KR20170002622A

KR20170002622A - 화학적으로-로킹된 이중특이적 항체

Info

Publication number: KR20170002622A
Application number: KR1020167034621A
Authority: KR
Inventors: 옌원 푸; 군나르 에프. 카우프만; 브라이언 존스; 라헬레 터피리
Original assignee: 소렌토 쎄라퓨틱스, 인코포레이티드
Priority date: 2014-05-10
Filing date: 2015-05-10
Publication date: 2017-01-06
Also published as: JP6687247B2; CN106661602B; EP3143154A1; CA2948810A1; JP2017518975A; EP3143154A4; AU2015259533A1; CN106661602A; WO2015175357A9; KR102460736B1; WO2015175357A1; AU2015259533B2; AR100367A1; US10435479B2; EP3143154B1; US20170260291A1

Abstract

바람직하게는 IgG 부류의 화학적으로-로킹된 이중특이적 또는 이종이량체 항체를 높은 특이성 및 높은 균질성으로 형성하는 방법이 개시된다. 더 구체적으로는, 생물-직교 클릭 화학과 함께 연결된 연결 영역을 갖는 화학적으로-로킹된 이중특이적 IgG 부류 항체가 개시된다.

Description

화학적으로-로킹된 이중특이적 항체{CHEMICALLY-LOCKED BISPECIFIC ANTIBODIES}

본 발명은 바람직하게는 IgG 부류의 화학적으로-로킹된(chemically-locked) 이중특이적 또는 이종이량체 항체를 높은 특이성 및 높은 균질성으로 형성하는 방법을 제공한다. 더 구체적으로는, 본 발명은 생물-직교 클릭 화학(bio-orthogonal click chemistry)과 함께 연결된 연결 영역을 갖는 화학적으로-로킹된 이중특이적 IgG 부류 항체를 제공한다.

관련 출원에 대한 교차 참조

본 특허 출원은 2014년 5월 10일자로 출원된 미국 가특허 출원 61/991,508로부터의 우선권을 주장한다.

사람 면역글로불린 G 또는 IgG 항체는 각각 상이한 구조적 및 작용성 특성을 갖는 4개의 하위 부류로 존재한다. IgG는 힌지 영역(EU-인덱스 넘버링: 시스테인 잔기 226 및 229; 카밧 넘버링: 시스테인 잔기 239 및 242) 내 Cys 잔기를 직접 연결하는 중쇄간 디설파이드 결합을 통해 연결된 2개의 중쇄-경쇄 쌍(절반-항체(half-antibody))으로 구성된다. 사람 IgG4 분자는 중쇄간 디설파이드 결합의 부재 또는 존재가 상이한 다양한 분자 형태로 존재한다.

IgG 항체 포맷 및 단일쇄 도메인의 융합에 의한 4가 이중특이적 항체와 같은, 다양한 재조합 항체 포맷이 개발되었다(Coloman et al., Nature Biotech 15 (1997) 159-163; WO 2001/077342; and Morrison, Nature Biotech 25 (2007) 1233-1234). 또 다른 포맷, 예를 들면, 디아바디, 트리아바디 또는 테트라바디, 미니바디, 수 개의 단일쇄 포맷(scFv, Bis-scFv)은 항체 코어 구조(IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM)가 더 이상 보유되지 않는다. 그러나 이러한 포맷은 2개 이상의 항원에 결합할 수 있다(Holliger et al., Nature Biotech 23 (2005) 1126-1136; Fischer and Leger, Pathobiology 74 (2007) 3-14; Shen et al., J. Immunological Methods 318 (2007) 65-74; and Wu et al., Nature Biotech. 25 (2007) 1290-1297).

2가지 유형의 폴리펩타이드 이량체를 포함하는 혼합물로부터 적어도 하나의 쇄간 디설파이드 연결을 통해 연결되지 않은 이량체로부터의 적어도 하나의 쇄간 디설파이드 연결을 통해 연결된 이량체를 분리하거나 우선적으로 합성하는 방법은 US 2005/0163782에 보고된다.

