CN106701695A - 一种菊花中多酚氧化酶快速高效提取测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种菊花中多酚氧化酶快速高效提取测定方法，在菊花中加入石英砂、聚乙烯吡咯烷酮以及柠檬酸‑磷酸缓冲液，研磨成匀浆，冷藏浸置，两次离心，即得粗酶液；将含有邻苯二酚的缓冲液与上述的粗酶液分别进行水浴锅保温，快速混合均匀后，倒入比色皿，同步记时，并用煮死的粗酶液作为对照；测ΔOD410nm波长处值的变化，根据时间以及波长值的变化计算多酚氧化酶的活力。本发明方法原料广，提取过程简化，反应速度快，测量时间快，测定结果精确，适用于新鲜菊花、不同温度热风干燥菊花、不同时间段微波干燥菊花、水蒸汽蒸菊花等任何加工方式的菊花中多酚氧化酶的测定。

Description

一种菊花中多酚氧化酶快速高效提取测定方法
技术领域
本发明涉及中药提取领域，具体是一种菊花中多酚氧化酶快速高效提取测定方法。
背景技术
多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase，简称PPO)是核编码的铜金属酶，在植物组织中，多酚氧化酶是与内囊体膜结合在一起的，天然状态无活性，但将组织匀浆或损伤后酶活被活化，从而表现出活性。
多酚氧化酶催化多酚氧化成醌，醌聚合并与细胞内蛋白质的氨基酸反应，结果发生黑色素沉淀，这就是新鲜花类药材的褐化原因。药材褐化，直接影响美观；药商从经济利益考虑，为节约成本，多采用硫磺熏，硫磺燃烧产生SO2，污染药材，影响药质。
2015版中国药典一部菊花规定，“本品按干燥品计算，含绿原酸(C16H18O9)不得少于0.2％”，新鲜采摘菊花药材挤压受损后，多酚氧化酶发生催化作用，药材颜色褐化，绿原酸属于反应底物，含量显著降低。
通过对多酚氧化酶的研究发现许多条件能影响花类药材褐化的发生。必需具备的条件有三个，底物(多酚类物质)、氧和多酚氧化酶。准确测定多酚氧化酶的活性，对预防药材褐化的发生及寻找有效保障药材质量的加工方法，具有实际重要性。
多酚氧化酶活性测定的方法，一般有四种方法，分别为减压法、氧电极法、比色法、碘量滴定法。其中比色法操作简便，结果较准确。比色法又分为终止法(反应产物吸收光谱分析)和记时法(测定反应的动力学分析。终止法，一般是利用终止剂三氯乙酸将反应终止的方法，记时法，则要求在单位时间内完成。终止法简单易行，但准确性不如记时法，记时法则对实验条件要求较高。具体如下：
1、粗酶液的制备
方法一：称取马铃薯植物组织20g，加入2g不溶性聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和100mL0.1mmol/LL磷酸缓冲液(pH6.5)，于匀浆机中打碎成匀浆，用尼龙网袋(或纱布袋)过滤，滤液中加入30％饱和度硫酸铵，离心除去沉淀，上清液再加硫酸铵使达60％饱和度，离心收集沉淀，将所得沉淀溶于少量0.01％mol/L磷酸缓冲液(pH6.5)中，即为粗酶液。上述实验方法出处《现代植物生理学实验指南》中国科学院上海植物生理研究所、上海市植物生理学会编；《植物生理学实验指导》周祖富、黎兆安主编广西大学。
方法二：称取4g马铃薯植物组织，加入5倍量(m/v)的0.1mol/L pH6.8柠檬酸-磷酸缓冲液及0.8g聚乙烯吡咯烷酮，冰浴研磨，4层纱布过滤，10000r/min离心15min，上清液用于酶活力测定。上述实验方法出处《植物生理学实验指导》二版，陈建勋、王晓峰主编的《生科学与工程系列教材》。
2、酶活性测定：采用比色法测定。
