FI125829B - Double click-teknologia - Google Patents

Description

KAKSOIS-CLICK-TEKNOLOGIA Keksinnön ala

Esillä oleva keksintö koskee menetelmää selluloosamateriaalin pinnan modifioimiseksi sekä mainitun menetelmän välituotetta.

Tekniikan tason kuvaus

Selluloosa on maapallon runsasmääräisin uusiutuva orgaaninen raaka-aine uusien biomateriaalien valmistukseen. Monipuolisten tekniikoiden kehittäminen selluloosan modifiointia varten on välttämätöntä selluloosan reaktiivisuuden ja yhteensopivuuden lisäämiseksi muiden aineiden kanssa. Yleisesti 1,3-dipolaariset sykloadditioreaktiot ovat olleet pitkään suosittuja hiilihydraattimimeettien kehittämisessä homogeenisessa reaktioympäristössä (Gallos, J. K. et ai, 2003). Tarkemmin sanottuna termisesti indusoitu sykloadditio (Huisgen-re-aktio) tapahtuu atsidin ja kolmoissidoksen välillä, ja nykyään siihen viitataan usein click-reaktioryhmän jäsenenä sen vahvuuden vuoksi (kaavio 1) (Huisgen, R. et ah, 1960).

Kaavio 1

Huisgen-sykloadditio on dipolarofiilin reaktio 1,3-dipolaarisen yhdisteen kanssa, ja se johtaa 5-jäsenisiin (hetero)sykleihin. Reaktio on saanut yhä enemmän huomiota sen jälkeen, kun havaittiin, että 1,3-dipolaarista sykloadditiota atsidien ja päätealkyynien välillä voidaan katalysoida Cu(I)-suoloilla (kupari(I)-katalysoitu atsidi-alkyynisykloadditio (CuAAC)) (Tornoe, C. W. et ai, 2002; Rostovtsev, V. V. et ah, 2002; Lewis, W. G. et ah, 2002; Lewis, W. G. et ah, 2002; Kolb, H. C. et ah, 2001; ja Iha, R. K. et ai, 2009). Itse asi- assa kupari(I)-katalysoidusta atsidi-alkyynisykloadditiosta (CuAAC) on tullut tähän mennessä suosituin click-reaktio sen suurten saantojen, nopeuden, suuren alue-ja stereoselek-tiivisyyden, lievien reaktio-olosuhteiden ja kokeellisen yksinkertaisuuden vuoksi. Useat kirjoittajat ovat kuvanneet tämän click-kemian käsitteen käyttöä hiilihydraattimimeettien ja -johdannaisten kehittämiseen (Huisgen, R., 1989; Kolb, H. C. et ah, 2001; Wu, P. et ah, 2004; ja Gupta, N. et ai, 2006). Mainittujen Huisgen-sykloadditiivisten click-reaktioiden lisäksi on myös muita kemiallisia reaktioita, jotka ovat voimakkaita ja nopeita ja saattavat mahdollistaa samanlaisen monipuolisen kemiallisen alustan molekyyliräätälöintiä varten, ja ne sisällytetään tässä click-kemian käsitteeseen. Esimerkit tällaisista reaktioista käsittävät esim. alkyylijodidien vapaaradikaaliaddition kaksoissidoksiin, merkaptaanien vapaara-dikaaliaddition kaksoissidoksiin, joista jälkimmäinen reaktio on myös mainittu ”tioli-click”-reaktiona, ja nukleofiilisen tio-bromi-click-reaktion, erityisesti tioglyserolin emäsvä-litteisen tioeetteröinnin α-bromiesterien kanssa (katso esim. Justynska, J. et ai. 2005 Kil-lops, K. L. et ai. 2008; tioli-eeni, Rosen, B. R. et ai. 2009 tio-bromi). Kaikki edellä mainitut reaktiot on myöhemmin merkitty yksinkertaisesti ”click-reaktioiksi”.

Polysakkaridien (joissa on hydroksyyli-, karboksyylihappo-ja amiiniryhmiä) kemiallisen funktionaalisuuden vuoksi esteröinti, eetteröinti ja amidointi ovat tavallisimpia lähestymistapoja polysakkaridien modifiointireaktioita varten. Nämä modifiointireaktiot vaativat kuitenkin usein orgaanisia liuottimia ja/tai melko ankaria reaktio-olosuhteita ollakseen riittäviä. Sen vuoksi nykyään tutkitaan paljon uusia menetelmiä biomateriaalin funktionalisoin-neille. Click-kemia on yksi lupaavimmista uudenaikaisista lähestymistavoista ja yhä suureneva määrä tutkimuksia kohdistuu click-kemiaan perustuviin biomateriaalien modifikaatioihin.

Click-kemian käyttö tunnetaan yleisellä tasolla, esimerkiksi julkaisusta W02010099818 AI, jossa esitetään koostumus, joka on tarkoitettu hydrogeelin valmistukseen vesiliuoksessa. Tässä koostumuksessa polymeeri tai bioaktiivinen yhdiste on kiinnitetty hydrofiilisen polysakkaridin pintaan käyttämällä click-kemiaa. Samoin julkaisussa W02008031525 AI on kuvattu menetelmä polykarboksyloitujen polysakkaridien, kuten karboksimetyyliselluloosan (CMC:n) johdannaisten, valmistamiseksi, jossa menetelmässä johdannainen on kiinnitetty käyttämällä click-kemiaa.

Toisaalta selluloosan pinnan funktionalisointi tunnetaan yleisellä tasolla esimerkiksi julkaisusta WO 0121890 AI, jossa kuvataan selluloosakuitujen modifiointi käyttäen CMC:tä tai sen johdannaista vesiliuoksessa.

