CN106841443B - 一种测定左卡尼汀注射液含量及杂质的方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种亲水作用色谱测定左卡尼汀注射液含量及杂质的方法，并进行了方法学验证，结果表明该方法分离度高，测定结果准确，可用于左卡尼汀注射液的有关物质控制，为左卡尼汀注射液质量标准的提高提供了参考；同时，本发明的方法可用于左卡尼汀注射液含量及杂质的测定。

Description

一种测定左卡尼汀注射液含量及杂质的方法及其用途

技术领域

本专利涉及一种测定左卡尼汀注射液含量及杂质的方法，具体为一种亲水作用色谱测定左卡尼汀注射液含量及杂质的方法，属于药物分析领域。

背景技术

左卡尼汀，化学名称为(R)-3-羧基-2-羟基-N,N,N-三甲基-1-丙胺氢氧化物，是哺乳动物能量代谢中必需的体内天然物质，其主要功能是协助细胞进行脂质代谢并产生能量。

E-4-(三甲基铵基)丁-2-烯酸乙酯(简称杂质A)是左卡尼汀中主要的杂质及降解产物，其结构中含有共轭结构，响应值远远大于左卡尼汀，需要对其进行单独定量。

左卡尼汀及其杂质A的结构式如下，

左卡尼汀注射液在临床上应用广泛，是治疗心力衰竭的首选药物，适用于慢性肾衰长期血透病人因继发性肉碱缺乏产生的一系列并发症状。目前已被美国药典、欧洲药典和我国国家药品标准收载。由于左卡尼汀和左卡尼汀杂质A结构类似，不易分离，在国家药品质量标准中未对左卡尼汀原料和制剂中左卡尼汀杂质A进行检测。欧洲药典所选用的色谱柱为丙胺基甲基硅烷键合硅胶柱，在国内尚未找到相应的色谱柱，且该标准对左卡尼汀与其杂质A的分离度限度要求(≥0.9)较低。美国药典选用色谱柱为氨基键合相色谱柱，方法中样品分析前对色谱柱进行长达3h柱平衡的需求过于严苛，容易造成柱流失导致保留时间漂移、理论塔板数降低，该法柱寿命较短，分离度限度要求(≥1.0)也较低。

因此，有必要开发一种左卡尼汀含量及其杂质A测定的新方法，以提高药品的质量标准和安全性，为该品种的研发及质量标准的建立提供参考。

发明内容

为解决现有技术中的不足，本发明提出了一种亲水作用色谱测定左卡尼汀注射液含量及杂质的方法，并进行了方法学验证，结果表明该方法分离度高，测定结果准确，可用于左卡尼汀注射液的有关物质控制，为左卡尼汀注射液质量标准的提高提供了参考；同时，本发明的方法可用于左卡尼汀注射液含量及杂质的测定。

具体技术方案如下，

一种亲水作用色谱测定左卡尼汀注射液含量及杂质的方法，包括以下步骤，

(1)色谱条件：

色谱柱为Waters XBridge Amide(250mm×4.60mm，3.5μm)，

检测波长为205nm，

柱温为30～40℃，

流动相为有机相-水相，其中，所述水相为pH值为5.0的10mM乙酸铵缓冲液，所述有机相为乙腈，所述有机相与水相的体积比为80:20～85:15，所述流动相的流速为1.2mL/min，

进样量10μL，

检测器为紫外检测器；

(2)样品测定：

精密吸取左卡尼汀注射液适量，加所述流动相稀释制成1mL含左卡尼汀2mg的溶液，即得供试品溶液；

取左卡尼汀对照品适量，精密称定，加所述流动相溶解稀释制成浓度为2mg/mL的溶液，即得左卡尼汀对照溶液；

取左卡尼汀杂质A对照品适量，精密称定，加所述流动相溶解稀释制成浓度为206μg/mL的溶液，即得杂质A对照储备溶液；

取左卡尼汀对照溶液、杂质A对照储备溶液、供试品溶液，分别注入高效液相色谱仪，按所述色谱条件进样分析，记录色谱图，然后采用外标法计算左卡尼汀注射液中左卡尼汀及其杂质A的含量；其中，所述杂质A为E-4-(三甲基铵基)丁-2-烯酸乙酯。

