CN114539345B - 一种基于孔板的高通量蛋白质样品预处理方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于孔板的高通量蛋白质样品预处理方法，是一种集蛋白质提取、变性、还原、烷基化、除盐以及酶解的为一体的方法。需要顺序使用预处理孔板Ⅰ和预处理孔板Ⅱ。生物样品首先加入预处理孔板Ⅰ中，进行蛋白质提取，变性和还原处理，这是由于上述操作的条件比较苛刻，可能会破坏预处理孔板Ⅱ；然后再将样品溶液转移到预处理孔板Ⅱ中进行烷基化捕获蛋白质、除盐以及酶解处理。酶解产生的肽段可以进行质谱检测。本发明的优点是将蛋白质样品预处理过程集成在孔板中进行，可同时处理24‑384个样品。此外，在提取过程中使用细胞裂解酶(如溶菌酶、酵母溶壁)和强提取溶剂(如SDS、离子液体)大大提高微生物蛋白质的提取效率。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于孔板的高通量蛋白质样品预处理装置，是一种将蛋白质提取、变性、还原、除盐以及蛋白质酶解过程整合在孔板中进行的样品预处理系统。
背景技术
在蛋白质工程化化菌株的筛选过程中，往往需要对大量的样本进行筛选。目前对于目标蛋白质的含量检测主要通过SDS-PAGE或Western Blot等方法。前一种方法表征标准目标蛋白质的特异性较差，而后者虽然特异性强，但是操作繁琐，无法实现高通量。此外，有些关键蛋白质也是研究疾病机理和预防诊治药物等的直接靶体库。针对临床样品的蛋白质组学大队列分析也成分人们研究疾病发生机理、监测疾病发展和预测治疗效果的有力工具。但是面对大量的临床体液和组织样本，依然缺乏高通量的样品处理方法。基于质谱的蛋白质组学技术可以针对复杂样品中的特定蛋白质进行较精确的定量分析。随着质谱技术的日益发展，配合高通量的样品制备方法，基于质谱的蛋白质组学定量分析方法有望成为高通量的目标蛋白质含量筛选方法。然而，常规的蛋白质样品预处理流程多在离心管中进行，难于实现高通量，而且花费时间长，严重影响了蛋白质分析的通量。因此发展高通量、集成化的样品预处理方法和装置具有非常重要的意义。
针对传统样品预处理方法存在的操作繁琐，耗时长等问题，我们发展了一种集蛋白提取、变性、还原、烷基化捕获、除盐以及在线酶解的样品预处理系统。该系统可以实现高通量的蛋白质样品预处理，在蛋白质组学研究中具有很好的应用前景。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种集蛋白质变性、还原、烷基化捕获蛋白质、除盐以及酶解于一体的样品预处理系统。该系统基于孔板，不需要复杂和繁琐的手工操作，可由自动化处理系统完成处理完成，整个处理过程具有较高通量。
为了实现该目的，本发明的技术方案是：
首先采用细胞裂解酶和强提取溶剂，保证蛋白质的高效提取。之后采用高温变性和还原剂对蛋白质样品进行快速的变性和还原，保证蛋白质结构舒展并打开二硫键。然后采用烷基化试剂对蛋白质进行捕获，在此基础上采用强洗脱溶剂进行洗脱以去除高浓度的强提取溶剂和还原剂，以确保后续高效的酶解反应。在酶解反应过程中通过微波或紫外辅助酶解，大大提高反应效率，同时保证酶解产生的多肽可以通过质谱直接检测或通过液质联用系统进行分析。
一种基于孔板的高通量蛋白质样品预处理装置，包括：顺序使用的预处理孔板Ⅰ和预处理孔板Ⅱ。因预处理孔板Ⅱ可能在变性还原的条件下受损，因此需在预处理孔板Ⅰ中进行样品裂解提取、变性和还原。以96孔板为例，选用低吸附的孔板。预处理孔板Ⅱ用于蛋白质捕获、除盐、酶解。以96孔板为例，选用平底板。先以多巴胺对96孔板的孔内壁进行氨基(NH2)修饰，再通过共价键合方式依次修饰上树枝状亲水性化合物聚乙烯亚胺(PEI)和碘乙酸-N-琥珀酰胺酯，制备成固相烷基化试剂修饰的96孔板。