Halutun modifiointimolekyylin kiinnittämisellä suoraan substraattiin on se haittapuoli, että reaktio edellyttää, että molemmilla komponenteilla on sopivat ja toisiaan vastaavat varaukset. Siten kun reaktio toteutetaan vesiliuoksessa, voidaan käyttää ainoastaan hydrofiilisiä yhdisteitä. Tämä aiheuttaa melko paljon rajoituksia menetelmälle.

Keksinnön yhteenveto

Se seikka, että tietyillä polysakkarideilla on affiniteetti adsorboitumiseen selluloosapintaan, mahdollistaa selluloosamateriaalin fysikaaliskemiallisen konversion suorittamisen arvokkaiksi aineiksi käyttämällä aktivoitujen polysakkaridien adsorptiota yhdistettynä click-ke-mian reaktioihin.

Siten tämän keksinnön kattava tavoite on tarjota uusi ympäristöystävällinen tekniikka sel-luloosamateriaalien modifiointiin vesipitoisessa väliaineessa.

Erityisemmin tämän keksinnön tavoitteena on tarjota selluloosamateriaalien modifiointiin uusi menetelmä, joka tarjoaa suuremman vaihtelun modifioidun aineen aikaansaaduissa ominaisuuksissa verrattuna tekniikan tason menetelmiin.

Nämä ja muut tavoitteet sekä niiden edut tunnettuihin menetelmiin ja saatuihin aineisiin nähden saavutetaan tällä keksinnöllä, kuten tässä jäljempänä on kuvattuja patenttivaatimuksissa esitetty.

Ehdotettu uusi tekniikka tarjoaa tavan selluloosapitoisten lähteiden homo- ja heterogeeniselle konversiolle arvokkaiksi aineiksi aktivoitujen konjugaattien adsorption kautta lähteeseen. Selluloosapintaan lisätyt uudet reaktiiviset kohdat taijoavat reitin ja välituotteen selluloosan edelleen räätälöidyille modifikaatioille click-kemian reaktioiden avulla.

Tämä keksintö koskee menetelmää selluloosamateriaalin pinnan modifioimiseksi, jolloin modifointiyhdiste kiinnitetään selluloosamateriaaliin linkkerillä tai väliosalla.

Erityisemmin tämän keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista se, mitä on mainittu patenttivaatimuksen 1 tunnusmerkkiosassa.

Edelleen tämän keksinnön mukaiselle välituotteelle on tunnusomaista se, mitä on mainittu patenttivaatimuksen 11 tunnusmerkkiosassa.

Keksinnön perustan muodostaa selluloosamateriaalin pinnan funktionalisointi vesiliuoksessa.

Aikaisemmin on osoitettu, että karboksimetyyliselluloosa (CMC) adsorboituu ir-reversiibelisti selluloosalle (Laine, J. et ai, 2000). Nyt on yllättäen todettu, että spesifisiä kemiallisia ryhmiä voidaan kiinnittää selluloosamateriaalin (esim. suodatinpaperin, nano-fibrilloidun selluloosan (NFC:n)) pintaan sen fysikaaliskemiallisten ominaisuuksien muuttamiseksi, niin että saadaan suurempaa vaihtelua mahdollisiin modifikaatioihin ilman, että reaktio-olosuhteiden vaatima vaihtelu lisääntyy.

Periaatteessa prosessointiteknologiaa voidaan käyttää erilaisten selluloosaliitäntäosien kanssa, esim. konjugaattien, CMC:n, hemiselluloosien ja polysakkaridien, kuten gluko-mannaanin, ksyloglukaanin ja kitosaanin, kanssa.

Keksinnön avulla saavutetaan merkittäviä etuja. Siten tämä keksintö taijoaa selluloosamateriaalin uuden modifiointimenetelmän, joka johtaa suurempaan vaihteluun saadun modifioidun materiaalin ominaisuuksissa tekniikan tason menetelmiin verrattuna.

Keksinnössä käytettävissä click-reaktioissa on kyse tehokkaista, alueselektiivisistä, nopeista ja suuren saannon kemiallisista reaktioista, jotka voidaan toteuttaa termodynaamisella tavalla ja jotka käsittävät sykloadditioita.

Menetelmän muita piirteitä ja etuja ovat, että: • konjugaatin adsorptioilmiö sallii selluloosamateriaalien heterogeeniset modifikaatiot, • click-kemia tarjoaa monia tapoja selluloosa-aineiden modifioimiseksi halutuilla funktionaalisuuksilla ja ominaisuuksilla, kuten varauksella, fluoresenssillä, anti-mikrobiaalisilla ominaisuuksilla, hydrofobisuudella, silloituksella, liukoisuudella, prosessoitavuudella, pintaenergialla, elektronisilla ja magneettisilla ominaisuuksilla (+para/superpara), johtokykyominaisuuksilla, optisilla ominaisuuksilla ja superhyd-rofobisilla ominaisuuksilla, • voidaan täysin välttää orgaanisten liuottimien käyttö, ja modifikaatiot toteutetaan vesipitoisissa väliaineissa, jolloin aikaansaadaan teollisesti houkutteleva menetelmä, ja • raaka-aineet voidaan saada biojalostamoilta ja ne ovat täysin uusiutuvia materiaaleja.

Keksintöä kuvataan seuraavaksi tarkemmin viitaten oheisiin piirustuksiin ja yksityiskohtaiseen selitykseen.

Piirustusten lyhyt kuvaus

Kuvio 1 on atsididerivatisoidun CMC:n (yhtenäinen viiva) ja vertailu-CMC:n (katkoviiva) FTIR-spektri.

Kuvio 2 on alkyynideri vati soidun CMC:n (yhtenäinen viiva) ja vertailu-CMC:n (katkoviiva) FTIR-spektri.

