CN106661602A - 化学锁定的双特异性抗体 - Google Patents

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Abstract

公开了一种用于以高特异性和高均一性形成化学锁定的双特异性或异二聚体抗体(优选IgG类)的方法。更具体地，公开了具有通过生物正交点击化学连接在一起的连接区的化学锁定双特异性IgG类抗体。

Description

化学锁定的双特异性抗体
技术领域
本公开提供了用于以高特异性和高均一性形成化学锁定的双特异性或异源二聚体抗体(优选IgG类)的方法。更具体地，本公开提供了具有利用生物正交点击化学(bio-orthogonal click chemistry)连接的连接区的化学锁定的双特异性IgG类抗体。
相关申请的交叉引用
本专利申请要求2014年5月10日提交的61/991,508号美国临时专利申请的优先权。
背景技术
人免疫球蛋白G或IgG抗体以四个亚类存在，每个亚类具有不同的结构和功能特性。IgG由两个重链-轻链对(半抗体)组成，该重链-轻链对通过直接连接铰链区中的Cys残基(EU索引编号：半胱氨酸残基226和229；Kabat编号：半胱氨酸残基239和242)的重链间二硫键连接。人IgG4分子以各种分子形式存在，其通过重链间二硫键的存在或不存在而不同。
已经开发了多种多样的重组抗体形式，例如通过融合IgG抗体形式和单链结构域的四价双特异性抗体(Coloman等，Nature Biotech 15(1997)159-163；WO 2001/077342；和Morrison，Nature Biotech 25(2007)1233-1234)。另一种形式具有不再保留的抗体核心结构(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)，例如双体抗体、三体抗体或四体抗体、微抗体、几种单链形式(scFv、Bis-scFv)。但是这类形式能够结合两个或更多的抗原(Holliger等，NatureBiotech 23(2005)1126-1136；Fischer和Leger，Pathobiology 74(2007)3-14；Shen等，J.Immunological Methods 318(2007)65-74；和Wu等，Nature Biotech.25(2007)1290-1297)。
US 2005/0163782中报道了用于从包含其中通过至少一个链间二硫键连接的二聚体和其中未通过至少一个链间二硫键连接的二聚体的该两种类型混合物中将通过至少一个链间二硫键连接的二聚体与未通过至少一个链间二硫键连接的二聚体分离或优先合成通过至少一个链间二硫键连接的二聚体的方法。
双特异性抗体是难以使用传统的杂种杂交瘤和化学偶联方法以足够数量和质量产生的材料。此外，WO2005/062916和美国专利申请2010/0105874描述了如何通过还原抗体“AA”和抗体“BB”以将二硫键分离成具有单一结合区域的单重链-轻链单元(A或B)(其中A和B两者结合不同的靶标)来形成双特异性抗体。然后，抗体允许二硫键发生异构化，以使得抗体AB、BA、AA和BB各自以约25％的概率重组。然而，AB和BA两者是相同的双特异性抗体，且因此最多表现出约50％的产率。因此，这需要额外的步骤来将形成的所需的双特异性抗体从原始的重组抗体分离。然而，美国专利申请2010/0105874指向具有CPSC序列的IgG4中的铰链区，并且陈述：“CPSC序列导致更灵活的核心铰链和形成链内二硫键的可能性….据信具有IgG4样核心铰链序列的抗体可以具有用于重排二硫键的内在活性，其通过本发明方法中使用的条件模拟”(第0013段)。此外，已经制备了其他形式的双特异性抗体，其具有通过改变抗体A和B的重链序列产生的“杵和臼”结构。
因此，本公开提供了产生化学锁定的双特异性IgG抗体的方法，其满足本领域对双特异性抗体的很高产率的需要并且比改变固定的抗体区域中的氨基酸序列的杵和臼方法具有更好的稳定性。
发明内容
本公开提供了用于从IgG1、IgG2或IgG4类抗体或其Fab2片段“A”和IgG1、IgG2或IgG4类抗体或其Fab2片段“B”产生化学锁定的双特异性抗体“AB”或“BA”的方法。该方法包括：
(a)在足以切割铰链区中重链之间的基本上所有二硫键的条件下使所述第一抗体“A”与还原剂接触，以产生一对第一抗体片段A'，每个第一抗体片段A'包含连接于单一重链的单一轻链，其中所述重链具有一个或多个由所述二硫键的还原形成的反应性巯基；
(b)将第一异双官能接头连接到所述第一抗体片段A'，其中所述第一异双官能接头包含(i)用于与所述第一抗体片段A'的所述重链的反应性巯基共价连接的第一巯基反应性官能团，和(ii)叠氮化物，从而形成叠氮化物官能化的第一抗体片段；
(c)在足以切割铰链区中重链之间的基本上所有二硫键的条件下使所述第二抗体“B”与还原剂接触，以产生一对第二抗体片段B'，每个第二抗体片段B'包含连接于单一重链的单一轻链，所述重链具有一个或多个由所述二硫键的还原形成的反应性巯基；
(d)将第二异双官能接头连接到所述第二抗体片段B'，所述第二异双官能接头包含：(i)用于与所述第二抗体片段的所述重链的反应性巯基共价连接的第二巯基反应性官能团，和(ii)炔；从而形成炔官能化的第二抗体片段；
(e)使所述叠氮化物官能化的第一抗体片段与所述炔官能化的第二抗体片段反应以通过所述叠氮化物与所述炔的1,3-偶极环加成将所述第一抗体片段共价连接于所述第二抗体片段，从而形成化学锁定的双特异性抗体“AB”或“BA”。
还原铰链区中二硫键的步骤优选在基本上不还原重链和轻链之间的二硫键的条件下进行，这意味着，在一些实施方式中，至少约90％或至少约95％或至少约99％的这类重链和轻链之间的二硫键在铰链区中的二硫键裂解后保持完整。
优选地，第一异双官能接头具有Q-L-N3的形式，其中Q是巯基反应性官能团，L是烃接头，且N3是叠氮化物。优选地，该巯基反应性官能团Q是卤代烷(例如，烷基氯、烷基溴或烷基碘)、苄基卤、马来酰亚胺、卤代马来酰胺(溴代马来酰亚胺)或二卤代马来酰亚胺(二溴代马来酰亚胺)。优选地，L是在Q和N3之间直链中具有3-60个原子(例如，更典型地为6-50个)的烃接头。更优选地，L是聚环氧烷(PEF)基团或L是其中每个链节(mer)单元是–(CH2CH2–O)n或(O–CH2CH2)n–的聚合物(其中“n”独立地是1-20的整数，更通常为1-8)。
优选地，第一异双功能性接头(连接到第一抗体片段)是：
其中Q可以是适合于将接头连接到抗体片段上的任何基团，但优选能够与来自重链铰链区中的半胱氨酸残基的巯基共价键合。示例性基团Q是：
其中Z独立地选自H、Br、I和SPh。优选地，至少一个Z不是H，尽管在马来酰亚胺的情况下，Z在每次出现时可以是氢。M独立地为CR*或N。
X1、X2、X3、X2、X4和X5独立地选自键(即不存在)、–O–、–NRN–、–N＝C–、–C＝N–、–N＝N–、–CR*＝CR*–(顺式或反式)、–C≡C–、–(C＝O)–、–(C＝O)–O–、–(C＝O)–NRN–、–(C＝O)–(CH2)n–、(C＝O)–O–(CH2)n–、(C＝O)–NRN–(CH2)n–和–(C＝O)–NRN–(CH2CH2–O)n–，其中“n”为0或1-10的整数。
Ra、Rb、Rc和Rd独立地选自–O–、–NRN–、–CH2–、–(CH2)n–、–(CR*2)n–、–(CH2CH2–O)n–、–(CR*2CR*2–O)n–、–(O–CH2CH2)n–、–(O–CR*2CR*2)n–、–CR*＝CR*–(顺式或反式)、–N＝C–、–C＝N–、–N＝N–、–C≡C–、–(C＝O)–、–(CH2)n–(C＝O)–、–(C＝O)–(CH2)n–、–(CH2)n–(C＝O)–(CH2)n–、–O–(C＝O)–、–(C＝O)–O–、–O–(C＝O)–O–、–(CH2)n–(C＝O)–O–、–O–(C＝O)–(CH2)n、–(C＝O)–O–(CH2)n–、–(CH2)n–O–(C＝O)–、–(CH2)n–(C＝O)–O–(CH2)n–、–(CH2)n–O–(C＝O)–(CH2)n–、–NRN–(C＝O)–、–(C＝O)–NRN–、–NRN–(C＝O)–O–、–O–(C＝O)–NRN–、–NRN–(C＝O)–NRN–、–(CH2)n–(C＝O)–NRN–、–NRN–(C＝O)–(CH2)n、–(C＝O)–NRN–(CH2)n–、–(CH2)n–NRN–(C＝O)–、–(CH2)n–(C＝O)–NRN––(CH2)n–、–(CH2)n–NRN–(C＝O)–(CH2)n–、–(C＝O)–NRN–(CH2CH2–O)n–、–(CH2CH2–O)n–(C＝O)–NRN–、–(CH2)n–(C＝O)–NRN–(CH2CH2–O)n–、–(CH2CH2–O)n–(C＝O)–NRN–(CH2)n–和2-8元的环状烃、杂环、芳基或杂芳基环；其中“n”独立地为0或1-10的整数；和其中“l”、“p”、“q”和“r”独立地为0或1-10的整数。
Ω是键(即，其不存在)或者是C3-26烃环或稠环系统，任选地包含至多四个稠合环，其中每个环具有3-8元和任选地在每个环中包含1-4个选自O、S和N的杂原子。优选地，Ω是与环辛烷环稠合或与8元杂环或环系统稠合的1,2,3-三唑环。
R*和RN在每次出现时独立地为H或C1-12烃，任选被1-6个选自卤素、O、S和N的杂原子取代；和其中任何两个基团R*和/或RN可以一起形成3-8元环。