预处理孔板Ⅱ制备过程如下：用5-500mM的Tris-HCl溶液或磷酸缓冲溶液(pH值6-9)配制度5-50mg/mL的多巴胺溶液(pH值为6-9)，每孔加入50-200微升。在15-50摄氏度反应1-12小时，反应后用水清洗。用5-500mM的Tris-HCl溶液或磷酸缓冲溶液(pH值6-9)配制1-20％(V/V)的戊二醛溶液，每孔加入50-200微升，在15-50摄氏度反应1-12小时，反应后用水清洗。用5-500mM的Tris-HCl溶液或磷酸缓冲溶液(pH值6-9)配制1-100mg/mL的PEI溶液(含氰基硼氢化钠使浓度为1-100mg/mL)，每孔加入50-200微升，在15-50摄氏度反应1-12小时。，反应后用水清洗。用甲醇和5-50mM的磷酸缓冲溶液度(pH值6-9)混合(比例1/：1至9：1)配置反应溶液，用次溶液配置0.1-5mg/mL的碘乙酸-N-琥珀酰胺酯溶液，每孔加入50-200微升，在15-50摄氏度避光反应1-8小时。
将样品加入到预处理孔板Ⅰ，加入1-1000mM的裂解酶(溶菌酶，酵母溶壁酶)处理0.5-6小时，再加入0.01-5％强提取溶剂(如SDS、charps、离子液体等)提取蛋白质样品，90度变性10分钟，然后向样品中加入TCEP使终浓度为1-100mM后，56℃反应0.5-2h，在变性和还原同时作用下，蛋白质二级结构被彻底破坏，二硫键断裂；从预处理孔板Ⅰ的每个样品孔中吸取蛋白质样品加入预处理孔板Ⅱ中相对应的孔中，反应1-6小时，吸去反应液，采用30-100％甲醇溶液和为5-200mM磷酸缓冲盐溶液一次清洗孔板；加入0.01-1μg胰蛋白酶酶解，其用量大约为所捕获蛋白质量的1％-5％，通过紫外(50-2000mW)或微波(50-2000mW)进行辅助酶解2-15min；吸取上清液进行LC-MS分析。
本发明将蛋白质样品预处理过程集成在孔板中进行，可同时处理24-384个样品，大大提高了样品预处理的通量。此外，在提取过程中使用细胞裂解酶(如溶菌酶、酵母溶壁)和强提取溶剂(如SDS、离子液体)大大提高微生物蛋白质的提取效率；在酶解过程中利用微波或紫外辅助，大大缩短了酶解时间，降低了酶自降解带来的污染问题。整个过程操作简便、低成本、通量高。此外，该预处理装置制备的肽段样品与分离鉴定平台具有很好的兼容性，在蛋白组研究中具有较好的实用性。
本发明具有如下优点：
1、采用多巴胺对普通孔板的内被进行修饰，可以修饰上氨基，为进一步修饰其他功能基团奠定了基础，该制备过程容易控制，重复性好；
2、采用PEI对孔板内壁的多巴胺图层进行改性，不仅提高孔板内壁的氨基键合量，为下一步反应提供了充足的活性位点，而且大大改善了孔板内壁的亲水性，降低了非特异性吸附；
3、采用碘乙酸-N-琥珀酰胺酯修饰PEI的氨基基团，制备的蛋白质固相烷基化孔板内壁，可以实现微量组织或细胞中蛋白质原位预处理(包括烷基化固定、表面活性剂和盐类干扰物的去除、酶解)。
附图说明
图1、蛋白质固相烷基化孔板Ⅱ的合成示意图；
图2、蛋白质固相烷基化孔板的酶解细菌蛋白的LC-MS效果图；
图3、蛋白质固相烷基化孔板的酶解细胞样品的LC-MS效果图；
具体实施方式
实施例1
该基于孔板的高通量蛋白质样品预处理方法，需顺序使用预处理孔板Ⅰ和预处理孔板Ⅱ。具体步骤如下(流程图如图1所示)：
采用低吸附的96孔板为预处理孔板Ⅰ(Corning.7007)；采用为普通平底96孔板为预处理孔板Ⅱ。