Kuviossa 3 on esitetty atsididerivatisoidun CMC:n, alkyyniderivatisoidun CMC:n ja vertai-lu-CMC:n QCM-käyrät.

Kuviossa 4 on esitetty QCM-käyrät atsididerivatisoidulle CMClle alkyyniderivatisoidun BSA:n kanssa ja ilman kupari(I):tä (CMC-atsido/BSA-alkyyni, vertailu), atsididerivatisoidulle CMClle kupari(I):n kanssa (CMC-atsido/Cu(I)/askorbiinihappo, vertailu) ja atsididerivatisoidulle CMClle alkyyniderivatisoidun BSA:n ja kupari(I):n kanssa (CMC-atsi-do/B SA-alkyyni/Cu(I)/askorbiinihappo, click-reaktio).

Kuviossa 5 on esitetty AFM-kuvat a) atsididerivatisoidulle CMClle alkyyniderivatisoidun BSA:n ja kupari(I):n kanssa (click-reaktio), b) atsididerivatisoidulle CMClle alkyyniderivatisoidun BSA:n kanssa ja ilman kupari(I):tä (vertailu) ja c) atsididerivatisoidulle CMClle kupari(I):n kanssa (vertailu).

Keksinnön edullisten suoritusmuotojen yksityiskohtainen kuvaus

Esillä oleva keksintö koskee selluloosamateriaalin pinnan modifiointimenetelmää, jossa modifiointiyhdiste kiinnitetään selluloosamateriaaliin linkkerillä, joka linkkeri on konju-gaatti, joka on aktivoitu funktionalisoinnilla ennen adsorptiota aktivoidun konjugaatin muodostamiseksi, ja jossa koko menetelmä toteutetaan vesipitoisessa väliaineessa. Menetelmässä käytetyt yhdisteet ja aineet voivat vaihdella paljon jäljempänä esitetyissä rajoissa.

Selluloosamateriaali voi perustua selluloosakuituun, nollakuituun, nano- tai mikroselluloo-safibrilleihin, mikrokiteiseen selluloosaan, nanokiteiseen selluloosaan (nanowhisker) tai johonkin muuhun selluloosapohjaiseen materiaaliin, mukaan lukien erilaiset regeneroidut selluloosamateriaalit, kuten tekstiilikuidut sekä paperi- ja kartonkilaadut, kuten suodatinpaperit.

Modifiointiyhdiste voi olla biomolekyylien, kuten DNA:n, RNA:n, albumiinin, naudan seerumialbumiini (BSA) mukaan lukien, biotiinin, hemoglobiinin ja muiden proteiinien, polymeerien, oligomeereihin asti ulottuvien pienen moolimassan polymeerien, väriaineiden, luminesoivat väriaineet mukaan lukien, radioleimojen ja nanopartikkelien tai niiden seosten tai kompleksien, muodossa.

Menetelmässä käytetään niin kutsuttuja click-kemian reaktioita, esimerkiksi aktivoivissa funktionalisointireaktioissa, jonka termin (click-reaktiot) tarkoitetaan käsittävän ryhmän selektiivisiä, nopeita ja suuren saannon kemiallisia reaktioita, jotka voidaan toteuttaa termodynaamisella tavalla ja jotka käsittävät sykloadditioreaktiot, kuten Diels-Alder-reaktiot, Huisgen-reaktiot, kupari(I)-katalysoidun atsidi-alkyynisykloaddition (CuAAC:n) ja muut 1,3-dipolaariset sykloadditioreaktiot sekä merkaptaanien reaktiot kaksoissidoksiin (”tioli”-click), halogeenien reaktiot kaksoissidoksiin ja, mikäli niillä saadaan stabiili tuote, myös ionireaktiot.

Erityisesti aktivoiva funktionalisointireaktio valitaan reaktioista, joilla aikaansaadaan kon-jugaatti, jossa on funktionaalisuus, joka on valittu ryhmästä, jonka muodostavat atsidi, kol-moissidos, kaksoissidos, tioli ja halogeeni.

Kupari(I)-katalysoidut atsidi-alkyynisykloadditio- (CuAAC-) reaktiot ovat erityisen merkittäviä tätä keksintöä varten, koska ne ovat atsidiryhmien ja päätekolmoissidosten välillä tapahtuvia nopeita ja suuren saannon kondensaatioreaktioita, jotka on todettu erityisen käyttökelpoisiksi tässä keksinnössä. Atsidipitoisen yhdisteen ja alkyynin muita piirteitä, kuten stereokemiaa ja muiden funktionaalisuuksien läsnäoloa, ei ole erityisesti rajoitettu.

”Konjugaatteja”, jotka sopivat käytettäväksi tässä keksinnössä, ovat ainakin bifunktionaali-set yhdisteet, jotka on valittu muun muassa erilaisista selluloosajohdannaisista, kuten kar-boksimetyyliselluloosasta (CMC:stä) ja polysakkarideista, kuten glukomannaanista, ksylo-glukaanista, kitosaanista ja erilaisista kumeista.

Konjugaatin funktionali sointi sen aktivoimiseksi toteutetaan reaktioilla, joilla kiinnitetään aktivointiosa konjugaattiin, niin että muodostuu sopiva lähtöaine click-reaktioita varten. Aktivointiosa voi vaihdella paljon ja se on edullisesti ei-aromaattinen orgaaninen yhdiste, jossa on C2-3o-hiilivetyketju (tai oligomeeri- tai polymeeriketju), joka mahdollisesti sisältää heteroatomeja, jotka on valittu ryhmästä, jonka muodostavat O, N ja S. Nämä funktionali-sointireaktiot ovat edullisesti esteröintejä, eetteröintejä, amidointeja, epoksidointeja tai ure-taanimuodostuksia, jotka tapahtuvat konjugaattimolekyylin karbonyyli- tai hydroksyyliryh-missä, jolloin aktivointiosa voi sopivimmin olla amiini, karboksyylihappo, alkoholi, epok-sidi tai uretaani. Funktionalisointireaktiot ovat edullisimmin amidointeja, joissa käytetään esim. EDC:tä (l-etyyli-3-[3-dimetyyliaminopropyyli]karbodi-imidivetykloridia) ja NHS:ä (N-hydroksisukkinimidiä).

