CN103525730A - 一种耳炎假单胞菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的是提供一种耳炎假单胞菌WU1（Pseudomonas otitidis WU1）菌株，该菌株已于2013年9月29日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏管理中心，保藏编号为CCTCC NO:M2013458。本发明的耳炎假单胞菌WU1（Pseudomonas otitidis WU1）菌株可用于水体净化，具有好氧反硝化的功能，营养需求简单，具有显著降低水体中硝态氮和亚硝态氮的能力，同时能有效降低生活污水中的氨氮含量，可开发为水产微生态制剂及污水处理剂，应用前景广阔。

Description

一种耳炎假单胞菌株及其应用
技术领域
本发明属于微生物应用技术领域，具体涉及一种耳炎假单胞菌株及其应用。 
背景技术
近几十年来，我国水产养殖业迅猛发展，集约化、高密度养殖规模日益扩大。但由于养殖水体中积累大量的残饵、粪便及动植物尸体，导致水体氮元素含量严重超标，富营养化加剧，使得养殖生态环境遭到破坏，鱼虾病害频发，最终造成巨大的经济损失。研究表明，水产动物致病的主要根源是养殖水体中亚硝态氮含量的严重超标，亚硝酸盐可以氧化鱼虾体内的亚铁血红蛋白，使其成为高铁血红蛋白，导致其失去运输氧的能力，最后造成鱼虾死亡。所以，控制水体中的亚硝态氮成为规模化养殖的关键之一。 
与物理脱氮法相比，生物脱氮具有无二次污染,脱氮彻底,经济安全等特点。而且生物脱氮技术具有成本低、易操作、达标排放可靠性强且无二次污染等优点，逐渐成为食品工业废水处理的主要方式。好氧反硝化作用是近年来提出的与传统的缺氧反硝化脱氮相比具有独特优势的生物脱氮技术：一方面，在有氧条件下进行反硝化，硝化作用和反硝化作用可同时在一个反应器中进行，设备与操作成本大幅下降；另一方面，硝化作用的产物可直接作为反硝化作用的底物，避免抑制硝化作用，硝化和反硝化进程加剧。因此，好氧反硝化作用越来越受到人们的关注，国内外对于好氧反硝化菌的筛选研究也比较多，但其成果仍旧远远不能满足工业生产的实际需求。通过筛选分离好氧反硝化细菌，并对好氧反硝化菌的各种生长特性和反硝化特性进行深入研究，对养殖废水、生活废水及工业污水的脱氮处理有着重要的理论价值和实际意义。 
发明内容
本发明的目的是提供一种耳炎假单胞菌株及其应用，筛选的耳炎假单胞菌具有好氧反硝化的性能，能显著降低水体中的硝态氮、亚硝态氮和氨态氮。 
本发明一方面提供了一株耳炎假单胞菌WU1（Pseudomonas otitidis WU1），已于2013年9月29日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2013458。 
上述的耳炎假单胞菌WU1菌株用于水体净化。 
本发明还提供一种微生物添加剂，是用耳炎假单胞菌WU1发酵后制备的。 
上述的微生物添加剂为菌粉。 
本发明筛选的耳炎假单胞菌WU1具有好氧反硝化的性能，其16h内可完全 降解浓度为5-10mg/L的亚硝态氮，可用于降低养殖废水中的硝态氮和亚硝态氮；WU1菌株还能有效降低生活污水中的氨氮含量，7天的降解率能达到92.59%，可开发为水产微生态制剂及污水处理剂，具有广阔的应用前景。 
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的耳炎假单胞菌WU1菌株及其应用的方法进行详细的描述。 
实施例1菌株的分离筛选及鉴定 
1、培养基： 
初筛BTB培养基：牛肉膏3.0g；蛋白胨10.0g；蔗糖15.0g；氯化钠20.0g；Teepol1.0g；溴麝香草酚蓝0.00006g；水1000ml。 
