KR102243670B1 - 신규 전통 장류 발효 효모 균주 데바리오마이세스 한세니 kd2 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명에서는 전통 간장과 된장 시료 유래의 곰팡이/효모 집락으로부터 신규 데바리오마이세스(Debaryomyces) 속 효모들을 발굴하여 계통학적으로 서로 다른 데바리오마이세스(Debaryomyces) 속의 두 균주 KD2와 C0-11-Y2를 선별하였다. 두 효모 균주는 염이 있는 조건에서 더 잘 자라는 호염성의 특징을 보였고, 특히 KD2는 더 높은 호염성을 보였다. 인체 내 온도인 37℃에서 염이 있더라도 성장하지 못하므로 인체 감염 병원균으로서의 가능성은 없는 것으로 판단되었다. 유전체 분석을 통해 본 발명에서 발굴된 KD2와 C0-11-Y2 균주는 기존에 보고된 D. hansenii 균주와는 구별되는 새로운 균주임을 증명하였다. 향미 프로파일 분석을 통해 데바리오마이세스 한세니 KD2(Debaryomyces hansenii KD2)와 C0-11-Y2 균주는 버터향, 카라멜향, 치즈향 등의 독특하고 다양한 성분을 생성하였다. 또한 인체 수지상 세포를 대상으로 효모 균주들의 면역유발성 평가 결과, 특히 KD2, C0-11-Y2 균주 순으로 기존에 알려진 프로바이오틱 효모보다 염증 억제 사이토카인 IL-10을 더 높은 수준으로 유도함을 관찰하였다. 종합적으로, 호염성 및 향미가 우수하고 면역 억제 사이토카인 분비능이 뛰어난 데바리오마이세스 한세니 KD2(Debaryomyces hansenii KD2) 균주가 향미가 증진된 장류 발효 종균 및 새로운 프로바이오틱 효모로서 개발될 수 있는 가능성을 제시하게 되었다.
Description
본 발명은 신규 전통 장류 발효 효모 균주 및 이를 이용한 프로바이오틱 효모 균주 개발에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 한국의 전통 장류에서 데바리오마이세스 효모 종(Debaryomyces sp.)의 발굴 및 동정, 성장, 유전체, 향미 프로파일 특성과 면역 활성 조절능 및 이를 이용한 전통 장류 발효 활용 방법에 관한 것이다.
우리나라 전통 방식의 장류 제조를 위해서는 물에 불린 콩을 삶은 후 사각형의 메주로 성형하고 볏짚을 이용해 여러 달 동안 공중에 매달아 자연 발효를 일으킨다. 이후, 메주를 소금물에 담가 된장과 간장을 담는다. 메주의 발효 과정 중, 세균, 효모, 곰팡이와 같은 다양한 미생물들이 관여하며, 이들이 생성하는 다양한 효소들에 의해 단백질이 분해되고 향미 성분들이 생성된다. 따라서, 우리나라 고유의 전통 장류는 자연적으로 존재하는 여러 미생물 균주들의 복합적인 발효 활성에 의해, 제조되는 지역에 따라 다양한 맛과 향미를 지니고 있는 특성이 있다. 미생물에 의한 발효에 기반을 두고 있는 국내 전통 장류의 경우, 다양한 세균, 효모, 곰팡이 균주들이 관여하는데 곰팡이, 효모 균주는 단백질, 전분, 지방을 아미노산, 포도당, 지방산 등으로 분해하는 과정에서 핵심적인 역할을 수행하고, 야생 효모와 유산균에 의해 장류의 맛과 향기가 형성된다. 전통 장류에 서식하는 미생물 집단의 균주 동정은 박테리아의 경우 16S rRNA, 효모/곰팡이의 경우 5.8S rRNA 또는 ITS (Internal transcribed spacer) 유전자 염기서열 비교 분석 및 PCR-변성 구배 젤 전기영동(denaturing gradient gel electrophoresis; DGGE) 분석을 기반으로 하는 분류 방법이 사용되고 있으며, 최근에는 차세대 염기서열분석(Next Generation Sequencing; NGS) 기법을 이용한 메주 및 된장에 서식하는 미생물 군집 전체에 대한 분석 연구가 시도되고 있다. 국내 전통 메주에서 우점종으로 존재한다고 알려진 바실러스(Bacillus)와 유산균에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으며 곰팡이와 곰팡이 유래 효소 활성이 된장의 향기 성분에 미치는 영향 연구를 통해 메주 곰팡이 종류, 메주 내의 효소 활성, 숙성기간과 된장의 향기 성분과의 상관관계를 분석하고 된장의 향미 조절 및 향상을 위한 주요 인자 규명을 위한 연구가 시도되고 있다. 일부 국내 전통 메주들 중에서 Pichia burtonii, Pichia farinosa, Candida rugosa, Zygosaccharomyces rouxii 등 효모 균주들도 상당한 우점종으로 동정이 되고 있으나, 곰팡이 균주들에 비해 이들 메주 유래 효모 균주 대상의 발효 생리 및 기능에 대한 연구는 저조한 편이다. 한편 일본 간장과 미소의 경우 발효 스타터인 Koji에서 다양한 종류의 효모/곰팡이 균주들이 발견되었고, 발효 시간에 따라 이들 군집의 변화가 관찰되며 이러한 균종들의 분포에 따라 Koji의 질이 달라짐이 보고되었다. 중국에서는 내염성 효모인 Z. rouxii와 Candida versatilis를 간장의 종균으로 사용하여 맛과 향을 증진시키고자 하는 응용 연구와 더불어 내염성 기작을 규명하기 위한 기초 연구를 수행하고 있다.