所述第二异双官能接头具有Q-L-G的形式，其中Q是巯基反应性官能团，L是烃接头，和G是含炔基团。巯基反应性官能团Q选自烷基卤(例如烷基氯、烷基溴或烷基碘)、苄基卤、马来酰亚胺、卤代马来酰胺(例如溴代马来酰亚胺)和二卤代马来酰亚胺(如，二溴代马来酰亚胺)。L是在Q和G之间直链中具有3-60个原子(例如，优选6-50个)的烃接头。优选地，L是聚环氧烷基团(PEG)，优选地，L是单元–(CH2CH2–O)n–或–(O–CH2CH2)n–(其中“n”独立地为1-20的整数，更通常为1-8)的聚合物。
G是能够与叠氮化物发生环加成的任何含炔基团。在一些实施方式中，G包含末端炔，例如-C≡CH。在其它的实施方式中，G包括在环中具有-C≡C-键的环或环系统。在一个实施方式中，G包含具有-C≡C-键的C8环。在一个实施方式中，含-C≡C-的环是应变的(strained)。
第二异双功能接头具有以下形式：
Q与第一异双功能接头中的相同或不同。Q通常是以下形式的巯基反应基团：
其中Z在每次出现时独立地选自H、Br、I和SPh。在一些实施方式中，至少一个Z不是H，尽管在马来酰亚胺的情况下，Z在每次出现时可以是氢。M在每次出现时独立地为CR*或N。
G通常是包含能够与叠氮化物发生1,3偶极环加成反应的-C≡C-键的C8-20烃基。在一些实施方式中，G具有-C≡C-H的形式。在其它实施方式中，G包含具有-C≡C-键的环。特别地，G可以包含具有三键的8-元环(例如环辛炔)。该环可任选地与一个、两个或更多的另外的环稠合，该另外的环通常为C3-6环烃环，包括芳基、杂芳基和杂环。含三键的8-元环可以在环中包括一个或多个(例如1-4个)杂原子，例如氮和氧。在一个实施方式中，8元环在环中含有氮原子，其提供与L的连接点，如在以下所示的示例性结构中：
优选地，G具有以下形式：
X1、X2、X3、X2、X4和X5在每次出现时独立地选自键(即，不存在)、–O–、–NRN–、–N＝C–、–C＝N–、–N＝N–、–CR*＝CR*–(顺式或反式)、–C≡C–、–(C＝O)–、–(C＝O)–O–、–(C＝O)–NRN–、–NRN–(C＝O)–、–NRN–(C＝O)–O–、–(C＝O)–(CH2)n–、–(C＝O)–O–(CH2)n–、–(C＝O)–NRN–(CH2)n–和–(C＝O)–NRN–(CH2CH2–O)n–，其中“n”为0或1-10的整数；
Ra、Rb、Rc和Rd在每次出现时独立地选自–O–、–NRN–、–CH2–、–(CH2)n–、–(CR*2)n–、–(CH2CH2–O)n–、–(CR*2CR*2–O)n–、–(O–CH2CH2)n–、–(O–CR*2CR*2)n–、–CR*＝CR*–(顺式或反式)、–N＝C–、–C＝N–、–N＝N–、–C≡C–、–(C＝O)–、–(CH2)n–(C＝O)–、–(C＝O)–(CH2)n–、–(CH2)n–(C＝O)–(CH2)n–、–O–(C＝O)–、–(C＝O)–O–、–O–(C＝O)–O–、–(CH2)n–(C＝O)–O–、–O–(C＝O)–(CH2)n、–(C＝O)–O–(CH2)n–、–(CH2)n–O–(C＝O)–、–(CH2)n–(C＝O)–O–(CH2)n–、–(CH2)n–O–(C＝O)–(CH2)n–、–NRN–(C＝O)–、–(C＝O)–NRN–、–NRN–(C＝O)–O–、–O–(C＝O)–NRN–、–NRN–(C＝O)–NRN–、–(CH2)n–(C＝O)–NRN–、–NRN–(C＝O)–(CH2)n、–(C＝O)–NRN–(CH2)n–、–(CH2)n–NRN–(C＝O)–、–(CH2)n–(C＝O)–NRN––(CH2)n–、–(CH2)n–NRN–(C＝O)–(CH2)n–、–(C＝O)–NRN–(CH2CH2–O)n–、–(CH2CH2–O)n–(C＝O)–NRN–、–(CH2)n–(C＝O)–NRN–(CH2CH2–O)n–、–(CH2CH2–O)n–(C＝O)–NRN–(CH2)n–或者2-8元环状烃、杂环、芳基或杂芳基环；其中“n”在每次出现时独立地为0或1-10的整数；和其中“l”、“p”、“q”和“r”独立地为0或1-10的整数；
Ω是键(即，不存在)或者为C3-26烃环或稠环系统，任选地包含至多四个稠合环，每个环具有3-8元和在每个环中任选地包含独立地选自O、S和N的1-4个杂原子；在一个实施方式中，Ω将包括与环辛烷环稠合或者与8元杂环或环系统稠合的1,2,3-三唑环。
R*和RN在每次出现时独立地为H或C1-12烃，任选地被1-6个选自卤素、O、S和N的杂原子取代；并且其中两个基团R*和/或RN可以一起形成3-8元环。
叠氮化物和炔之间的环加成反应可以通过1,3偶极环加成反应进行。该反应可以由铜离子催化。在一些实施方式中，环加成反应在中性或生理pH下发生。
本公开还提供了一种用于具有铰链残基序列(EU索引编号：残基226-229；Kabat编号：残基239-242)CPPC或CPSC或SPPC或SPSC的还原抗体“A”和具有铰链残基序列(残基226-229)CPPC或CPSC或SPPC或SPSC的第二抗体“B”以形成半抗体A和半抗体B的方法，该方法包括：
(a)还原各个抗体A和抗体B，由此还原条件破坏具有铰链残基序列(EU索引编号：残基226-229；Kabat编号：残基239-242)CPPC或CPSC或SPPC或SPSC的各抗体铰链区中的任何链间或链内二硫键；
(b)将选自于以下的化合物连接于半抗体A的铰链核心序列的一个或两个Cys残基(EU索引编号：残基226和229；Kabat编号：残基239和242)以形成连接的半抗体A：
M＝N、C
M’＝N、C
Z＝I、Br、SPh，
其中N3是–N＝N＝N；
(c)将选自以下的化合物连接于抗体B的铰链核心序列的一个或两个Cys残基226和229(EU索引编号：残基226和229；Kabat编号：残基239和242)以形成连接的抗体B：
M＝N、C
M’＝N、C
Z＝I、Br、SPh；和
(d)在中性条件下温育近似相等摩尔量的连接的抗体A与连接的抗体B以形成连接的双特异性抗体AB。
优选地，抗体A还原以形成半抗体A和抗体B还原以形成半抗体B是在还原剂中进行的，其中所述还原剂选自L-半胱氨酸、二硫苏糖醇、β-巯基乙醇、半胱胺、TCEP(三(2-羧乙基)膦)、2-MEA(2-巯基乙胺)及其组合。优选地，具有一个或两个Cys残基的抗体A的铰链区与具有选自以下的结构的部分A连接：
M＝N、C
M’＝N、C
Z＝I、Br、SPh，
其中N3是–N＝N＝N。优选地，具有一个或两个Cys残基的抗体B的铰链区与具有选自以下的结构的部分B连接：
M＝N、C
M’＝N、C
Z＝I、Br、SPh，
以形成连接的半抗体B。
本公开还提供了一种化学锁定的双特异性抗体AB，其中连接的半抗体A
其中N3是–N＝N＝N，
结合于连接的抗体B
以形成具有图10所示结构的双特异性抗体AB。
本公开提供了来自IgG类抗体“A”或其片段和IgG类抗体“B”的化学锁定的双特异性抗体“AB”或“BA”，其包含具有选自以下结构的半抗体A：
M＝N、C
M’＝N、C
Z＝I、Br、SPh，
其中N3是–N＝N＝N；和其中Z是离去基团；
和具有选自以下的结构的半抗体B：
M＝N、C
M’＝N、C
Z＝I、Br、SPh。
本公开进一步提供了双特异性抗体，其包含：
(a)第一抗体片段A'，其包含来自抗体A的单一重链和轻链，所述重链具有一个或多个反应性巯基基团；
(b)第二抗体片段B'，其包含单一重链和轻链，所述重链具有一个或多个反应性巯基基团；
其中所述第一和第二抗体片段通过经由叠氮化物和炔的环加成反应形成的1,2,3-三唑共价连接，所述叠氮化物通过接头连接于所述第一抗体片段的反应性巯基，和炔通过接头连接于所述第二抗体片段的反应性巯基。上文描述了接头。抗体片段A'和B'衍生自IgG1、IgG2或IgG4免疫球蛋白或其Fab2片段。
本公开进一步提供了与接头共价键合的抗体片段，其中所述接头包含具有能够与叠氮化物发生环加成反应的-C≡C-键的C8环。本公开还提供了与接头共价键合的抗体片段，其中所述接头包含能够与-C≡C-键发生环加成反应的叠氮化物。
优选地，抗体A还原以形成半抗体A和抗体B还原以形成半抗体B在还原剂中进行，其中所述还原剂选自L-半胱氨酸、二硫苏糖醇、β-巯基乙醇、半胱胺、TCEP(三(2-羧乙基)膦)、2-MEA(2-巯基乙胺)及其组合。优选地，具有一个或两个Cys残基的抗体A的铰链区与具有选自以下的结构的部分A连接：
M＝N、C
M’＝N、C
Z＝I、Br、SPh，
其中N3是–N＝N＝N
连接于半抗体A的铰链核心序列的一个或两个Cys残基(EU索引编号：残基226和229；Kabat编号：残基239和242)以形成连接的半抗体A；
(c)将选自以下的化合物连接于抗体B的铰链核心序列的一个或两个Cys残基226和229(EU索引编号：残基226和229；Kabat编号：残基239和242)以形成连接的抗体B：
M＝N、C
M’＝N、C
Z＝I、Br、SPh；和
(d)在中性条件下温育近似相等摩尔量的连接的抗体A与连接的抗体B以形成连接的双特异性抗体AB。
优选地，抗体A还原以形成半抗体A和抗体B还原以形成半抗体B是在还原剂中进行的，其中所述还原剂选自L-半胱氨酸、二硫苏糖醇、β-巯基乙醇、半胱胺、TCEP(三(2-羧乙基)膦)、2-MEA(2-巯基乙胺)及其组合。优选地，具有一个或两个Cys残基的抗体A的铰链区与具有选自以下的结构的部分A连接：
M＝N、C
M’＝N、C
Z＝I、Br、SPh
其中N3是–N＝N＝N。优选地，具有一个或两个Cys残基的抗体B的铰链区与具有选自以下的结构的部分B连接：