对预处理孔板Ⅱ采用如下处理方法：先以多巴胺对96孔板的孔内壁进行氨基(NH2)修饰，再通过共价键合方式依次修饰上树枝状亲水性化合物聚乙烯亚胺(PEI)和碘乙酸-N-琥珀酰胺酯，制备成固相烷基化试剂修饰的96孔板。具体过程如下：a)预处理孔板Ⅱ的多巴胺修饰。使用10mM Tris-HCl(pH 8.5)配置10mg/ml多巴胺溶液,向96孔板中每孔加入100μL，室温反应12小时。b)预处理孔板Ⅱ的PEI修饰。使用50mM磷酸盐缓冲液(pH 8.0)配置10％戊二醛溶液(V/V)，加入100微升至96孔板中，30摄氏度下反应3小时。吸去反应液后，用50mM磷酸盐缓冲液(pH 8.0)清洗。使用50mM磷酸盐缓冲液(pH 8.0)配置10mg/mL的PEI的溶液，加入氰基硼氢化钠使终浓度为10mg/mL，向96孔板中每孔加入100μL，30摄氏度下反应3小时。c)预处理孔板Ⅱ的碘乙酸-N-琥珀酰胺酯修饰。使用50％的甲醇-50mM磷酸盐缓冲液(pH 8.0)配置1mg/mL的碘乙酸-N-琥珀酰胺酯溶液，向96孔板中每孔加入100μL，30摄氏度，避光反应8小时。该方法制备的预处理孔板可以进行高通量蛋白质组学样品制备。
实施例2
该基于孔板的高通量蛋白质样品预处理方法，需顺序使用的预处理孔板Ⅰ和预处理孔板Ⅱ。具体步骤如下：
采用低吸附的96孔板为预处理孔板Ⅰ(芯硅谷D3820-07-5EA)；采用为普通平底96孔板为预处理孔板Ⅱ。
对预处理孔板Ⅱ采用如下处理方法：先以多巴胺对96孔板的孔内壁进行氨基(NH2)修饰，再通过共价键合方式依次修饰上树枝状亲水性化合物聚乙烯亚胺(PEI)和碘乙酸-N-琥珀酰胺酯，制备成固相烷基化试剂修饰的96孔板。具体过程如下：a)预处理孔板Ⅱ的多巴胺修饰。使用10mM磷酸盐缓冲液(pH 8.5)配置5mg/ml多巴胺溶液,向96孔板中每孔加入150μL，37摄氏度反应6小时。b)预处理孔板Ⅱ的PEI修饰。使用10mM磷酸盐缓冲液(pH8.5)配置5％戊二醛溶液(V/V)，加入150微升至96孔板中，37摄氏度下反应1小时。吸取反应液后，用10mM磷酸盐缓冲液(pH 8.5)清洗。使用10mM磷酸盐缓冲液(pH 8.0)配置5mg/mL的PEI的溶液，加入氰基硼氢化钠使终浓度为10mg/mL，向96孔板中每孔加入150μL，37摄氏度下反应1小时。c)预处理孔板Ⅱ的碘乙酸-N-琥珀酰胺酯修饰。使用80％的甲醇-10mM磷酸盐缓冲液(pH 8.0)配置2mg/mL的碘乙酸-N-琥珀酰胺酯溶液，向96孔板中每孔加入150μL，37摄氏度，避光反应5小时。该方法制备的预处理孔板可以进行高通量蛋白质组学样品制备。
实施例3
该基于孔板的高通量蛋白质样品预处理方法，需顺序使用的预处理孔板Ⅰ和预处理孔板Ⅱ。其特征是具体步骤如下：
采用低吸附的96孔板为预处理孔板Ⅰ；采用为普通平底96孔板为预处理孔板Ⅱ。
对预处理孔板Ⅱ采用如下处理方法：先以多巴胺对96孔板的孔内壁进行氨基(NH2)修饰，再通过共价键合方式依次修饰上树枝状亲水性化合物聚乙烯亚胺(PEI)和碘乙酸-N-琥珀酰胺酯，制备成固相烷基化试剂修饰的96孔板。具体过程如下：a)预处理孔板Ⅱ的多巴胺修饰。使用100mM磷酸盐缓冲液(pH 8.5)配置2mg/ml多巴胺溶液,向96孔板中每孔加入70μL，50摄氏度反应1小时。b)预处理孔板Ⅱ的PEI修饰。使用100mM磷酸盐缓冲液(pH8.5)配置3％戊二醛溶液(V/V)，加入70微升至96孔板中，50摄氏度下反应1小时。吸去反应液后，用100mM磷酸盐缓冲液(pH 8.5)清洗。使用100mM磷酸盐缓冲液(pH 8.0)配置10mg/mL的PEI的溶液，加入氰基硼氢化钠使终浓度为5mg/mL，向96孔板中每孔加入70μL，50摄氏度下反应1小时。c)预处理孔板Ⅱ的碘乙酸-N-琥珀酰胺酯修饰。使用90％的甲醇-10mM磷酸盐缓冲液(pH 8.0)配置0.5mg/mL的碘乙酸-N-琥珀酰胺酯溶液，向96孔板中每孔加入70μL，50摄氏度，避光反应2小时。该方法制备的预处理孔板可以进行高通量蛋白质组学样品制备。