장류 유래 미생물 균주들에 대한 유전체, 전사체, 단백질체, 대사체 등 다양한 오믹스 분석 연구가 국내에서도 최근 관심을 받기 시작하고 있으나, 대부분의 경우 일부 연구진에 의해 장류 미생물 집단 대상의 메타 대사체 분석 연구로 한정되어 있으며, 전통 장류 발효 미생물 균주 대상의 유전체 및 전사체 분석을 통한 기능 분석 연구는 현재로는 원핵 미생물을 대상으로 수행되고 있다. 국내 된장 및 간장 발효에서 다양한 효모 및 곰팡이 종들이 분리되었지만, 체계적인 생리 활성 및 다중 오믹스의 기반이 되는 유전체 분석 연구도 아직 수행되지 않았다. 일본의 경우 전통적인 콩 발효 곰팡이인 Aspergillus oryzae에 대한 유전체 분석을 완료하였고, 최근 Koji로부터 분리한 Aspergillus sojae의 유전체 분석을 완료하는 등 실제 산업에 이용하기 위한 발효미생물 연구가 지속적으로 이루어지고 있다. 각 효모 종마다 다른 맛과 향을 생산해내므로 새로운 향미를 내는 효모 균주 발굴 및 유전체 분석을 통한 향미 관련 미생물 및 유전자원 확보에 관한 연구가 일본의 Kikkoman 회사를 비롯하여 세계적으로 활발하게 수행되고 있으며, 대표적인 향미 효모인 Meyerozyma guilliermondii, Z. rouxii, C. versatilis에 대한 유전체 분석연구가 수행되어 이를 기반으로 한 내염성 및 향미 관련 유전자들의 기능 및 발현 조절 기작에 대한 연구가 보다 체계적으로 수행될 수 있는 틀이 구축되었다.
한편, 식품 안전성 및 식습관과 건강 간의 관계는 현대 사회의 소비자에게 주요 관심사이자 쟁점이다. 결과적으로, 발효 식품에서 효모는 새로운 프로바이오틱 미생물이 될 수 있는 반면, 다른 환경에서는 감염을 일으키거나 소비자에 부정적인 영향을 끼칠 수 있기 때문에 식품 효모의 안전성은 최근 화두가 되는 주제 중 하나이다. 특히 독소, 바이오제닉아민 등의 유해물질 생성은 미생물의 대사 및 생리적 활성과 밀접한 관련이 있으므로 개별 효모 종들에 대한 면밀한 분석이 필요하다.
현재 산업체에서 대량으로 제조되어 시판되고 있는 장류의 경우, 단조로운 향미를 지니고 있어 전통 장이 지닌 다양한 향미 특성을 구현할 필요가 있다. 특히 장류의 맛과 향에 핵심적인 역할을 할 것으로 기대되는 새로운 국내 토종 효모 균주 개발 및 이를 포함한 향미와 기능, 면역활성 유발성 및 안전성이 증진된 종균 개발에 대한 중요성이 대두되고 있다. 따라서 전통 장류 발효에 핵심적인 역할을 수행하는 효모 균주들을 발굴하고 이들의 기능 및 생리 활성을 첨단 과학 기술인 다양한 오믹스 분석 연구를 통해 총체적으로 이해하고, 이를 기반으로 하는 기능성과 안정성이 검증된 종균 개발 및 발효 공정 제어 기술 개발이 필요하다.
본 발명의 목적은 신규 전통 장류 발효 효모 균주 및 이를 이용한 프로바이오틱 효모 균주 개발에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 한국의 전통 장류에서 데바리오마이세스 효모 종(Debaryomyces sp.)의 발굴 및 동정, 성장, 유전체, 향미 프로파일 특성과 면역활성 조절능 및 이를 이용한 전통 장류 발효 활용 방법을 제공하는 데에 있다.
상기 과제의 해결을 위하여, 본 발명은 KACC 93324P로 수탁되고, 호염성 및 내염성이 우수한 데바리오마이세스 한세니 KD2(Debaryomyces hansenii KD2) 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에서는 전통 간장과 된장 시료 유래의 곰팡이/효모 집락으로부터 신규 데바리오마이세스(Debaryomyces) 속 효모들을 발굴하여 계통학적으로 서로 다른 데바리오마이세스(Debaryomyces) 속의 두 균주 KD2와 C0-11-Y2를 선별하였다. 두 효모 균주는 염이 있는 조건에서 더 잘 자라는 호염성의 특징을 보였고, 특히 KD2는 더 높은 호염성을 보였다. 인체 내 온도인 37℃에서 염이 있더라도 성장하지 못하므로 인체 감염 병원균으로서의 가능성은 없는 것으로 판단되었다. 유전체 분석을 통해 본 발명에서 발굴된 KD2와 C0-11-Y2 균주는 기존에 보고된 데바리오마이세스 한세니(Debaryomyces hansenii) 균주와는 구별되는 새로운 균주임을 증명하였다. 향미 프로파일 분석을 통해 데바리오마이세스 한세니 KD2(Debaryomyces hansenii KD2)와 C0-11-Y2 균주는 버터향, 카라멜향, 치즈향 등의 독특하고 다양한 성분을 생성하였다. 또한 인체 수지상 세포를 대상으로 효모 균주들의 면역활성 유발성 평가 결과, 특히 KD2, C0-11-Y2 균주 순으로 기존에 알려진 프로바이오틱 효모보다 염증 억제 사이토카인 IL-10을 더 높은 수준으로 유도함을 관찰하였다. 종합적으로, 호염성 및 향미가 우수하고 면역 억제 사이토카인 분비능이 뛰어난 데바리오마이세스 한세니 KD2(Debaryomyces hansenii KD2) 균주가 향미가 증진된 장류 발효 종균 및 새로운 프로바이오틱 효모로서 개발될 수 있는 가능성을 제시하게 되었다.
도 1은 간장 및 된장에서 분리된 데바리오마이세스(Debaryomyces) 속 균주들과 데바리오마이세스(Debaryomyces) 속 공시균주들의 5.8S rRNA 및 ITS2 염기서열을 이용하여 작성한 계통도이다.
도 2는 본 발명에서 최종 선발된 데바리오마이세스(Debaryomyces) 속 균주 C0-11-Y2 및 데바리오마이세스 한세니 KD2(Debaryomyces hansenii KD2)의 5.8S rRNA 및 ITS2 유전자의 염기서열을 나타낸 것이다.
도 3은 다양한 염 스트레스 조건에서 한국 전통 장류 유래 Debaryomyces sp.와 누룩 유래 및 표준 균주(type strain) D. hansenii의 내염성 비교 분석 및 37 ℃ 에서의 성장 분석 결과를 나타낸다. (A) 다양한 염이 첨가된 배지에서 배양 3일 결과, (B) 15% NaCl 첨가 배지에서 배양 7일 결과, (C) 37 ℃ 에서의 성장 분석 결과.
