CN106811457B - 一种分离噬菌体用载体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种分离噬菌体用载体，包括陶瓷类载体和负载在所述陶瓷类载体上的副溶血性弧菌。采用本发明的分离噬菌体用的载体能够快速分离海水、淡水和污水中副溶血性弧菌的噬菌体，分离效率达到80％。经鉴定分离到的噬菌体为副溶血弧菌噬菌体。

Description

一种分离噬菌体用载体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于病毒分离技术领域，尤其涉及一种分离噬菌体用载体及其制备方法和应用。

背景技术

近年来，由于水产养殖业的大密度养殖以及抗生素的广泛使用，导致大量耐药菌株出现，噬菌体作为一种更有效的治疗手段，正越来越受到关注。因此，快速噬菌体分离是开展噬菌体治疗研究首要的一步。噬菌体广泛存在于自然环境中，凡是有细菌的场所，就可能有相应噬菌体的存在。如在人和动物的排泄物或污染的井水、河水中，就常有肠道菌的噬菌体。噬菌体也广泛存在于海洋环境中，海洋中的细菌、蓝细菌及真核微生物都发现有其相应的噬菌体存在。

目前噬菌体的分离纯化方法为直接法、间接法和诱导法，直接法指直接从宿主菌生活的生物体上取样寻找噬菌体。间接法指根据对象菌的特性，从相应的非生物环境中采集样品寻找噬菌体，如对消化道致病菌，通常从人和动物的排泄物或者生活污水中釆样；水产致病菌，通常从养殖废水或自然水域中分离。诱导法指利用对象菌感染相应的生物，并取样寻找噬菌体，与直接法类似，所不同的是有诱导这一步骤。诱导法的可行性在于对象菌可以从患病生物中分离，能够更容易找到噬菌体。但是采用传统的噬菌体分离方法，在噬菌体含量低于10²/m³的污水、底泥、海水中等分离噬菌体的成功率很低。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术的不足，而提供一种分离噬菌体用载体的制备方法，能够提高噬菌体分离的成功率。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一种分离噬菌体用载体，包括陶瓷类载体和负载在所述陶瓷类载体上的副溶血性弧菌。

本发明提供了上述技术方案所述的分离噬菌体用载体的制备方法，包括以下步骤：

1)将副溶血性弧菌接种于宿主菌培养基中培养，得到宿主菌培养液；

2)将陶瓷类载体浸没于所述步骤1)得到的宿主菌培养液中，将浸泡后的陶瓷类载体干燥至含水率为45～55％，得到分离噬菌体用载体。

优选的，所述步骤1)得到的宿主菌培养液中副溶血性弧菌的含量为10⁸～10¹²cfu/ml。

优选的，所述步骤2)得到的陶瓷类载体上副溶血性弧菌的含菌量为10¹⁰～10¹⁶cfu/g。

优选的，所述陶瓷类载体的孔隙率大于92％，所述陶瓷类载体的最大比表面积为350～450m²/m³。

优选的，所述步骤2)中浸泡时，载体的质量与宿主菌培养液的体积比为(0.5～1.5)g:(0.5～1.5)ml。

优选的，所述步骤1)中培养的条件包括：所述培养的温度为28～35℃，所述培养的转速为150～200rpm，所述培养的时间为14～24h。

本发明还提供了上述技术方案制备得到的载体在分离水体中噬菌体的应用，包括：将上述技术方案制备得到的分离噬菌体用载体放入水体中3～7h，分离得到噬菌体。

优选的，所述分离噬菌体用载体放入水体中的深度≤0.5～1.5m。

优选的，所述分离噬菌体用载体放入水体中被取回后还包括：

将载体取回后再次放入宿主菌培养液中，得到噬菌体富集液；

将所述宿主菌培养液涂布于LB或NB平板上，再将所述噬菌体富集液滴于所述平板上，培养14～24h，得出分离结果。

本发明提供了一种分离噬菌体用载体，包括陶瓷类载体和负载在所述陶瓷类载体上的副溶血性弧菌。本发明利用载体可以附着大量副溶血弧菌的原理，通过水流的不断流动，与载体的巨大的比表面积接触，大大增加了宿主菌与噬菌体相遇并吸附的几率，从而捕获噬菌体。采用本发明的分离噬菌体用的载体能够快速分离海水、淡水和污水中副溶血性弧菌的噬菌体，分离的效率达到80％。经鉴定分离到的噬菌体为副溶血弧菌噬菌体。