Siten konjugaatin lopulliset konjugaatiokohdat, jotka kiinnittyvät funktionaalisiin ryhmiin modifiointimolekyylissä, ovat aktiivisia kohtia, jotka liittyvät aktivointiosien tai -molekyylien kautta.

Samanlaisia funktionalisointeja toteutetaan edullisesti myös modifiointiyhdisteelle, jolloin aikaansaadaan yhteensopivia konjugaatiokohtia click-reaktiota varten sekä konjugaattiin että modifiointimolekyyliin. Sopivimmin konjugaatille ja modifiointiyhdisteelle suoritetaan erilaisia funktionalisointireaktioita, jolloin aikaansaadaan yksi niistä komponenteista, joissa on atsidi-, tioli- tai halogeenifunktionaalisuus, ja toinen komponentti, jossa on kol-moissidos- tai kaksoissidosfunktionaalisuus.

Esillä olevan keksinnön erään suoritusmuodon mukaisesti keksinnön mukainen menetelmä käsittää kolme vaihetta (esitetty kaaviossa 2). Vaiheessa 1 click-aktivointiosa kiinnitetään konjugaattiin. Vaiheessa 2 konjugaatti adsorboidaan selluloosamateriaaliin. Vaiheessa 3 haluttu modifiointiyhdiste kiinnitetään click-aktivointiosaan, joka on nyt paikallaan sellu-loosapinnalla.

Kaavio 2

Keksinnön toisen suoritusmuodon mukaisesti vaiheet 2 ja 3 ovat käänteiset edellä esitettyyn verrattuna.

Menetelmä toteutetaan edullisesti amidisidoksen karbodi-imidivälitteisellä muodostuksella karboksyylin sisältävien biosubstraattien ja pääteamiinifunktionaalisuuden sisältävien pre-kursorien välillä. Näiden oksastettujen amiiniyhdisteiden pitäisi sisältää päätealkyyni- tai -atsidifunktionaalisuuksia, jotka ovat välttämättömiä click-kemian reaktiolle. Lopuksi al-kyyni- ja atsidifunktionalisoidut biomateriaalit voidaan ”klikata” so. adsorboida suureen määrään yhdisteitä, jotta voidaan valmistaa lopullisia aineita, joilla on halutut ominaisuudet. Tässä on tärkeää huomata, että nämä reaktiot voidaan toteuttaa heterogeenisessä vesipitoisessa ympäristössä ja niitä voidaan melko helposti soveltaa kaikille biomateriaaleille, joissa on karboksyylihappofunktionaalisuus ja joilla on affiniteetti selluloosaan, kuten proteiineille, polysakkarideille, pektiineille ja hemiselluloosille.

Mahdollista on myös monifunktionalisointi, jolloin useampi kuin yksi erilainen konjugaat-tityyppi aktivoituu ja kiinnittyy selluloosapintaan.

Keksinnön edullisen suoritusmuodon mukaisesti linkkerin adsorptio selluloosamateriaalin pintaan tapahtuu monien vuorovaikutusten kautta, pääasiassa sekä linkkerin että sellu-loosamateriaalien pinnoilla läsnä olevien hydroksyyli-, karbonyyli-, amiini- tai sulfaatti-ryhmien kautta.

Koska tietyt polysakkaridit kiteytyvät yhdessä selluloosan kanssa, lopullisesta rakenteesta voi tulla pinnan pysyvä osa.

Adsorptioreaktiot voivat perustua fysikaalisiin vuorovaikutuksiin, kuten adsorptioon tai pidättymiseen, sähköstaattiset vuorovaikutukset, van der Waalsin voimat, π-π-vuorovaiku-tukset ja vetysidokset (so. ei-kovalenttiset) tai kovalenttinen kiinnittyminen mukaan lukien. Konjugaatti adsorboituu todennäköisimmin selluloosapintaan useilla vetysidoksilla, kun taas muut adsorptiot perustuvat edullisesti kovalenttiseen sitoutumiseen.

Esillä olevan keksinnön edullisen suoritusmuodon mukaisesti valmistetaan ensin välituote, ja se mahdollisesti varastoidaan tai kuljetetaan sen käyttöpaikkaan, minkä jälkeen siihen adsorboidaan modifiointiyhdiste.

Tämän suoritusmuodon mukaisesti välituote käsittää funktionalisoidun konjugaatti-linkkerin, joka on adsorboitu selluloosamateriaaliin. Konjugaatti ja sen funktionalisointi ovat edullisesti sellaisia kuin edellä on kuvattu. Sopivimmin välituote koostuu mainitusta funktionalisoidusta konjugaattilinkkeristä, joka on adsorboitu selluloosamateriaaliin.