도 4는 메주/된장 유래 데바리오마이세스 한세니 KD2(Debaryomyces hansenii KD2), C0-11-Y2 균주의 배수체 분석 결과와 유전체 조립 및 주석화 결과를 나타낸다. (A) FACS 실험을 통한 데바리오마이세스 한세니 KD2(Debaryomyces hansenii KD2), C0-11-Y2 균주의 배수체 분석 결과, (B) KD2 균주의 유전체 조립 결과, (C) C0-11-Y2 균주의 유전체 조립 결과, (D) KD2와 (E) C0-11-Y2 균주의 전사체 데이터(transcriptome data) 기반 대략적인 유전자 주석화 결과, (F) 참조유전체 D. hansenii CBS767 유전체를 참고한 염색체 수준으로의 KD2 균주 whole genome assembly 결과.
도 5는 SPME-GC/MS를 이용한 데바리오마이세스 한세니 KD2(Debaryomyces hansenii KD2) 균주의 향미 화합물 분석 결과를 나타낸다. (a) KD2 균주의 향미 프로파일, (b) KD2 균주로부터 검출된 향미 화합물.
도 6은 SPME-GC/MS를 이용한 Debaryomyces sp. C0-11-Y2 균주의 향미 화합물 분석 결과를 나타낸다. (A) C0-11-Y2 균주의 향미 프로파일, (B) C0-11-Y2 균주로부터 검출된 향미 화합물.
도 7은 장류 유래 데바리오마이세스 한세니 KD2(Debaryomyces hansenii KD2) 및 C0-11-Y2 균주와 반응시킨 인체 유래 수지상 세포(human DC, hDC)의 표면 분화 마커 발현 정도의 측정 결과를 나타낸다. (A) FACS 분석 시 hDC의 gating (B), (C), (D) 장류 효모와 반응시킨 인체 유래 수지상 세포(human DC, hDC)의 표면 분화 마커 CD86, MHC class II, MHC class I 의 발현 정도.
도 8은 장류 유래 데바리오마이세스 한세니 KD2(Debaryomyces hansenii KD2) 및 C0-11-Y2 균주와 반응한 인체 유래 수지상 세포가 분비한 사이토카인들의 정량 그래프를 나타낸다.
도 2는 본 발명에서 최종 선발된 데바리오마이세스(Debaryomyces) 속 균주 C0-11-Y2 및 데바리오마이세스 한세니 KD2(Debaryomyces hansenii KD2)의 5.8S rRNA 및 ITS2 유전자의 염기서열을 나타낸 것이다.
도 3은 다양한 염 스트레스 조건에서 한국 전통 장류 유래 Debaryomyces sp.와 누룩 유래 및 표준 균주(type strain) D. hansenii의 내염성 비교 분석 및 37 ℃ 에서의 성장 분석 결과를 나타낸다. (A) 다양한 염이 첨가된 배지에서 배양 3일 결과, (B) 15% NaCl 첨가 배지에서 배양 7일 결과, (C) 37 ℃ 에서의 성장 분석 결과.
도 4는 메주/된장 유래 데바리오마이세스 한세니 KD2(Debaryomyces hansenii KD2), C0-11-Y2 균주의 배수체 분석 결과와 유전체 조립 및 주석화 결과를 나타낸다. (A) FACS 실험을 통한 데바리오마이세스 한세니 KD2(Debaryomyces hansenii KD2), C0-11-Y2 균주의 배수체 분석 결과, (B) KD2 균주의 유전체 조립 결과, (C) C0-11-Y2 균주의 유전체 조립 결과, (D) KD2와 (E) C0-11-Y2 균주의 전사체 데이터(transcriptome data) 기반 대략적인 유전자 주석화 결과, (F) 참조유전체 D. hansenii CBS767 유전체를 참고한 염색체 수준으로의 KD2 균주 whole genome assembly 결과.
도 5는 SPME-GC/MS를 이용한 데바리오마이세스 한세니 KD2(Debaryomyces hansenii KD2) 균주의 향미 화합물 분석 결과를 나타낸다. (a) KD2 균주의 향미 프로파일, (b) KD2 균주로부터 검출된 향미 화합물.
도 6은 SPME-GC/MS를 이용한 Debaryomyces sp. C0-11-Y2 균주의 향미 화합물 분석 결과를 나타낸다. (A) C0-11-Y2 균주의 향미 프로파일, (B) C0-11-Y2 균주로부터 검출된 향미 화합물.
도 7은 장류 유래 데바리오마이세스 한세니 KD2(Debaryomyces hansenii KD2) 및 C0-11-Y2 균주와 반응시킨 인체 유래 수지상 세포(human DC, hDC)의 표면 분화 마커 발현 정도의 측정 결과를 나타낸다. (A) FACS 분석 시 hDC의 gating (B), (C), (D) 장류 효모와 반응시킨 인체 유래 수지상 세포(human DC, hDC)의 표면 분화 마커 CD86, MHC class II, MHC class I 의 발현 정도.
도 8은 장류 유래 데바리오마이세스 한세니 KD2(Debaryomyces hansenii KD2) 및 C0-11-Y2 균주와 반응한 인체 유래 수지상 세포가 분비한 사이토카인들의 정량 그래프를 나타낸다.
이에, 본 발명자들은 전통 장류에서 분리한 새로운 효모 데바리오마이세스 속(Debaryomyces sp.)의 두 가지 균주 KD2와 C0-11-Y2의 발굴 및 동정을 보고하며, 성장 특성 및 유전체 특성, 향미 프로파일 특성을 분석하였고, 이와 더불어 면역활성 조절능을 분석함으로써 프로바이오틱 효모 균주 및 전통 장류 종균으로서의 이용 가능성을 제시하였다.
본 발명은 KACC 93324P로 수탁되고, 호염성 및 내염성이 우수한 데바리오마이세스 한세니 KD2(Debaryomyces hansenii KD2) 균주를 제공한다.