具体实施方式

本发明提供了一种分离噬菌体用载体，包括陶瓷类载体和负载在所述陶瓷类载体上的副溶血性弧菌。在本发明中，所述陶瓷类载体的孔隙率优选大于92％，更优选93～97％，最优选为95％；所述陶瓷类载体的最大比表面积优选为350～450m²/m³，更优选为375～425m²/m³，最优选为400m²/m³。在本发明实施例中，所述陶瓷类载体的来源为市售产品，如昆山恒润净水设备有限公司生产的型号为3-5的陶瓷类载体。

在本发明中，所述分离噬菌体用载体上副溶血性弧菌的含量优选为10¹⁰～10¹⁶cfu/g，更优选为10¹²～10¹⁴cfu/g，最优选为10¹⁵cfu/g。

本发明还提供了上述技术方案所述的分离噬菌体用载体的制备方法，包括以下步骤：

1)将副溶血性弧菌接种于宿主菌培养基中培养，得到宿主菌培养液；

2)将陶瓷类载体浸没于所述步骤1)得到的宿主菌培养液中，将浸泡后的陶瓷类载体干燥至含水率为45～55％，得到分离噬菌体用载体。

本发明将副溶血性弧菌接种于宿主菌培养基中培养，得到宿主菌培养液。在本发明中，所述宿主菌培养基优选包括以下含量的组分：牛肉膏1～8g/L、蛋白胨5～15g/L、氯化钠15～55g/L、余量为水或酵母浸膏1～8g/L、胰蛋白胨5～15g/L、氯化钠20～60g/L、余量为水；更优选包括牛肉膏3～6g/L、蛋白胨8～12g/L、氯化钠20～50g/L、余量为水或酵母浸膏3～6g/L、胰蛋白胨8～12g/L、氯化钠25～55g/L、余量为水；最优选包括牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠25～45g/L、余量为水或酵母浸膏5g/L、胰蛋白胨10g/L、氯化钠30～50g/L、余量为水。

在本发明中，对所述宿主菌培养基在使用前优选进行灭菌，本发明对所述灭菌的方法没有特殊限定，在实施例中可具体为115～121℃灭菌15～30min。

将所述副溶血性弧菌接种于宿主菌培养基中培养，本发明对所述副溶血性弧菌的接种方法和接种量没有特殊限定，采用本领域技术人员常规使用的接种方法和接种量即可。

在本发明中，所述副溶血性弧菌在宿主菌培养基中培养优选在振荡条件下培养，所述培养的条件包括：所述所述培养的温度优选为28～35℃，，更优选为30～34℃，最优选为31～33℃；所述培养的转速优选为150～200rpm，更优选为160～190rpm，最优选为170～180rpm；所述培养的时间优选为14～24h，更优选为16～22h，最优选为18～20h。

在本发明中，所述培养完成后，所述宿主菌培养液中副溶血性弧菌的含菌量优选为10⁸～10¹²cfu/ml，更优选为10¹⁰～10¹¹cfu/ml。

得到宿主菌培养液，本发明将陶瓷类载体浸没于所述步骤1)得到的宿主菌培养液中浸泡。在本发明中，所述陶瓷类载体的孔隙率优选大于92％，更优选93～97％，最优选为95％；所述陶瓷类载体的最大比表面积优选为350～450m²/m³，更优选为375～425m²/m³，最优选为400m²/m³。在本发明实施例中，所述陶瓷类载体的来源为市售产品，如昆山恒润净水设备有限公司生产的型号为3-5的陶瓷类载体。

在本发明中，所述陶瓷类载体的质量与所述宿主菌培养液的体积比优选为(0.5～1.5)g:(0.5～1.5)ml，更优选为(0.8～1.2)g:(0.8～1.2)ml，最优选为1g:1ml。

在本发明中，所述陶瓷类载体在宿主菌培养液中浸泡的时间优选为0.5～3h，更优选为1～2.5h，最优选为1.5～2h。

所述浸泡后，本发明将得到的陶瓷类载体干燥至含水率为45～55％，得到分离噬菌体用载体。在本发明中，所述含水率优选为45～55％，更优选为48～52％，最优选为50％。

本发明优选重复上述技术方案所述浸泡和干燥步骤1～5次，更优选为2～4次，最优选为3次，得到分离噬菌体用载体。

在本发明中，所述浸泡和干燥后，得到分离噬菌体用载体，所述分离噬菌体用载体上副溶血性弧菌的含量优选为10¹⁰～10¹⁶cfu/ml，更优选为10¹²～10¹⁴cfu/ml，最优选为10¹⁵cfu/ml。