实施例4
将1mg E.coli细菌样品加入到预处理孔板Ⅰ(Corning.7007)，加入终浓度为10ug-1000ug/ml溶菌酶,冰上孵育20-60min。之后再加SDS溶液使终浓度为2％，90摄氏度变性10分钟，然后向样品中加入TCEP使终浓度为25mM，使总反应体积为150uL。56℃反应0.5h。从预处理孔板Ⅰ的每个样品孔中吸取100ul，加入实施例1制备的预处理孔板Ⅱ中相对应的孔中，避光反应2小时，吸去反应液，采用甲醇溶液和磷酸缓冲盐溶液清洗孔板各2次；加入胰蛋白酶0.5微克进行酶解，在紫外条件(1000mW)下酶解3分钟；吸取上清液进行LC-MS分析(LC-MS谱图如图2所示)。样品经质谱分析可鉴定918个蛋白质，约占所有大肠杆菌总蛋白质的30％。同等条件下，用未经任何任何处理的孔板替换预处理孔板Ⅱ，仅能鉴定到45个蛋白质。
实施例5
将1mg酵母样品加入到预处理孔板Ⅰ(芯硅谷D3820-07-5EA)，加入终浓度为50mM的酵母溶壁酶，处理2小时，再加SDS溶液使终浓度为4％。90摄氏度变性10分钟，然后向样品中加入TCEP使终浓度为10mM，使总反应体积为150uL，56℃反应1.5h。从预处理孔板Ⅰ的每个样品孔中吸取100uL蛋白质样品加入实施例2制备的预处理孔板Ⅱ中相对应的孔中，避光反应1.5小时，吸去反应液，采用甲醇溶液和磷酸缓冲盐溶液清洗孔板各2次；加入胰蛋白酶0.2微克进行酶解，在微波辅助(850mW)条件下酶解5分钟；吸取上清液进行LC-MS分析。样品经质谱分析可鉴定1546个蛋白质，约占所有大肠杆菌总蛋白质的50％。同等条件下，用未经任何任何处理的孔板替换预处理孔板Ⅱ，仅能鉴定到67个蛋白质。
实施例6
将哺乳动物细胞100ug样品加入到预处理孔板Ⅰ(芯硅谷D3820-07-5EA)，加SDS溶液使终浓度为4％。90摄氏度变性5分钟，然后向样品中加入TCEP使终浓度为10mM，使总反应体积为150uL，56℃反应2h。从预处理孔板Ⅰ的每个样品孔中吸取蛋白质溶液100ul加入实施例3制备的预处理孔板Ⅱ中相对应的孔中，避光反应3小时，吸去反应液，采用甲醇溶液和磷酸缓冲盐溶液清洗孔板各3次；加入胰蛋白酶0.1微克进行酶解，在微波辅助(1300mW)条件下酶解5分钟；吸取上清液进行LC-MS分析(LC-MS谱图如图3所示)。样品经质谱分析可鉴定2015个蛋白质。同等条件下，用未经任何任何处理的孔板替换预处理孔板Ⅱ，仅能鉴定到110个蛋白质。
Claims (8)
1.一种基于孔板的高通量蛋白质样品预处理方法，其特征在于：所述孔板包括：顺序使用的预处理孔板Ⅰ和预处理孔板Ⅱ；具体步骤如下：
1）生物样品首先加入预处理孔板Ⅰ中，进行蛋白质提取，变性和还原处理；
2）然后再将样品溶液转移到预处理孔板Ⅱ中进行烷基化捕获蛋白质、除盐以及酶解处理；
所述预处理孔板Ⅱ是先以多巴胺对孔板的孔内壁进行氨基修饰，再通过共价键合方式依次修饰上树枝状亲水性化合物聚乙烯亚胺和碘乙酸-N-琥珀酰胺酯，制备成固相烷基化试剂修饰的孔板；
采用多巴胺对普通孔板内壁进行氨基修饰时，仅需配置多巴胺溶液，将多巴胺溶液加到孔板内，反应1-12小时；其中，多巴胺的浓度5-50mg/mL； 所用溶剂为5-50mM的Tris-HCl溶液或磷酸缓冲溶液度，pH值为6-9；加入体积为50-200微升；反应温度为15-50摄氏度；