바람직하게는, 상기 균주는 된장으로부터 분리될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 균주는 콩 발효식품의 풍미를 향상시키는 향미 성분 화합물을 생산할 수 있고, 보다 바람직하게는 상기 향미 성분 화합물은 플루오로아세틸렌(Fluoroacetylene), 이소발렐알데히드(Isovaleraldehyde), (Z)-2-부테날((Z)-2-Butenal), 이소부틸 알콜(Isobutyl alcohol), 이소아밀 알콜(Isoamyl alcohol), 스티렌(Styrene), 아세토인(Acetoin), 2-노나논(2-Nonanone), 2-하이드로퍼록시펜탄(2-Hydroperoxypentane), 1-이소프로필-1-부탄올(1-Isopropyl-1-butanol), 이소부타노익산(Isobutanoic acid), 부타노익산(butanoic acid), 페닐아세트알데히드(Phenylacetaldehyde), 2-메틸헥사노익산(2-Methylhexanoic acid), 3-하이드록시-2,4,4-트리메틸펜틸 2-메틸프로파노에이트(3-Hydroxy-2,4,4-trimethylpentyl 2-methylpropanoate), 1-[2-(이소부티릴옥시)-1-메틸에틸)-2,2-디메틸프로필 2-메틸프로파노에이트(1-[2-(Isobutyryloxy)-1-methylethyl)-2,2-dimethylpropyl 2-methylpropanoate), 1-(2-하이드록시-1-메틸에틸)-2,2-디메틸프로필 2-메틸프로파노에이트(1-(2-Hydroxy-1-methylethyl)-2,2-dimethylpropyl 2-methylpropanoate), 페닐에틸 알콜(Phenylethyl alcohol), 2-에틸부틸 알콜(2-Ethylbutyl alcohol), 아세트산(Acetic acid), 퍼푸랄(Furfural), 프로파노익산(Propanoic acid), 퍼푸릴 알콜(Furfuryl alcohol), 3-(메틸티오)-1-프로파놀(3-(Methylthio)-1-propanol), 펜틸 알콜(Pentyl alcohol), 벤즈알데히드(Benzaldehyde) 및 디에틸 프탈레이트(Diethyl phthalate)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 화합물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 균주는 염증 억제 사이토카인인 IL-10 생산을 유도할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱 조성물을 제공한다.
본 발명에서 “프로바이오틱스(probiotics)” 또는 “프로바이오틱(probiotic) 균주”란, 섭취되어 장에 도달하였을 때에 장내 환경에 유익한 작용을 하는 균주를 의미한다. 일반적으로 프로바이오틱스로는 유산균이 많이 사용되지만, 효모가 프로바이오틱스로서 사용되는 경우 유산균과는 다른 이점들이 존재한다. 예를 들어, 보통 프로바이오틱스는 열에 매우 민감하여 30℃만 넘어가도 기능을 잃기 시작하는 반면, 효모는 37℃에서도 활발히 활동을 하기 때문에 온도에 민감하지 않다는 장점이 있다. 또한, 일반적인 프로바이오틱스는 항생제에 의해 무력화될 수 있지만 효모의 경우 항생제에 영향을 받지 않는다. 마지막으로, 일반적인 프로바이오틱스는 위산과 담즙에 약하기 때문에 위산과 담즙에 버티기 위하여 다양한 방법을 적용해야 하지만 효모의 경우 위산과 담즙에 상관없이 생존한다는 특징이 있다.
상기 프로바이오틱스 조성물은 장 기능 개선을 위한 다양한 용도에서 활용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 프로바이오틱스 조성물은 정장 작용을 가지므로 '정장용' 조성물로서 사용 가능하다. '정장용'이란 사람이나 동물의 장내 세균총의 이상 발효에 의하여 야기되는 제반증상을 치료 및/또는 개선하는 용도를 말한다. 상기 증상으로는 이에 한정되지는 않으나, 예를 들어, 설사, 위장염, 염증성 장질환, 신경성 장염 증후군, 소장 미생물 과성장증 등이 포함된다.
상기 프로바이오틱스 조성물은 당업계에 공지된 방법에 따라 다양한 제형과 방법으로 제조 및 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 데바리오마이세스 한세니 KD2(Debaryomyces hansenii KD2) 균주를 포함하는 조성물은 식품/의약 분야에서 통상적으로 사용되는 담체와 혼합하여 활용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 식품 조성물의 경우, 상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 균주 또는 이의 배양물을 첨가할 수 있는 식품은 발효식품인 것이 바람직하지만, 예를 들어, 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등에도 첨가될 수 있다.
보다 바람직하게는, 본 발명의 실시예에서는 간장 또는 된장의 제조에 상기 균주 또는 이의 배양물을 첨가하였다.
본 발명에서 “배양물”이란, 균주를 공지의 액체 배지 또는 고체 배지에서 배양시켜 수득한 산물을 의미하며, 균주가 포함되는 개념이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
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실시예
1>
Debaryomyces
sp
. 균주 발굴 및 동정
간장 및 된장 시료 1 ml(g)을 PBS (phosphate buffered saline) 용액에 10-1 - 10-3배 희석한 후 항생제(Tetracycline, 10 mg/L; Chloramphenicol, 50mg/L)가 포함된 YPD (yeast extract peptone dextrose) 배지에 도말하여 30℃에서 3일간 정치배양한 후 생성된 곰팡이/효모의 집락을 획득하였다. 획득한 곰팡이/효모 집락은 ITS1 (5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’), NL4 (5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’) 프라이머를 이용하여 곰팡이/효모의 5.8S rRNA 및 ITS2 유전자를 PCR 증폭한 후 시퀀싱을 진행하였으며, 시퀀싱된 결과를 유전체 서열 데이터베이스인 NCBI에서 blast search하여 Debaryomyces 속에 속하는 균주 11점을 분리하였다(표 1). 또한 계통수 비교를 통해 계통학적으로 서로 다른 Debaryomyces 속 두 균주 KD2와 C0-11-Y2를 최종적으로 선별하였다(도 1 및 도 2).