이중특이적 항체는 전통적인 하이브리드 하이브리도마 및 화학적 접합 방법을 사용하여 충분한 양 및 품질로 물질을 생산하는 것이 어렵다. 더욱이, WO2005/062916 및 미국 특허 출원 2010/0105874는, 항체 "AA" 및 항체 "BB"를 환원시켜 디설파이드 결합을 단일 결합 영역을 갖는 단일 중쇄-경쇄 단위(A 또는 B)(여기서, A 및 B 모두는 상이한 표적에 결합한다)로 분리함으로써 이중특이적 항체를 형성하는 방법을 기재한다. 이후, 항체 내 디설파이드 결합은 이성질화를 겪게 되어 항체 AB, BA, AA 및 BB가 각각 약 25%의 확률로 재편될 수 있게 한다. 그러나, AB 및 BA 둘 모두는 동일한 이중특이적 항체이며, 따라서, 기껏해야, 약 50%의 수율을 나타낸다. 따라서, 이는 원래의 재조합된 항체로부터 형성된 목적하는 이중특이적 항체를 분리하기 위한 추가의 단계를 필요로 한다. 그러나, 미국 특허 출원 2010/0105874에서는, CPSC의 서열을 갖는 IgG4 내의 힌지 영역을 가리키며 다음과 같이 명시한다: "CPSC 서열은 더 가요성 코어 힌지를 초래하고 쇄내 디설파이드 결합을 형성할 가능성을 야기한다.... 이는 IgG4-유사 코어 힌지 서열을 갖는 항체가, 본 발명의 방법에 사용된 조건에 의해 시뮬레이션되는, 디설파이드 결합의 재배열을 위한 내인성 활성을 가질 수 있는 것으로 여겨진다."(단락 0013). 또한, 다른 형태의 이중특이적 항체는 항체 A 및 B의 중쇄의 서열을 변경하여 제조된 "놉 앤드 홀(knob and hole)" 구조로 제조되었다.

따라서, 본 발명은 고정된 항체 영역에서 아미노산 서열을 변경하는 놉 앤드 홀 방법보다 더 우수한 안정성으로 훨씬 더 높은 이중특이적 항체 수율을 위한 당해 분야에서의 요구를 다루는 화학적으로-로킹된 이중특이적 IgG 항체를 생성하는 방법을 제공한다.

본 발명은 IgG 1, IgG2 또는 IgG4 부류 항체 또는 이의 Fab2 단편 "A" 및 IgG1, IgG2 또는 IgG4 부류 항체 또는 이의 Fab2 단편 "B"로부터의 화학적으로-로킹된 이중특이적 항체 "AB" 또는 "BA"의 생성 방법을 제공한다. 상기 방법은

(a) 제1 항체 "A"를, 힌지 영역 내 중쇄 사이의 실질적으로 모든 디설파이드 결합을 절단하기에 충분한 조건 하에 환원제와 접촉시켜 각각 단일 중쇄에 부착된 단일 경쇄를 포함하는 한 쌍의 제1 항체 단편 A'를 수득하는 단계로서, 상기 중쇄는 상기 디설파이드 결합의 환원으로부터 형성된 하나 이상의 반응성 티올 그룹을 갖는, 상기 한 쌍의 제1 항체 단편 A'를 수득하는 단계;

(b) 제1 헤테로-이작용성(hetero-bi-functional) 링커를 상기 제1 항체 단편 A'에 부착하여 아지드-작용화된 제1 항체 단편을 형성하는 단계로서, 상기 제1 헤테로-이작용성 링커는 (i) 상기 제1 항체 단편 A'의 중쇄의 반응성 티올 그룹에 공유 부착하기 위한 제1 티올-반응성 관능 그룹, 및 (ii) 아지드를 포함하는, 상기 제1 항체 단편을 형성하는 단계;

(c) 상기 제2 항체 "B"를, 힌지 영역 내 중쇄 사이의 실질적으로 모든 디설파이드 결합을 절단하기에 충분한 조건 하에 환원제와 접촉시켜 각각 단일 중쇄에 부착된 단일 경쇄를 포함하는 한 쌍의 제2 항체 단편 B'를 수득하는 단계로서, 상기 중쇄는 상기 디설파이드 결합의 환원으로부터 형성된 하나 이상의 반응성 티올 그룹을 갖는, 상기 한 쌍의 제2 항체 단편 B'를 수득하는 단계;