M＝N、C
M’＝N、C
Z＝I、Br、SPh，
以形成连接的半抗体B。
本公开还提供了一种化学锁定的双特异性抗体AB，其中连接的半抗体A
其中N3是–N＝N＝N；
结合于连接的抗体B
以形成具有图10所示结构的双特异性抗体AB。
本公开提供了来自IgG类抗体“A”和IgG类抗体“B”的化学锁定的双特异性抗体“AB”或“BA”，其包含具有选自以下的结构的半抗体A：
M＝N、C
M’＝N、C
Z＝I、Br、SPh，
其中N3是–N＝N＝N，和其中Z是离去基团，其结合于；
和具有选自于以下的结构的半抗体B：
M＝N、C
M’＝N、C
Z＝I、Br、SPh。
附图说明
图1显示了设置通过与IgG类抗体的铰链区中的单个Cys残基的化学偶联来产生双特异性mAb的示意图。
图2显示了根据本公开通过与IgG类抗体的铰链区中的单个Cys残基化学偶联的链间交联的示意图。
图3显示了与IgG类抗体的铰链区内的两个Cys残基链内交联的示意图。
图4显示(上和下)通过与IgG类抗体的铰链区内的两个Cys残基的链间交联产生双特异性mAb的示意图。
图5显示化学锁定的半mAb片段的SDS PAGE分析。
图6显示来自裸mAb(上)、叠氮化物偶联的mAb片段(中间)和炔偶联的mAb片段(下)的HC Fab的MS分析。
图7显示来自叠氮化物连接的半mAb和炔连接的半mAb片段的交联产物的SDSPAGE。
图8显示来自初始mAb(上)和交联产物(下)的(Fab)2的MS分析。
图9显示了本文实施例4中产生的化学修饰的半抗体片段的非还原SDS PAGE(泳道2和3)。
图10显示通过两个半抗体片段之间的点击偶联(Click conjugation)产生双特异性抗体。
图11显示半抗体片段(a)和点击产物(b)的非还原SDS PAGE。半抗体-叠氮化物在凝胶(a)的泳道2中，和半抗体-DBCO在凝胶(a)中的泳道3。点击产物在凝胶(b)中的泳道2中。
图12显示了示出双特异性抗体CBA-0710的质量的IdeS消化的点击产物的质谱。
图13显示双特异性抗体CBA-0710的SEC尺寸排阻色谱。
图14显示双特异性抗体CBA-0710在BIAcore上的结合。更具体地，图14显示双特异性抗体CBA-0710与BIAcore上的两种抗原的2个同时的结合。
图15显示双特异性抗体CBA-0710与三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231结合。该细胞表达抗原-1和抗原-2。STI-A0607是抗抗原-1单克隆抗体，和STI-A1010是抗抗原-2单克隆抗体。
图16显示双特异性抗体CBA-0710在三阴性乳腺癌细胞中的拮抗活性。STI-A0607是抗抗原-1单克隆抗体，和STI-A1010是抗抗原2单克隆抗体。HGF是抗原-1的天然配体。
图17显示了响应于双特异性抗体CBA-0710的IFN-γ释放增加。STI-A1010是抗抗原-2(免疫检查点)单克隆抗体。竞争mAb是人源化抗抗原-2(免疫检查点)单克隆抗体。
图18显示响应于双特异性抗体CBA-0710的IL-2释放增加。STI-A1010是抗抗原-2(免疫检查点)单克隆抗体。竞争mAb是人源化抗抗原-2(免疫检查点)单克隆抗体。
图19显示与常规抗-c-Met IgG1和抗-PD-L1IgG1抗体相比，由A抗c-Met抗体和B抗PD-L1抗体组成的化学锁定双特异性抗体改善的功效。
图20显示通过化学偶联产生双特异性F(ab)'2的示意图。
图21显示F(ab)'2和F(ab)'的SDS_PAGE凝胶分析。第1列是用IdeS消化的抗体A。第2列是用IdeS消化的抗体B。第3列是经消化并除去FC的抗体A。第4列是经消化并除去FC的抗体B。第5列是经消化并去除FC，用2MEA和TCEP还原和与DBCO(二苯并环辛基)-马来酰亚胺偶联的抗体A。第6列是经消化并去除FC，用2MEA和TCEP还原和与叠氮化物-马来酰亚胺偶联的抗体B。
图22显示通过两个F(ab)'片段之间的点击偶联产生F(ab)'2化学锁定双特异性抗体的示意图。
图23显示了来自本文实施例7的点击F(ab)'2的SEC。
图24显示点击双特异性F(ab)'2片段分析SDS PAGE。第1列是经消化并除去FC的抗体A，并用与DBCO(二苯并环辛基)-马来酰亚胺偶联的2MEA和TCEP还原。第2列是经消化并且除去FC的抗体B，并用与叠氮化物-马来酰亚胺偶联的2MEA和TCEP还原。第3列是点击_双特异性F(ab)'2。
图25显示了点击产物的质谱，其示出了双特异性F(ab)'2的质量。
图26示出了点击F(ab)'2的SEC。
图27显示双特异性F(ab)'2与Octet Red上的两种抗原的同时结合。
图28显示了通过化学偶联产生双特异性IgG2的示意图。
图29显示IgG2片段分析SDS PAGE。第1列是抗体A。第2列是用TCEP还原并与叠氮化物-马来酰亚胺偶联的抗体A。第3列是抗体B。第4列是用TCEP还原并与叠氮化物-马来酰亚胺偶联的抗体B。
图30A-C显示了质谱图，其示出了与接头偶联的IgG2_A(图30A)、与接头偶联的IgG2_B(图30B)和IgG2_A与IgG2_B之间形成的双特异性IgG2(图30C)的质量。
图31显示了IgG2_A、IgG2_B和点击产物的SEC。
具体实施方式
双特异性抗体(BsAb)由在铰链区化学连接的两个半抗体片段组成(图1)。初始抗体是IgG1或IgG4同种型。初始抗体可以含有修饰的铰链区，其中Cys残基首先突变为Ser，在铰链处仅留下一个二硫键。双特异性抗体的产生涉及三个主要步骤。第一步是选择性地还原抗体A和B两者以形成半抗体片段。第二步是通过基于半胱氨酸的偶联将功能性部分X或Y引入每个半抗体片段的铰链区中，分别导致化学修饰的抗体片段半体A'和B'。在最后一步中，两个抗体片段半体通过X和Y部分之间的化学接合连接在一起，以形成双特异性抗体。
本公开提供了用于从IgG类抗体“A”和IgG类抗体“B”产生化学锁定的双特异性抗体“AB”或“BA”的方法，其包括：
(a)还原具有铰链残基序列(EU索引编号：残基226-229；Kabat编号：残基239-242)CPPC或CPSC或SPPC或SPSC的第一抗体“A”和具有铰链残基序列(EU索引编号：残基226-229；Kabat编号：残基239-242)CPPC或CPSC或SPPC或SPSC的第二抗体“B”以形成半抗体A和半抗体-B，其中抗体A结合第一靶标和抗体B结合第二靶标，由此还原条件破坏具有铰链残基序列(残基226-229)CPPC或CPSC或SPPC或SPSC的一类抗体的铰链区中的任何链间或链内二硫键；
(b)将来自式I的化合物连接于半抗体A的铰链核心序列的一个或两个Cys残基(EU索引编号：残基226和229；Kabat编号：残基239和242)以形成连接的半-抗体A，其具有选自于以下的结构：
M＝N、C
M’＝N、C
Z＝I、Br、SPh，
其中N3是–N＝N＝N；
(c)将来自式II的化合物连接于抗体B的铰链核心序列的一个或两个Cys残基(EU索引编号：残基226和229；Kabat编号：残基239和242)以形成连接的抗体B，其具有选自于以下的结构：
M＝N、C
M’＝N、C
Z＝I、Br、SPh；和
(d)在中性条件下温育近似相等摩尔量的连接的抗体A与连接的抗体B以形成连接的双特异性抗体AB。
优选地，在还原剂，如L-半胱氨酸、二硫苏糖醇、β-巯基乙醇、半胱胺、TCEP(三(2-羧乙基)膦)、2-MEA(2-巯基乙胺)及其组合中进行抗体A的还原以形成半抗体A和抗体B的还原以形成半抗体B。优选地，具有两个Cys残基的抗体A的铰链区与具有选自以下的结构的部分A连接：
M＝N、C
M’＝N、C
Z＝I、Br、SPh
其中N3是–N＝N＝N。优选地，具有两个Cys残基的抗体B的铰链区与具有选自以下的结构的部分B连接：
M＝N、C
M’＝N、C
Z＝I、Br、SPh。
本公开进一步提供了一种化学锁定的双特异性抗体AB，其中连接的半抗体A
其中N3是–N＝N＝N；
结合于连接的抗体B
以形成具有图10所示结构的双特异性抗体AB。
本公开提供了来自IgG类抗体“A”和IgG类抗体“B”的化学锁定的双特异性抗体“AB”或“BA”，其包含具有选自以下的结构的半抗体A：
M＝N、C
M’＝N、C
Z＝I、Br、SPh，
其中N3是–N＝N＝N；
和具有选自于以下的结构的半抗体B：
M＝N、C
M’＝N、C
Z＝I、Br、SPh。
优选地，抗体A还原以形成半抗体A和抗体B还原以形成半抗体B是在还原剂如，L-半胱氨酸、二硫苏糖醇、β-巯基乙醇、半胱胺、TCEP(三(2-羧乙基)膦)、2-MEA(2-巯基乙胺)及其组合中进行的。
优选地，抗体A和B是单克隆抗体。单克隆抗体可以通过杂交瘤方法或通过重组DNA和蛋白质表达方法产生。此外，抗体A和B是全长抗体或是抗体片段。
抗体A和B具有CPPC核心铰链区序列或CPSC核心铰链区序列或SPPC核心铰链区序列或SPSC核心铰链区序列(EU索引编号：残基226-229；Kabat编号：残基239-242)。此外，步骤(d)温育还包括添加还原剂的步骤，其中还原剂选自L-半胱氨酸、二硫苏糖醇、β-巯基乙醇、半胱胺、TCEP(三(2-羧乙基)膦)、2-MEA(2-巯基乙胺)及其组合。
可以使用常规生物化学技术如吸光度测量、HP-SEC、SDS-PAGE、非变性PAGE和RP-HPLC来分析所得的双特异性抗体的质量和纯度。应当注意，因为式I的接头对式II的接头的亲和性的特异性，所公开的方法通常避免任何纯化步骤。然而，在US2010/0105874中提供了各种纯化步骤，其公开内容通过引用并入本文。