| 분리원 | 균주명 | 발견빈도 |
| 간장 | Aspergillius sp. | 8/17 |
| 간장 | Debaryomyces sp . | 6/17 |
| 간장 | Candida sp . | 2/17 |
| 간장 | Lichthemia sp . | 1/17 |
| 된장 | Debaryomyces sp . | 5/16 |
| 된장 | Candida sp . | 7/16 |
| 된장 | Aspergillus sp . | 3/16 |
| 된장 | Lichtheimia sp . | 1/16 |
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실시예
2>
Debaryomyces
sp
. 성장 특성 및 내염성
앞서 확보한 데바리오마이세스 한세니 KD2(Debaryomyces hansenii KD2)와 C0-11-Y2 효모 균주들의 내염성을 비교 분석하기 위해 salt stress가 주어진 조건에서 스팟팅 실험을 수행하였다. 5%, 10%, 15% NaCl, 10%, 15% KCl, 2 M, 2.5 M sorbitol 첨가된 YPD 배지에 각 균주들을 OD=1부터 1/10씩 연속 희석하여 스팟팅한 후 28℃에서 배양하였다. 3일 배양 결과, 데바리오마이세스 한세니 KD2(Debaryomyces hansenii KD2)와 C0-11-Y2 균주를 표준 균주(type strain) D. hansenii ATCC 36239 균주와 누룩 유래 KCTC 27743 균주와 비교하였을 때, 장류 유래 KD2와 C0-11-Y2 균주는 호염성(halophilic)의 특징을 보였다(도 3A). 내염성이 떨어지는 표준 균주(type strain)에 비해 누룩 및 장 유래 Debaryomyces 균주들은 내염성이 높았으며, 특히 장 유래의 Debaryomyces sp. 균주들의 내염성이 더 강했다. 15% NaCl 배지를 7일 배양한 결과, 누룩 유래 D. hansenii KCTC 27743, 장 유래 데바리오마이세스 한세니 KD2(Debaryomyces hansenii KD2), C0-11-Y2 균주 순으로 강한 내염성을 보였다(도 3B). 장 유래 Debaryomyces sp. 균주들이 인체 내 온도인 37℃에서 자랄 수 있는지 확인하기 위해 YPD 일반 배지와 5% 염(NaCl)이 첨가된 YPD 배지에 각 균주를 OD 1, 10-1, 10-2 그리고 10-3 로 준비하여 스팟팅을 실시하였다(도 3C). 대조군으로 사용한 Saccharomyces cerevisiae 균주의 경우 37℃에서 염 조건에서 보다 일반 YPD 배지에서 더 잘 자라는 모습을 보이는 반면, 37℃ 조건에서 장에서 유래한 데바리오마이세스 한세니 KD2(Debaryomyces hansenii KD2), C0-11-Y2, 그리고 D. hansenii 균주는 일반 배지와 염 첨가 배지에서도 모두 성장하지 못하였다.
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실시예
3>
Debaryomyces
sp
. 유전체 특성
장류 유래 데바리오마이세스 한세니 KD2(Debaryomyces hansenii KD2)와 C0-11-Y2 균주의 배수체(ploidy)를 FACS를 이용하여 분석함으로써 유전체 조립 및 주석화에 필요한 사전 정보를 확보하고자 하였다. 배수체 분석 결과, 데바리오마이세스 한세니 KD2(Debaryomyces hansenii KD2) 균주는 일배체(haploid, H), C0-11-Y2 균주는 이배체(diploid, D)로 분석되었다(도 4A).
유전체 정보 분석은 PacBio Sequel system과 Illumina HiSeq error correction이 병합된 방법으로 수행하였다. 먼저 PacBio SMRT(Single Molecule, Real-Time) sequencing을 위한 양질의 유전체를 확보하기 위해 데바리오마이세스 한세니 KD2(Debaryomyces hansenii KD2)와 C0-11-Y2 균주에 lyticase 처리 후 페놀 추출(phenol extraction) 방법을 거쳐 유전체를 얻었다. 일차적인 de novo assembly 결과, KD2 균주의 유전체는 21개의 contig으로 조립되었고 크기는 약 13 Mb(도 4B), C0-11-Y2 균주의 유전체는 109개 contig으로 조립되었으며 크기는 약 26 Mb(도 4C)로 배수체 분석 결과와 일치하게 KD2 균주는 일배체, C0-11-Y2 균주는 이배체 균주로 확인되었다.
데바리오마이세스 한세니 KD2(Debaryomyces hansenii KD2)와 C0-11-Y2 균주의 유전체 주석화를 위한 첫 단계로 transcriptome data를 생성 및 분석하였고, 이를 기반으로 대략적인 유전체의 형태를 알 수 있었다. KD2 균주는 13 Mb의 유전체에서 6,134개의 단백질 암호화 유전자를 가지고 있으며, 이중 6,063개의 유전자가 NCBI에 알려진 단백질 암호화 유전자와 BLAST matching되었다(도 4D). C11 균주는 26 Mb의 유전체에서 12,395개의 단백질 암호화 유전자를 가지며, 이중 12,207개 유전자가 NCBI에 알려진 단백질 암호화 유전자와 BLAST matching되었다(도 4E). 데바리오마이세스 한세니 KD2(Debaryomyces hansenii KD2) 고품질 유전체 조립을 위하여 Trinity, CANU, Falcon, Flye 등의 여러 가지 유전체 조합 프로그램 사용하여 염색체 수준으로의 whole genome assembly을 진행하고, BLAST 및 genome alignment을 이용하여 참조 유전체 D. hansenii CBS767와의 유전체 서열의 유사정도와 유전체 구조를 분석하였다. Reference 균주인 D. hansenii CBS767 유전체 서열과 99% 동일성을 보이지만 유전체 구조는 염색체 F와 D 사이의 translocation 및 fusion 부위의 갭 존재 등 상이한 결과를 얻었다(도 4F). 이는 데바리오마이세스 한세니 KD2(Debaryomyces hansenii KD2)는 D. hansenii에 속하지만 균주 특이적 유전체 구조를 지니고 있음을 시사한다.
