CN105219685B

CN105219685B - 一种脱酚嗜盐菌及其应用

Info

Publication number: CN105219685B
Application number: CN201510761411.7A
Authority: CN
Inventors: 姜宇; 王弘宇; 尚宇; 杨开
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2015-11-10
Filing date: 2015-11-10
Publication date: 2018-11-13
Anticipated expiration: 2035-11-10
Also published as: CN105219685A

Abstract

本发明公开了一种脱酚嗜盐菌及其应用，属于生物工程、环境工程技术领域。本发明的脱酚嗜盐菌为保藏编号为CCTCC NO：M 2015603的JS4菌株，该菌株可在苯酚浓度0～1200mg/L范围内、盐度0%～15%范围内、pH值4.0～10.0范围内以苯酚为唯一碳源和能源稳定存在并降解苯酚。菌株JS4在好氧条件下对苯酚具有较强降解能力，可用于含苯酚废水的处理，去除废水中的苯酚；也可用于制备生物脱酚菌剂。菌株JS4作为脱酚嗜盐菌，通过自身氧化分解过程降解目标有机污染物苯酚，具有能耗低、投资成本和运行费用少，工艺简单等特点。

Description

一种脱酚嗜盐菌及其应用

技术领域

本发明属于生物工程、环境工程技术领域，具体涉及一种脱酚嗜盐菌及其应用。

背景技术

高盐度废水是指含盐质量分数至少1%的废水，这种废水含有多种污染物质，包括无机盐、有机物、重金属和放射性物质等。无机盐类可维持生物细胞膜平衡、调节渗透压、促进微生物的酶反应。但是，较高的盐度会破坏生物的代谢功能，降低生物的降解动力，从而抑制微生物的生长代谢。苯酚常温下为一种无色晶体，有较强毒性。长期饮用含酚的水可引起慢性积累性中毒，引起头晕、出疹、瘙痒、贫血及各种神经系统症状，酚对皮肤和粘膜有强烈的腐蚀作用，也可对人的肝脏造成伤害。由于高盐含酚废水对环境及生物活体造成巨大危害，在我国被列为重点解决的有害废水之一。

高盐含酚废水广泛产生于一些行业如炼油、印染、造纸等工业生产工艺流程中。其数量多，危害大。我国石油储备比较丰富，石油开采作为我国工业主要组成部分之一，排放的废水一般含有高浓度可溶性无机盐及难降解或有毒的有机物。不仅如此，作为我国国民经济主要支柱的化工、制药等行业，也产生大量类似成分的工业废水，这类废水的环境影响是不容忽视的。

目前，对高盐含酚废水中苯酚的处理方法包括物理法、物理化学法及生物法。其中，物理方法包括利用难溶于水的萃取剂与苯酚结合的萃取法、采用较高比表面积材料的吸附法、通过阴离子交换树脂回收的离子交换法等；化学方法包括利用强氧化性氧化剂氧化水中苯酚的化学氧化法、将苯酚形成溶解度更小的酯类物质的化学沉淀法等。但物化法具有处理规模大、基建投资和运行费用高，易造成水资源的浪费及二次污染的缺点。生物处理方法利用微生物的新陈代谢作用分解水中的苯酚，具有应用范围广、处理量大、设备简单等优点，但传统的活性污泥法占地面积大，且苯酚的毒性及高盐度环境导致微生物的生长受到抑制。自然界中嗜盐菌的存在使微生物在高盐环境下降解有机物成为可能。因此，研究高效脱酚嗜盐菌的培养及筛选对实际工业废水的处理具有很强的应用价值。

发明内容

本发明的首要目的在于针对传统活性污泥法中因苯酚的毒性致使微生物生长受到抑制、且高盐度造成细胞失水等问题，提供一种在高盐环境下稳定存在并高效降解苯酚的脱酚嗜盐菌。本发明的目的还在于提供所述脱酚嗜盐菌的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种脱酚嗜盐菌为菌株JS4，经真菌ITS鉴定，菌株JS4为德巴利氏酵母属（Debaryomyces sp.）。该菌株已于2015年10月13日保藏于中国典型培养物保藏中心（地址：中国.武汉.武汉大学），其分类命名为Debaryomyces sp. JS4，保藏编号为CCTCC NO：M2015603。菌株JS4可在苯酚浓度0～1200mg/L范围内、盐度0%～15%范围内、pH值4.0～10.0范围内以苯酚为唯一碳源和能源稳定存在并降解苯酚。菌株JS4在pH 6.8～7.2、温度30℃、盐度5%的条件下，72h内对700mg/L苯酚的去除率超过99%。

