CN106809958A - 一种防海参霉菌病的海参养殖水质修复剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种防海参霉菌病的海参养殖水质修复剂及其制备方法和应用，所述方法包括制备益生菌原液、液态发酵培养和喷雾干燥处理。本发明所述防海参霉菌病的海参养殖水质修复剂环境耐受性强，漂浮性、悬浮性以及沉浮可控性好，可以快速、长久抑制水体中藻类、霉菌的生长；本发明所述防海参霉菌病的海参养殖水质修复剂能够修复水体酸化和臭底，缓解养殖环境对海参的应激反应，预防海参霉菌病的发生，提高养殖的质量和产量。
Description
技术领域
本发明属于水产养殖领域，涉及一种水产养殖及海洋微生物技术，具体为一种防海参霉菌病的海参养殖水质修复剂及其制备方法和应用。
背景技术
从近年来水产养殖业的发展历程，几乎所有养殖品种都经历过由盛而衰的演变过程，其原因除市场因素之外，病害的影响有时也起着主导作用。所不同的是维持其周期长短而已。目前养殖刺参的主要疾病种类有：寄生虫病、皮肤溃烂病、围口部肿胀病、溢肠症、身体扭曲症、僵化病等。可能为微生物性病原（细菌、病毒、支原体、衣原体、立克次氏体、有害原生动物、寄生虫等）对刺参（宿主）的感染、侵害所致。造成刺参病害及死亡原因也可以说是多方面的。主要有如下因素：近海水域污染严重，生态环境遭到破坏而导致沿岸水质条件发生变化。据资料统计表明85 %以上的养殖病害是水质环境条件差的原因造成的结果。水质问题是造成刺参发病的重要原因之一。受降雨因素影响，池中淡水比率增大，盐度发生急剧变化也是导致刺参死亡的原因之一。外来病害传入，产生交叉感染，导致了蔓延扩大的严重后果。如果盲目地购进外地海参苗种进行越冬或养殖，会将带病苗种引入，由此产生交叉感染。
近几年来，大部分育苗单位都采用虾池种参进行育苗，由于虾池种参严重退化、变异及多代繁育产生幼体抗病力低下等问题，这也是产生病害、死亡率高的一个原因。另外，养殖池投放大苗和小苗的死亡率差距较大，投放大苗和生态养殖苗抗病力强、死亡率低，投放小苗抗病力差、死亡率高。管理不善，措施不力，缺乏科学管理意识。如养殖池老化不加改建或改造不到位，放苗密度超越承载容量，盲目投放病苗等都是产生病害的重要原因。
目前海参养殖发生的疾病主要有以下几种：
（1）烂边病 发病症状主要表现为：在显微镜下耳状幼体边缘突起处组织增生，颜色加深变黑，边缘变得模糊不清，逐步溃烂，最后整个幼体解体消失。经苏木-伊红染色发现细胞核固缩深染，组织细胞坏死。存活个体的发育迟缓、变态率低，即使幼体能变态附板1周左右也大多“化板”消失。
（2）烂胃病 发病症状主要表现为：幼体胃壁增厚、粗糙，胃的周边界限变得模糊不清，继而萎缩变小、变形，严重时整个胃壁发生糜烂，最终可导致幼体死亡。患病幼体摄食能力下降或不摄食，发育迟缓、形态大小不齐，从耳状幼体到樽形幼体变态率低。发病原因一方面是由于饵料品质不佳如投喂老化、沉淀变质的单胞藻饵料，或饵料营养单一如单独投喂金藻类、扁藻等饵料。另一方面，一些细菌感染幼体也可以导致此病发生。
（3）化板症 发病症状主要表现为：附着的幼体收缩不伸展，触手收缩，活力下降，附着力差，并逐渐失去附着在附着基上的能力而沉落池底。在光学显微镜下，患病幼体表皮出现褐色“锈”斑和污物，有的患病稚参体外包被一层透明的薄膜，皮肤逐步溃烂直至解体，骨片散落。镜检池底可见大量骨片。
（4）气泡病 发病症状主要表现为：幼体体内吞有气泡，摄食能力下降或不摄食，最终也可导致幼体死亡。
目前养殖水体微生物制剂以投放光合细菌居多，但由于光合细菌代谢机制的限制，不可能成为改善微生态与水质的主力，应选用其它分解转化和适应能力强，对养殖生物和人类无害的微生物。芽孢杆菌属的大部分细菌符合此要求，且本身又是鱼池常见的菌种。芽孢杆菌，革兰氏染色阳性，是普遍存在的一类好气性细菌，多属芽孢杆菌属，能分泌出活性强的多种酶类，在其生命过程中又能以孢子体形式存在，易于生产和保存，作为饲料微生态添加剂和水体微生态调控剂都有广阔前景。但是单一的芽孢杆菌效果不佳，且芽孢杆菌的载体影响了其在水中的活性。
发明内容
本发明的目的是：为了克服现有技术的缺陷，获得一种能够抑制海参养殖过程中霉菌病发生的水质修复剂，本发明提供了一种防海参霉菌病的海参养殖水质修复剂及其制备方法和应用。
技术方案：一种防海参霉菌病的海参养殖水质修复剂的制备方法，所述方法包括以下步骤：
（1）制备益生菌原液：将在LB琼脂斜面培养基上生长良好的枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌和弯曲芽孢杆菌分别接种至BS液体培养基中，在pH为7.5～7.9，温度为35～38℃振荡培养10～16小时，再以1～5:1:1的体积比混合，制备成益生菌原液；
（2）液态发酵培养：向在密闭式发酵反应器中加入发酵液，并按2～8%的体积比加入营养物质，再将步骤（1）制备的益生菌原液按体积比2～8%接种，进行发酵，压力为0.05～0.35MPa，温度为35～38℃，发酵24～36小时；
（3）喷雾干燥处理：将步骤（2）制得的发酵产物喷雾至吸附载体上，在4～8℃条件下晾干；
其中，所述营养物质，按重量份计包括蚕蛹粉1～9份、玉米粉2～7份、大麦粉3～8份、氯化钠1～3份、海水12～28份；
所述吸附载体，按重量份计包括麸皮2～8份、丝素蛋白1～9份、海泡石粉3～8份。
优选的，步骤（1）制备益生菌原液：将在LB琼脂斜面培养基上生长良好的枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌和弯曲芽孢杆菌分别接种至BS液体培养基中，在pH为7.8，温度为37℃振荡培养13小时，再以3:1:1的体积比混合，制备成益生菌原液。
优选的，步骤（2）液态发酵培养：向在密闭式发酵反应器中加入发酵液，并按6%的体积比加入营养物质，再将步骤（1）制备的益生菌原液按体积比4%接种，进行发酵，压力为0.26MPa，温度为37℃，发酵30小时。
优选的，步骤（3）喷雾干燥处理：将步骤（2）制得的发酵产物喷雾至吸附载体上，在6℃条件下晾干。
优选的，所述吸附载体中海泡石粉为100～200目。
优选的，步骤（1）中菌体浓度为1×108～1.8×108cfu/mL。
优选的，步骤（3）中吸附载体上混合菌体的终浓度为108～1010 cfu/mL。
任一所述方法制备获得的防海参霉菌病的海参养殖水质修复剂。
所述的防海参霉菌病的海参养殖水质修复剂在海参养殖中的应用。
有益效果：（1）本发明所述防海参霉菌病的海参养殖水质修复剂环境耐受性强，漂浮性、悬浮性以及沉浮可控性好，可以快速、长久抑制水体中藻类、霉菌的生长；（2）本发明所述防海参霉菌病的海参养殖水质修复剂能够修复水体酸化和臭底，缓解养殖环境对海参的应激反应，预防海参霉菌病的发生，提高养殖的质量和产量。
具体实施方式
实施例1
一种防海参霉菌病的海参养殖水质修复剂的制备方法，所述方法包括以下步骤：
（1）制备益生菌原液：将在LB琼脂斜面培养基上生长良好的枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌和弯曲芽孢杆菌分别接种至BS液体培养基中，在pH为7.5，温度为35℃振荡培养10小时，再以1:1:1的体积比混合，制备成益生菌原液；
（2）液态发酵培养：向在密闭式发酵反应器中加入发酵液，并按2%的体积比加入营养物质，再将步骤（1）制备的益生菌原液按体积比2%接种，进行发酵，压力为0.05MPa，温度为35℃，发酵24小时；
（3）喷雾干燥处理：将步骤（2）制得的发酵产物喷雾至吸附载体上，在4℃条件下晾干；
其中，所述营养物质，按重量份计包括蚕蛹粉1份、玉米粉2份、大麦粉3份、氯化钠1份、海水12份；
所述吸附载体，按重量份计包括麸皮2份、丝素蛋白1份、海泡石粉3份。
所述吸附载体中海泡石粉为100目。
步骤（1）中菌体浓度为1×108cfu/mL。
步骤（3）中吸附载体上混合菌体的终浓度为108 cfu/mL。
实施例2
一种防海参霉菌病的海参养殖水质修复剂的制备方法，所述方法包括以下步骤：
（1）制备益生菌原液：将在LB琼脂斜面培养基上生长良好的枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌和弯曲芽孢杆菌分别接种至BS液体培养基中，在pH为7.8，温度为37℃振荡培养13小时，再以3:1:1的体积比混合，制备成益生菌原液；
（2）液态发酵培养：向在密闭式发酵反应器中加入发酵液，并按6%的体积比加入营养物质，再将步骤（1）制备的益生菌原液按体积比4%接种，进行发酵，压力为0.26MPa，温度为37℃，发酵30小时；
（3）喷雾干燥处理：将步骤（2）制得的发酵产物喷雾至吸附载体上，在6℃条件下晾干；
其中，所述营养物质，按重量份计包括蚕蛹粉6份、玉米粉5份、大麦粉6份、氯化钠2份、海水26份；
所述吸附载体，按重量份计包括麸皮5份、丝素蛋白6份、海泡石粉5份。
所述吸附载体中海泡石粉为150目。
步骤（1）中菌体浓度为1.5×108cfu/mL。
步骤（3）中吸附载体上混合菌体的终浓度为109 cfu/mL。
实施例3
一种防海参霉菌病的海参养殖水质修复剂的制备方法，所述方法包括以下步骤：
（1）制备益生菌原液：将在LB琼脂斜面培养基上生长良好的枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌和弯曲芽孢杆菌分别接种至BS液体培养基中，在pH为7.9，温度为38℃振荡培养16小时，再以5:1:1的体积比混合，制备成益生菌原液；
（2）液态发酵培养：向在密闭式发酵反应器中加入发酵液，并按8%的体积比加入营养物质，再将步骤（1）制备的益生菌原液按体积比8%接种，进行发酵，压力为0.35MPa，温度为38℃，发酵36小时；
（3）喷雾干燥处理：将步骤（2）制得的发酵产物喷雾至吸附载体上，在8℃条件下晾干；
其中，所述营养物质，按重量份计包括蚕蛹粉9份、玉米粉7份、大麦粉8份、氯化钠3份、海水28份；
所述吸附载体，按重量份计包括麸皮8份、丝素蛋白9份、海泡石粉8份。
所述吸附载体中海泡石粉为200目。
步骤（1）中菌体浓度为1.8×108cfu/mL。
步骤（3）中吸附载体上混合菌体的终浓度为1010 cfu/mL。
实施例1～3制备获得的防海参霉菌病的海参养殖水质修复剂使用效果：
选取3处条件相同的海参养殖圈，平均水深1.5～2m，参苗规格35～50头/500g，密度在9～10头/m2。对照组未添加修复剂，实验组除了定期泼洒实施例1～3所述的修复剂之外，饲喂方式和管理方式与对照组一样。
实验周期为1个月，实验组修复剂每隔3天泼洒一次，泼洒量为4g/m3。
实验期间，定期检测水质，观察海参摄食情况，每隔10天下水摸探，测量海参体重。盐度为35～38‰，水温为16～23℃，pH为7.6～8.5，溶解氧不低于4mg/L。
海参生长和免疫机能结果如下：
| 平均增重/g | 呼吸爆发活力 | 吞噬率/% | ||
| 对照组 | 7.3 | 4.1 | 0.124±0.021 | 28.32±0.215 |
| 实施例1 | 8.9 | 11.3 | 0.639±0.075 | 49.12±0.223 |
| 实施例2 | 8.5 | 14.9 | 0.753±0.068 | 59.84±0.0213 |
| 实施例3 | 8.4 | 14.2 | 0.721±0.072 | 53.6±0.0156 |
Claims (9)
1.一种防海参霉菌病的海参养殖水质修复剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）制备益生菌原液：将在LB琼脂斜面培养基上生长良好的枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌和弯曲芽孢杆菌分别接种至BS液体培养基中，在pH为7.5～7.9，温度为35～38℃振荡培养10～16小时，再以1～5:1:1的体积比混合，制备成益生菌原液；
（2）液态发酵培养：向在密闭式发酵反应器中加入发酵液，并按2～8%的体积比加入营养物质，再将步骤（1）制备的益生菌原液按体积比2～8%接种，进行发酵，压力为0.05～0.35MPa，温度为35～38℃，发酵24～36小时；
（3）喷雾干燥处理：将步骤（2）制得的发酵产物喷雾至吸附载体上，在4～8℃条件下晾干；
其中，所述营养物质，按重量份计包括蚕蛹粉1～9份、玉米粉2～7份、大麦粉3～8份、氯化钠1～3份、海水12～28份；
所述吸附载体，按重量份计包括麸皮2～8份、丝素蛋白1～9份、海泡石粉3～8份。
2.根据权利要求1所述的一种防海参霉菌病的海参养殖水质修复剂的制备方法，其特征在于，步骤（1）制备益生菌原液：将在LB琼脂斜面培养基上生长良好的枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌和弯曲芽孢杆菌分别接种至BS液体培养基中，在pH为7.8，温度为37℃振荡培养13小时，再以3:1:1的体积比混合，制备成益生菌原液。
3.根据权利要求1所述的一种防海参霉菌病的海参养殖水质修复剂的制备方法，其特征在于，步骤（2）液态发酵培养：向在密闭式发酵反应器中加入发酵液，并按6%的体积比加入营养物质，再将步骤（1）制备的益生菌原液按体积比4%接种，进行发酵，压力为0.26MPa，温度为37℃，发酵30小时。
4.根据权利要求1所述的一种防海参霉菌病的海参养殖水质修复剂的制备方法，其特征在于，步骤（3）喷雾干燥处理：将步骤（2）制得的发酵产物喷雾至吸附载体上，在6℃条件下晾干。
5.根据权利要求1所述的一种防海参霉菌病的海参养殖水质修复剂的制备方法，其特征在于，所述吸附载体中海泡石粉为100～200目。
6.根据权利要求1所述的一种防海参霉菌病的海参养殖水质修复剂的制备方法，其特征在于，步骤（1）中菌体浓度为1×108～1.8×108cfu/mL。
7.根据权利要求1所述的一种防海参霉菌病的海参养殖水质修复剂的制备方法，其特征在于，步骤（3）中吸附载体上混合菌体的终浓度为108～1010 cfu/mL。
8.权利要求1～7任一所述方法制备获得的防海参霉菌病的海参养殖水质修复剂。
9.权利要求8所述的防海参霉菌病的海参养殖水质修复剂在海参养殖中的应用。
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