优选，所述色谱条件中所述有机相与水相的体积比为85:15，此时左卡尼汀及其杂质A的分离度最优，为3.598，但保留时间较长。

优选，所述色谱条件中柱温为40℃，柱温较高时左卡尼汀及其杂质A具有良好的分离度。

优选，所述流动相平衡前，使用5倍柱体积不含盐的流动相进行平衡，防止盐在色谱柱及系统中析出。

上述方法可用于左卡尼汀注射液含量及杂质测定的用途，具体为用于左卡尼汀注射液含量及杂质A测定的用途。

亲水作用色谱(Hydrophilic interaction liquid chromatography,HILIC)是用来分离极性、亲水性物质的一种高选择性的液相色谱分离方式。本发明选用的色谱柱为XBridge Amide色谱柱，使用了化学稳定的、三键键合式的酰胺官能团，其选择性与氨基柱相近，且基于BEH(亚乙基桥杂化颗粒)技术，色谱柱耐受性更强(pH2-11)，相对于氨基键合相的稳定性更高(柱流失减少)。左卡尼汀属于氨基酸衍生物，其分子内含有季铵结构，同时也有内盐结构，亲水。故本发明的创新在于采用亲水作用色谱建立左卡尼汀含量及其杂质A的测定方法，同时也提供了该方法的用途。

有益效果，

本研究选定的方法和色谱条件使左卡尼汀与杂质A的分离度大于2.0，达到了完全分离的要求。

相比现有技术，本发明提出的左卡尼汀注射液含量及杂质A测定方法的专属性、精密度、线性与范围、准确度均符合要求，能够准确地测定左卡尼汀注射液含量及杂质A。该方法克服了国外药典中色谱柱不易得、左卡尼汀与杂质A分离度不好等问题，可为左卡尼汀注射液质量控制和质量标准的建立提供可靠手段。

附图说明

图1为左卡尼汀及杂质A混合对照溶液图谱；

其中1为左卡尼汀，2为杂质A。

具体实施方式

以下实施例有助于对本发明的进一步了解，但本发明并非限于这些内容。

一种亲水作用色谱测定左卡尼汀注射液含量及杂质的方法。

1材料准备

岛津LC-20A高效液相色谱仪系统(包括LC-20AT泵；DGU-20A脱气机；SIL-20A自动进样器；CTO-10ASvp柱温箱；SPD-20A紫外检测器；Lab solution色谱工作站)；WatersXBridge Amide色谱柱(4.6mm×250mm，3.5μm)；万分之一电子天平(AR1140，OhausCorp.Brook，NJ，USA)；十万分之一电子天平(MS105Du型，METTLER TOLEDO)；电子pH计(pHMeter PHS-3C，上海精科实业有限公司)；超声波清洗器(SK250HP，无锡建仪实验器材有限公司)。

左卡尼汀对照品由中国食品药品检定研究院提供，批号：101041-201503；左卡尼汀杂质A对照品由欧洲药品质量管理局提供，批号：003K19；左卡尼汀注射液：东北制药集团沈阳第一制药有限公司，批号：8150407、8150527，规格：5mL:1g；乙腈为色谱纯，冰醋酸、乙酸铵为分析纯，水为哇哈哈纯净水。

