CN105850743A

CN105850743A - 一种卫矛茎段不定芽诱导方法

Info

Publication number: CN105850743A
Application number: CN201610287767.6A
Authority: CN
Inventors: 陆秀君; 赵丽蒙; 刘广林; 张晓林; 张丽杰; 孙晓梅; 王玉涛
Original assignee: Shenyang Agricultural University
Current assignee: Shenyang Agricultural University
Priority date: 2016-05-04
Filing date: 2016-05-04
Publication date: 2016-08-17
Anticipated expiration: 2036-05-04
Also published as: CN105850743B

Abstract

本发明提供一种卫矛茎段不定芽诱导方法，其包括以下步骤：选取具有3‑5个节间长、势良好的当年生枝条，剪去叶片的茎段；用洗衣粉水和流水将茎段清洗干净；将外植体于超净工作台上采用紫外灯照射、75%酒精、吐温结合升汞等系列灭菌方法；将茎段基部朝下，竖直插入培养基中；培养温度24±1℃，湿度50－60%，光周期16h光照，光照强度2000－3000lx；生长状况记录。本发明以卫矛茎段为外植体，成功建立了卫矛茎段无菌体系，成功诱导出不定芽，且不定芽诱导率达到70.67%，每个外植体平均芽数达5.6个，在随后增殖过程中的增殖系数达到了23.51，平均芽长1.28cm。这种生产周期短，繁殖系数高。

Description

一种卫矛茎段不定芽诱导方法

技术领域

本发明涉及一种植物组织培养技术方法，特别涉及一种卫矛茎段不定芽诱导方法。

背景技术

卫矛(Euonymus alatus (Thunb.) Sieb.)是卫矛科(Celastracea)卫矛属(Euonymus L.)落叶灌木，又名鬼箭羽、见肿消、千层皮等。其株形密集，秋叶紫红色，假种皮橘红色，极具观赏价值，为重要的野生观叶观果的灌丛。同时，卫矛根、皮均可入药，具有破血、杀虫、通经、散疲止痛等功效和调血脂、降血糖、延缓动脉粥样硬化等作用，近年来我国临床上用于治疗糖尿病已取得显著效果，卫矛在韩国和日本也多用于对抗肿瘤，具有很好的药用价值。

中国除新疆、青海、西藏、广东及海南以外，各地均有分布，但都是在野外自然条件下生长，种植却不普遍。虽然现如今卫矛已在欧洲普遍栽培，但是引进成本高，驯化困难，因此我国需研究出这个集观赏价值与经济价值为一体的乡土树种------卫矛的培育技术。然而由于卫矛种子具有假种皮，种子内含油量高，休眠期长，生产中获得卫矛实生苗难度大。传统的扦插、嫁接等无性繁殖技术，繁殖系数低，速度慢，品质易退化，且操作比较困难，无法规模化生产，很难满足当今市场的需求。

组织培养是植物离体快繁的重要实验技术，在很多苗木生产中得到推广和应用，基本步骤包括外植体的选取、处理、灭菌、诱导培养、增殖培养、生根培养、炼苗、移栽等一系列过程。实验步骤并不繁复，但要诱导出大量不定芽，进而获得丛生苗，每一个步骤的操作都非常重要，尤其是培养基的筛选。不同植物、同一植物的不同组织器官，对激素的作用浓度以及基本培养基的种类有很大差异，需要进行大量的摸索和改进。而卫矛茎段诱导不定芽发生技术至今并没有报道。

综上所述，如果能找到卫矛茎段诱导不定芽发生的技术方法，为卫矛快繁体系建立提供理论依据和技术支撑，对推动卫矛工厂化育苗及普遍栽植的实现具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于针对卫矛引进成本高，传统繁殖方法困难，且繁殖系数低，工作量大等问题，基于组织培养技术，找到一种简单可行的卫矛不定芽获得方法，为后续的卫矛离体快繁体系的建立以及卫矛种苗的大量生产和供应提供技术支持。

本发明技术方案如下：

1、外植体的选取：

选取在野外健康生长的卫矛植株，于5月中旬晴天午后14:00时左右，从2-3年生的植株上选取具有3-5个节间、长势良好的当年生枝条若干，置于自封袋内带回实验室。

2、外植体预处理：

（1）将采取的枝条剪去叶片，并剪成2cm的茎段；

（2）将剪好的茎段放在流水下冲洗10min，去除表面脏物；

（3）将处理好的茎段放于洗衣粉水中浸泡30min，期间用毛笔不断刷洗茎段的腋芽处，进行深层清理；

（4）置于流水下冲洗2h，用干净滤纸吸干水分，移至超净工作台备用。

3、外植体灭菌处理：

（1）移到超净工作台的茎段，先用紫外灯照射10min；

（2）将茎段倒于无菌瓶中，先用75%酒精灭菌30s，期间不断用无菌镊子搅拌，之后用无菌水漂洗3次，转移至新的无菌瓶中；

（3）在0.1%升汞中加入两滴吐温-20，再一同作用灭菌8min，期间不断用无菌镊子搅拌，之后用无菌水漂洗5次，准备接种。

4、外植体接种：

将茎段放在无菌培养皿的无菌滤纸上，用无菌的手术刀和镊子，把茎段两端切掉少许，切后茎段长1.5cm，进行接种；

将诱导出来的不定芽切分成单个芽，再将单芽接种在增殖培养基中进行增殖培养。

5、培养基：

（1）诱导培养基：MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.05mg/L，附蔗糖30g/L，琼脂7.0g/L，pH5.8；