终止法，配置酶的反应体系中，包括3.9mL0.05mol/L、pH5.5磷酸缓冲液、1.0mL/L儿茶酚和0.1mL酶液。以煮过失活的酶液为对照，做两组重复实验，反应体系加入酶液后，于37℃中保湿10min，迅速放入冰浴中，立即加入2mL20％三氯乙酸，以5000转速离心10min，收集上清液，并适当的稀释，于525nm波长下测定其光密度。上述实验方法出处《现代植物生理学实验指南》中国科学院上海植物生理研究所、上海市植物生理学会编；《植物生理学实验指导》周祖富、黎兆安主编广西大学。
记时法1，3mL酶活力测定反应液，测定OD398值的变化，以每minΔOD398变化0.01表示一个酶活力单位。上述实验方法出处《植物生理学实验指导》二版，陈建勋、王晓峰主编的《生物科学与工程系列教材》。
记时法2，在试管中加入3.9ml 0.05mol·L-1pH5.5磷酸缓冲液，1.0ml 0.1mol·L-1儿茶酚在37℃恒温水浴中保温10min，然后加入0.5ml酶液(可视酶活性增减用量)，迅速摇匀，倒入比色杯内，于525nm波长处以时间扫描方式，在1～2min内测定吸光度变化(A)值。《植物生理学实验指导》周祖富、黎兆安主编广西大学。
3、上述两种粗酶液的制备实验方法存在缺陷：
(1)粗酶液制备方法一存在缺陷
植物组织用量过多；磷酸缓冲液量过大；匀浆时必须用液氮冷冻匀浆机，大多数实验室都不具备该项设备；硫酸铵反复去除杂蛋白，此项操作过于繁琐，实际运用中，沉淀很难获得，实验因此中断无法继续。
(2)粗酶液制备方法二存在缺陷
植物组织用量多，缓冲盐用量大，研钵小，实际操作中需要分次进行，相对一次操作，误差增多；4层纱布过滤，实际操作中繁琐，粗酶液损耗大；离心机转速过高，时间过长。
(3)植物组织局限于马铃薯
4、酶的活性比色法测定存在缺陷
(1)终止法存在缺陷
生物化学教材指出，酶反应迅速，3min之内反应基本完成。另有实验证明反应产物410nm波长吸光度最大。
(2)记时法存在缺陷
记时法1，根据《生物化学》酶相关章节要求没有明确酶反应的最适温度，没有记录酶活力计算相关公式。
记时法2，酶反应底物缓冲液PH值5.5与粗酶液制备缓冲液pH6.5，pH值不一致，增加实验复杂程度；另有实验证明410nm波长吸光值最大；缓冲液，反应底物，酶液合计4.9ml，比色皿试验容积3mI，实际操作倾倒液体时误差大，另外酶液用量过高；另有实验证明410nm波长吸光值最大；根据《生物化学》酶相关章节要求测定酶活力，应测定酶促反应的初速率，实验证明1-2min反应速率相对1min内已降低，不属于初速率时间范围。
针对以上多酚氧化酶的提取测定方式存在各种缺点，本发明提出一种新的提取测定方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种菊花中多酚氧化酶快速高效提取测定方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种菊花中多酚氧化酶快速高效提取测定方法，步骤如下：
(1)多酚氧化酶粗酶液的提取：取菊花，加入石英砂、聚乙烯吡咯烷酮以及柠檬酸-磷酸缓冲液，冰浴上混合均匀研磨成匀浆后，倒入离心管；然后用剩余的柠檬酸-磷酸缓冲液冲洗研钵，再次倒入离心管，混合均匀；然后放置3～5℃的冰箱中冷藏浸置22～26h；取出后，放入冷冻离心机中进行离心5～7min，冷冻离心机温度为3～5℃；静置3～5min；提取上清液至离心管中再次离心5～7min，再静置3～5min，取上清液，即为粗酶液；以上操作条件温和，全部操作在0～5℃间进行；
(2)多酚氧化酶活力测定：将含反应底物邻苯二酚的缓冲液移入离心管中，与上述的粗酶液分别放入36～38℃的水浴锅保温5～7min；移取粗酶液，迅速加入邻苯二酚缓冲液中，摇匀后迅速倒入比色皿，同步开始记时；同时将粗酶液放入99～101℃的水中煮4～6min，将煮死的酶液作为对照；测ΔOD410nm波长处值的变化，每隔1min读数一次，以每min内A410值增加0.01表示一个酶活力单位，记时3min，按照如下公式计算多酚氧化酶的活力，