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실시예
4>
Debaryomyces
sp
. 향미 프로파일 특성
효모 균주들이 다양한 향미 관련 대사 물질을 생성하여 콩 발효 식품의 풍미를 향상시킴이 알려져 있음에 따라, 장에서 분리한 Debaryomyces sp. 효모들의 향미 프로파일을 분석하였다. KD2와 C0-11-Y2 균주를 YPD 배지에서 전배양한 후, 25 ml YPD 배지에 초기 OD 0.3으로 접종하였다. 0, 12, 24, 48 시간 배양 후 각 배양액 5 ml을 GC vial에 옮기고 SPME headspace로 향미 성분 화합물을 회수하여 Gas Chromatography-Mass Spectrometry (SPME-GC/MS) 분석을 수행하였다. 표준(Standard) 물질로 에틸 아세테이트(ethyl acetate), 이소아밀 아세테이트(isoamyl acetate)와 세가지 중쇄 지방산[medium chain fatty acid (ethyl butyrate, ethyl hexanoate, ethyl octanoate)]을 사용하였다. SPME-GC/MS 조건은 다음과 같다. Equilibrium을 위해 샘플을 50℃에서 5분간 반응시켰다. SPME 장치(a 50/30 μm divinylbenzene/carboxen/ polydimethylsiloxane (DVB/CAR/PDMS) fiber)를 이용하여 휘발성 화합물을 30분간 흡착시킨 후, 250℃에서 2분간 용출시켰다. 용출된 화합물은 250℃로 설정된 이동선을 따라 GC-MS 기기(7820A series gas chromatograph-5977E quadrupole mass selective detector, Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)로 주입되었다. HP-INNOWax GC column (30 m length × 250 μm i.d. × 0.25 μm film thickness) (19091N-133, Agilent Technologies)을 이용하여 분리를 진행하였고, GC 조건은 다음과 같다: Oven 온도 40℃로 시작, 5분 유지, 5℃/min의 속도로 150℃ 까지 온도 증가 후 10분 유지, 10℃/min의 속도로 220℃ 까지 온도 증가 후 5분 유지; 운반 기체(He) 유속 1.0 mL/min; 이온화 에너지 70 eV; 스캔 범위 33-200 m/z. 보존 지수(retention indices)와 mass spectrum data를 이용하여 각 화합물을 동정하였고, mass spectrum data는 the National Institute of Standards and Technology에서 제공하는 mass spectral libraries를 이용하여 비교하였다.
SPME-GC/MS를 통한 KD2 균주의 향미 프로파일 분석 결과(도 5), 버터향이 나는 acetoin이 다량 감지되었고, 치즈의 시큼한 향을 내는 isobutanoic acid와 butanoic acid도 시간이 갈수록 증가하였다. 아몬드, 카라멜향을 내는 furfural이 24시간에 검출되었고, 아몬드 향을 내는 benzaldehyde도 48시간에 다량 검출되었다. 반면, C0-11-Y2 균주의 향미 프로파일에서는, KD2 균주만큼 다양한 피크(peak)가 나타나지 않았다(도 5). 24시간에 acetoin이 검출되었지만 KD2보다 작은 피크(peak)로 검출되었고, isobutanoic acid와 butanoic acid는 KD2와 비슷하게 검출되었다. 단향을 내는 styrene이 KD2에서보다 C0-11-Y2 균주에서 약간 높은 수준으로 검출되었다. 대조군으로 또 다른 장류 유래 효모인 Wickerhamomyces anomalus 균주의 향미 프로파일에서는 acetate ester들이 다량 검출되었는데(도 5A 및 도 6A), 결과적으로 Debaryomyces sp. 균주들은 이와는 구별되는 독특한 성분의 향미 프로파일을 가지며 특히 KD2 균주가 C0-11-Y2 균주보다 더 다양한 중요 향미 성분을 더 높은 수준으로 생성한다는 것을 알 수 있었다.
<
실시예
5>
Debaryomyces
sp
. 면역활성
조절능
전통 장류에서 분리 동정된 다양한 효모 균주들의 면역활성 유발성을 비교 평가하여 프로바이오틱스로 개발될 수 있는 면역강화 기능성을 지닌 효모 종균을 선발하고자 하였다. 프로바이오틱스 평가를 위해 건강한 인체 유래의 혈액에서 생성된 말초 혈액 단핵구 세포(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)들 중 plate에 부착된 단핵 세포(mononuclear cells)를 분리하고 IMDM 배지에서 배양하였다. 단핵 세포의 수를 세어 1×106 cells/ml이 되도록 튜브에 IL-4 (2 μg/ml)와 GM-CSF (5 μg/ml) 처리한 RPMI 배지 첨가 후 6-well plate에 2 ml 씩 분주하고 37℃ 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 이틀에 한번 씩 배지를 교체해주며 6일 배양하여 미성숙 수지상 세포(immature dendritic cells, iDCs)로 분화시켰다. Immature DC와 효모 균주들을 반응시켜 성숙한 수지상 세포(mature DCs)로부터 표면 분화 마커들의 발현 정도와 사이토카인 분비량을 측정하고자 하였다. 사용한 효모 균주는 데바리오마이세스 한세니 KD2(Debaryomyces hansenii KD2), C0-11-Y2이고, 양성 대조군으로 이미 프로바이오틱 효모(probiotic yeast)로 이용되고 있는 Saccharomyces boulardii 균주를 사용하였다. 효모 균주들을 2 ml YPD 배지에서 16시간 배양한 후 세포를 모아 PBS로 세척하였다. 효모 세포의 OD를 측정하고 RPMI 1640 + 10% FBS 배지를 이용하여 1×107 cells/ml의 농도로 준비하였다. 항생제가 포함되지 않은 complete DC 배지(RPMI 1640 + 10% FBS)를 이용하여 1×106 cells/ml의 농도로 준비한 immature DC를 96-well plate에 100 μl씩 분주하고, 음성 대조군으로 100 μl의 RPMI + 10% FBS 첨가, 양성 대조군으로 1×107 cells/ml 농도의 S. boulardii 현탁액 100 μl 첨가, 실험군으로 데바리오마이세스 한세니 KD2(Debaryomyces hansenii KD2)와 C0-11-Y2 균주 현탁액 100 μl을 각각 첨가하여 총 200 μl의 양으로 iDC와 효모 균주를 37℃ 5% CO2 인큐베이터에서 20 시간 반응시켰다. 각 대조군과 실험군은 5-well 씩 반복 실험하였다. 20 시간 반응 후 단핵 세포로부터 미성숙 수지상 세포로 잘 분화된 것을 현미경으로 관찰할 수 있었고, 효모 균주들과 반응시킨 미성숙 수지상 세포가 성숙한 수지상 세포로 분화한 것을 관찰할 수 있었다.