(d) 제2 헤테로-이작용성 링커를 상기 제2 항체 단편 B'에 부착하여 알킨 작용화된 제2 항체 단편을 형성하는 단계로서, 상기 제2 헤테로-이작용성 링커는 (i) 상기 제2 항체 단편의 상기 중쇄의 반응성 티올 그룹에 공유 부착하기 위한 제2 티올-반응성 관능 그룹, 및 (ii) 알킨을 포함하는, 상기 제2 항체 단편을 형성하는 단계; 및

(e) 상기 아지드 작용화된 제1 항체 단편을 상기 알킨 작용화된 제2 항체 단편과 반응시켜 상기 제1 항체 단편을 상기 제2 항체 단편에, 상기 알킨에 대한 상기 아지드의 1,3-쌍극자 사이클로첨가(cycloaddition)를 통해 공유 부착하여 화학적으로-로킹된 이중-특이적 항체(bi-specific antibody) "AB" 또는 "BA"를 형성하는 단계를 포함한다.

힌지 영역 내 디설파이드 결합을 환원시키는 단계는 바람직하게는 중쇄 및 경쇄 사이의 디설파이드 결합을 실질적으로 환원시키지 않으면서 수행되며, 이는, 일부 양태에서, 중쇄 및 경쇄 사이의 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99%의 이러한 디설파이드 결합이 힌지 영역 내 디설파이드 결합의 절단 후 온전한 상태로 남아있다는 것을 의미한다.

바람직하게는, 제1 헤테로-이작용성 링커는 형태 Q-L-N₃을 가지며, 여기서 Q는 티올-반응성 관능 그룹이고, L은 탄화수소 링커이고, N₃은 아지드이다. 바람직하게는, 티올-반응성 관능 그룹 Q는 알킬 할라이드(예를 들면, 알킬 클로라이드, 브로마이드, 또는 요오다이드), 벤질 할라이드, 말레이미드, 할로-말레아미드(브로모말레이미드), 또는 디할로-말레이미드(디브로모말레이미드)이다. 바람직하게는, L은 Q 및 N₃ 사이에 직접적인 쇄에서 3 내지 60개의 원자(예를 들면, 더 통상적으로 6 내지 50개의 원자)를 갖는 탄화수소 링커이다. 더 바람직하게는, L은 폴리알킬렌 옥사이드(PEF) 그룹이거나 또는 L은 중합체이고, 여기서 각각의 폴리머 단위는 -(CH₂CH₂-O)_n- 또는 -(O-CH₂CH₂)_n-이다(여기서, "n"은 독립적으로 1 내지 20의 정수, 더 통상적으로는 1 내지 8의 정수이다).

바람직하게는, 제1 헤테로-이작용성 링커(제1 항체 단편에 부착됨)는

이며,

여기서, Q는 항체 단편 위로 링커를 결찰(ligating)시키는데 적합한 임의의 그룹일 수 있지만, 바람직하게는 중쇄의 힌지 영역 내 시스테인 잔기로부터의 티올과 공유 결합할 수 있다. 예시적인 그룹 Q는

이며,

여기서, Z는 H, Br, I 및 SPh로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된다. 바람직하게는, Z의 적어도 하나는 H가 아니지만, 말레이미드의 경우에 Z는 각각 수소일 수 있다. M은 독립적으로 CR^* 또는 N이다.