通过共价键合的方式，先通过戊二醛将PEI修饰于孔板的内壁，再加入碘乙酸-N-琥珀酰胺酯，实现固相烷基化试剂修饰；
反应过程为：
A. 加入戊二醛溶液，反应1-12小时；其中，戊二醛的浓度1-20% （V/V）；
B.加入PEI溶液，反应反应1-12小时；其中，PEI的终浓度范围为1-100mg/mL；所用溶剂为5-50mM的Tris-HCl溶液或磷酸缓冲溶液度，pH值为6-9；加入体积为50-200微升；反应温度为15-50摄氏度；
C. 加入碘乙酸-N-琥珀酰胺酯溶液，避光反应1-8小时；其中，碘乙酸-N-琥珀酰胺酯的浓度为0.1-5 mg/mL；所用溶剂为甲醇和缓冲溶液混合体系，所用缓冲溶剂为5-50mM的Tris-HCl溶液或磷酸缓冲溶液度，pH值为6-9；甲醇与缓冲溶液体积比为1/1-9/1；反应温度为15-50摄氏度。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述预处理孔板Ⅰ为低吸附的孔板；
酶解产生的肽段可以进行质谱检测。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述孔板为具有6个以上样品处理孔的孔板。
4.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
预处理孔板Ⅰ采用96孔板，所述预处理孔板Ⅰ为Corning.7007或芯硅谷 D3820-07-5EA；
生物样品于预处理孔板Ⅰ中处理后，从预处理孔板Ⅰ的每个样品孔中吸取蛋白质样品加入预处理孔板Ⅱ中相对应的孔中；
预处理孔板Ⅱ采用96孔板，所述预处理孔板Ⅱ为普通平底96孔板。
5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述预处理是将生物样品进行蛋白质提取、变性、还原、除盐以及蛋白质酶解处理；具体过程如下：
1）将细胞样品加入到预处理孔板Ⅰ，加入裂解酶处理0.5-6小时，再加入强提取溶剂提取蛋白质样品，80-100度变性1-10分钟，然后向样品中加入TCEP后，37-65℃反应0.1-1.5h，在变性和还原同时作用下，蛋白质二级结构被彻底破坏，二硫键断裂；
2）从预处理孔板Ⅰ的每个样品孔中吸取蛋白质样品加入预处理孔板Ⅱ中相对应的孔中，反应1-6小时，吸去反应液，采用甲醇溶液和磷酸缓冲盐溶液一次清洗孔板；加入胰蛋白酶酶解，通过紫外或微波进行辅助酶解；吸取上清液进行LC-MS分析；
其中，裂解酶的浓度范围1-1000mM；
所用强提取溶剂，如SDS的终浓度范围0.01-5%，离子液体1-十二烷基-3-甲基咪唑氯盐终浓度范围0.5-15%，尿素的终浓度范围2-10M；
TCEP的终浓度为1-100µM；
采用的甲醇溶液体积浓度为30-100%，磷酸缓冲溶液的浓度为5-200 mM，胰蛋白酶加入量为所捕获蛋白质量的1%-5%。
6.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述生物样品为细菌、细胞、组织或体液样品中的一种或二种以上。
7.按照权利要求3所述的方法，其特征在于：所述孔板为具有24-384个样品处理孔的孔板。
8.按照权利要求5所述的方法，其特征在于：所述裂解酶为溶菌酶、酵母溶壁酶中的一种或二种以上；
所述强提取溶剂为十二烷基苯磺酸钠、3-[(3-氯氨基丙基)二甲基铵基] -1-丙烷磺酸盐、离子液体中的一种或二种以上；
所述尿素的终浓度范围为6-8M。
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