式中：A为反应时间内吸光度的变化值；
计算A值，取1min内反应初速率吸光度的变化值，A＝(吸光度值-初始吸光度值)/min。
作为本发明进一步的方案：所述步骤(1)中，菊花与聚乙烯吡咯烷酮的质量比为4.5～5.5∶1，柠檬酸-磷酸缓冲液重研磨用量与冲洗用量的体积比为0.7～1.5∶1。
作为本发明进一步的方案：所述步骤(1)中，匀浆后冷藏浸置的时间22～26h。
作为本发明再进一步的方案：所述步骤(1)中的两次离心过程，第一次离心的转速为4800～5200r/min，第二次离心的转速为5800～6200r/min。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、多酚氧化酶广泛存在于植物体的各种组织和器官中。现有技术选用的原料，用量大。本发明选用的原料用量少，采用冰浴研磨，匀浆准确，勿需冰冻匀浆机。
2、本发明聚乙烯吡咯烷酮适量，与多酚化合物形成络合物，发挥稳定作用。与现有技术聚乙烯吡咯烷酮需要天平称量精确相比，简化了聚乙烯吡咯烷酮加量的操作程序。
3、本发明4℃匀浆浸置24h，多酚氧化酶可充分浸出。与现有技术直接过滤相比，保障多酚氧化酶的提取充分。
4、本发明采用两次离心，分别提取上清液，与原有不同饱和度硫酸铵分级沉淀或者4层纱布过滤相比，简化了操作程序，避免操作程序多引起的误差，同时冷冻离心机转速减小，时间缩短，减少了机器损耗。
5、多酚氧化酶反应时需要温度在37℃左右，温度过低酶反应慢，温度过高则酶易失活，本发明则反应迅速。
6、通过实验本发明适用于任何加工方式的菊花，例如新鲜菊花、不同温度热风干燥菊花、不同时间段微波干燥菊花、水蒸汽蒸菊花等等加工方式多酚氧化酶的测定。
附图说明
图1-图4为不同热风温度加工方式下菊花多酚氧化酶的活性变化趋势图。
图5为水蒸气加工方式下菊花多酚氧化酶的活性变化趋势图。
图6为微波加工方式下菊花多酚氧化酶的活性变化趋势图。
图7为新鲜菊花的多酚氧化酶在不同加热温度下的活性变化趋势图。
图8为80℃热风干燥1h的菊花多酚氧化酶在不同温度下的活性变化趋势图。
图9为水蒸气蒸5s后的菊花多酚氧化酶在不同温度下的活性变化趋势图。
图10为水蒸气加工方式5s、10s、15s、30s四个不同时间段下菊花多酚氧化酶的活性变化趋势图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
1、实验材料：菊花
2、仪器设备：-80℃冰箱、研钵、制冰机、14mL离心管、1.5mL离心管、4mL离心管、移液枪、4℃恒温冰箱、冷冻离心机、水浴锅、紫外分光光度计；
3、试剂药品：0.1mol/L pH6.8柠檬酸-磷酸缓冲液、邻苯二酚、聚乙烯吡咯烷酮；
4、实验步骤
(1)多酚氧化酶粗酶液的提取：取0.5g菊花，加入石英砂、0.1g聚乙烯吡咯烷酮，5mL柠檬酸-磷酸缓冲液(其中2-3mL缓冲液可用于研磨，剩余缓冲液冲洗研钵)冰浴研磨成匀浆后，倒入14mL规格离心管，放置4℃冰箱冷藏浸置24h；冷冻离心机温度设置4℃，转速5000r/min离心6min；提取上清液至1.5mL离心管，6000r/min再次离心6min，上清液即为粗酶液。
(2)多酚氧化酶活力测定：水浴锅温度设置37℃，将含反应底物10mmol邻苯二酚的缓冲液2.9mL移入4mL离心管；将上述缓冲液及粗酶液分别放入水浴锅保温6min；移100μL粗酶液，迅速加入上述缓冲液中，摇匀后迅速倒入比色皿，同步开始记时；将粗酶液放入100℃水中煮5min，煮死的酶液作为对照；测ΔOD410nm波长处值的变化，每隔1min读数一次，以每min增加0.01表示一个酶活力单位，记时3min。