Esillä olevan keksinnön mukaisen menetelmän lopputuote on selluloosapohjainen tuote, jossa on pinta, jota on modifioitu modifiointiyhdisteen yhden tai useamman kerroksen adsorptiolla, ja se käsittää biorajapinnat, bioaktiivisen paperin ja tekstiilituotteet, elektroaktiiviset ja sähköä johtavat koostumukset, hydrofobiset ja superhydrofobiset aineet, optisesti aktiiviset aineet, huokoiset aineet ja aineet ja välituotteet suuren lujuuden komposiittimateriaaleja varten, erityisesti lämpö/ärsykeherkät aineet, haarautuneet aineet, dendriittiset aineet, grafeenin, SWCNT:n, MWCNT:n, nanosaven, fluoresoivat aineet ja supramolekulaariset aineet. Kun adsorboidaan useampi kuin yksi modifiointiyhdisteen kerros, lisäkerrokset adsorboidaan yleensä pääasiassa fysikaalisilla vuorovaikutuksilla, vaikkakin primaarisen kerroksen modifiointiyhdisteen kovalenttista aktivaatiota voitaisiin käyttää myös lisäkerrosten kiinnittämiseen kovalenttisesti.

Seuraavat esimerkit valaisevat keksinnön joidenkin edullisten suoritusmuotojen toimintaa, eikä niitä tule pitää keksintöä rajoittavina.

Esimerkit FTIR:ä, QCM:ä ja AFM:ä käytettiin liitettyihin derivatisoituihin selluloosamateriaaleihin perustuvien valmistettujen uusien alustojen tärkeimpien kemiallisten, turpoamis- ja morfologisten ominaisuuksien karakterisointiin.

Materiaalit:

Naudan seerumialbumiini (nro 29130), NHS (N-hydroksisukkinimidi, nro 24500) ja EDC (l-etyyli-3-[3-dimetyyliaminopropyyli]karbodi-imidivetykloridi, nro 22980) ostettiin Pier-celtä (Rockford, IL, USA). Etanoliamiini (Ethanolamine, nro 398136) ja CMC (karboksi-metyyliselluloosa, moolimassa 250 000, DS = 0,7, nro 419311) saatiin Sigma-Aldrichilta (Helsinki, Suomi). Kaikissa liuoksissa käytetty vesi oli deionisoitua ja edelleen Millipore Synergy UV -yksiköllä puhdistettua. QCM-D-kiteet olivat AT-leikattuja kvartsikiteitä, joita toimittaa Q-Sense AB (Västra Frölunda, Ruotsi). Perustaajuus (fo) oli 5 MHz ja herk-kyysvakio (C) oli 17,7 ngHz"'cm"2, Karboksimetyyliselluloosa (CMC, 0,5 g/1) liuotettiin 25 mM CaCl2:iin pH:ssa 6. EDC/NHS-konjugointiliuos valmistettiin liuottamalla 0,125 M EDC:täja 0,125 MNHS:äNaAc-puskuriliuokseen (10 mM, pH 5, vakiojohtokyky 3 mS/cm). Etanoliamiini liuotettiin MilliQ-veteen pitoisuutena 0,2 M ja pH säädettiin arvoon 8,5 lisäämällä HCl:a. BSA liuotettiin PBS-puskuriin (pH 7,2) pitoisuutena 100 pg/ml. Q1SO4 x 5H20:n / askorbiinihapon liuos valmistettiin liuottamalla 40 mg CuSCE x 5H20:ta ja 140,9 mg askorbiinihappoa 50 mkaan PBS-puskuria.

Esimerkki 1 - Selluloosamallikalvojen valmistus

Substraatit spin-coating-pinnoitetun selluloosamallikalvon valmistusta varten olivat piidioksidilla (SiCEdla) päällystettyjä QCM-D-ilmaisinkiteitä. Trimetyylisilyyliselluloosa (TMSC) laimennettiin tolueeniin ja sitten pinnoitettiin spin-coating-tekniikalla pyörimisnopeudella 4 000 kierrosta minuutissa (RPM) (Kontturi, E. et ai., 2003). Ennen käyttöä QCM-D:ssä SiCE-kiteille saostettu TMSC-kerros konvertoitiin selluloosalle desilyloimalla kloorivetyhappohöyryllä aikaisemmin julkaistun menetelmän mukaisesti (Schaub, M. et ai, 1993).

Esimerkki 2 - Atsidimodifioidun CMC:n synteesi 50 mg:n määrä CMC:tä (DS = 0,7, moolimassa = 25 kDa) liuotettiin 40 mkaan NaAc-pus-kuriliuosta (10 mM, pH 5, vakiojohtokyky 3 mS/cm). Tyypillisessä synteesissä lisättiin 120 mg EDC-HCl:a [N-(3-dimetyyliaminopropyyli)-N’-etyylikarbodi-imidivetykloridia)] liuotettuna 2,5 mkaan NaAc-puskuriliuosta, 72 mg NHS:ä (N-hydroksisukkinimidiä) liuotettuna 2,5 mkaan NaAc-puskuriliuosta ja vastaavasti 100 μΐ ll-atsido-3,6,9-trioksaunde-kan-l-amiinia CMC-seokseen. Korostamme, että ll-atsido-3,6,9-trioksaundekan-l-amiinin valinta ei ole ratkaiseva ja koostumus saattaa vaihdella paljon, jolloin onnistuneet reaktiot saavutetaan oksietyleeniliitosketjun eri pituuksilla atsido-ja amiiniryhmien välillä, eri lii-tosketjujen tai väliosien valinnalla ja amiinipääteryhmän valinnalla valittujen kemiallisten reaktioiden mukaan. Reaktio suoritettiin huoneenlämpötilassa sekoittamalla 24 tunnin ajan, minkä jälkeen lisättiin etanoliamiinia (0,2 M, 61 mg liuotettuna 5 mkaan MilliQ-H20:ta). Saatua seosta dialysoitiin (MWCO = 12 kDa) tislattua vettä vastaan 3 vuorokauden ajan. Lopuksi liuokset kuivattiin lyofilisointijärjestelmää käyttäen atsidomodifioidun CMC:n talteen ottamiseksi (katso kaavio 3). Modifioidun CMC:n FTIR paljastaa uuden venyvän juovan kohdassa 2 120 cm'1, joka on tunnusomainen atsideille, ja venyvän juovan kohdassa 1 650 cm'1, joka on tunnusomainen amideille (kuvio 1).