所述的菌株JS4通过自身氧化分解过程能降解目标有机污染物苯酚，其在好氧条件下对苯酚具有较强降解能力，可用于含苯酚废水的处理，去除废水中的苯酚。

所述的菌株JS4在制备生物脱酚菌剂中的应用。

一种生物脱酚菌剂，包含菌株JS4。

一种用于筛选高效脱酚嗜盐菌的高盐高酚选择培养基，其配制为：取2.0g KH₂PO₄、1.3g K₂HPO₄、一定量NaCl、0.1g NH₄Cl、一定量苯酚和1mL微量元素液，加蒸馏水至1000mL，调节pH 6.8～7.2，121℃下灭菌20min；其中，微量元素液的配制为：取0.01g FeCl₃·6H₂O、0.15g H₃BO₃、0.03g CuSO₄·5H₂O、0.18g KI、0.12g MnCl₂·4H₂O、0.06g Na₂MoO₄·2H₂O、0.12g ZnSO₄·7H₂O、0.15g CoCl₂·6H₂O、10g EDTA，加蒸馏水至1000mL。

本发明具有如下优点和效果：

（1）本发明的脱酚嗜盐菌可在盐度0%～15%、pH4.0～10.0、苯酚浓度0mg/L～1200mg/L的废水中以苯酚为唯一碳源和能源生长；其对苯酚具有较强降解能力，在适宜生长条件下，对苯酚的去除率达99%以上。

（2）本发明的脱酚嗜盐菌对盐度、pH等环境因素适应范围广，抗冲击性强，符合运行因素变化幅度较大的工业废水的处理对微生物的要求。

（3）本发明的脱酚嗜盐菌应用于含苯酚废水的处理中，无需另投加碳源，工艺简单，成本低廉且相对安全，有较强的实用价值。

附图说明

图1是脱酚嗜盐菌JS4在700mg/L苯酚环境中OD₆₀₀和苯酚浓度随时间的变化曲线图。

图2是脱酚嗜盐菌JS4在不同初始苯酚浓度下培养72h内OD₆₀₀最大值的柱状图。

图3是脱酚嗜盐菌JS4在不同pH下培养72h内OD₆₀₀最大值的柱状图。

图4是脱酚嗜盐菌JS4在不同盐度下培养72h内OD₆₀₀最大值的柱状图。

具体实施方式

下面结合具体实施例。进一步阐述本发明，应当理解，以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

下述实施例中所用培养基：

液体高盐高酚选择培养基的配制：取2.0g KH₂PO₄、1.3g K₂HPO₄、一定量NaCl、0.1gNH₄Cl、一定量苯酚和1mL微量元素液，加蒸馏水至1000mL，调节pH 6.8～7.2，121℃下灭菌20min。其中，微量元素液的配制为：取0.01g FeCl₃·6H₂O、0.15g H₃BO₃、0.03g CuSO₄·5H₂O、0.18g KI、0.12g MnCl₂·4H₂O、0.06g Na₂MoO₄·2H₂O、0.12g ZnSO₄·7H₂O、0.15gCoCl₂·6H₂O、10g EDTA，加蒸馏水至1000mL。盐度和苯酚的浓度由NaCl和苯酚的加入量决定，如1L培养基中加入50g NaCl，则高盐高酚选择培养基的盐度为5%；1L培养基中加入50mg苯酚，则高盐高酚选择培养基的苯酚浓度为50mg/L。固体高盐高酚选择培养基的配制为在1L所述液体高盐高酚选择培养基中加入20g琼脂。