장류 유래 효모 균주들과 반응시킨 성숙한 수지상 세포(mature DCs)의 표면 분화 마커들의 발현 정도를 관찰하기 위해 효모-수지상 세포 반응액에서 원심분리를 통해 세포 펠릿과 상층액을 분리하였다. 세포 펠릿은 분화 마커 분석에, 상층액은 사이토카인 측정에 이용하였다. 분화 마커 분석을 위하여, 세포 펠릿을 FACS 완충액(2 mM EDTA, 1% BSA, 0.1% sodium azide)으로 세척 후 anti-human HLA-A,B,C (MHC class II) 항체, anti-human HLA-DR (MHC class I) 항체, anti-human CD86 항체 용액을 첨가하여 빛을 차단한 상태로 4℃에서 40분간 반응시켰다. 항체-염색된 세포를 200 μl의 FACS 완충액에 현탁시킨 후 microtube로 옮겨 FACS 분석하였다.
수지상 세포만을 분석하기 위해 gating 작업을 수행하였다(도 7A). 일차적으로 FSC-H와 SSC-H를 통해 세포를 크기별로 분류하였고, FSC-H와 FSC-A를 통해 단일 수지상 세포들을 분류하였다. 마지막으로 수지상 세포의 마커인 CD86과 MHC class II로 수지상 세포들만을 선별하여 샘플 분석을 수행하였다. 측정값은 MFI(mean fluorescence intensity, 평균형광강도)로 나타내었다. CD86 측정 결과(도 7B), 양성 대조군인 S. boulardii를 반응시킨 수지상 세포에서는 미성숙 수지상 세포와 CD86 발현에 큰 차이가 없었다. 반면, 데바리오마이세스 한세니 KD2(Debaryomyces hansenii KD2)와 C0-11-Y2 균주를 반응시킨 수지상 세포에서 CD86의 발현이 증가되었다. 이 양상은 MHC class II 결과에서도 동일하게 나타났다(도 7C). 한편, MHC class I의 발현은 모든 샘플에서 미성숙 수지상 세포와 큰 차이를 보이지 않았다(도 7D). 수지상 세포에서 특이적으로 높게 발현된다고 알려진 CD86과 MHC class II에서 효모 균주 간 발현의 차이가 보였으므로 다음으로 사이토카인 측정을 수행하였다.
효모와 반응시킨 수지상 세포가 분비한 사이토카인의 양을 측정하기 위해 Human Cytokines cytometric bead array (CBA) 키트를 사용하였다. IL-1β, IL-6, TNF-α, IL-8, IL12p70, IL-10에 대한 항체가 접합된, 크기와 내부 형광강도가 각기 다른 beads를 각 사이토카인의 표준(standards) 또는 효모-수지상세포 배양 상층액이 들어있는 96-well V-bottom plate에 첨가하고 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 원심분리하여 상층액 제거 후 바이오틴 표지된 검출(detection) 항체를 첨가, 상온에서 1시간 반응 후, 바로 PE 표지된 스트렙트아비딘(streptavidin)을 첨가하여 상온에서 30분간 반응시켰다. 원심분리하여 상층액 제거 후, 세척 완충액(wash buffer) 첨가 후 beads를 파이펫팅으로 잘 풀어주고 microtube로 옮겨주었다. 이후 FACS 분석을 수행하였다. 각 bead를 분리하기 위해 FSC, SSC, 그리고 두 개의 laser(red, blue)로 조건을 잡았고, flow rate 25 μl/min, 1800 events (300 events/bead)로 설정하여 분석하였다. 각 사이토카인의 양(0 pg/ml ~ 10,000 pg/ml)에 대한 표준 곡선(standard curve)을 얻었고, 이를 이용하여 효모와 반응시킨 수지상 세포가 분비한 사이토카인의 정량값을 얻었다(도 7).
각 5개의 반복실험 값에서 가장 높은 값을 제외하고 미성숙 수지상 세포가 분비한 각 사이토카인의 정량 값에 대비하여 그래프를 그린 결과(도 8), IL-6와 TNF-α가 의미있는 양상을 보였다. 미성숙 수지상 세포(iDC) 대비 S. boulardii (Sb)가 염증 유발 사이토카인인 IL-6와 TNF-α를 가장 높게 유도하였고, Debaryomyces sp. C0-11-Y2와 KD2가 그 뒤를 이었다. 과도한 염증 반응을 완화시켜주고 면역 관용에 관여하여 프로바이오틱스 평가에서 중요하게 간주되는 염증 억제 사이토카인 IL-10에 대해서, 데바리오마이세스 한세니 KD2(Debaryomyces hansenii KD2)와 C0-11-Y2 균주가 S. boulardii보다 높은 수준으로 유도하였다. 특히 KD2 균주는 iDC 대비 약 4배 정도의 높은 수준으로 IL-10을 유도했다. D. hansenii에 대한 이전 연구 결과에서도(Ochangco et al. 2016, World J Microbiol Biotechnol 32(9):141), 염증 유발 사이토카인을 유도하는 균주들은 염증 억제 사이토카인도 함께 유도하였으며, 특히 D. hansenii가 S. boulardii 보다 높은 수준으로 IL-10을 유도하였다고 보고하였고, 이는 본 발명자들의 결과와도 일치하였다. 따라서 장류에서 유래된 데바리오마이세스 한세니 KD2(Debaryomyces hansenii KD2) 균주의 프로바이오틱 효모로서의 잠재성을 확인할 수 있었다.