（2）增殖培养基：MS+NAA 0.05mg/L+6-BA 1.0mg/L或MS+NAA 0.05mg/L+6-BA0.5mg/L，附蔗糖30g/L，琼脂7.0g/L，pH5.8。

6、培养条件：培养温度24±1℃，湿度50－60%，光照时间16h/d，光照强度2000－3000lx，培养周期60天。

7、生长状况：

（1）诱导培养：于MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.05mg/L培养基上，诱导10天后，在茎段中上部观察到有浅绿色愈伤组织；20天后，愈伤组织逐渐变为黄褐色；培养40天后，产生深褐色愈伤组织，并有不定芽形成；培养至60天，不定芽诱导率达70.67%，每个外植体平均芽数达5.6个；

（2）增殖培养：于MS+NAA 0.05mg/L+6-BA 1.0mg/L或MS+NAA 0.05mg/L+6-BA0.5mg/L培养基上，可以诱导单个不定芽增殖，在培养10天后，单芽基部变为白色并开始分化形成多个小芽，随后不定芽继续增殖和伸长，在60天时，MS+NAA 0.05mg/L+6-BA 0.5mg/L培养基上增殖系数达19.25，MS+NAA 0.05mg/L+6-BA 1.0mg/L培养基上增殖系数达23.51，平均芽长1.28cm。

本发明的积极效果是：提供的一种卫矛茎段无菌体系的建立方法，对不定芽进行诱导和增殖，可以在短时间内获得大量卫矛不定芽，为卫矛快繁体系建立提供理论依据和技术支持。

附图说明

图1：卫矛茎段不定芽诱导10天后产生的浅绿色愈伤组织；

图2：卫矛茎段不定芽诱导20天后产生的黄褐色愈伤组织；

图3：卫矛茎段不定芽诱导40天后褐色愈伤组织上长出的不定芽；

图4：卫矛茎段不定芽诱导60天后获得的不定芽；

图5：MS+NAA 0.05mg/L+6-BA 0.5mg/L增殖培养基上获得的丛生芽；

图6：MS+NAA 0.05mg/L+6-BA 1.0 mg/L增殖培养基上获得的丛生芽。

具体实施方式

1、外植体的选取：

2、外植体预处理：

（1）将采取的枝条剪去叶片，并剪成2cm的茎段；

（2）将剪好的茎段置于烧杯中，并蒙上纱布放在流水下，以最大水流冲洗10min，以去除表面脏物；

（3）将冲洗过的茎段放于洗衣粉水中浸泡30min，期间用毛笔不断刷洗茎段的腋芽处，进行深层清理；

（4）将洗衣粉水中的茎段捞出转到另一烧杯中，蒙上纱布置于流水下冲洗2h，再用干净滤纸将茎段表面水分吸干，移至超净工作台备用。

3、外植体灭菌处理：

（1）移到超净工作台的茎段，平铺在灭菌后的滤纸上，先用紫外灯照射5min，再将茎段用镊子翻转过来，继续照射5min，在紫外线照射期间将工作台的风机打开；

4、外植体接种：

将茎段放在无菌培养皿的无菌滤纸上，用无菌的手术刀和镊子，把茎段两端切掉少许（尽量做到一刀完成，不要反复切割），切后茎段长1.5cm，将茎段基部朝下，竖直插入培养基中，茎段基部不要接触到瓶底；

5、培养基：（含蔗糖30g/L，琼脂7.0g/L，pH5.8）

（1）诱导培养基：MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.05mg/L

（2）增殖培养基：MS+NAA 0.05mg/L+6-BA 1.0mg/L或

MS+NAA 0.05mg/L+6-BA 0.5mg/L

6、培养条件：培养温度24±1℃，光照时间为16h/d，光照强度2000－3000lx，培养周期60天。

7、生长状况：

（1）诱导培养：于MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.05mg/L培养基上，诱导10天后，在茎段中上部观察到有浅绿色愈伤组织（图1）；20天后，愈伤组织逐渐变为黄褐色（图2）；培养40天后，产生深褐色愈伤组织，并有不定芽形成（图3）；培养至60天，不定芽诱导率达70.67%，每个外植体平均芽数达5.6个（图4）；