所公开的方法还包括配制双特异性抗体用于治疗用途的步骤。这通过在适合人类使用的，特别是适于肠胃外或静脉内施用的水性溶液中有效量的双特异性抗体的制剂来实现。
图2显示了通过化学偶联产生双特异性单克隆抗体(mAb)的方案。本文所述的双特异性mAb由在铰链区化学连接的两个半抗体片段组成。双特异性mAb产生的过程包括三个主要步骤(图2)。第一步是分别在两种不同mAb A和B中选择性还原铰链二硫键。第二步是通过接头X或Y诱导每个mAb中相同重链上的两个半胱氨酸之间的链内连接。链内连接过程产生两个化学锁定的mAb片段A'和B'。在最后一步中，两个mAb片段通过X和Y之间的化学接合连接在一起，以形成双特异性抗体AB。
具有铰链突变(CPSC)的IgG1、wt IgG4和具有铰链突变(SPSC)的IgG4用于本研究中。
第一步是还原抗体A和抗体B中的每一个。在一个实施方式中，用在0.1M PBS pH7.4，1.0mM的二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)中的10摩尔当量的2-巯基乙胺(2-MEA)在37℃下处理抗体(10mg)2小时。过量的2-MEA使用50kDa过滤器离心管伴随3,000RPM的离心20分钟从部分还原的mAb纯化掉。用0.1M PBS进行总共三次洗涤。蛋白质浓度对于1.0mg/mL溶液使用在280nm处1.58的吸光度值来定量，并且使用150,000g/mol的分子量测定摩尔浓度。
在还原步骤的另一个实施方式中，将抗体(10mg)用在0.1M PBS pH 7.4，1.0mM二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)中的3.0摩尔当量的二硫苏糖醇(DTT)在24℃下处理2小时。过量的DTT使用50kDa过滤器离心管伴随3,000RPM下离心20分钟，从部分还原的mAb纯化掉。用0.1M PBS进行总共3次洗涤。
在还原步骤的另一个实施方式中，将mAb(10mg)用在0.1M PBS pH 8.0，1.0mM二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)中的2.0摩尔当量的三(2-羧乙基)-膦(TCEP)在24℃下处理2小时。mAb浓度为8.0mM。在不纯化的情况下，部分还原的mAb直接用于偶联步骤。
第二步是偶联步骤。将在0.1M PBS中的来自还原步骤的部分还原的mAb“抗体A”加入到2.5摩尔当量的交联剂Z-X-Z中(图2和图3)。交联剂取自预制备的DMSO储备溶液(1mg/mL)。在反应混合物中，部分还原抗体浓度为8.0mg/mL，和DMSO含量为5％(v/v)。在24℃下进行偶联2小时。用半胱氨酸(1mM终浓度)来淬灭任何未反应的过量交联剂。使用磷酸盐缓冲盐水平衡的PD-10柱纯化偶联的mAb。偶联的mAb结构示于图4中。在相同条件下，将第二mAb(抗体B)与交联剂Z-Y-Z(图5和图6)偶联并纯化。偶联的mAb结构示于图7和图8中。
第三步是链间偶联步骤。在图9中说明了用于链间交联的点击偶联。简言之，对于在0.5mL PBS(0.1M，pH 7.4)中的叠氮化修饰的抗体片段(3.0mg)，加入0.5mL PBS(0.1M，pH7.4)中的3.0mg的炔修饰的抗体片段。向该混合物中加入50μL乙腈且乙腈的最终含量为5％(v/v)。在室温下反应3小时后，使用100kDa过滤器离心管在3,000RPM下离心20分钟来纯化混合物。将混合物用PBS洗涤3次，并将所得产物进行体外表征。
实施例1
该实施例表明了根据所公开的方法的双特异性抗体的合成。图4显示了通过与IgG类抗体的铰链区中的两个Cys残基的化学偶联产生双特异性单克隆抗体(mAb)的方案。所公开的双特异性mAb由在其各自铰链区处化学连接的两个半抗体片段组成。合成双特异性mAb的方法包括图5中所示的三个主要步骤。第一步是分别在两种不同的mAb(A和B)中选择性地还原铰链二硫键。第二步是通过接头X或Y在每个mAb中诱导相同重链上的两个半胱氨酸之间的链内连接。链内连接过程产生两个化学锁定的mAb片段A'和B'。在最后一步中，两个mAb片段通过X和Y之间的化学接合连接在一起以形成双特异性抗体AB。
更具体地，我们获得了抗体“A”，一种具有铰链突变(CPSC)的IgG1，和抗体“B”，一种野生型IgG4。第一步是抗体还原。条件1：将抗体(10mg)单独地用在0.1M PBS pH 7.4，1.0mM二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)中的10摩尔当量的2-巯基乙胺(2-MEA)在37℃下处理2小时。过量的2-MEA使用50kDa过滤器离心管伴随3,000RPM下离心20分钟从部分还原的mAb中纯化掉。用0.1M PBS进行总共三次洗涤。对于1.0mg/mL溶液使用280nm处1.58的吸光度值对蛋白质浓度进行定量，并使用150,000g/mol的分子量测定摩尔浓度。
条件2：用在0.1M PBS pH 7.4，1.0mM二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)中的3.0摩尔当量的二硫苏糖醇(DTT)在24℃下处理抗体(10mg)2小时。过量的DTT使用50kDa过滤器离心管伴随3,000RPM下离心20分钟从部分还原的mAb纯化掉。用0.1M PBS进行总共3次洗涤。
条件3：用在0.1M PBS pH 8.0，1.0mM二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)中的2.0M摩尔当量的三(2-羧乙基)-膦(TCEP)在24℃下处理mAb(10mg)2小时。mAb浓度为8.0mM。在不纯化的情况下，部分还原的mAb直接用于偶联。
实施例2
该实施例显示，在实施例1中制备的双特异性抗体保留了其原始半Mab的两种结合特征。
1-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙基)-3,4-二溴-1H-吡咯-2,5-二酮的合成：
向在60mL THF中的2.5g 3,4-二溴-1H-吡咯-2,5-二酮(10mmol)和1g NMM滴加MeOCOCl(10mmol，940mg，在10ml DCM中)，搅拌20分钟，然后将反应溶液用60mL DCM稀释，用水洗涤3次，将有机相用无水硫酸钠搅拌，浓缩，得到2.65g 3,4-二溴-2,5-二氧代-2H-吡咯-1(5H)-羧酸甲基酯。向311mg，1mmol该化合物中加入2-(2-叠氮基乙氧基)乙胺(130mg，1mmol)和5mL DCM，TLC显示反应在20分钟内完成，然后通过DCM和盐水萃取，用NH4Cl溶液洗涤，用无水硫酸钠干燥，且然后浓缩用于柱纯化，用2:1己烷和乙酸乙酯闪蒸，得到230mg的1-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙基)-3,4-二溴-1H-吡咯-2,5-二酮。1HNMR：3.32ppm(t，J＝5.0Hz，1H)，3.40ppm(t，J＝5.0Hz，1H)，3.50ppm(q，J＝5.0Hz，1H)，3.62ppm(t，J＝，1H)，3.63-3.69ppm(m，3H)，3.84ppm(t，J＝5Hz，1H)。Fw：365.9，C8H8Br2N4O3；质谱峰(1:2:1)：366.9,368.9,370.9。
实施例3
该实施例说明了使用位于IgG类抗体的铰链区中的单个Cys残基来化学产生双特异性抗体。本文所述的起始mAb含有工程化的铰链区，其中各条链上相同位置处的一个Cys突变为Ser，从而产生仅留下单一二硫键的铰链。双特异性mAb产生的过程包括三个主要步骤(图1)。第一步是分别在两种不同的mAb A和B中选择性地还原铰链二硫键。第二步是通过基于半胱氨酸的偶联引入功能性基团X或Y。Cys-连接步骤产生两个化学锁定的mAb片段A'和B'。在最后一步中，两个mAb片段通过X和Y之间的化学接合连接在一起以形成双特异性抗体AB。在本研究中使用具有铰链区突变(SPPC)的IgG1单克隆抗体。
条件1：用在0.1M PBS pH 7.4，1.0mM二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)中的10摩尔当量的2-巯基乙胺(2-MEA)在37℃下处理抗体(10mg)2小时。过量的2-MEA使用50kDa过滤器离心管伴随3,000RPM下离心20分钟从部分还原的mAb纯化掉。用0.1M PBS进行总共三次洗涤。对于1.0mg/mL溶液使用在280nm处1.58的吸光度值来定量蛋白质浓度，并且使用150,000g/mol的分子量测定摩尔浓度。
条件2：用在0.1M PBS pH 7.4，1.0mM二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)中的3.0摩尔当量的二硫苏糖醇(DTT)在24℃下处理抗体(10mg)2小时。过量的DTT使用50kDa过滤器离心管伴随3,000RPM下离心20分钟从部分还原的mAb纯化掉。用0.1M的PBS进行总共3次洗涤。
条件3：用在0.1M PBS pH 8.0，1.0mM二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)中的2.0M摩尔当量的三(2-羧乙基)-膦(TCEP)在24℃下处理mAb(10mg)2小时。mAb浓度为8.0mM。在不纯化的情况下，部分还原的mAb直接用于偶联。