<
실시예
6>
데바리오마이세스
한세니
KD2(
Debaryomyces
hansenii
KD2)를 사용한 전통간장 및 된장 제조
선별한 대두를 물에 14시간 침지한 후 2시간 동안 탈수시키고 100℃에서 4시간 동안 증자하였다. 100℃에서 4시간 동안 증자한 콩(총 중량 5.69kg)을 메주 6덩이로 성형하였다. 성형한 메주는 15℃에서 90일 동안 발효시킨 후 11% 염 농도의 소금물 20 ℓ에 담군 후 데바리오마이세스 한세니 KD2(Debaryomyces hansenii KD2) 균주를 1×106/ml 농도로 접종하여 25℃에서 3개월 동안 숙성시킨 후, 소금물(간장)에서 메주(된장)를 분리하였다. 분리된 간장은 추가적으로 3개월 더 숙성시켰으며, 된장은 9개월을 더 숙성시켜 완성하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Chung-Ang University Industry-Academy Cooperation Foundation
<120> New yeast Debaryomyces hansenii KD2 strain isolated from Korean
traditional fermented soybean foods and its use
<130> ADP-2019-0009
<140> 10-2019-0040101
<141> 2019-04-05
<160> 2
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 578
<212> DNA
<213> Debaryomyces
<400> 1
gcgcttattg cgcggcgaaa aaccttacac acagtgtttt ttgttattac aagaactttt 60
gctttggtct ggactagaaa tagtttgggc cagaggttta ctgaactaaa cttcaatatt 120
tatattgaat tgttatttat ttaattgtca atttgttgat taaattcaaa aaatcttcaa 180
aactttcaac aacggatctc ttggttctcg catcgatgaa gaacgcagcg aaatgcgata 240
agtaatatga attgcagatt ttcgtgaatc atcgaatctt tgaacgcaca ttgcgccctc 300
tggtattcca gagggcatgc ctgtttgagc gtcatttctc tctcaaacct tcgggtttgg 360
tattgagtga tactcttagt tgaactaggc gtttgcttga aatgtattgg catgagtggt 420
actggatagt gctatatgac tttcaatgta ttaggtttat ccaactcgtt gaatagttta 480
atggtatatt tctcggtatt ctaggctcgg ccttacaata taacaaacaa gtttgacctc 540
aaatcaggta ggattacccg ctgaacttaa gcatatca 578
<210> 2
<211> 574
<212> DNA
<213> Debaryomyces
<400> 2
cgcttattgc gcggcgaaaa accttacaca cagtgttttt tgttattaca agaacttttg 60
ctttggtctg gactagaaat agtttgggcc agaggttact gaactaaact tcaatattta 120
tattgaattg ttatttattt aattgtcaat ttgttgatta aattcaaaaa atcttcaaaa 180
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ggtatatttc tcggtattct aggctcggcc ttacaatata acaaacaagt ttgacctcaa 540
atcaggtagg actacccgct gaacttaagc atat 574
Claims (9)
- KACC 93324P로 수탁되고, 콩 발효식품의 풍미를 향상시키는 향미 성분 화합물을 생산하며, 호염성 및 내염성이 우수한 데바리오마이세스 한세니 KD2(Debaryomyces hansenii KD2) 균주.
- 제1항에 있어서, 상기 균주는 된장으로부터 분리된 것을 특징으로 하는 데바리오마이세스 한세니 KD2(Debaryomyces hansenii KD2) 균주.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 향미 성분 화합물은 플루오로아세틸렌(Fluoroacetylene), 이소발렐알데히드(Isovaleraldehyde), (Z)-2-부테날((Z)-2-Butenal), 이소부틸 알콜(Isobutyl alcohol), 이소아밀 알콜(Isoamyl alcohol), 스티렌(Styrene), 아세토인(Acetoin), 2-노나논(2-Nonanone), 2-하이드로퍼록시펜탄(2-Hydroperoxypentane), 1-이소프로필-1-부탄올(1-Isopropyl-1-butanol), 이소부타노익산(Isobutanoic acid), 부타노익산(butanoic acid), 페닐아세트알데히드(Phenylacetaldehyde), 2-메틸헥사노익산(2-Methylhexanoic acid), 3-하이드록시-2,4,4-트리메틸펜틸 2-메틸프로파노에이트(3-Hydroxy-2,4,4-trimethylpentyl 2-methylpropanoate), 1-[2-(이소부티릴옥시)-1-메틸에틸)-2,2-디메틸프로필 2-메틸프로파노에이트(1-[2-(Isobutyryloxy)-1-methylethyl)-2,2-dimethylpropyl 2-methylpropanoate), 1-(2-하이드록시-1-메틸에틸)-2,2-디메틸프로필 2-메틸프로파노에이트(1-(2-Hydroxy-1-methylethyl)-2,2-dimethylpropyl 2-methylpropanoate), 페닐에틸 알콜(Phenylethyl alcohol), 2-에틸부틸 알콜(2-Ethylbutyl alcohol), 아세트산(Acetic acid), 퍼푸랄(Furfural), 프로파노익산(Propanoic acid), 퍼푸릴 알콜(Furfuryl alcohol), 3-(메틸티오)-1-프로파놀(3-(Methylthio)-1-propanol), 펜틸 알콜(Pentyl alcohol), 벤즈알데히드(Benzaldehyde) 및 디에틸 프탈레이트(Diethyl phthalate)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 화합물인 것을 특징으로 하는 데바리오마이세스 한세니 KD2(Debaryomyces hansenii KD2) 균주.
- 제1항에 있어서, 상기 균주는 염증 억제 사이토카인인 IL-10 생산을 유도하는 것을 특징으로 하는 데바리오마이세스 한세니 KD2(Debaryomyces hansenii KD2) 균주.
- 제1항, 제2항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항에 따른 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱 조성물.
- 제1항, 제2항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항에 따른 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물.
- 제7항에 있어서, 상기 식품은 발효식품인 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
- 제8항에 있어서, 상기 발효식품은 간장 또는 된장인 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
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Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| KR101464546B1 (ko) | 2013-05-31 | 2014-11-25 | 재단법인 발효미생물산업진흥원 | 전통장류 유래 감마-아미노부티르산을 고생산하는 디바리오마이세스 한세니 균주 및 이의 용도 |
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| World J Microbiol Biotechnol.,제32권,141호,1-13면 (2016.07.18.) 1부.* |
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