酶活力计算公式
以每min内A410值增加0.01为1个酶活力单位，按下式计算多酚氧化酶的活力，
公式中：A为反应时间内吸光度的变化值。
计算A值，取1min内反应初速率吸光度的变化值，A＝(吸光度值-初始吸光度值)/min。
具体实验例
实验例1：50℃热风干燥加工方式菊花不同时间段多酚氧化酶的活性测定
取样时间分别为15min、30min、1h、2h、1h、4h、6h、8h、10h，每个时间段分别取0.5g药材，提取粗酶液，测定酶的活性，于410nm波长处以时间扫描方式，每隔1min计数一次，取1min内反应初速率的吸光度的变化值。根据公式计算酶的活力。结果显示加工时间达到10h，酶的活性相对较高。
取样时间 酶活
15min 1500
30min 1000
1h 1500
2h 300
4h 500
6h 650
8h 1900
10h 1200
实验例2：60℃热风干燥加工方式菊花不同时间段多酚氧化酶的活性测定
取样时间分别为15min、30min、1h、2h、1h、4h、6h、8h，每个时间段分别取0.5g药材，提取粗酶液，测定酶的活性，于410nm波长处以时间扫描方式，每隔1min计数一次，取1min内反应初速率的吸光度的变化值。根据公式计算酶的活力。结果显示加工时间达到8h，酶的活性仍然高。
实验例3：70℃热风干燥加工方式菊花不同时间段多酚氧化酶的活性测定
取样时间分别为2min、5min、15min、30min、1h、2h、4h、6h，每个时间段分别取0.5g药材，提取粗酶液，测定酶的活性，于410nm波长处以时间扫描方式，每隔1min计数一次，取1min内反应初速率的吸光度的变化值，根据公式计算酶的活力。结果与前两组数据比较温度升高酶活相对降低。
取样时间 酶活
2min 450
5min 550
15min 450
30min 350
1h 450
2h 650
4h 650
6h 900
实验例4：80℃热风干燥加工方式菊花不同时间段多酚氧化酶的活性测定
取样时间分别为2min、5min、15min、30min、1h、2h、4h、6h，每个时间段分别取0.5g药材，提取粗酶液，测定酶的活性，于410nm波长处以时间扫描方式，每隔1min计数一次，取1min内反应初速率吸光度的变化值，根据公式计算酶的活力。结果显示加工时间达到6h，酶失活。
取样时间 酶活
2min 350
5min 300
15min 350
30min 200
1h 300
2h 150
4h 50
6h 0
实验例5：水蒸汽加工方式菊花不同时间段多酚氧化酶的活性测定
取样时间分别为5s、10s、30s、45s、60s、90s、2min，每个时间段分别取0.5g药材，提取粗酶液，测定酶的活性，于410nm波长处以时间扫描方式，每隔1min计数一次，取1min内反应初速率的吸光度的变化值，根据公式计算酶的活力。结果显示加工时间30s以上，酶失活。
取样时间 酶活
5s 500
10s 700
15s 300
30s 0
60s 0
90s 0
2min 0
实验例6：微波加工方式菊花不同时间段多酚氧化酶的活性测定
取样时间分别为15s、30s、45s、60s、2min、4min、6min、8min、10min、12min每个时间段分别取0.5g，提取粗酶液，测定酶的活性，于410nm波长处以时间扫描方式，每隔1min计数一次，取1min内反应初速率的吸光度的变化值，根据公式计算酶的活力。结果显示加工时间12min，酶失活。
取样时间 酶活
15s 200
30s 500
45s 350
60s 500
2min 250
4min 100
6min 150
8min 100
10min 100
12min 0
实验例7：最适多酚氧化酶反应温度测定