X₁, X₂, X₃, X₂, X₄ 및 X₅는 결합(즉, 이는 부재하다), -O-, -NR^N-, -N=C-, -C=N-, -N=N-, -CR^*=CR^*-(시스 또는 트랜스), -C≡C-, -(C=O)-, -(C=O)-O-, -(C=O)-NR^N-, -(C=O)-(CH₂)_n-, -(C=O)-O-(CH₂)_n-, -(C=O)-NR^N-(CH₂)_n- 및 -(C=O)-NR^N-(CH₂CH₂-O)_n-으로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고, 여기서, "n"은 0 또는 1 내지 10의 정수이고;

R^a, R^b, R^c 및 R^d는 -O-, -NR^N-, -CH₂-, -(CH₂) _n -, -(CR^* ₂)_n-, -(CH₂CH₂-O)_n-, -(CR^* ₂CR^* ₂-O)_n-, -(O-CH₂CH₂)_n-, -(O-CR^* ₂CR^* ₂)_n-, -CR^*=CR^*-(시스 또는 트랜스), -N=C-, -C=N-, -N=N-, -C≡C-, -(C=O)-, -(CH₂)_n-(C=O)-, -(C=O)-(CH₂)_n-, -(CH₂)_n-(C=O)-(CH₂) _n -, -O-(C=O)-, -(C=O)-O-, -O-(C=O)-O-, -(CH₂) _n -(C=O)-O-, -O-(C=O)-(CH₂) _n , -(C=O)-O-(CH₂) _n -, -(CH₂)_n-O-(C=O)-, -(CH₂)_n-(C=O)-O-(CH₂)_n-, -(CH₂)_n-O-(C=O)-(CH₂)_n-, -NR^N-(C=O)-, -(C=O)-NR^N-, -NR^N-(C=O)-O-, -O-(C=O)-NR^N-, -NR^N-(C=O)-NR^N-, -(CH₂)_n-(C=O)-NR^N-, -NR^N-(C=O)-(CH₂)_n, -(C=O)-NR^N-(CH₂)_n-, -(CH₂)_n-NR^N-(C=O)-, -(CH₂)_n-(C=O)-NR^N-(CH₂)_n-, -(CH₂)_n-NR^N-(C=O)-(CH₂)_n-, -(C=O)-NR^N-(CH₂CH₂-O)_n-, -(CH₂CH₂-O)_n-(C=O)-NR^N-, -(CH₂)_n-(C=O)-NR^N-(CH₂CH₂-O)_n-, -(CH₂CH₂-O)_n-(C=O)-NR^N-(CH₂)_n-, 및 2 내지 8원 사이클릭 탄화수소, 헤테로사이클, 아릴, 또는 헤테로아릴 환으로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고; 여기서, "n"은 독립적으로 0 또는 1 내지 10의 정수이고;

"l", "p", "q" 및 "r"은 독립적으로 0 또는 1 내지 10의 정수이고;

Ω는 결합(즉, 이는 부재하다)이거나 또는 임의로 4개 이하의 융합된 환을 포함하는 C₃ _-26 탄화수소 환 또는 융합된 환 시스템이며, 각각의 환은 3 내지 8개의 구성원을 갖고, 임의로 각각의 환 내에 O, S 및 N으로부터 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자를 포함하며, 바람직하게는, Ω는 사이클로옥탄 환에 융합되거나 또는 8원 헤테로사이클릭 환 또는 환 시스템에 융합된 1,2,3-트리아졸 환이고;

R^* 및 R^N은, 각각 독립적으로, H, 또는 할로겐, O, S 및 N으로부터 선택된 1 내지 6개의 헤테로원자로 임의로 치환된 C₁ _-12 탄화수소이고; 임의의 2개의 그룹 R^* 및/또는 R^N은 함께 3 내지 8원 환을 형성할 수 있다.

제2 헤테로-이작용성 링커는 형태 Q-L-G를 가지며, 여기서 Q는 티올-반응성 관능 그룹이고, L은 탄화수소 링커이고, G는 알킨-함유 그룹이다. 티올-반응성 관능 그룹 Q는 알킬 할라이드(예를 들면, 알킬 클로라이드, 브로마이드 또는 요오다이드), 벤질 할라이드, 말레이미드, 할로-말레아미드(예를 들면, 브로모말레이미드), 및 디할로-말레이미드(예를 들면, 디브로모말레이미드)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. L은 Q 및 G 사이에 직접적인 쇄에서 3 내지 60개의 원자(예를 들면, 바람직하게는 6 내지 50개의 원자)를 갖는 탄화수소 링커이다. 바람직하게는, L은 폴리알킬렌 옥사이드 그룹(PEG)이며, 바람직하게는, L은 단위 -(CH₂CH₂-O)_n- 또는 -(O-CH₂CH₂)_n-의 중합체이다(여기서, "n"은 독립적으로 1 내지 20의 정수, 더 통상적으로는 1 내지 8의 정수이다).