营养肉汤培养基：蛋白胨10g；牛肉粉3g；氯化钠5.0g；葡萄糖1g；水1000ml。 
筛选培养基：NaNO20.1g（约20mg/L NO2-N）；葡萄糖5.0g；K2HPO41.0g；NaCl2.0g；MgSO4.7H2O0.5g；水1000ml。 
2、筛选方法 
采用梯度稀释法将污泥样品稀释后，取0.1mL均匀涂布于BTB培养基表面，置入恒温培养箱，30℃下培养2～3d后，用接种环挑取使周围培养基出现蓝色晕圈的单菌落，进行分离纯化即为初筛菌株，共挑取了13株单菌落，分别命名为NK1、Y1-13、BX、BY、N1、N4、NI1、NI2、NI3、WU1、WU2、WU3、XAO1。接种初筛菌株至营养肉汤培养基，在30℃、205r/min条件下进行液体培养24h后，经过离心重悬，以1%的接种量接种到筛选培养基中，30℃、205r/min条件下进行摇瓶处理，24h后取样测定实验体系中亚硝态氮浓度。其中，亚硝态氮NO2 –N含量通过重氮-偶氮分光光度法测定，菌体量通过涂布法测定，测定结果如表1所示。 
表1各菌株培养24h后发酵液中NO2 —N含量 
  初始NO2-N值(mg/L) 24hNO2-N值(mg/L) 降解率
NK1 22.4 21.4 4.5%
Y1-13 22.0 22.0 0%
N1 22.2 21.6 2.7%
N4 22.4 7.8 65.2%
BX 22.6 15.8 30.1%
BY 22.1 21.3 3.6%
NI1 22.4 0 100%
NI2 22.8 22.7 0.4%
NI3 22.4 5.2 76.8%
WU1 22.6 0 100%
WU2 22.2 21.8 1.8%
WU3 22.0 22.0 0%
[0020] 
XAO1 22.1 15.7 29.0%
空白 22.2 22.2 0%
从表1可以看出，WU1菌株对亚硝态氮具有很强的降解能力，降解率达到了100%。 
3、鉴定 
1）菌落形态特征：将WU1菌株在营养琼脂培养基上培养18-24小时，其菌落形态特征如下： 
WU1菌落呈圆形，乳白色不透明，表面光滑偏湿润，边缘规则，无晕环，中央凸起，直径2-3mm。 
2）利用试剂盒提取WU1菌株的基因组DNA，利用PCR技术扩增其16S rRNA序列。通过BLAST比对分析发现，WU1菌株与公布的耳炎假单胞菌的16S rRNA序列相似度最高，与生化鉴定结果一致。因此将WU1菌株命名为耳炎假单胞菌WU1（Pseudomonas otitidis WU1）。 
将耳炎假单胞菌WU1（Pseudomonas otitidis WU1）于2013年9月29日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO:M2013458。 
实施例2亚硝态氮降解实验 
1、培养基： 
活化培养基：营养肉汤； 
筛选培养基：NaNO20.1g（约20mg/L NO2-N）；葡萄糖5.0g；K2HPO41.0g；NaCl2.0g；MgSO4.7H2O0.5g；水1000ml。 
检测培养基： 
高浓度亚硝态氮培养基：NaNO20.05g（约10mg/L NO2-N）；葡萄糖5.0g；K2HPO41.0g；NaCl2.0g；MgSO4.7H2O0.5g；水1000ml。 
低浓度亚硝态氮培养基：NaNO20.025g（约5mg/L NO2-N）；葡萄糖5.0g；K2HPO41.0g；NaCl2.0g；MgSO4.7H2O0.5g；水1000ml。 
2、实验方法： 