在本发明中，所述分离噬菌体用载体在使用前优选用20～60目纱网进行紧密包裹后，再放入水体中。所述纱网的粒度优选为30～50目，更优选为40目。

本发明还提供了上述技术方案制备得到的载体在分离水体中噬菌体的应用，具体为将制备得到的分离噬菌体用载体放入水体中3～7h，分离得到噬菌体，所述放入水中的时间优选为4～6h，最优选为5h。

在本发明实施例中，所述水体的种类优选为海水、淡水或污水。

在本发明中，所述分离噬菌体用载体放入水体中的深度优选为≤0.5～1.5m，更优选为≤0.8～1.2m，最优选为≤1m。

本发明将所述分离优选包括：

将所述载体取回再次放入宿主菌培养液中，得到噬菌体富集液；将所述宿主菌培养液涂布于LB或NB平板上，再将所述噬菌体富集液滴于所述平板上，培养14～24h，得出分离结果。

在本发明中，将所述取回的载体再次放入宿主菌培养液中进行富集，所述富集的时间优选为6～14h，更优选为8～12h，最优选为10～11h；所述富集的温度优选为20～40℃，更优选为28～35℃，最优选为30～32℃。

本发明将所述宿主菌培养液涂布于LB或NB平板上，所述LB或NB平板的直径优选为6～15cm，更优选为8～12cm，最优选为10cm；所述LB或NB平板的厚度优选为3～15mm，更优选为5～12mm，最优选为8mm；所述宿主菌培养液涂布的量优选为150～250μl，更优选为180～220μl，最优选为200μl。本发明将所述宿主菌培养液涂布于LB或NB平板上后静置10～25min，优选为15～20min，更优选为16～18min；

将所述宿主菌培养液涂布于LB或NB平板上静置后，再将所述噬菌体富集液滴2～5滴于所述平板上，优选待所述噬菌体富集液被所述平板吸收后进行培养。所述培养的温度优选为25～37℃，更优选为28～35℃，最优选为30～33℃；所述培养的时间优选为14～24h，更优选为16～22h，最优选为18～20h。

在本发明中，所述平板上有噬菌斑出现，并且在出现噬菌斑后的24～48h内，所述噬菌斑的直径不超过3mm，表明本申请制备的分离噬菌体用载体分离到了副溶血性弧菌的噬菌体；若无噬菌斑出现，表明未分离到副溶血性弧菌的噬菌体。

下面结合实施例对本发明提供的一种分离噬菌体用载体及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

在无菌条件下，将副溶血性弧菌接种于宿主菌培养基中进行培养，在培养温度为28℃、转速为150rpm的条件下培养14h，得到宿主菌培养液，培养液中副溶血性弧菌的含量在10⁸cfu/ml以上；宿主菌培养基为：牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠30g/L、余量为水。

将陶瓷类载体浸泡于宿主菌培养液中2h，陶瓷类载体的质量与宿主菌培养液的体积比为1g:1ml，浸泡后取出，在通风的条件下干燥，使陶瓷类载体的含水率为50％，重复浸泡和干燥的步骤3次，再用40目纱网紧密包裹，得到分离噬菌体用载体。

将分离噬菌体用载体放入流动的海水中4h，放入的深度为50cm，取回后再次放入宿主菌培养液中浸泡8h，浸泡温度为28℃，得到噬菌体富集液；取200μl宿主菌培养液涂布于NB平板上，静置15min后，滴3滴噬菌体富集液，在14h出现噬菌斑，噬菌斑的直径为0.5mm，表明分离到副溶血性弧菌的噬菌体。

实施例2

在无菌条件下，将副溶血性弧菌接种于宿主菌培养基中进行培养，在培养温度为35℃、转速为200rpm的条件下培养24h，得到宿主菌培养液，培养液中副溶血性弧菌的含量在10⁸cfu/ml以上；宿主菌培养基为：牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠30g/L、余量为水。

将陶瓷类载体浸泡于宿主菌培养液中1h，陶瓷类载体的质量与宿主菌培养液的体积比为0.5g:1.5ml，浸泡后取出，在通风的条件下干燥，使陶瓷类载体的含水率为40％，重复浸泡和干燥的步骤3次，再用54目纱网紧密包裹，得到分离噬菌体用载体。

将分离噬菌体用载体放入流动的海水中6h，放入的深度为80cm，取回后再次放入宿主菌培养液中浸泡12h，浸泡温度为35℃，得到噬菌体富集液；取200μl宿主菌培养液涂布于NB平板上，静置20min后，滴3滴噬菌体富集液，在24h出现噬菌斑，噬菌斑的直径为0.5mm，表明分离到副溶血性弧菌的噬菌体。