实施例4
该实施例显示了根据本文公开的方法制备双特异性抗体且具有将各个半抗体片段的铰链区彼此连接的所公开的化学连接结构的方法。抗体支架是：
具有铰链突变(SPSC)的IgG4。
我们首先通过化学修饰改变各Ig抗体以产生半抗体。具体地，缓冲液交换反应将抗体(0.5-3mg)加入到15mL的过滤器离心管(Millipore，UFC903024)中，并添加适当量的pH8.0的PBS 1mM DTPA(二亚乙基三胺五乙酸)缓冲液至管上的50mL标记。将管在5℃下以3,000RPM离心20分钟。将抗体转移到1.5mL塑料小瓶中并使用Nanodrop(Fisher，ND-2000UV-Vis分光光度计)检查浓度。最终抗体浓度在5-8mg/mL之间。
制备在pH 8.0PBS(1.0mM DTPA)缓冲液中1mg/mL TCEP((三(2-羧乙基)膦))(Sigma-Aldrich，C4706)的储备溶液。我们使用下表计算需要加入到抗体中的TCEP溶液的体积，这取决于缓冲液交换后回收的抗体的当量数和最终质量。
将适当量的TCEP溶液(通过上表计算)加入到抗体溶液中，轻轻涡旋，并将小瓶置于转盘上。在室温下进行还原反应90分钟。
基于上表的计算制备在DMSO(Sigma-Aldrich，472301)中的DBCO-马来酰亚胺(Click Chemistry Tools，A108-100)储备溶液。将DMSO中的DBCO-马来酰亚胺加入到抗体样品(无TCEP的纯化)中。抗体样品中DMSO的最终量为约5％(v/v)。在室温下在通过转盘的混合条件下将偶联反应进行1小时。将每个样品置于单独的15mL过滤器离心管(Millipore，UFC903024)中，并加入适当量的1X DPBS(Corning，21-031-CM，无钙或镁)缓冲液至管上的50mL标记。将样品以3,000RPM在5℃下离心20分钟。再次重复洗涤步骤。洗涤后，将样品转移到单独的1.5mL塑料小瓶中，并置于冰箱(5℃)中。
对于IgG4抗体，4.0当量的TCEP提供了大量的半抗体。对于IgG1抗体，3.5当量的TCEP提供了大量的半抗体。对于两种类型的抗体使用5.0当量的DBCO。
向在DMSO(0.12mL)中的DBCO-马来酰亚胺(1.0mg，1.0当量)溶液中加入在DMSO(0.6mL)中的叠氮基-PEG4-叠氮化物(2.5mg，5.0当量)。将混合物在室温下搅拌2小时。如通过LC/MS所示反应完成。所得叠氮化物-马来酰亚胺的分子量为627.65g/mol。叠氮化物-马来酰亚胺合成(方案1)：
方案1.叠氮化物-马来酰亚胺的合成
将DMSO中的叠氮化物-马来酰亚胺(5.0当量)加入到抗体样品中。抗体样品中DMSO的最终量为约5％(v/v)。在通过转盘的混合下将偶联反应在室温下进行1小时。如前所述洗涤样品。
通过疏水相互作用柱(HIC)纯化各半抗体片段。HIC分析使用TOSOH丁基-NPR柱在40℃柱温和0.6mL/min流速下进行。在50mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)中降低的盐浓度(从1.5至0M硫酸铵)和增加的有机改性剂(从0％至25％异丙醇)的30分钟梯度实现洗脱。通过SDSPAGE分析半抗体片段。具体地，对于每个待分析的样品，需要0.6mg/mL浓度的20μL。我们遵循建立方案运行SDS-PAGE凝胶(RTP AD001-01和AD002-01)。图9显示化学修饰的半抗体片段(泳道2和3)的非还原SDS PAGE。
实施例5
该实施例说明了通过点击反应产生双特异性抗体。图10显示通过两个半抗体片段之间的点击偶联产生双特异性抗体。两个半抗体片段之间的点击反应示于图10中。向在PBS中的半抗体叠氮化物片段(500μg)(5.0mg/mL)中加入PBS中的半抗体-DBCO片段(500μg)(5.0mg/mL)。反应在室温下在通过转盘的混合条件下进行2小时。将混合物进行SDS PAGE分析(图11)并通过离子交换色谱纯化。
在Agilent 1200HPLC上使用Thermo WCX-10柱以0.6mL/min流速纯化双特异性抗体。用在pH 5.7的10mM MES缓冲液中增加的盐浓度(从0至100mM NaCl)的30分钟梯度实现洗脱。通过IdeS蛋白酶消化双特异性抗体STI CBA-0710，并在Water Xevo G-2QTOF质谱上进行分析和确认(图12)。
通过双特异性抗体的尺寸排阻色谱(SEC)确定双特异性抗体STI CBA-0710的生物物理性质(图13)。具体地，在Agilent 1200HPLC上使用TSK凝胶SuperSW3000柱(4.6mm ID×30cm，4μm)分析双特异性抗体。缓冲液为0.2M磷酸钾，0.25M KCl，pH 6.2。
表2.双特异性抗体CBA-0710的SEC数据
主 HMWS LMWS
98.3％ 1.2％ 0.5％
图14显示双特异性抗体CBA-0710在BIAcore上的结合。使用标准NHS/EDC偶联方法将第一抗原固定在CM5传感器芯片上至约1500RU。运行缓冲液用作基线。加载双特异性抗体，然后缓冲液，然后进行针对第二抗原的结合。
实施例6
该实施例显示了本文产生的双特异性抗体的各种测定结果。存在双特异性抗体的基于细胞的结合和功能。双特异性抗体CBA-0710结合MDA-MB-231(人乳腺癌)细胞(图15)，如通过流式细胞术测定的。测定了抗体的EC50值。用无酶细胞解离缓冲液(GIBCO)收获表达抗原-1和抗原-2两者的MDA-MB-231三阴性乳腺癌(TNBC)细胞，并转移至V-形底96孔板(50,000个细胞/孔)。将细胞与FACS缓冲液(PBS+2％FBS)+NaN3中的双特异性抗体CBA-0710或者亲本单特异性抗抗原-1或抗抗原-2抗体的系列稀释物在冰上温育45分钟。在FACS缓冲液中洗涤2次后，加入1：1000稀释的藻红蛋白偶联抗人IgG(γ-链特异性的)，并温育30分钟。在最后洗涤后，在Intellicyt高通量流式细胞仪(HTFC)上测量荧光强度。使用GraphpadPrism软件和非线性回归拟合分析数据。数据点显示为阳性标记细胞的中值荧光强度(MFI)+/-标准误差。EC50值报告为达到与细胞的50％最大结合的抗体浓度。
结果示于表3和图15中，并且显示与亲本类型相比，双特异性抗体与MDA-MB-231细胞的结合改善，具有类似于抗-抗原-2抗体的亚纳摩尔EC50值，和与抗抗原-1抗体一样高的结合强度。
表3.双特异性抗体和亲本型抗体的结合数据
显示了双特异性抗体CBA-0710的拮抗活性。具体来说，按照Phospho-Met(panTyr)Sandwich ELISA试剂盒#7333方案运行双特异性抗体CBA-0710对c-MET磷酸化的抑制。简言之，将细胞裂解物加入重构的检测抗体并温育，然后加入重构的HRP-接头二级抗体。洗涤后，加入TMB底物并温育。加入STOP溶液后，读取结果。图16显示双特异性抗体CBA-0710在三阴性乳腺癌细胞中的拮抗活性。STI-A0607是抗-抗原-1单克隆抗体，和STI-A1010是抗-抗原2单克隆抗体。HGF是抗原-1的天然配体。
存在双特异性抗体CBA-0710的免疫调节活性。为了测量双特异性抗体CBA-0710调节T细胞反应性的能力，将纯化的CD4+细胞与同种异基因树突细胞一起培养，其通过在GM-CSF和IL-4中培养单核细胞7天而制备。设置平行平板以允许在第3天和第5天收集上清液而使用商业ELISA试剂盒分别测量IL-2和IFNγ。竞争的人源化抗-抗原-2(免疫检查点)mAb内部产生并用作阳性对照IgG1，并且不相关的STI人mAb用作阴性对照IgG抗体。图17显示响应于双特异性抗体CBA-0710的IFN-γ释放增加。STI-A1010是抗-抗原-2(免疫检查点)单克隆抗体。竞争mAb是人源化抗-抗原-2(免疫检查点)单克隆抗体。
实施例7
该实施例说明了使用F(ab)'2抗体A'和B'合成所公开的双特异性抗体的方案。本文所述的双特异性F(ab)'2由在铰链区化学连接的两个F(ab)'片段组成(图20)。起始抗体是IgG1或IgG4同种型。起始抗体含有修饰的铰链区，其中Cys残基突变为Ser残基，从而在铰链区仅留下一个二硫键。双特异性F(ab)'2化学锁定双特异性抗体的产生涉及四个主要步骤。第一步是除去Fc片段。第二步是分别选择性还原抗体A和B。第三步是通过基于半胱氨酸的偶联在铰链区中引入功能性部分X或Y，从而分别产生化学修饰的抗体片段A'和B'。在最后一步中，两个抗体片段通过X和Y之间的化学接合连接在一起以形成双特异性F(ab)'2。该合成的方案示于图21中。
具体地，我们进行了用具有铰链突变(SPPC)的IgG1A抗体和具有铰链突变(SPSC)的IgG4 B抗体合成F(ab)'2化学锁定双特异性抗体的方法。使用酶IdeS(其是仅在铰链区之下的一个特异性位点切割IgG的消化酶)，将抗体(1.5mg)加入到IdeS(A0-FR1-008)的各个管中，并在37℃下在翻转式摇床(head to head spinner)上温育过夜。然后使用蛋白A纯化除去Fc片段。
将抗体(1-10mg)加入到15mL过滤器离心管(Millipore，UFC903024)中，并加入适当量的50mM磷酸钠，150mM NaCl，5mM EDTA，pH 7.7缓冲液至管上的50mL标记。将管在22℃下以3,000RPM离心20分钟。将抗体转移到1.5mL塑料小瓶中，并使用Nanodrop(Fisher，ND-2000UV-Vis分光光度计)检查浓度。最终抗体浓度高达10mg/mL。