实施例1 脱酚嗜盐菌的筛选和鉴定

（1）以制药厂废水处理系统的硫酸盐活性污泥作为原料，通过用清水反复洗涤1～2d去除污泥本身携带的高浓度硫酸盐。

（2）第一阶段：取200mL洗涤后的活性污泥加入到盛有1L液体高盐高酚选择培养基（盐度5%，苯酚浓度50mg/L）的烧杯中，驯化过程每周期持续24h，其中搅拌并曝气23h，沉淀0.5h，静置0.5h。每周期沉淀后排出500mL上清液，并加入500mL新鲜的盐度5%的液体高盐高酚选择培养基，新加入的培养基中苯酚浓度由上一阶段剩余苯酚浓度决定，使每周期初始苯酚浓度保持50mg/L。第一阶段持续48h，即2个周期，在第2周期结束时，污泥具有超过90%的苯酚去除率。第一阶段结束后排出500mL上清液，加入500mL盐度5%、一定苯酚浓度的液体高盐高酚选择培养基进行第二阶段驯化。

（3）自第二阶段起各阶段每周期初始苯酚浓度依次为100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L，具体操作同第一阶段，各阶段持续72h即3个周期。经检测，该污泥在各阶段最后一个周期均具有超过90%的苯酚去除率。

（4）取第六阶段的污泥混合液10mL加入到盛有100mL液体高盐高酚选择培养基（盐度5%、苯酚浓度700mg/L）的锥形瓶中，随后置于30℃、转速为160r/min的恒温振荡器上振荡培养48h。将上清液以10%接种量接种于LB培养基（10g蛋白胨、5g酵母提取物、10g NaCl，加蒸馏水至1000mL）中富集48h。再将富集菌液以10%接种量接种于盛有液体高盐高酚选择培养基（盐度5%、苯酚浓度700mg/L）的锥形瓶中，置于30℃、转速为160r/min的恒温振荡器上振荡培养48h获得驯化菌液。

（5）梯度稀释驯化菌液，稀释梯度分别为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5，分别取1mL驯化菌液加到固体高盐高酚选择培养基（盐度5%、苯酚浓度700mg/L）平板中，涂布法涂匀，置于30℃恒温培养箱中培养72h左右，获得单菌落。

（6）利用之字划线、三区划线继续纯化所获得单菌落，液体、固体高盐高酚选择培养基（盐度5%、苯酚浓度700mg/L）交替培养驯化，加速筛菌过程，重复多次操作获得白色、圆形、表面和边缘较为光滑的纯菌落，将其命名为脱酚嗜盐菌JS4。

脱酚嗜盐菌JS4 ITS区域rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，经提交Genbank数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）进行对比，鉴定菌株JS4为德巴利氏酵母属（Debaryomyces sp.）。菌株JS4于2015年10月13日保藏于中国典型培养物保藏中心（地址：中国.武汉.武汉大学），其分类命名为Debaryomyces sp. JS4，保藏编号为CCTCC NO：M2015603。

菌株JS4可在苯酚浓度0～1200mg/L范围内、盐度0%～15%范围内、pH值4.0～10.0范围内以苯酚为唯一碳源和能源稳定存在并降解苯酚。

实施例2

通过试验对脱酚嗜盐菌JS4在高盐环境中的脱酚特性进行研究。方法为：将平板上的JS4单菌落以2接种环/100mL的接种量接种于盛有牛肉膏蛋白胨培养基（10g蛋白胨、5g牛肉膏、5g NaCl，加蒸馏水至1000mL）的摇瓶中，在温度为30℃、转速为160r/min的条件下培养2d后再以10%接种量接种于盛有液体高盐高酚选择培养基（盐度5%、苯酚浓度700mg/L）的摇瓶中，在温度为30℃、转速为160r/min的条件下培养2d作为种液。将种液随后以5%的接种量接种于盛有液体高盐高酚选择培养基（盐度5%、苯酚浓度700mg/L）的摇瓶中，在温度为30℃、转速为160r/min的条件下培养72h，期间连续监测培养液中苯酚浓度及培养液OD₆₀₀的变化情况，研究菌株JS4对苯酚的降解及以苯酚为唯一碳源和能源的生长情况，结果如图1所示。