G는 아지드와 함께 사이클로첨가 반응을 진행할 수 있는 임의의 알킨 함유 그룹이다. 일부 양태에서, G는 말단 알킨, 예를 들면, -C≡CH를 포함한다. 다른 양태에서, G는 환 내에 -C≡C- 결합을 갖는 환 또는 환 시스템을 포함한다. 한 양태에서, G는 -C≡C- 결합을 갖는 C8 환을 포함한다. 한 양태에서, -C≡C- 함유 환은 변형된다.

제2 헤테로-이작용성 링커는 하기 형태를 갖는다.

Q는 제1 헤테로-이관능성 링커에서 동일하거나 상이하다. Q는 통상적으로 하기 형태의 티올-반응성 그룹이며:

여기서, Z는 각각 H, Br, I 및 SPh로부터 독립적으로 선택된다. 일부 양태에서, Z의 적어도 하나는 H가 아니지만, 말레이미드의 경우에, Z는 각각 수소일 수 있다. M은 각각 독립적으로 CR^* 또는 N이다.

G는 통상적으로 아지드와 함께 1,3 쌍극자 사이클로첨가 반응을 진행할 수 있는 -C≡C- 결합을 포함하는 C₈ _-20 탄화수소 그룹이다. 일부 양태에서, G는 형태 -C≡C-H를 갖는다. 다른 양태에서, G는 -C≡C- 결합을 갖는 환을 포함한다. 특히, G는 3중 결합을 갖는 8원 환(예를 들면, 사이클로옥틴)을 포함할 수 있다. 상기 환은 임의로, 통상적으로 아릴, 헤테로아릴 및 헤테로사이클을 포함하는 C₃ _-6-사이클릭 탄화수소 환일 수 있는, 1개, 2개 이상의 추가의 환에 융합될 수 있다. 3중 결합을 함유하는 8원 환은 환 내에 질소 및 산소와 같은 하나 이상의(예를 들면, 1 내지 4개) 헤테로원자를 포함할 수 있다. 한 양태에서, 8원 환은 하기 보여주는 예시적인 구조에서와 같이 L에 대한 부착점을 제공하는, 환 내에 질소 원자를 함유한다.

바람직하게는, G는 하기 형태를 갖고:

X₁, X₂, X₃, X₂, X₄ 및 X₅는, 각각, 결합(즉, 이는 부재하다), -O-, -NR^N-, -N=C-, -C=N-, -N=N-, -CR^*=CR^*-(시스 또는 트랜스), -C≡C-, -(C=O)-, -(C=O)-O-, -(C=O)-NR^N-, -NR^N-(C=O)-, -NR^N-(C=O)-O-, -(C=O)-(CH₂)_n-, -(C=O)-O-(CH₂)_n-, -(C=O)-NR^N-(CH₂)_n- 및 -(C=O)-NR^N-(CH₂CH₂-O)_n-으로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되며, 여기서, "n"은 0 또는 1 내지 10의 정수이고;