向含有6mg 2-巯基乙胺·HCl的一个小瓶中加入1mL的50mM磷酸钠，150mM NaCl，5mM EDTA，pH 7.7缓冲液(得到50mM 2-MEA)。加入50mM 2-MEA至F(ab)'2终浓度15mM，充分混合。在37℃下温育15分钟。使用NAP-5(GE17-0853-02)脱盐柱从还原的F(ab)'2分离2-MEA。
制备在pH 8.0的PBS(1.0mM DTPA)缓冲液中的1mg/mL TCEP((三(2-羧乙基)膦))(Sigma-Aldrich，C4706)的储备溶液。取决于蛋白A纯化后回收的F(ab)'2的当量数和最终质量，将5当量的TCEP加入到脱盐的F(ab)'中，充分振摇，并在室温下温育5分钟。
对于DBCO(二苯并环辛基)-马来酰亚胺和叠氮化物-马来酰亚胺偶联，制备DBCO-马来酰亚胺(Click Chemistry Tools，A108-100)在DMSO(Sigma-Aldrich，472301)中的储备溶液，并且将在DMSO中的20当量的DBCO-马来酰亚胺加入到F(ab)'(A)样品(没有TCEP的纯化)中。抗体样品中DMSO的最终量为约5％(v/v)。在室温下通过转盘的混合进行偶联反应2小时。将在DMSO中的叠氮化物-马来酰亚胺(20当量)加入到F(ab)'(B)样品中。抗体样品中DMSO的最终量为约5％(v/v)。在室温下通过转盘的混合进行偶联反应2小时。
对于洗涤步骤，将每个样品置于单独的15mL过滤器离心管(Millipore，UFC903024)中，并加入适当量的1X DPBS(Corning，21-031-CM，无钙或镁)缓冲液至管上的50mL标记。将样品在22℃下以3,000RPM离心20分钟。再次重复洗涤步骤。洗涤后，将样品转移到单独的1.5mL塑料小瓶中，并置于冰箱(5℃)中或用于点击步骤。对于F(ab)'片段分析，使用SDS PAGE程序。对于每个待分析的样品，需要浓度为0.6mg/mL的20μL。遵循已建立的方案运行SDS-PAGE凝胶(RTP AD001-01和AD002-01)(图21)。
两个F(ab)'片段之间的点击反应方案示于图23中。向PBS中的F(ab)'-叠氮化物片段(500μg)(5.0mg/mL)中加入PBS中的F(ab)'-DBCO片段(500μg)(5.0mg/mL)。在室温下通过转盘的混合进行反应过夜。将混合物进行SEC分析(图24)。
使用尺寸排阻色谱(SEC)分析在本实施例中制备的双特异性抗体的生物物理性质。使用TSK凝胶SuperSW3000柱(4.6mm ID×30cm，4μm)的尺寸排阻色谱(SEC)Agilent1200HPLC分析F(ab)'_A、F(ab)'_B和双特异性点击_F(ab)'2(图24)。缓冲液0.2M磷酸钾，0.25M KCl，pH 6.2。
通过质谱法证实双特异性F(ab)'2。在Water Xevo G-2 QTOF9上分析双特异性F(ab)'2(图25)。使用尺寸排阻色谱(SEC)纯化双特异性F(ab)'2。使用TSK凝胶SuperSW3000柱(4.6mm ID×30cm，4μm)的尺寸排阻色谱(SEC)Agilent1200 HPLC用于纯化双特异性点击_F(ab)'2(图26)。缓冲液0.2M磷酸钾，0.25M KCl，pH 6.2。
体外亲和力测量是使用Octet Red的测量(图27)。传感器AR2G用于测量Octet Red(ForteBio，Inc.)上的双特异性F(ab)'2抗原相互作用。简言之，测量方案如下：300秒基线；300秒加载10μg/ml双特异性F(ab)'2，120秒基线；300秒抗原A；300秒解离；300秒抗原B和300秒解离(图27)。在PBS中进行传感器水合及基线-和解离测量。
实施例8
该实施例说明了使用IgG2抗体A'和B'合成所公开的双特异性抗体的方案。本文所述的双特异性IgG2由在铰链区化学连接的两个IgG2片段组成(图29)。起始抗体是IgG2同种型。双特异性IgG2的产生涉及三个主要步骤。第一步是还原IgG2抗体铰链区中的(四个中的)一个或两个二硫键，其仍然保持同源二聚体结构。第二步是通过基于半胱氨酸的偶联在铰链中引入功能性部分X或Y，从而分别导致化学修饰的抗体片段A'和B'。在最后一步中，通过X和Y之间的化学接合将两种抗体连接在一起以形成双特异性IgG2。
具体地，我们进行了用于合成IgG2化学锁定的双特异性抗体的方法。将抗体(1-10mg)加入到15mL过滤器离心管(Millipore，UFC903024)中，并加入适当量的50mM磷酸钠、150mM NaCl、5mM EDTA，pH 7.7缓冲液至管上的50mL标记。将管在22℃下以3,000RPM离心20分钟。将抗体转移到1.5mL塑料小瓶中，并使用Nanodrop(Fisher，ND-2000UV-Vis分光光度计)检查浓度。最终抗体浓度高达10mg/mL。
制备在pH 8.0的PBS(2.0mM DTPA)缓冲液中的1mg/mL的TCEP((三(2-羧基乙基)膦))(Sigma-Aldrich，C4706)的储备溶液。根据IgG2的当量数和所得质量，将2当量的TCEP加入到IgG2溶液中，充分摇动并在室温下温育90分钟。
DBCO(二苯并环辛基)-马来酰亚胺和叠氮化物-马来酰亚胺
为了偶联，制备DBCO-马来酰亚胺(Click Chemistry Tools，A108-100)在DMSO(Sigma-Aldrich，472301)中的储备溶液，并将DMSO中的5当量的DBCO-马来酰亚胺加入到IgG2_A样品(没有TCEP的纯化)。抗体样品中的DMSO的最终量为约5％(v/v)。在室温下通过转盘的混合进行1小时偶联反应。将DMSO中的叠氮化物-马来酰亚胺(5当量)加入到IgG2(B)样品中。抗体样品中DMSO的最终量为约5％(v/v)。在室温下通过转盘的混合进行1小时偶联反应。
对于洗涤步骤，将每个样品置于单独的15mL过滤器离心管(Millipore，UFC903024)中，并加入适当量的1X DPBS(Corning，21-031-CM，无钙或镁)缓冲液至管上的50mL标记。将样品在22℃下以3,000RPM离心20分钟。再次重复洗涤步骤。洗涤后，将样品转移到单独的1.5mL塑料小瓶中，并置于冰箱(5℃)中或用于点击步骤。
对于每个待分析的样品，需要0.6mg/mL浓度的20μL。遵循已建立的方案运行SDS-PAGE凝胶(RTP AD001-01和AD002-01)(图29)。
对于质谱，用TCEP还原抗体A，并与DBCO偶联，在Water Xevo G-2QTOF上进行分析。该数据表明2个DBCO(仅一个二硫键还原)或4个DBCO(两个二硫键还原)与我们的IgG2偶联(图30A-C)。
使用尺寸排阻色谱(SEC)分析在该实施例中制备的双特异性抗体的生物物理性质。使用TSK凝胶SuperSW3000柱(4.6mm ID×30cm，4μm)的尺寸排阻色谱(SEC)Agilent1200HPLC来分析双特异性IgG2(图31)。缓冲液0.2M磷酸钾，0.25M KCl，pH 6.2。

Claims (26)

1.一种用于从第一抗体“A”和第二抗体“B”制备双特异性抗体“AB”或“BA”的方法，其包括：
(a)使所述第一抗体A与还原剂在足以切割铰链区中重链之间的基本上所有二硫键的条件下接触以产生一对第一抗体片段A'，每个第一抗体片段A'包含连接于单一重链的单一轻链，其中所述重链具有一个或多个由所述二硫键的还原形成的反应性巯基；
(b)将第一异双官能接头连接到所述第一抗体片段A'，所述第一异双官能接头包含(i)用于与所述第一抗体片段的所述重链的反应性巯基共价连接的第一巯基反应性官能团和(ii)叠氮化物，从而形成叠氮化物官能化的第一抗体片段；
(c)使所述第二抗体B与还原剂在足以切割铰链区中重链之间的基本上所有二硫键的条件下接触以产生一对第二抗体片段B'，每个第二抗体片段B'包含连接于单一重链的单一轻链，其中所述重链具有一个或多个由所述二硫键的还原形成的反应性巯基；
(d)将第二异双官能接头连接到所述第二抗体片段B'，所述第二异双官能接头包含(i)用于与所述第二抗体片段的所述重链的反应性巯基共价连接的第二巯基反应性官能团和(ii)炔；从而形成炔官能化的第二抗体片段；和
(e)使所述叠氮化物官能化的第一抗体片段与所述炔官能化的第二抗体片段反应，以通过所述叠氮化物对所述炔的环加成将所述第一抗体片段共价连接于所述第二抗体片段，从而形成化学锁定的双特异性抗体“AB”或“BA”。
2.根据权利要求1所述的用于从第一抗体“A”和第二抗体“B”制备双特异性抗体“AB”或“BA”的方法，其中所述第一异双官能接头具有Q-L-N3的形式，其中Q是包含烷基卤、苄基卤、马来酰亚胺、卤代马来酰胺或二卤代马来酰亚胺的巯基反应性官能团；且L是具有3-60个原子的烃接头，和N3是叠氮基。
3.根据权利要求1所述的用于从第一抗体“A”和第二抗体“B”制备双特异性抗体“AB”或“BA”的方法，其中所述第一异双官能接头具有Q-L-N3的形式，其中Q是包含马来酰亚胺、卤代马来酰胺或二卤代马来酰亚胺基团的巯基反应性官能团；和L是在具有单元-(CH2CH2-O)n-和/或-(O-CH2CH2)n-的聚合物构型中具有3-60个原子的烃接头，其中“n”独立地是1-20的整数；和N3是叠氮基。
4.根据权利要求2所述的用于从第一抗体“A”和第二抗体“B”制备双特异性抗体“AB”或“BA”的方法，其中所述第一异双功能接头具有以下形式：
