1）中所述多氨基树枝状聚合物的分子量范围为30000 Da-100000 Da。
3.按照权利要求1所述的富集方法，其特征在于：步骤2）中水溶性高分子化合物与蛋白质酶解产物充分混合后，室温避光振荡反应0.5-24小时，形成水溶性高分子-巯基多肽复合物，将复合物置于超滤膜上；进行离心，离心转速为5000 rpm至20000 rpm，离心时间0.5小时以上，再用磷酸缓冲盐清洗。
4.按照权利要求1所述的富集方法，其特征在于：步骤2）中所述超滤膜的截留分子量为3000 Da至10000Da；步骤2）中蛋白质酶解产物加入量为水溶性高分子化合物质量的0.1-1倍。
5.按照权利要求1所述的富集方法，其特征在于：步骤3）中所述二硫键还原剂为0.5-1M的巯基乙醇、二硫苏糖醇、磷酸三氯乙酯中的一种；
其中二硫键还原剂加入摩尔量为蛋白质酶解产物摩尔量的0.5%-2%。
6.按照权利要求1所述的富集方法，其特征在于：步骤3）中所述二硫键还原剂选择性将硫巯化多肽从高分子化合物上释放，25℃-90℃下，反应0.5-3小时，断裂硫巯化多肽上的二硫键，进而释放出多肽。
7.按照权利要求1所述的富集方法，其特征在于：所述方法应用于蛋白质酶解产物样品中硫巯化多肽的规模化富集，所述蛋白质为细胞、组织、体液提取物中的一种或二种以上。
8.按照权利要求1或2所述的富集方法，其特征在于：多氨基树枝状聚合物为以1,4-丁二胺为核心的氨基乙醇树枝状聚合物中的一种或二种以上。
CN201510902151.0A 2015-12-09 2015-12-09 一种硫巯化多肽的富集方法 Active CN106854231B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510902151.0A CN106854231B (zh) 2015-12-09 2015-12-09 一种硫巯化多肽的富集方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510902151.0A CN106854231B (zh) 2015-12-09 2015-12-09 一种硫巯化多肽的富集方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106854231A CN106854231A (zh) 2017-06-16
CN106854231B true CN106854231B (zh) 2020-08-11

Family

ID=59132240

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510902151.0A Active CN106854231B (zh) 2015-12-09 2015-12-09 一种硫巯化多肽的富集方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106854231B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114539345B (zh) * 2020-11-24 2023-12-15 中国科学院大连化学物理研究所 一种基于孔板的高通量蛋白质样品预处理方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101893634A (zh) * 2009-05-20 2010-11-24 中国科学院生物物理研究所 特异检测蛋白质或多肽半胱氨酸巯基修饰的方法及其用途
CN104237439A (zh) * 2014-10-09 2014-12-24 江西师范大学 一种检测蛋白质二硫键是否断裂的方法
CN104781276A (zh) * 2012-08-14 2015-07-15 安吉奥开米公司 肽-树枝状聚合物结合物及其用途

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9453844B2 (en) * 2013-10-07 2016-09-27 Washington State University Detection of protein S-sulfhydration via a tag-switch technique

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101893634A (zh) * 2009-05-20 2010-11-24 中国科学院生物物理研究所 特异检测蛋白质或多肽半胱氨酸巯基修饰的方法及其用途
CN104781276A (zh) * 2012-08-14 2015-07-15 安吉奥开米公司 肽-树枝状聚合物结合物及其用途
CN104237439A (zh) * 2014-10-09 2014-12-24 江西师范大学 一种检测蛋白质二硫键是否断裂的方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Chemical-proteomic strategies to investigate cysteine posttranslational modifications;Shalise M.Couvertier等;《Biochimica et Biophysica Acta》;20141005;第1844卷(第12期);2315-2330 *
Reaction of Hydrogen Sulfide with Disulfide and Sulfenic Acid to Form the Strongly Nucleophilic Persulfide;Ernesto Cuevasanta等;《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》;20151106;第290卷(第45期);26866-26880 *
Site-Specific Quantification of Persulfidome by Combining an Isotope-Coded Affinity Tag with Strong Cation-Exchange-Based Fractionation;Qiong Wu等;《Analytical Chemistry》;20191031;A-E *
一种基于聚酰胺-胺型树枝状聚合物富集糖肽的新策略;邓珊珊等;《生物技术通讯》;20140331;第25卷(第2期);158-164 *
基于碘乙酸功能化树枝状聚合物的硫巯化肽段选择性富集新方法;吴琼等;《色谱》;20190831;第37卷(第8期);836-844 *
硫巯基化:一种新的蛋白质翻译后修饰;梅玉东等;《中国生物化学与分子生物学报》;20180930;第34卷(第9期);911-920 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN106854231A (zh) 2017-06-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Shinde et al. Imprinted polymers displaying high affinity for sulfated protein fragments
Luchini et al. Nanoparticle technology: addressing the fundamental roadblocks to protein biomarker discovery
CN103217406B (zh) 基于Au/Ag核/壳量子点的半胱氨酸和Cu2+荧光探针的制法
CN103506093B (zh) 一种磁性双模板蛋白质分子印迹纳米粒子及其制备方法
CN110003323A (zh) 一种双水相体系分离纯化蛋白质的方法
CN103772497B (zh) 蜂王浆中得到王浆主蛋白和活性滤后液的超滤膜分离方法
CN106905472B (zh) 一种功能化温度敏感型聚合物及其制备方法与应用
JPWO2009133696A1 (ja) 糖鎖標識方法
WO2018090651A1 (zh) 一种离体体液中蛋白质的预处理方法
CN105651999A (zh) 一种基于二硫化钼的传感器及其制备方法和应用
CN104725559B (zh) 嗜硫色谱材料及其制备方法和应用
CN107607642A (zh) 一种鉴定烟草中蛋白与蛋白组的多维液相色谱质谱联用法
WO2023142398A1 (zh) 一种新冠rbd蛋白荧光微球复合制剂
CN104415740A (zh) 亲水色谱填料及其制备方法与应用
CN106854231B (zh) 一种硫巯化多肽的富集方法
CN106483228A (zh) 定量检测污泥中含硫氨基酸的方法
CN113341036B (zh) 一种评价天然蜂花粉与酶法破壁蜂花粉致敏性的方法
CN101788541A (zh) 一种分离富集和鉴定大分子量蛋白质的方法
CN102796193A (zh) 一种从鸡蛋清中提取卵转铁蛋白的方法
Ji et al. Separation and purification of horseradish peroxidase from horseradish roots using a novel integrated method
Biggins et al. Physical properties of spinach chloroplast lamellar proteins
Krenkova et al. Macroporous cryogel based spin column with immobilized concanavalin A for isolation of glycoproteins
CN112014198B (zh) 一种用于富集内源性低分子量蛋白和多肽的试剂盒及方法
CN106637956B (zh) 一种含有磷酸根的棉花修饰材料及其制备方法和应用
CN109142611A (zh) 一种基于疏水基团修饰的sumo化肽段的富集方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant