CN106718906B - 一种银边扶芳藤组织培养的培养基及方法 - Google Patents
一种银边扶芳藤组织培养的培养基及方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及组织培养技术领域，尤其涉及一种扶芳藤组织培养的培养基及方法。本发明提供了适用于扶芳藤新品种银边扶芳藤的组织培养培养基，以1/4MS培养基为基础，添加KT、NAA、TDZ和维生素C进行初代培养，以WPM培养基为基础，添加KT和NAA进行几代培养，以WPM培养基添加NAA作为生根培养基。在本发明提供培养基的诱导下，经诱导可使增殖系数提高至5.68，幼苗成活率可达93.6％。
Description
技术领域
本发明涉及组织培养技术领域，尤其涉及一种银边扶芳藤组织培养的培养基及方法。
背景技术
银边扶芳藤(Euonymus fortunei'Emerald Gaiety')为卫矛科卫矛属常绿藤本灌木，别名爬山火儿、爬藤、爬藤卫矛、爬卫矛、爬行卫矛、滂藤、铺地枫、千层楼、青藤。小枝方梭不明显。生长旺盛，是庭院中常见地面覆盖植物，点缀墙角、山石、老树等，都极为出色。银边扶芳藤从扶芳藤(Euonymus fortunei)中选育出来，其叶片两边为银白色，中间为绿色，叶片冬季银边变为红色，且温度越低颜色越红。此新品种色泽鲜艳，并继承了扶芳藤耐寒抗逆性好的特点，容易养护，是北方缺乏的彩色不落叶植物，具有很大市场潜力的园林树种。
为了提高繁殖的效率，并维持母本的优良性状，目前，该新品种主要靠扦插进行繁殖，但扦插繁殖成苗率低，且根系弱、浅，繁殖系数不高。为了在保持母本的优良性状的基础上，达到快速繁殖的目的，应利用组培技术来实现对该扶芳藤新品种的快速繁殖。
但是目前并没有适用于该品种的组织培养的培养基。因此，研发一种可提高扶芳藤新品种外植体增殖系数、丛生芽个数及生根率的组织培养的培养基具有重要的现实意义。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种扶芳藤组织培养的培养基及方法，该培养基可提高扶芳藤新品种外植体的增殖系数、丛生芽个数及生根率。
本发明提供了一种扶芳藤的组培的初代培养基，其为含有0.06mg/L～0.15mg/LKT、0.06mg/L～0.1mg/L NAA、0.0.3mg/L～0.1mg/L TDZ、0.1mg/L维生素C、30g/L蔗糖和7g/L琼脂的1/4MS培养基。
本发明还提供了一种扶芳藤的组培的继代培养基，其为含有0.3mg/L～1mg/L KT、0.07mg/L～0.2mg/L NAA、30g/L蔗糖和7g/L琼脂的WPM培养基。
本发明还提供了一种扶芳藤的组培的生根培养基，其为含有0.01mg/L～0.1mg/LNAA、20g/L蔗糖和7g/L琼脂的WPM培养基。
1/4MS培养基是将MS培养基中大量元素、微量元素、有机物质、铁盐减半而蔗糖、琼脂量不变的培养基，其配方为：NH4NO3 0.4125g/L、KNO30.475g/L、CaCl2·2H2O 0.11g/L、MgSO4·7H2O 0.0925g/L、KH2PO4 0.0425g/L、KI 0.2075mg/L、H3BO3 1.55mg/L、MnSO4·4H2O5.575mg/L、ZnSO4·7H2O 2.15mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.0625mg/L、CuSO4·5H2O 0.00625mg/L、CoCl2·6H2O 0.00625mg/L、FeSO4·7H2O 6.95mg/L、Na2-EDTA·2H2O 9.325mg/L、肌醇25mg/L、烟酸0.125mg/L、盐酸吡哆醇(维生素B6)0.125mg/L、盐酸硫胺素(维生素B1)0.025mg/L、甘氨酸0.5mg/L，pH值为5.80。
WPM培养基是适用于木本植物的培养基，其配方为K2SO4 0.99g/L、MgSO4·7H2O0.37g/L、KH2PO4 0.17g/L、NH4NO3 0.4g/L、MnSO4·4H2O 22.5mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、H3BO3 6.2mg/L、CuSO4·5H2O 0.25mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、Ca(NO3)2·4H2O 0.556g/L、FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2-EDTA 37.3mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L、维生素B60.5mg/L、维生素B1 0.1mg/L、维生素B5 0.5mg/L，pH值为5.80。
激动素(Kinetin，KT)是一种非天然的细胞分裂素，化学名称为6-糖基氨基嘌呤(或N6-呋喃甲基腺嘌呤)，除具有促进细胞分裂的作用外，还具有延缓离体叶片和切花衰老，诱导芽分化和发育及增加气孔开度的作用。
萘乙酸(1-Naphthylacetic acid，NAA)，是广谱型植物生长调节剂，能促进细胞分裂与扩大，诱导形成不定根增加座果，防止落果，改变雌、雄花比率等。可经叶片、树枝的嫩表皮，种子进入到植株内，随营养流输导到全株。
塞苯隆(thidiazuron，TDZ)，是一种新型高效的细胞分裂素用于组培能更好的促进植物的芽分化。
维生素C存在植物生长过程中，起保护和屏蔽有害物质与细菌侵害的作用，在植物组织培养基中添加适量维生素C能够起到防止褐变的作用。
本发明将上述4种物质以特定比例添加到基础培养基中，制得诱导扶芳藤的培养基、诱导扶芳藤丛生芽生根的培养基和扶芳藤组培苗炼苗的培养基，对扶芳藤外植体进行组织培养时，可显著提高扶芳藤的增殖系数、丛生芽发生率及生根率，效果好于现有报道的培养基种类。
一些实施例中，本发明提供的扶芳藤的组培的初代培养基，其为含有0.1～0.15mg/L KT、0.08～0.1mg/L NAA、0.05～0.1mg/L TDZ、0.5～1mg/L维生素C、30g/L蔗糖和7g/L琼脂的1/2MS培养基，pH值为5.8。
一些具体实施例中，本发明提供的扶芳藤的组培的初代培养基，其为含有0.1mg/LKT、0.1mg/L NAA、0.05mg/L TDZ、0.5mg/L维生素C、30g/L蔗糖和7g/L琼脂的1/2MS培养基，pH值为5.8。
一些具体实施例中，本发明提供的扶芳藤的组培的初代培养基，其为含有0.15mg/L KT、0.08mg/L NAA、0.1mg/L TDZ、1mg/L维生素C、30g/L蔗糖和7g/L琼脂的1/2MS培养基，pH值为5.8。
一些具体实施例中，本发明提供的扶芳藤的组培的初代培养基，其为含有0.06mg/L KT、0.06mg/L NAA、0.03mg/L TDZ、0.1mg/L维生素C、30g/L蔗糖和7g/L琼脂的1/2MS培养基，pH值为5.8。
一些实施例中，本发明提供的扶芳藤的组培的继代培养基，其为含有0.3～0.5mg/L KT、0.07～0.1mg/L NAA、30g/L蔗糖和7g/L琼脂的WPM培养基。
一些具体实施例中，本发明提供的扶芳藤的组培的继代培养基，其为含有0.3mg/LKT、0.07mg/L NAA、30g/L蔗糖和7g/L琼脂的WPM培养基。
一些具体实施例中，本发明提供的扶芳藤的组培的继代培养基，其为含有0.5mg/LKT、0.1mg/L NAA、30g/L蔗糖和7g/L琼脂的WPM培养基。
一些具体实施例中，本发明提供的扶芳藤的组培的继代培养基，其为含有1mg/LKT、0.2mg/L NAA、30g/L蔗糖和7g/L琼脂的WPM培养基。
一些实施例中，本发明提供的扶芳藤的组培的生根培养基，其为含有0.01～0.05mg/L NAA、20g/L蔗糖和7g/L琼脂的WPM培养基。
一些具体实施例中，本发明提供的扶芳藤的组培的生根培养基，其为含有0.01mg/L NAA、20g/L蔗糖和7g/L琼脂的WPM培养基。
一些具体实施例中，本发明提供的扶芳藤的组培的生根培养基，其为含有0.05mg/L NAA、20g/L蔗糖和7g/L琼脂的WPM培养基。
一些具体实施例中，本发明提供的扶芳藤的组培的生根培养基，其为含有0.1mg/LNAA、20g/L蔗糖和7g/L琼脂的WPM培养基。
本发明提供的扶芳藤组培的初代培养基、继代培养基、生根培养基所适用的扶芳藤的品种为银边扶芳藤。
本发明还提供了一种扶芳藤的组织培养方法，包括如下步骤：
步骤1：将扶芳藤外植体接种到所述初代培养基，培养至芽眼萌动；
步骤2：芽眼萌动的外植体接种至所述继代培养基，培养至分化出丛生苗；
步骤3：所述丛生苗转接到所述生根培养基，培养后，经室外炼苗，得到扶芳藤幼苗；
所述扶芳藤的品种为银边扶芳藤。
本发明中，外植体为扶芳藤的茎段，经消毒后切成0.5～1cm的带腋芽的茎段。
本发明中，外植体获取的时间为每年4月中旬。
选取幼嫩无病虫害的枝条，采回后摘去叶片，作为外植体。
本发明中，消毒处理具体为：将扶芳藤的枝条用水冲洗后，以NaClO溶液清洗，然后经酒精浸泡、HgCl溶液浸泡，再用水浸泡。
本发明中，所述用水冲洗的时间为2h；
所述NaClO溶液中NaClO的质量分数为0.1％；
所述酒精中乙醇的体积分数为75％，酒精浸泡的时间为20s；
所述HgCl溶液中HgCl的质量分数为0.1％，HgCl溶液浸泡的时间为5min；
所述用水浸泡的次数为5～6次，每次不短于3min。
用水冲洗时需用双层纱布包住外植体，在流水下冲洗2h。
用水浸泡采用的水为无菌水。
外植体接种至初代培养基，该操作在无菌工作台(紫外灯杀菌15min后，接种前再以75％的乙醇溶液喷洒消毒)进行，器具(镊子、手术刀、接种盘)用体积分数为75％的酒精喷洒消毒，接种前，内资、手术刀在酒精灯上反复烧1min。
外植体接种的容器为PP塑料组培瓶(500mL)，每瓶3个外植体。
本发明中，步骤1、步骤2、步骤3中所述培养的光照周期为12h/d，光照强度为3000lx，培养温度为25℃，相对湿度为60％，每3天用紫外灯灭菌30min。
外植体接入初代培养基，15～20d芽眼萌动。芽眼萌动后，继代培养基中培养30～40d，芽眼分化完成，叶片展开，产生大量丛生苗。丛生苗在生根培养基上培养25d～35天，长出3～5条根系。
本发明中，步骤3中所述炼苗于室外进行。
本发明中，步骤3中所述室外炼苗为：取出组培苗，洗掉根部附着的培养基，晾干水分后栽植至培养土中，喷施含有多菌灵和代锌蒙森混合液，放置背光处，覆膜保湿，保持温度在15～20℃之间；待长出新叶后将苗挪至向阳处，并逐渐去掉覆膜，30d后转入正常养护。
本发明提供了适用于扶芳藤新品种银边扶芳藤的组织培养培养基，以1/4MS培养基为基础，添加KT、NAA、TDZ和维生素C进行初代培养，以WPM培养基为基础，添加KT和NAA进行几代培养，以WPM培养基添加NAA作为生根培养基。在本发明提供培养基的诱导下，经诱导可使增殖系数提高至5.68，幼苗成活率可达93.6％。
具体实施方式
本发明提供了一种扶芳藤组织培养的培养基及方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
1、生长环境
(1)采用固体MS培养基，其中琼脂质量浓度7g/L，蔗糖质量浓度30g/L，pH值为5.8，所配培养基经过高压高温蒸汽灭菌，126℃下5min。
(2)组培室，光照时间12h/d，光照强度3000lx，培养温度为25℃，相对湿度60％，每3d用紫外灯灭菌30min。
2.外植体的处理
(1)每年4月期间采取生长健康无病虫害幼嫩带芽的茎段作为外植体。
(2)采集完成后，先去掉叶片只留腋芽，然后用纱布包好放自来水下流水冲洗2h。
(3)用软毛刷蘸取含有0.1％NaClO的溶液清洗外植体。注：在清洗时刷子要顺着腋芽刷，避免将腋芽刷掉。
(4)在超净工作台内依次用75％酒精消毒20s、0.1％HgCl消毒5min，注：消毒液的使用次数不超过10次，达到后倒掉重新配置。HgCl要求避光保存，以免失效。
(5)消毒完成后用无菌水清洗5-6遍，每次不少于3min。
(6)清洗完成后，在超净工作台内，用手术刀和镊子将外植体切成有一对芽或一个顶芽的长0.5-1.0cm小段待用。
3、初代培养
(1)打开超净工作台紫外灯杀菌15min。
(2)接种前用75％的酒精喷洒消毒。
(3)在超净工作台内，将手术刀、镊子、接种盘用75％酒精充分消毒。
(4)接种前将手术刀、镊子在酒精灯上反复烧1min。
(5)将清洗好的外植体用手术刀切掉底部1-2mm，接种到分装好的培养基中。初代培养基为：
组1：1/4MS+0.1mg/L KT+0.1mg/L NAA+0.05mg/L TDZ+0.5mg/L VC+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH 5.8。
组2：1/4MS+0.15mg/L KT+0.08mg/L NAA+0.1mg/L TDZ+1mg/L VC+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH 5.8。
组3：1/4MS+0.06mg/L KT+0.06mg/L NAA+0.03mg/L TDZ+0.1mg/L VC+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH 5.8。
对照：1/4MS+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH 5.8。
各组外植体接种后进行观察，记录芽分化状况。统计外植体的芽眼萌动天数、叶色、褐化百分率如下表：
表1丛生芽增值情况表
| 观察内容 | 芽眼萌动天数(d) | 叶色 | 褐化百分率(％) |
| 组1 | 10 | 嫩绿 | 3 |
| 组2 | 20 | 嫩绿 | 5.6 |
| 组3 | 未萌动 | 无 | 83.1 |
| 对照 | 未萌动 | 无 | 59.6 |
结果表明：组1中10d后芽眼萌动，子叶展开，叶色嫩绿；
组2中20d后少数材料芽眼萌动，子叶展开，没有发生褐化情况；
组3和对照中芽眼未萌动，并且部分材料发生褐化。
实施例2
(1)选取实施例1组1中芽眼已萌动的外植体。
(2)在超净工作台内，用镊子小心将外植体夹出转接到分装好的培养基中。继代培养基为：
组A：WPM+0.3mg/L KT+0.07mg/L NAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH 5.8。
组B：WPM+0.5mg/L KT+0.1mg/L NAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH 5.8。
组C：WPM+1mg/L KT+0.2mg/L NAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH 5.8。
对照：WPM+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH 5.8。
继代培养后，记录芽分化状况。统计外植体的增殖系数、丛生芽产生时间、丛生芽个数如下表：
表2丛生芽增值情况表
| 观察内容 | 接种外植体数(个) | 增殖系数 | 丛生芽产生时间(d) | 丛生芽个数(个) |
| 组A | 100 | 5.68 | 30 | 5 |
| 组B | 100 | 3.47 | 40 | 2 |
| 组C | 100 | 0.28 | 50 | 0.18 |
| 对照 | 100 | 0.15 | 无 | 无 |
结果表明：
组A中材料产生大量丛生芽，生长健康，并且繁殖系数为5.68。
组B中部分材料产生丛生芽，繁殖系数为3.47。
组C和对照材料不产生丛生芽或仅产生极少的丛生芽。
实施例3
(1)选取实施例2组1中经继代培养中叶片已经展开，包含2对以上腋芽的小苗。
(2)在超净工作台内，用镊子小心夹出转接到生根培养基：
组a：WPM+0.01mg/L NAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH 5.8。
组b：WPM+0.05mg/L NAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH 5.8。
组c：WPM+0.1mg/L NAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH 5.8。
对照：WPM+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH 5.8。
生根培养后，统计外植体生根时间，生根数。结果如下表：
表3丛生芽生根情况表
| 观察内容 | 接种外植体数(个) | 生根时间(d) | 生根情况(条) | 生根平均数(个) |
| 组a | 100 | 25 | 3～5 | 3.8 |
| 组b | 100 | 35 | 2～3 | 2.3 |
| 组c | 100 | 35 | 1 | 0 |
| 对照 | 100 | 40 | 0 | 0 |
结果表明：
组a～b中材料生根状况良好，炼苗后成活率分别为93.6％、87.2％。
组c和对照中材料生根情况不佳，炼苗后成活率分别为11.3％、5.4％。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.银边扶芳藤的组培培养基，其特征在于，包括初代培养基、继代培养基、生根培养基；其中：
所述初代培养基为含有0.1mg/L KT、0.1mg/L NAA、0.05mg/LTDZ、0.5mg/L维生素C、30g/L蔗糖和7g/L琼脂的1/4MS培养基；
所述继代培养基为含有0.3mg/L KT、0.07mg/L NAA、30g/L蔗糖和7g/L琼脂的WPM培养基；
所述生根培养基为含有0.01mg/L NAA、30g/L蔗糖和7g/L琼脂的WPM培养基。
2.一种扶芳藤的组织培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：将扶芳藤外植体接种到权利要求1所述初代培养基，培养至芽眼萌动；
步骤2：所述芽眼萌动的外植体接种至权利要求1所述的继代培养基，培养至分化出丛生苗；
步骤3：所述丛生苗转接到权利要求1所述的生根培养基，培养后，经室外炼苗，得到扶芳藤幼苗；
所述扶芳藤的品种为银边扶芳藤。
3.根据权利要求2所述的组织培养方法，其特征在于，所述外植体为扶芳藤的茎段，经消毒后切成0.5～1cm的带腋芽的茎段。
4.根据权利要求3所述的组织培养方法，其特征在于，所述消毒处理具体为：将扶芳藤的枝条用水冲洗后，以NaClO溶液清洗，然后经酒精浸泡、HgCl溶液浸泡，再用水浸泡。
5.根据权利要求4所述的组织培养方法，其特征在于，
所述用水冲洗的时间为2h；
所述NaClO溶液中NaClO的质量分数为0.1％；
所述酒精中乙醇的体积分数为75％，酒精浸泡的时间为20s；
所述HgCl溶液中HgCl的质量分数为0.1％，HgCl溶液浸泡的时间为5min；
所述用水浸泡的次数为5～6次，每次不短于3min。
6.根据权利要求2所述的组织培养方法，其特征在于，步骤1、步骤2、步骤3中所述培养的光照周期为12h/d，光照强度为3000lx，培养温度为25℃，相对湿度为60％，每3天用紫外灯灭菌30min。
7.根据权利要求2所述的组织培养方法，其特征在于，步骤3中所述室外炼苗为：取出组培苗，洗掉根部附着的培养基，晾干水分后栽植至培养土中，喷施含有多菌灵和代锌蒙森混合液，放置背光处，覆膜保湿，保持温度在15～20℃之间；待长出新叶后将苗挪至向阳处，并逐渐去掉覆膜，30d后转入正常养护。
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Address after: 262411 No. 37, Honghe Town, Changle County, Weifang City, Shandong Province Patentee after: Shandong Tian Xu agricultural and Forestry Technology Co.,Ltd. Patentee after: Henan Hongfeng biological high tech Limited by Share Ltd. Patentee after: SHANDONG CITY GARDENING HORTICULTURE CO.,LTD. Address before: 262411 No. 37, Honghe Town, Changle County, Weifang City, Shandong Province Patentee before: Shandong Tian Xu agricultural and Forestry Technology Co.,Ltd. Patentee before: HENAN HOFUNG SEED Co.,Ltd. Patentee before: SHANDONG CITY GARDENING HORTICULTURE Co.,Ltd. |
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