实施例3

在无菌条件下，将副溶血性弧菌接种于宿主菌培养基中进行培养，在培养温度为30℃、转速为180rpm的条件下培养16h，得到宿主菌培养液，培养液中副溶血性弧菌的含量在10⁸cfu/ml以上；宿主菌培养基为：酵母浸膏5g/L、胰蛋白胨10g/L、氯化钠30g/L、余量为水。

将陶瓷类载体浸泡于宿主菌培养液中1.5h，陶瓷类载体的质量与宿主菌培养液的体积比为1.5g:0.5ml，浸泡后取出，在通风的条件下干燥，使陶瓷类载体的含水率为60％，重复浸泡和干燥的步骤3次，再用60目纱网紧密包裹，得到分离噬菌体用载体。

将分离噬菌体用载体放入流动的污水中5h，放入的深度为90cm，取回后再次放入宿主菌培养液中浸泡10h，浸泡温度为30℃，得到噬菌体富集液；取200μl宿主菌培养液涂布于NB平板上，静置18min后，滴2滴噬菌体富集液，在16h出现噬菌斑，噬菌斑的直径为0.5mm，表明分离到副溶血性弧菌的噬菌体。

实施例4

在无菌条件下，将副溶血性弧菌接种于宿主菌培养基中进行培养，在培养温度为32℃、转速为190rpm的条件下培养18h，得到宿主菌培养液，培养液中副溶血性弧菌的含量在10⁸cfu/ml以上；宿主菌培养基为：牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠30g/L、余量为水。

将陶瓷类载体浸泡于宿主菌培养液中2h，陶瓷类载体的质量与宿主菌培养液的体积比为1g:1ml，浸泡后取出，在通风的条件下干燥，使陶瓷类载体的含水率为50％，重复浸泡和干燥的步骤3次，再用45目纱网紧密包裹，得到分离噬菌体用载体。

将分离噬菌体用载体放入流动的淡水中5h，放入的深度为60cm，取回后再次放入宿主菌培养液中浸泡11h，浸泡温度为32℃，得到噬菌体富集液；取200μl宿主菌培养液涂布于NB平板上，静置15min后，滴5滴噬菌体富集液，在18h出现噬菌斑，噬菌斑的直径为0.5mm，表明分离到副溶血性弧菌的噬菌体。

由以上实施例可知，采用本发明的分离噬菌体用的载体能够快速分离海水、淡水和污水中副溶血性弧菌的噬菌体，分离的效率为达到80％。经鉴定分离到的噬菌体为副溶血弧菌噬菌体。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种分离噬菌体用载体，包括陶瓷类载体和负载在所述陶瓷类载体上的副溶血性弧菌。

2.一种分离噬菌体用载体的制备方法，包括以下步骤：

1)将副溶血性弧菌接种于宿主菌培养基中培养，得到宿主菌培养液；

2)将陶瓷类载体浸没于所述步骤1)得到的宿主菌培养液中，将浸泡后的陶瓷类载体干燥至含水率为45～55％，得到分离噬菌体用载体。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)得到的宿主菌培养液中副溶血性弧菌的含量为10⁸～10¹²cfu/ml。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)得到的陶瓷类载体上副溶血性弧菌的含菌量为10¹⁰～10¹⁶cfu/g。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述陶瓷类载体的孔隙率大于92％，所述陶瓷类载体的最大比表面积为350～450m²/m³。

6.根据权利要求2或5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中浸泡时，载体的质量与宿主菌培养液的体积比为(0.5～1.5)g∶(0.5～1.5)ml。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中培养的条件包括：所述培养的温度为28～35℃，所述培养的转速为150～200rpm，所述培养的时间为14～24h。

8.权利要求1所述分离噬菌体用载体或权利要求2～7任意一项所述方法制备得到的载体在分离水体中噬菌体的应用，包括：将权利要求1所述分离噬菌体用载体或权利要求2～7任意一项所述方法制备得到的分离噬菌体用载体放入水体中3～7h，分离得到噬菌体。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述分离噬菌体用载体放入水体中的深度≤0.5～1.5m。

10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述分离包括：

将载体取回后再次放入宿主菌培养液中，得到噬菌体富集液；

将所述宿主菌培养液涂布于LB或NB平板上，再将所述噬菌体富集液滴于所述平板上，培养14～24h，得出分离结果。