随机抽取3组粗酶液，水浴锅温度分别设置为17℃、27℃、37℃、47℃、57℃。将装有2.9ml反应底物及待测酶液100μL的离心管分别放入不同设置温度时的水浴锅保温6min后，混匀倒入比色皿，同时计时，读取吸光值。具体操作同上。结果显示37℃酶活性最大。
新鲜菊花提取的多酚氧化酶粗酶液及反应底物不同温度保温后反应，结果显示37℃吸光值最大。
取样温度 酶活
17℃ 450
27℃ 600
37℃ 650
47℃ 500
57℃ 400
菊花80℃热风干燥1h后提取的多酚氧化酶粗酶液及反应底物不同温度保温后反应，结果显示37℃吸光值最大。
取样温度 酶活
17℃ 250
27℃ 250
37℃ 300
47℃ 250
57℃ 250
菊花水蒸气蒸5s后提取的多酚氧化酶粗酶液及反应底物不同温度保温后反应，结果显示37℃吸光值最大。
取样温度 酶活
17℃ 400
27℃ 450
37℃ 500
47℃ 350
57℃ 200
实验例8：水蒸气加工方式5s、10s、15s、30s四个不同时间段菊花多酚氧化酶粗酶液制备及活性测定
序号 取样时间 初始值 1min 2min 3min 酶活
1 5s 0.249 0.349 0.385 0.388 500
2 10s 0.218 0.358 0.397 0.392 700
3 15s 0.106 0.166 0.172 0.170 300
4 30s 0.077 0.085 0.09 0.089 0
本发明明确了药材取用量0.5g，多酚氧化酶与底物反应最适温度37℃，最适缓冲液pH6.8，最适反应底物浓度10mmol，粗酶液匀浆浸置时间24h，提取粗酶液上清液采取2次离心，410nm处测1min内初速率的光吸收变化。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

Claims (4)

1.一种菊花中多酚氧化酶快速高效提取测定方法，其特征在于，步骤如下：
(1)多酚氧化酶粗酶液的提取：取菊花，加入石英砂、聚乙烯吡咯烷酮以及柠檬酸-磷酸缓冲液，冰浴上混合均匀研磨成匀浆后，倒入离心管；然后用剩余的柠檬酸-磷酸缓冲液冲洗研钵，再次倒入离心管，混合均匀；然后放置3～5℃的冰箱中冷藏浸置22～26h；取出后，放入冷冻离心机中进行离心5～7min，冷冻离心机温度为3～5℃；静置3～5min；提取上清液至离心管中再次离心5～7min，再静置3～5min，取上清液，即为粗酶液；
(2)多酚氧化酶活力测定：将含反应底物邻苯二酚的缓冲液移入离心管中，与上述的粗酶液分别放入36～38℃的水浴锅保温5～7min；移取粗酶液，迅速加入邻苯二酚缓冲液中，摇匀后迅速倒入比色皿，同步开始记时；同时将粗酶液放入99～101℃的水中煮4～6min，将煮死的酶液作为对照；测ΔOD410nm波长处值的变化，每隔1min读数一次，以每min内A410值增加0.01表示一个酶活力单位，记时3min，按照如下公式计算多酚氧化酶的活力，
式中：A为反应时间内吸光度的变化值。
2.根据权利要求1所述的菊花中多酚氧化酶快速高效提取测定方法，其特征在于，所述步骤(1)中，菊花与聚乙烯吡咯烷酮的质量比为4.5～5.5∶1，柠檬酸-磷酸缓冲液重研磨用量与冲洗用量的体积比为0.7～1.5∶1。
3.根据权利要求1所述的菊花中多酚氧化酶快速高效提取测定方法，其特征在于，所述步骤(1)中，匀浆后冷藏浸置的时间22～26h。
4.根据权利要求1所述的菊花中多酚氧化酶快速高效提取测定方法，其特征在于，所述步骤(1)中的两次离心过程，第一次离心的转速为4800～5200r/min，第二次离心的转速为5800～6200r/min。
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