其中
Q是以下形式的巯基反应性基团：
其中Z独立地选自H、Br、I和SPh，条件是至少一个Z不是H；和M独立地是CR*或N；
其中X1、X2、X3、X2、X4和X5独立地选自键、-O-、-NRN-、-N＝C-、-C＝N-、-N＝N-、-CR*＝CR*-(顺式或反式)、-C≡C-、-(C＝O)-、-(C＝O)-O-、-(C＝O)-NRN-、-(C＝O)-(CH2)n-、-(C＝O)-O-(CH2)n-、-(C＝O)-NRN-(CH2)n-和-(C＝O)-NRN-(CH2CH2-O)n-，其中“n”为0或1-10的整数；
其中Ra、Rb、Rc和Rd独立地选自–O–、–NRN–、–CH2–、–(CH2)n–、–(CR*2)n–、–(CH2CH2–O)n–、–(CR*2CR*2–O)n–、–(O–CH2CH2)n–、–(O–CR*2CR*2)n–、–CR*＝CR*–(顺式或反式)、–N＝C–、–C＝N–、–N＝N–、–C≡C–、–(C＝O)–、–(CH2)n–(C＝O)–、–(C＝O)–(CH2)n–、–(CH2)n–(C＝O)–(CH2)n–、–O–(C＝O)–、–(C＝O)–O–、–O–(C＝O)–O–、–(CH2)n–(C＝O)–O–、–O–(C＝O)–(CH2)n、–(C＝O)–O–(CH2)n–、–(CH2)n–O–(C＝O)–、–(CH2)n–(C＝O)–O–(CH2)n–、–(CH2)n–O–(C＝O)–(CH2)n–、–NRN–(C＝O)–、–(C＝O)–NRN–、–NRN–(C＝O)–O–、–O–(C＝O)–NRN–、–NRN–(C＝O)–NRN–、–(CH2)n–(C＝O)–NRN–、–NRN–(C＝O)–(CH2)n、–(C＝O)–NRN–(CH2)n–、–(CH2)n–NRN–(C＝O)–、–(CH2)n–(C＝O)–NRN––(CH2)n–、–(CH2)n–NRN–(C＝O)–(CH2)n–、–(C＝O)–NRN–(CH2CH2–O)n–、–(CH2CH2–O)n–(C＝O)–NRN–、–(CH2)n–(C＝O)–NRN–(CH2CH2–O)n–、–(CH2CH2–O)n–(C＝O)–NRN–(CH2)n–或者2-8元的环状烃、杂环、芳基或杂芳基环；其中“n”独立地为0或1-10的整数；和其中“l”、“p”、“q”和“r”独立地为0或1-10的整数；
Ω是键或者是C3-26烃环或稠环系统，任选地包含至多四个稠合环，其中每个环具有3-8元和任选地在每个环中包含1-4个选自O、S和N的杂原子；
其中R*和RN独立地为H或C1-12烃，任选被1-6个选自卤素、O、S和N的杂原子取代；和
其中R*和/或RN可以一起形成3-8元环。
5.根据权利要求4所述的用于从第一抗体“A”和第二抗体“B”制备双特异性抗体“AB”或“BA”的方法，其中Q是马来酰亚胺、溴代-马来酰亚胺或二溴代马来酰亚胺。
6.根据权利要求1所述的用于从第一抗体“A”和第二抗体“B”制备双特异性抗体“AB”或“BA”的方法，其中所述第二异双官能接头具有Q-L-G的形式，其中Q是包含烷基卤、苄基卤、马来酰亚胺、卤代马来酰胺或二卤代马来酰亚胺的巯基反应性官能团；且L是具有3-60个原子的烃接头，和G是含炔基团。
7.根据权利要求1所述的用于从第一抗体“A”和第二抗体“B”制备双特异性抗体“AB”或“BA”的方法，其中G是-C≡CH。
8.根据权利要求1所述的用于从第一抗体“A”和第二抗体“B”制备双特异性抗体“AB”或“BA”的方法，其中G包含具有-C≡C-键的C8环。
9.根据权利要求8所述的用于从第一抗体“A”和第二抗体“B”制备双特异性抗体“AB”或“BA”的方法，其中G具有以下形式：
10.根据权利要求8所述的用于从第一抗体“A”和第二抗体“B”制备双特异性抗体“AB”或“BA”的方法，其中G具有以下形式：
11.根据权利要求1所述的用于从第一抗体“A”和第二抗体“B”制备双特异性抗体“AB”或“BA”的方法，其中所述第二异双官能接头具有Q-L-G的形式，其中Q是包含马来酰亚胺、卤代马来酰胺或二卤代马来酰亚胺基团的巯基反应性官能团；L是具有3-60个原子和包含具有单元–(CH2CH2–O)n–或–(O–CH2CH2)n–的聚合物的烃接头，其中“n”独立地是1-20的整数；且G是C8-20烃，其包含具有能够与叠氮化物发生1,3偶极环加成反应的-C≡C-键的C8环。
12.根根据权利要求10所述的用于从第一抗体“A”和第二抗体“B”制备双特异性抗体“AB”或“BA”的方法，其中所述第二异双功能接头具有以下形式：
其中，
Q是以下形式的巯基反应基团：
其中Z独立地选自H、Br、I和SPh，条件是至少一个Z不是H；和M独立地是CR*或N；
G是C8-20烃基团，其包含具有能够与所述的叠氮化物发生1,3偶极环加成反应的-C≡C-键的C8环；
X1、X2、X3、X2、X4和X5在每次出现时独立地选自键、–O–、–NRN–、–N＝C–、–C＝N–、–N＝N–、–CR*＝CR*–(顺式或反式)、–C≡C–、–(C＝O)–、–(C＝O)–O–、–(C＝O)–NRN–、–NRN–(C＝O)–、–NRN–(C＝O)–O–、–(C＝O)–(CH2)n–、–(C＝O)–O–(CH2)n–、–(C＝O)–NRN–(CH2)n–和–(C＝O)–NRN–(CH2CH2–O)n–，其中“n”为0或1-10的整数；
Ra、Rb、Rc和Rd独立地选自–O–、–NRN–、–CH2–、–(CH2)n–、–(CR*2)n–、–(CH2CH2–O)n–、–(CR*2CR*2–O)n–、–(O–CH2CH2)n–、–(O–CR*2CR*2)n–、–CR*＝CR*–(顺式或反式)、–N＝C–、–C＝N–、–N＝N–、–C≡C–、–(C＝O)–、–(CH2)n–(C＝O)–、–(C＝O)–(CH2)n–、–(CH2)n–(C＝O)–(CH2)n–、–O–(C＝O)–、–(C＝O)–O–、–O–(C＝O)–O–、–(CH2)n–(C＝O)–O–、–O–(C＝O)–(CH2)n、–(C＝O)–O–(CH2)n–、–(CH2)n–O–(C＝O)–、–(CH2)n–(C＝O)–O–(CH2)n–、–(CH2)n–O–(C＝O)–(CH2)n–、–NRN–(C＝O)–、–(C＝O)–NRN–、–NRN–(C＝O)–O–、–O–(C＝O)–NRN–、–NRN–(C＝O)–NRN–、–(CH2)n–(C＝O)–NRN–、–NRN–(C＝O)–(CH2)n、–(C＝O)–NRN–(CH2)n–、–(CH2)n–NRN–(C＝O)–、–(CH2)n–(C＝O)–NRN––(CH2)n–、–(CH2)n–NRN–(C＝O)–(CH2)n–、–(C＝O)–NRN–(CH2CH2–O)n–、–(CH2CH2–O)n–(C＝O)–NRN–、–(CH2)n–(C＝O)–NRN–(CH2CH2–O)n–、–(CH2CH2–O)n–(C＝O)–NRN–(CH2)n–或者2-8元环状烃、杂环、芳基或杂芳基环；其中“n”独立地为0或1-10的整数；和其中“l”、“p”、“q”和“r”独立地为0或1-10的整数；
Ω独立地是键或者为C3-26烃环或稠环系统，任选地包含至多四个稠合环，每个环具有3-8元和在每个环中任选地包含独立地选自O、S和N的1-4个杂原子；
其中R*和RN在每次出现时独立地为H或C1-12烃，任选地被1-6个选自卤素、O、S和N的杂原子取代；并且其中两个基团R*和/或RN可以一起形成3-8元环。
13.根据权利要求1所述的用于从第一抗体“A”和第二抗体“B”制备双特异性抗体“AB”或“BA”的方法，其中所述环加成反应在铜离子的存在下发生。
14.根据权利要求1所述的用于从第一抗体“A”和第二抗体“B”制备双特异性抗体“AB”或“BA”的方法，其中所述环加成反应在中性pH下发生。
15.根据权利要求1所述的用于从第一抗体“A”和第二抗体“B”制备双特异性抗体“AB”或“BA”的方法，其中至少90％的重链和轻链之间的二硫键在铰链区的二硫键裂解后基本上保持完整。
16.根据权利要求1所述的用于从第一抗体“A”和第二抗体“B”制备双特异性抗体“AB”或“BA”的方法，其中抗体A或抗体B是IgG1免疫球蛋白。
17.根据权利要求1所述的用于从第一抗体“A”和第二抗体“B”制备双特异性抗体“AB”或“BA”的方法，其中抗体A或抗体B是IgG4免疫球蛋白。
18.一种用于从IgG1、IgG2或IgG4类抗体或其Fab2片段“A”和IgG1、IgG2或IgG4类抗体或其片段“B”产生化学锁定的双特异性抗体“AB”或“BA”的方法，其包括：
(a)还原具有选自于CPPC、CPSC、SPPC和SPSC的铰链残基序列(EU索引编号：残基226-229)的第一抗体“A”和具有选自于CPPC、CPSC、SPPC和SPSC的铰链残基序列(EU索引编号：残基226-229)的抗体“B”以形成半抗体A和半抗体-B，其中抗体A结合第一靶标和抗体B结合第二靶标，由此还原条件破坏抗体A和抗体B的铰链区中的任何链间或链内二硫键；
(b)将第一化合物与半抗体A的抗体铰链核心序列的一个或两个Cys残基226或/和229(EU索引编号：残基226或/和229)连接，以形成连接的半抗体A，其中所述第一化合物具有选自以下的结构：
M＝N、C
M’＝N、C
Z＝I、Br、SPh
其中N3是–N＝N＝N；
(c)将第二化合物与具有铰链残基序列(残基226-229)CPPC或CPSC或SPPC或SPSC的抗体B的铰链核心序列的一个或两个Cys残基226和229连接以形成连接的抗体B，其中该第二化合物具有选自以下的结构：