（2）增殖培养：于MS+NAA 0.05mg/L+6-BA 1.0mg/L或MS+NAA 0.05mg/L+6-BA0.5mg/L培养基上，可以诱导单个不定芽增殖，在培养10天后，单芽基部变为白色并开始分化形成多个小芽，随后不定芽继续增殖和伸长，在60天时，MS+NAA0.05mg/L+6-BA0.5mg/L上增殖系数达19.25（图5），MS+NAA 0.05mg/L+6-BA 1.0mg/L上增殖系数达23.51，平均芽长1.28cm（图6）。

本发明成功建立了卫矛茎段的无菌体系，并诱导了卫矛茎段不定芽的产生及增殖。

Claims

1.一种卫矛茎段不定芽诱导方法，其特征在于按如下步骤进行：

（1）、外植体的选取：

在野外从2-3年生的卫矛健康植株上选取长势良好的当年生枝条若干，置于自封袋内带回实验室；

（2）外植体预处理：

（a）将采取的枝条剪去叶片，并剪成2cm的茎段；

（b）将剪好的茎段置于烧杯中，并蒙上纱布放在流水下，以最大水流冲洗，以去除表面脏物；

（c）将冲洗过的茎段放于洗衣粉水中浸泡，期间用毛笔不断刷洗茎段的腋芽处，进行深层清理；

（d）将洗衣粉水中的茎段捞出转到另一烧杯中，蒙上纱布置于流水下冲洗，再用干净滤纸将茎段表面水分吸干，移至超净工作台备用；

（3）、外植体灭菌处理：

（a）移到超净工作台的茎段，平铺在灭菌后的滤纸上，先使用紫外灯照射10min，在紫外线照射期间将工作台的风机打开；

（b）将茎段倒于无菌瓶中，先用75%酒精灭菌，期间不断用无菌镊子搅拌，之后用无菌水漂洗3次，转移至新的无菌瓶中；

（c）使用加入两滴吐温-20的0.1%升汞灭菌，期间不断用无菌镊子搅拌，之后用无菌水漂洗5次，准备接种；

（4）、外植体接种：

将茎段放在无菌培养皿的无菌滤纸上，用无菌的手术刀和镊子，把茎段两端切掉少许，插入培养基中；

将诱导出来的不定芽切分成单个芽，再将单芽接种在增殖培养基中进行增殖培养；

（5）、培养条件；培养温度24±1℃，湿度50－60%，光照时间为16h/d，光照强度2000－3000lx，培养周期60天；

（6）、生长状况：

（a）诱导培养：于MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.05mg/L培养基上，诱导10天后，在茎段中上部观察到有浅绿色愈伤组织；20天后，愈伤组织逐渐变为黄褐色；培养40天后，产生深褐色愈伤组织，并有不定芽形成；培养至60天，不定芽诱导率达70.67%，每个外植体平均芽数达5.6个；

（b）增殖培养：于MS+NAA 0.05mg/L+6-BA 1.0mg/L或MS+NAA 0.05mg/L+6-BA0.5mg/L培养基上，可以诱导单个不定芽增殖，在培养10天后，单芽基部变为白色并开始分化形成多个小芽，随后不定芽继续增殖和伸长，在60天时，MS+NAA 0.05mg/L+6-BA0.5mg/L培养基上增殖系数达到19.25，MS+NAA 0.05mg/L+6-BA 1.0mg/L培养基上增殖系数高达23.51，平均芽长1.28cm。

2.按照权利要求1所述的一种卫矛茎段不定芽诱导方法，其特征在于：所述步骤1中，选取具有3-5个节间、长势良好的当年生枝条。

3.按照权利要求1所述的一种卫矛茎段不定芽诱导方法，其特征在于：所述步骤2中，外植体的预处理为：流水冲洗需10min，去掉表面脏物，洗衣粉水需浸泡30min进行深层清洗，之后流水冲洗2h。

4.按照权利要求1所述的一种卫矛茎段不定芽诱导方法，其特征在于：所述步骤3中，外植体的灭菌处理为：超净工作台上，先用紫外灯照射5min，再将茎段用镊子翻转过来，继续照射5min，75%酒精处理30s，两滴吐温-20结合0.1%升汞共同作用8min。

5.按照权利要求1所述的一种卫矛茎段不定芽诱导方法，其特征在于：所述步骤4中，切后茎段长1.5cm，茎段基部朝下，竖直插入培养基中，茎段基部不要接触到瓶底。

6.按照权利要求1所述的一种卫矛茎段不定芽诱导方法，其特征在于：所述步骤6中，诱导培养基：MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L，pH5.8；增殖培养基：MS+NAA 0.05mg/L+6-BA 1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L或MS+NAA 0.05mg/L+6-BA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L，pH5.8。