挑取平板上的耳炎假单胞菌WU1（Pseudomonas otitidis WU1）单菌落接种至装有8ml营养肉汤的试管中，置于30℃、205r/min摇床中进行活化；将5ml菌液转移到10ml无菌离心管中，4000r/min离心10min，并用生理盐水清洗两次，得到菌悬液；取1ml菌悬液接种至装有约100ml筛选培养基的250ml三角瓶中（接种量约1%），每个处理组三个平行，置于30℃、205r/min摇床中培养；分别在4h、8h、16h和24h取样检测菌量和NO2--N浓度；用一次性注射器取约3ml培养 液，将其中1.5ml培养液转移至离心管中，用营养琼脂平板计菌落总数；其余1.5ml培养液用0.22μm滤膜过滤，得到无菌液置于离心管中，用重氮-偶氮光度法测定其中亚硝态氮NO2--N浓度。 
表2：耳炎假单胞菌WU1菌株在24h内中对亚硝态氮的降解情况 
Figure DEST_PATH_GDA0000407357010000041
从表2的结果可以看出，本发明的耳炎假单胞菌WU1菌株在16h内可完全降解浓度为5-10mg/L的亚硝态氮。 
实施例3水产养殖废水处理实验 
将本发明筛选的耳炎假单胞菌WU1菌株用活化培养基进行活化、扩大培养，经液态发酵，离心收集菌泥，加入淀粉载体，烘干制成100亿/g的菌粉。 
取养殖废水取自泥鳅塘养殖废水，经测定其硝态氮含量为45.62±1.15mg/L，亚硝态氮为0.58±0.03mg/L，实验容器为塑料桶，实验水体为10L，实验组按照质量比50ppm添加菌粉，对照组不加菌粉，实验组和对照组均设置3个平行，实验期间不间断曝气，各容器曝气量调至一致，实验温度为28℃恒温。在第3d时测定各实验组及对照组水体中的硝态氮NO3 –N及亚硝态氮NO2 –N的含量，结果见表3。 
表3养殖废水各处理组中硝态氮及亚硝态氮的含量 
组别 NO3 –N（mg/L） NO2 –N（mg/L）
24h对照组 22.8 1.2
WU1 12.6 0.7
48h对照组 10.3 0.9
WU1 3.3 0.3
从表3的结果可以看出，耳炎假单胞菌WU1菌株能显著降低养殖废水中硝态氮及亚硝态氮的含量。 
实施例4生活污水废水处理实验 
生物污水的主要指标是污水中的氨态氮含量，将耳炎假单胞菌WU1菌株用活化培养基活化、扩大培养，经液态发酵，离心收集菌泥，加入淀粉载体，烘 干制成100亿/g的菌粉。生活废水取自青岛市李沧区李村菜市场排水沟，静置沉淀后取其上清液，测定其氨态氮含量为206.54mg/L，实验容器为塑料桶，实验水体为10L，实验组按照质量比10ppm添加耳炎假单胞菌WU1菌株的菌粉，对照组不加菌粉，实验组和对照组均设置3个平行，实验期间不间断曝气，各容器曝气量调至一致，实验温度为28℃恒温。在第4天和第7天时分别测定各实验组及对照组水体中氨态氮的含量 
表4生活污水各处理组中氨态氮的去除率 
Figure DEST_PATH_GDA0000407357010000051
从表4的结果可以看出，本发明的耳炎假单胞菌WU1菌株对生活污水中的氨态氮具有明显的降解作用，7天的降解率能达到92.59%。 
综上所述，本发明筛选到的耳炎假单胞菌WU1菌株能有效降解水体中的硝态氮和亚硝态氮，对于生活污水中的氨态氮也具有显著的降解效果。 

Claims (5)

1.一种耳炎假单胞菌，其特征在于，所述的耳炎假单胞菌的保藏编号为CCTCC NO:M2013458。
2.权利要求1所述的耳炎假单胞菌在水体净化中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的水体为水产养殖水体或生活污水。
4.一种微生物添加剂，所述的微生物添加剂是由权利要求1所述的耳炎假单胞菌发酵制备的。
5.权利要求1所述的微生物添加剂为菌粉。
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