M＝N、C
M’＝N、C
Z＝I、Br、SPh；
(d)在中性条件下温育近似相等摩尔量的连接的抗体A与连接的抗体B，以形成化学锁定的双特异性抗体AB。
19.根据权利要求18所述的用于产生化学锁定的双特异性抗体的方法，其中所述抗体A还原以形成半抗体A和抗体B还原以形成半抗体B在还原剂中进行，其中该还原剂选自于L-半胱氨酸、二硫苏糖醇、β-巯基乙醇、半胱胺、TCEP(三(2-羧乙基)膦)、2-MEA(2-巯基乙胺)及其组合。
20.根据权利要求18所述的用于产生化学锁定的双特异性抗体的方法，其中具有两个Cys残基(EU索引编号：残基226或/和229)的抗体A的铰链区与部分A连接，其中所述部分A具有选自以下的结构：
M＝N、C
M’＝N、C
Z＝I、Br、SPh
其中N3是–N＝N＝N。
21.根据权利要求18所述的用于产生化学锁定的双特异性抗体的方法，其中具有一个或两个Cys残基(EU索引编号：残基226或/和229)的抗体B的铰链区与具有选自于以列结构的部分B连接：
M＝N、C
M’＝N、C
Z＝I、Br、SPh
以形成具有选自于以下结构的连接的半抗体A：
M＝N、C
M’＝N、C
Z＝I、Br、SPh
其中N3是–N＝N＝N；
和具有选自于以下结构的连接的抗体B：
M＝N、C
M’＝N、C
Z＝I、Br、SPh。
22.一种化学锁定的双特异性抗体AB，其包含连接的半抗体A，其连接于：
其中N3是–N＝N＝N；
该连接的半抗体A结合于连接的抗体B，该连接的抗体B连接于：
23.一种来自IgG类抗体“A”和IgG类抗体“B”的化学锁定的双特异性抗体“AB”或“BA”，其包含与选自以下的结构连接的半抗体A：
M＝N、C
M’＝N、C
Z＝I、Br、SPh
其中N3是–N＝N＝N；
该半抗体A结合于与选自于以下的结构连接的半抗体B：
M＝N、C
M’＝N、C
Z＝I、Br、SPh。
24.一种双特异性抗体，其包含：
(a)包含来自抗体A的单一重链和轻链的第一抗体片段A'，其中所述单一重链具有一个或多个反应性巯基基团；
(b)包含来自抗体B的单一重链和轻链的第二抗体片段B'，其中所述单一重链具有一个或多个反应性巯基基团；
其中所述第一和第二抗体片段通过经由叠氮化物和炔的环加成反应形成的1,2,3-三唑共价连接，所述叠氮化物通过接头连接于所述第一抗体片段上的反应性巯基，和所述炔通过接头连接于所述第二抗体片段上的反应性巯基。
25.根据权利要求24所述的双特异性抗体，其中所述片段A'和B'源自IgG1或IgG4免疫球蛋白。
26.一种与接头共价键合的抗体片段，所述接头包含具有能够与叠氮化物发生环加成反应的-C≡C-键的C8环。
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Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180050321A (ko) 2015-08-07 2018-05-14 이미지냅 인코포레이티드 분자를 표적화하기 위한 항원 결합 구조체
JP7170535B2 (ja) * 2015-10-20 2022-11-14 ソレント・セラピューティクス・インコーポレイテッド 細胞内送達化合物
CA3005454A1 (en) * 2015-11-18 2017-05-26 Sorrento Therapeutics, Inc. Chemically-locked bispecific antibodies
WO2017218891A1 (en) * 2016-06-17 2017-12-21 Life Technologies Corporation Site-specific crosslinking of antibodies
EP3507307A4 (en) * 2016-09-01 2020-04-22 Immunomab, Inc. BISPECIFIC ANTIBODIES
AU2017346401B2 (en) * 2016-10-17 2021-05-20 Shenzhen Enduring Biotech, Ltd. Long acting multi-specific molecules and related methods
US20180194859A1 (en) * 2017-01-12 2018-07-12 Sorrento Therapeutics, Inc. Linked Dual Antibodies Conjugated at a Hinge Region
US11266745B2 (en) 2017-02-08 2022-03-08 Imaginab, Inc. Extension sequences for diabodies
CN112041337A (zh) 2018-04-16 2020-12-04 日本医事物理股份有限公司 修饰抗体、及放射性金属标记抗体

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101802015A (zh) * 2007-03-29 2010-08-11 根马布股份公司 双特异性抗体及其制造方法

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5185433A (en) 1990-04-09 1993-02-09 Centocor, Inc. Cross-linking protein compositions having two or more identical binding sites
AU2004308439A1 (en) 2003-12-22 2005-07-14 Centocor, Inc. Methods for generating multimeric molecules
US8293714B2 (en) 2008-05-05 2012-10-23 Covx Technology Ireland, Ltd. Anti-angiogenic compounds
US8435488B2 (en) * 2009-02-27 2013-05-07 Genentech, Inc. Methods and compositions for protein labelling
MX2012006406A (es) 2009-12-04 2012-07-25 Genentech Inc Anticuerpos multiespecificos, analogos de anticuerpo, composiciones y metodos.
EP3112382A1 (en) 2009-12-29 2017-01-04 Emergent Product Development Seattle, LLC Heterodimer binding proteins and uses thereof
EP2640745B1 (en) 2010-09-10 2018-11-07 MedImmune Limited Bivalent and bispecific anti-il6/anti-il23 antibodies
FI125829B (fi) 2011-03-07 2016-02-29 Aalto Korkeakoulusã Ã Tiã Double click-teknologia
US10081684B2 (en) 2011-06-28 2018-09-25 Whitehead Institute For Biomedical Research Using sortases to install click chemistry handles for protein ligation
CA2870485A1 (en) * 2012-04-13 2013-10-17 Whitehead Institute For Biomedical Research Sortase-modified vhh domains and uses thereof
US20160326266A1 (en) * 2015-05-10 2016-11-10 Sorrento Therapeutics, Inc. Chemically-Locked Bispecific Antibodies
US20180194859A1 (en) * 2017-01-12 2018-07-12 Sorrento Therapeutics, Inc. Linked Dual Antibodies Conjugated at a Hinge Region

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101802015A (zh) * 2007-03-29 2010-08-11 根马布股份公司 双特异性抗体及其制造方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHAN HYUK KIM ET AL.: ""Synthesis of Bispecific Antibodies using Genetically Encoded Unnatural Amino Acids"", 《 JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY》 *

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