2具体步骤及方法学验证

2.1溶液的制备

左卡尼汀对照溶液：取左卡尼汀对照品适量，精密称定，加流动相溶解稀释制成浓度为2mg/mL的溶液，即得。

杂质A对照储备溶液：取左卡尼汀杂质A对照品适量，精密称定，加流动相溶解稀释制成浓度为206μg/mL的溶液，即得。

供试品溶液：精密吸取左卡尼汀注射液适量，加流动相稀释制成每1mL约含左卡尼汀2mg的溶液，即得。

系统适用性试验溶液：取左卡尼汀对照品和左卡尼汀杂质A对照品适量，用流动相溶解并制成每1mL约含左卡尼汀2mg和左卡尼汀杂质A0.01mg的混合溶液，即得。

2.2色谱条件

色谱柱为Waters XBridge Amide(250mm×4.60mm，3.5μm)，柱温40℃，流动相为10mM乙酸铵缓冲液(pH5.0)-乙腈(15:85)，流速1.2mL/min，检测波长205nm，进样量10μL。

取“2.2”项下左卡尼汀原料药供试品在紫外可见分光光度计扫描波长，由吸收谱图可知其在短波长处有吸收峰，为排除溶剂峰的影响，采用205nm为检测波长。

缓冲液-乙腈(20:80)和(15:85)均可为流动相，其中，缓冲液为10mM 乙酸铵缓冲液(pH5.0)，左卡尼汀和杂质A有良好的分离度，杂质A不影响左卡尼汀含量的测定；本例中采用有机相与水相(缓冲液-乙腈)的体积比为85:15，此时左卡尼汀及其杂质A的分离度为3.598，具有更明显的分离效果。但是从节约时间及减少流动相的使用角度出发，也可以采用缓冲液-乙腈(20:80)为流动相进行含量测定。

提高柱温能使左卡尼汀与杂质A的分离度增大，保留时间也有所减小，为了能更好的对左卡尼汀进行定量测定，节约时间以及流动相，所以采用色谱柱柱温为40℃进行测定。

2.3系统适用性

精密吸取左卡尼汀及杂质A混合对照溶液，按“2.2”项下条件进样分析，结果见图1。理论塔板数以左卡尼汀峰计算不小于10000，左卡尼汀与杂质A分离度为3.598，分离度良好。

2.4线性关系考察

分别精密吸取左卡尼汀及杂质A的对照品储备液，加流动相制成不同浓度的系列对照品溶液，精密吸取10μL注入高效液相色谱仪，以各自的峰面积A对其浓度C进行线性回归，左卡尼汀回归方程为y＝429735x+6869，r＝0.99表明左卡尼汀在0.53～3.16mg/mL范围内线性关系良好。杂质A回归方程y＝22655x-3519，r＝1.0，表明杂质A在2.06～82.4μg/mL范围内线性关系良好。

2.5检测限与定量限

将“2.4”项下左卡尼汀及杂质A对照品最低浓度点用流动相逐步稀释成不同浓度，注入液相色谱仪，分别以信噪比3:1和10:1为标准测定各成分的检测限和定量限。得左卡尼汀检测限1.70μg/mL、定量限5.20μg/mL；杂质A检测限40.8ng/mL、定量限81.6ng/mL。

2.6精密度

分别精密吸取左卡尼汀及杂质A对照品溶液，按“2.2”项下条件连续进样6次，进行精密度试验。结果左卡尼汀峰面积的RSD(n＝6)为0.12％，杂质A峰面积的RSD(n＝6)为0.55％，表明仪器的精密度良好。

2.7重复性

精密量取左卡尼汀注射液(批号8150527)适量，加流动相稀释制成每1mL 中约含左卡尼汀2mg的溶液，平行制备6份。按“2.2”项下条件进样分析，记录色谱图，6个样品左卡尼汀及其杂质A测定结果的RSD分别为0.68％，RSD为1.20％，结果表明本方法重复性良好。

2.8稳定性

取“2.7”项下的供试品溶液，室温放置，按“2.2”项下色谱条件于0、2、4、6、8h进样测定，结果左卡尼汀峰面积的RSD为0.42％。表明供试品溶液在8h内稳定。