Kaavio 3

Esimerkki 3 - Alkyynimodifioidun CMC:n synteesi 50 mg:n määrä CMC:tä (DS = 0,7, moolimassa = 25 kDa) liuotettiin 40 mkaan NaAc-pus-kuriliuosta (10 mM, pH 5, vakiojohtokyky 3 mS/cm). Tyypillisessä synteesissä lisättiin 120 mg EDC-HCka [N-(3-dimetyyliaminopropyyli)-N’-etyylikarbodi-imidivetykloridia)] liuotettuna 2,5 mkaan NaAc-puskuriliuosta, 72 mg NHS:ä (N-hydroksisukkinimidiä) liuotettuna 2,5 mkaan NaAc-puskuriliuosta ja vastaavasti 30 μΐ propargyyliamiinia CMC-seok-seen. Reaktio suoritettiin huoneenlämpötilassa sekoittamalla 24 tunnin ajan, minkä jälkeen lisättiin etanoliamiinia (0,2 M, 61 mg liuotettuna 5 mkaan MilliQ-H20:ta). Saatua seosta dialysoitiin (MWCO = 12 kDa) tislattua vettä vastaan 3 vuorokauden ajan. Lopuksi liuokset kuivattiin lyofdisointijärjestelmää käyttäen alkyynimodifioidun CMC:n talteen ottamiseksi (katso kaavio 4). Modifioidun CMC:n FTIR paljastaa uudet venyvät juovat kohdissa 1 650 ja 1 270 cm'1, jotka ovat tunnusomaisia amideille (kuvio 2).

Kaavio 4

Esimerkki 4 - Alkyynimodifioidun BSA:n synteesi N-alkynyylisubstituoitu maleaamihappo. Tarkoituksenmukaisen asetyleeniamiinin (0,02 mol, 1,1 g) liuos Me2CO:ssa (5 ml) lisättiin tipoittain maleiinihappoanhydridin (0,02 mol, 1,96 g) refluksoituvaan liuokseen Me2CO:ssa (10 ml). Seosta, jota sekoitettiin, refluksoitiin 1 tunti ja sen jälkeen liuotin poistettiin. Kiteinen jäännös puhdistettiin uudel-leenkiteyttämällä (kaavio 5, vaihe 1).

N-alkynyylisubstituoitu maleimidi. Seosta, jonka muodostivat tarkoituksenmukainen N-al-kynyylisubstituoitu maleaamihappo (3,3 mmol, 0,5 g), AC2O (3,75 ml) ja vedetön NaOAc (167 mg), sekoitettiin kiehuvassa vesihauteessa 1 tuntija sitten jäähdytettiin. Lisättiin jää-vettä (5 ml) ja seosta sekoitettiin 2 tuntia. Seos neutraloitiin kiinteällä K2C03:lla sekoittaen voimakkaasti ja sitten uutettiin kuudella 5 ml:n erällä Et20:ta. Uute kuivattiin (K2CO3), liuotin poistettiin ja jäännös puhdistettiin uudelleenkiteyttämällä (kaavio 5, vaihe 2).

BSA:n alkyynifunktionalisointi. Ilman rajoituksia valitaan BSA proteiiniksi, joka on monipuolinen biomolekyyleille. BSA (77,5 mg, 1,17 x 10'3 mmol, 1 ekv.) ja N-alkyynifunktio-nalisoitu maleimidi (10,0 mg, 75,0 x 10'3 mmol, 63 ekv., liuotettu 1 mkaan metanolia) sekoitettiin PBS:ssä (14 ml) huoneenlämpötilassa. 24 tunnin kuluttua seos sentrifugoitiin ylimääräisen N-alkyynifunktionalisoidun maleimidin poistamiseksi käyttämällä 50 ml:n membraaniputkeaMWCO:lla 30 000 g/mol. Tuote (BSA-alkyyni) erotettiin lyofilisoimalla (kaavio 5, vaihe 3).

Kaavio 5

Esimerkki 5 - Analyysi

Kvartsikidemikropunnitus dissipaatioseurannalla (QCM-D): CMC:n ja modifioidun CMC:n adsorptioita selluloosalla tutkittiin QCM-D E4 -laitteella Q-Senseltä (Västra Frölunda, Ruotsi). QCM-D-tekniikan perusperiaatteet ovat kuvanneet Rodahl et ai. (1995) ja Höök et ai. (1998). QCM-D-mittaukset suoritettiin 5 MHz:n perus-taajuudella ja sen ylätaajuuksilla 15, 25, 35, 45, 55 ja 75 MHz 25 °C:ssa vakiovirtausno-peudella 0,1 ml/min. Selluloosapintojen annettiin turvota yön yli tarkoituksenmukaisessa puskuriliuoksessa ennen QCM-D-mittauksia. Kaikki mittaukset toteutettiin ainakin kahtena rinnakkaiskokeena. Ainoastaan viidennen ylätaajuuden normalisoitujen taajuuksien ja dis-sipaatioiden muutokset on esitetty esimerkin yksinkertaistamiseksi.

Atsidimodifioidun CMC:n adsorptiota on havainnollistettu kaaviossa 6. Kuten kuviosta 3 voidaan nähdä, sekä alkyyni- että atsidimodifioidut CMC:t adsorboituvat selluloosamalli-pintaan. Itse asiassa adsorptio on samanlainen kuin modifioimattoman CMC:n adsorptio.