从图1可以看出，在pH6.8～7.2、温度30℃、盐度5%的条件下，72h内菌株JS4对700mg/L苯酚的去除率超过99%。OD₆₀₀可反映菌株的生长情况，而OD₆₀₀的升高伴随着苯酚浓度的降低说明脱酚嗜盐菌JS4可利用苯酚为唯一碳源和能源合成自身营养物质以进行繁殖。

实施例3

通过试验对脱酚嗜盐菌JS4在不同苯酚浓度、pH及盐度中的生长及脱酚特性进行研究。

（1）不同苯酚浓度对菌株生长及脱酚效果影响情况试验方法为：将JS4种液（JS4种液的制备同实施例2）以5%的接种量分别接种于盛有不同苯酚浓度的液体高盐高酚选择培养基（盐度5%；苯酚浓度100mg/L～1300mg/L，苯酚浓度梯度为100mg/L）的摇瓶中，在温度为30℃、转速为160r/min的条件下培养72h，期间连续监测培养液中苯酚浓度及培养液OD₆₀₀的变化情况。

菌株JS4在不同苯酚初始浓度下的生长情况如图2所示，当苯酚浓度低于1300mg/L时，培养液OD₆₀₀具有不同程度的增长，由此说明，菌株JS4能够生长的苯酚浓度范围是0～1200mg/L。

通过分析菌株JS4对不同初始浓度苯酚的平均去除速率可知，500mg/L为最适苯酚浓度，在5%盐度下，菌株JS4在36h内可将初始浓度为500mg/L的苯酚降解。

（2）不同pH对菌株生长及脱酚效果影响情况试验方法为：将JS4种液以5%的接种量分别接种于盛有不同pH的液体高盐高酚选择培养基（pH分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，盐度5%，苯酚浓度500mg/L）的摇瓶中，在温度为30℃、转速为160r/min的条件下培养72h，期间连续监测培养液中苯酚浓度及培养液OD₆₀₀的变化情况。

菌株JS4在不同pH下的生长情况如图3所示，当pH为6.0时培养液OD₆₀₀值最大，故pH=6.0为菌株JS4最适生长pH。当pH达到10.0时，菌株JS4生长明显受到抑制，而在pH为3.0或11.0时，未发现菌株JS4生长，故菌株JS4能够生长的pH范围是4.0～10.0。

通过分析苯酚的平均去除速率可知，当pH范围为5.0～8.0，初始苯酚浓度为500mg/L时，菌株JS4在36h内的苯酚去除率可达到99%以上。

（3）不同盐度对菌株生长及脱酚效果影响情况试验方法为：将JS4种液以5%的接种量分别接种于盛有不同盐度的液体高盐高酚选择培养基（盐度分别为0%、1%、3%、5%、7%、9%、11%、13%、15%、17%，苯酚浓度500mg/L）的摇瓶中，在温度为30℃、转速为160r/min的条件下培养72h，期间连续监测培养液中苯酚浓度及培养液OD₆₀₀的变化情况。

菌株JS4在不同盐度下的生长情况如图4所示，当盐度为1%时培养液OD₆₀₀值最大，故1%盐度为菌株JS4最适生长盐度。当盐度达到13%时，菌株JS4生长明显受到抑制，而在盐度达到17%时，未发现菌株JS4生长，故菌株JS4能够生长的盐度范围是0%～15%。

通过分析苯酚的平均去除速率可知，当盐度范围为0%～5%、初始苯酚浓度为500mg/L时，菌株JS4在36h内的苯酚去除率可达到99%以上。

Claims

1.一种脱酚嗜盐菌，其特征在于：所述的脱酚嗜盐菌为德巴利氏酵母属(Debaryomycessp.)，其保藏编号为CCTCC NO：M 2015603。

2.根据权利要求1所述的脱酚嗜盐菌，其特征在于：所述的脱酚嗜盐菌在苯酚浓度0～1200mg/L范围内、盐度0％～15％范围内、pH值4.0～10.0范围内以苯酚为唯一碳源和能源稳定存在并降解苯酚。

3.权利要求1所述的脱酚嗜盐菌在含苯酚废水处理中的应用。

4.权利要求1所述的脱酚嗜盐菌在制备生物脱酚菌剂中的应用。

5.一种生物脱酚菌剂，其特征在于：包含权利要求1所述的脱酚嗜盐菌。