2.9加样回收率

2.9.1左卡尼汀加样回收率

在一定量的已知含量的样品中，按80％、100％、120％浓度水平分别精密加入左卡尼汀0.8，1.0，1.2mL各三份，加流动相稀释定容，摇匀，作为供试品溶液。取“2.4”项下2.11mg/mL左卡尼汀对照品作为对照品溶液。精密吸取供试品溶液和对照品溶液按“2.2”项下色谱条件进样测定，按外标法以峰面积计算，左卡尼汀平均回收率为100.2％(n＝9)，RSD＝0.69％，结果见表1，说明该方法准确度良好。

表1左卡尼汀加样回收率结果

2.9.2杂质A加样回收率

在一定量的已知杂质A含量的样品中，按80％、100％、120％浓度水平分别精密加入左卡尼汀杂质A对照品储备溶液0.8，1.0，1.2mL各三份，加流动相稀释定容，摇匀，作为供试品溶液。取“2.4”项下41.2μg/mL杂质A对照品溶液作为对照品溶液。精密吸取供试品溶液和对照品溶液按“2.2”项下色谱条件进样测定，按外标法以峰面积计算，杂质A平均回收率为101.0％(n＝9)，RSD为0.72％，结果见表2，说明该方法准确度良好。

表2杂质A加样回收率结果

2.10样品测定

精密吸取左卡尼汀注射液2个批次样品，每个批号平行制备三份，按“2.1”项下方法制备供试品溶液与对照品溶液，取左卡尼汀对照溶液、杂质A对照储备溶液、供试品溶液，分别注入高效液相色谱仪，按所述色谱条件进样分析，记录色谱图，然后采用外标法计算左卡尼汀注射液中左卡尼汀及其杂质A的含量，结果见表3。

表3样品测定数据

在例中所用流动相中含缓冲盐，为防止盐在色谱柱及系统中析出，在流动相平衡前，需使用5倍柱体积不含盐的流动相进行平衡。有机相与水相的比例是物质保留及有效分离的关键。同时提高柱温可明显提高分离度。本例中，左卡尼汀及杂质A的分离度可达3.0以上，而在美国药典中，两者所规定的分离度为1.0。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种等同变换，这些等同变换均属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种亲水作用色谱测定左卡尼汀注射液含量及杂质的方法，其特征在于包括以下步骤，

(1)色谱条件：

色谱柱为Waters XBridge Amide，规格：250mm×4.60mm、3.5μm，检测波长为205nm，

柱温为30～40℃，

流动相为有机相-水相，其中，所述水相为pH值为5.0的10mM乙酸铵缓冲液，所述有机相为乙腈，所述有机相与水相的体积比为80:20～85:15，所述流动相的流速为1.2mL/min，

进样量10μL，

检测器为紫外检测器；

(2)样品测定：

精密吸取左卡尼汀注射液适量，加所述流动相稀释制成1mL含左卡尼汀2mg的溶液，即得供试品溶液；

取左卡尼汀对照品适量，精密称定，加所述流动相溶解稀释制成浓度为2mg/mL的溶液，即得左卡尼汀对照溶液；

取左卡尼汀杂质A对照品适量，精密称定，加所述流动相溶解稀释制成浓度为206μg/mL的溶液，即得杂质A对照储备溶液；

取左卡尼汀对照溶液、杂质A对照储备溶液、供试品溶液，分别注入高效液相色谱仪，按所述色谱条件进样分析，记录色谱图，然后采用外标法计算左卡尼汀注射液中左卡尼汀及其杂质A的含量；

其中，所述杂质A为E-4-(三甲基铵基)丁-2-烯酸乙酯。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述色谱条件中所述有机相与水相的体积比为85:15。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述色谱条件中柱温为40℃。

4.根据任一权利要求1-3所述的方法，其特征在于所述流动相平衡前，使用5倍柱体积不含盐的流动相进行平衡。

5.根据权利要求4所述的方法的用途，其特征在于上述方法可用于左卡尼汀注射液含量及杂质测定的用途。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于用于左卡尼汀注射液含量及杂质E-4-(三甲基铵基)丁-2-烯酸乙酯测定的用途。