Kaavio 6

Kaaviossa 7 havainnollistetaan click-reaktiota atsidimodifioidun selluloosamallipinnan ja alkyynimodifioidun BSA:n välillä. Kuvion 4 QCM-tulokset valaisevat click-reaktiota (CMC-atsido/BSA-alkyyni/Cu(I)/askorbiinihappo). Voidaan havaita, että jopa perusteellisten pesujen jälkeen huomattava määrä BSA:ta on edelleen kiinnittyneenä selluloosamalli-pintaan, mikä viittaa BSA:n kovalenttiseen sitoutumiseen. Määrä, joka huuhtoutui pois, edustaa mitä todennäköisimmin BSA:n lisäkerroksia, jotka ovat adsorboituneet ainoastaan heikosti primaariseen kerrokseen. 2 vertailunäytteen (CMC-atsido/BSA-alkyyni ja CMC-atsido/Cu(I)/askorbiinihappo) QCM-tulokset eivät osoittaneet BSA:n sitoutumista selluloo-samallipintaan.

Kaavio 7

Atomivoimamikroskopia (AFM): CMC:n ja modifioitujen CMC:ien adsorptiot selluloosaan karakterisoitiin myös käyttämällä AFM-laitetta; Nanoscope Ilia Multimode -pyyhkäisyanturimikroskopia, Digital Instruments Incdtä, Santa Barbara, CA, USA. Kuvat skannattiin käyttämällä hipaisumoodia ilmassa piivarsilla. Kuvien skannauskoot olivat 5x5 pm ja lxl pm. Litistystä lukuun ottamatta mitään kuvankäsittelyä ei tehtyjä kullakin näytteellä mitattiin ainakin kolme eri aluetta.

AFM-kuva (kuvio 5a) osoittaa selvästi selluloosamallipinnan pintaan kiinnittyneen BSA:n kuviot. Sitä vastoin 2 vertailunäytteen AFM-kuvat paljastivat melko ehjät selluloosapinnat.

Kirjallisuusluettelo 1. Gallos, J. K.; Koumbis, A. E. Curr. Org. Chem. 2003, 7, 397 - 426.

2. Huisgen, R. Proc. Chem. Soc. 1960, 357 - 369.

3. Tornoe, C. W.; Christensen, C.; Meldal, M. J. Org. Chem. 2002, 67, 3 057 - 3 064.

4. Rostovtsev, V. V.; Green, L. G.; Fokin V. V.; Sharpless, K. B. Angew.Chem., Int. Ed. 2002, 41, 2 596-2 599.

5. Lewis, W. G.; Green, L. G.; Grynszpan, F.; Radie, Z.; Carrier, P. R.; Taylor, P.; Finn, M. G.; Sharpless, K. B. Angew. Chem. 2002, 114, 1 095 - 1 099.

6. Lewis, W. G.; Green, L. G.; Grynszpan, F.; Radie, Z.; Carrier, P. R.; Taylor, P.; Green, M. G.; Fokin, V. V.; Sharpless, K. B. Angew. Chem., Int. Ed. 2002, 41, 1 053 - 1 057.

7. Kolb, H. C.; Finn, M. G; Sharpless, K. B. Angew. Chem. 2001, 113, 2 056 - 2 075.

8. Iha, R. K.; Wooley, K. L.; Nyström, A. M.; Burke, D. J.; Kade, M. J.; Hawker, G. J. Chem. Rev. 2009, 109, 5 620 - 5 686.

9. Huisgen, R. Pure Appi. Chem. 1989, 61, 613 - 628.

10. Kolb, H. C.; Finn, M. G.; Sharpless, K. B. Angew. Chem., Int. Ed. 2001, 40, 2 004 -2 021.

11. Wu, P.; Feldman, A. K.; Nugent, A. K.; Hawker, C. F; Scheel, A.; Voit, B.; Pyun, F; Fréchet, J. M. F; Sharpless, K. B.; Fokin, V. V. Angew. Chem., Int. Ed. 2004, 43, 3 928 -3 932.

12. Gupta, N.; Vestberg, R.; Malkoch, M.; Hikita, S. T.; Thibault, R. F; Lingwood, M.; McCarney, E.; Hän, S.; Clegg, O. D.; Hawker, C. J. Polym. Prepr. 2006, 47, 25 - 26.

13. Laine, J; Lindström, T.; Nordmark, G. G.; Risinger, G., Studies on topochemical modification of cellulosic fibers. Part 1. Chemical conditions for the attachment of carboxymethyl cellulose onto fibers. Nordic Pulp & Paper Research Journal. 2000, 15, (5), 520.

14. Kontturi, E.; Thiine, P. C.; Niemantsverdriet, J. W., Cellulose Model Surfaces Simplified Preparation by Spin Coating and Characterization by X-ray Photoelectron Spectroscopy, Infrared Spectroscopy, and Atomic Force Microscopy. Langmuir 2003, 19, (14), 5 735.

15. Schaub, M.; Wenz, G.; Wegner, G.; Stein, A.; Klemm, D., Ultrathin films of cellulose on silicon wafers. Advanced Materials 1993, 5, (12), 919.

16. Rodahl, M.; Hook, F.; Krozer, A.; Brzezinski, P.; Kasemo, B., Quartz crystal microbalance setup for frequency and Q-factor measurements in gaseous and liquid environments. Section Title: Electric Phenomena 1995, 66, (7), 3 924.

17. Höök, F.; Rodahl, M.; Brzezinski, P.; Kasemo, B., Energy dissipation kinetics for protein and antibody-antigen adsorption under shear oscillation on a quartz crystal microbalance. Langmuir 1998, 14, (4), 729.

18. J. Justynska, Z. Hordyjewicz, H. Schlaad, Toward a toolbox of functional block copolymers via free-radical addition of mercaptans, Polymer, 2005, 46, 12 057 - 12 064.

19. Killops, K. L.; Campos, L.M.; Hawker, C. J., J. Am. Chem. Soc., 2008, 130, 62.

20. Rosen, B. R.; Lligadas, G.; Hahn, C.; Percec, V., J. Polym. Sci., Part A; Polym. Chem., 2009, 47, 3 931.

Claims (15)

1. Menetelmä selluloosamateriaalin pinnan modifioimiseksi, jossa modifiointiyhdiste kiinnitetään selluloosamateriaaliin linkkerin avulla, tunnettu siitä, että linkkeri on konju-gaatti, joka on valittu selluloosajohdannaisesta tai polymeeristä, joka on aktivoitu funktionalisoimalla ennen adsorptiota aktivoidun konjugaatin muodostamiseksi, ja että koko menetelmä toteutetaan vesipitoisessa väliaineessa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa aktivoitu konjugaatti adsorboidaan ensin selluloosamateriaaliin ja sen jälkeen kiinnitetään kovalenttisesti modifiointiyhdistee-seen.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa aktivoitu konjugaatti kiinnitetään ensin kovalenttisesti modifiointiyhdisteeseen ja sen jälkeen adsorboidaan selluloosamateriaaliin.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa selluloosamateriaali on valittu joukosta selluloosakuidut, nollakuitu, nano- tai mikroselluloosafibrillit, mikrokiteinen selluloosa, nanokiteinen selluloosa (nanowhisker) tai jokin muu selluloosapohjainen materiaali, johon sisältyy tekstiilimateriaalit sekä paperi- ja kartonkilaadut, kuten suodatinpaperit.

5. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, jossa selluloosa-johdannainen on karboksimetyyliselluloosa (CMC) ja polymeeri on valittu joukosta glu-komannaani, ksyloglukaani, kitosaani ja erilaiset kumit, jolloin konjugaatti on sopivimmin karboksimetyyliselluloosa (CMC).

6. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, jossa aktivoiva funktio-nalisointireaktio on valittu reaktioista, joilla aikaansaadaan konjugaatti, jossa on funktionaalisuus, joka on valittu joukosta atsidi, kolmoissidos, kaksoissidos, tioli ja halogeeni.

7. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, jossa modifiointiyhdiste on valittu bio molekyyleistä, kuten DNA:sta, RNA:sta, albumiinista, johon sisältyy naudan seerumialbumiini (BSA), biotiinista, hemoglobiinista, muista proteiineista, polymeereistä, oligomeereistä, väriaineista, joihin sisältyy luminesoivat väriaineet, radio leimoista ja nanopartikkeleista tai niiden seoksista tai komplekseista.

8. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, jossa modifiointiyhdiste funktionalisoidaan ennen adsorptiota käyttäen reaktiota, joka on valittu reaktioista, joilla aikaansaadaan yhdiste, jossa on funktionaalisuus, joka on valittu joukosta atsidi, kolmoissidos, kaksoissidos, tioli ja halogeeni.

9. Patenttivaatimuksen 6 tai 8 mukainen menetelmä, jossa konjugaatille ja modifiointiyh-disteelle suoritetaan erilaisia funktionalisointireaktioita, jolloin yhdelle näistä komponenteista aikaansaadaan on atsidi-, tioli- tai halogeenifunktionaalisuus ja toiselle komponentille kolmoissidos- tai kaksoissidosfunktionaalisuus.

10. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, jossa linkkerin adsorptio selluloosamateriaalin pintaan tapahtuu useiden vuorovaikutusten kautta, pääasiassa sekä linkkerin että selluloosamateriaalin pinnoilla läsnä olevien hydroksyyli-, karbonyyli-, amiini- tai sulfaattiryhmien kautta.

11. Välituote, joka soveltuu modifiointiyhdisteeseen adsorboimiseen, joka modifiointiyhdiste on valittu bio molekyyleistä, kuten albumiinista, johon sisältyy naudan seerumialbumiini (BSA), hemoglobiinista, polymeereistä, väriaineista, joihin sisältyy luminesoivat väriaineet, ja nanopartikkeleista tai näiden seoksista tai komplekseista, tunnettu siitä, että välituote käsittää funktionalisoidun konjugaattilinkkerin, joka on valittu selluloosajohdannaisesta tai polymeeristä, joka on adsorboitu selluloosamateriaaliin.

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen välituote, jolloin välituote koostuu funktionalisoidus-ta konjugaattilinkkeristä, joka on adsorboitu selluloosamateriaaliin.

13. Patenttivaatimuksen 11 tai 12 mukainen välituote, jossa selluloosamateriaali on valittu joukosta selluloosakuidut, nollakuitu, nano- tai mikroselluloosafibrillit, mikrokiteinen selluloosa, nanokiteinen selluloosa (nanowhisker) tai jokin muu selluloosapohjainen materiaali, johon sisältyy tekstiilimateriaalit sekä paperi- ja kartonkilaadut, kuten suodatinpaperit.

14. Jonkin patenttivaatimuksen 11-13 mukainen välituote, selluloosajohdannainen on karboksimctyylisclluloosa (CMC) ja polymeeri on valittu joukosta glukomannaani, ksyloglukaani, kitosaani ja erilaiset kumit, jolloin konjugaatti on sopivimmin kar-boksimetyyliselluloosa (CMC).

15. Jonkin patenttivaatimuksen 11-14 mukainen välituote, jossa funktionalisoitu konju-gaattilinkkeri sisältää atsidi-, tioli-, halogeeni-, kolmoissidos- tai kaksoissidosfunktionaa-lisuuden.