R^a, R^b, R^c 및 R^d는, 각각, -O-, -NR^N-, -CH₂-, -(CH₂)_n-, -(CR*₂)_n-, -(CH₂CH₂-O)_n-, -(CR^* ₂CR^* ₂-O)_n-, -(O-CH₂CH₂)_n-, -(O-CR^* ₂CR^* ₂)_n-, -CR^*=CR^*-(시스 또는 트랜스), -N=C-, -C=N-, -N=N-, -C≡C-, -(C=O)-, -(CH₂)_n-(C=O)-, -(C=O)-(CH₂)_n-, -(CH₂)_n-(C=O)-(CH₂)_n-, -O-(C=O)-, -(C=O)-O-, -O-(C=O)-O-, -(CH₂)_n-(C=O)-O-, -O-(C=O)-(CH₂)_n, -(C=O)-O-(CH₂)_n-, -(CH₂)_n-O-(C=O)-, -(CH₂)_n-(C=O)-O-(CH₂)_n-, -(CH₂)_n-O-(C=O)-(CH₂)_n-, -NR^N-(C=O)-, -(C=O)-NR^N-, -NR^N-(C=O)-O-, -O-(C=O)-NR^N-, -NR^N-(C=O)-NR^N-, -(CH₂)_n-(C=O)-NR^N-, -NR^N-(C=O)-(CH₂)_n, -(C=O)-NR^N-(CH₂)_n-, -(CH₂)_n-NR^N-(C=O)-, -(CH₂)_n-(C=O)-NR^N-(CH₂)_n-, -(CH₂)_n-NR^N-(C=O)-(CH₂)_n-, -(C=O)-NR^N-(CH₂CH₂-O)_n-, -(CH₂CH₂-O)_n-(C=O)-NR^N-, -(CH₂)_n-(C=O)-NR^N-(CH₂CH₂-O)_n-, -(CH₂CH₂-O)_n-(C=O)-NR^N-(CH₂)_n-, 또는 2 내지 8원 사이클릭 탄화수소, 헤테로사이클, 아릴 또는 헤테로아릴 환으로부터 독립적으로 선택되고; 여기서, "n"은, 각각 독립적으로, 0 또는 1 내지 10의 정수이고;

"l", "p", "q" 및 "r"은, 독립적으로, 0 또는 1 내지 10의 정수이고;

Ω는 결합(즉, 이는 부재하다)이거나 또는 임의로 4개 이하의 융합된 환을 포함하는 C₃ _-26 탄화수소 환 또는 융합된 환 시스템이며, 각각의 환은 3 내지 8개의 구성원을 갖고, 임의로 각각의 환 내에 O, S 및 N으로부터 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자를 포함한다. 한 양태에서, Ω는 사이클로옥탄 환에 융합되거나 8원 헤테로사이클릭 환 또는 환 시스템에 융합된 1,2,3-트리아졸 환을 포함할 것이다.

R^* 및 R^N은, 각각 독립적으로, H, 또는 할로겐, O, S 및 N으로부터 선택된 1 내지 6개의 헤테로원자로 임의로 치환된 C₁ _-12 탄화수소이고; 여기서 2개의 그룹 R^* 및/또는 R^N은 함께 3 내지 8원 환을 형성할 수 있다.

아지드 및 알킨 사이의 사이클로첨가 반응은 1,3 쌍극자 사이클로첨가 반응을 통해 진행될 수 있다. 상기 반응은 구리 이온에 의해 촉매될 수 있다. 일부 양태에서, 사이클로첨가 반응은 중성 또는 생리적 pH에서 발생한다.

본 발명은 추가로 힌지 잔기 서열(EU-인덱스 넘버링: 잔기 226-229; 카밧 넘버링: 잔기 239-242) CPPC 또는 CPSC 또는 SPPC 또는 SPSC를 갖는 항체 "A"를 환원시키고, 힌지 잔기 서열(잔기 226-229) CPPC 또는 CPSC 또는 SPPC 또는 SPSC를 갖는 제2 항체 "B"를 환원시켜 절반-항체 A 및 절반-항체-B를 형성하는 방법을 제공하며,

(a) 힌지 잔기 서열(EU-인덱스 넘버링: 잔기 226-229; 카밧 넘버링: 잔기 239-242) CPPC 또는 CPSC 또는 SPPC 또는 SPSC를 갖는 각각의 항체 A 및 항체 B를, 각각의 항체의 힌지 영역 내 임의의 쇄간 또는 쇄내 디설파이드 결합을 파괴시키는 환원 조건 하에 환원시키는 단계;

(b) 절반-항체 A의 힌지 코어 서열의 Cys 잔기(EU-인덱스 넘버링: 잔기 226 및 229; 카밧 넘버링: 잔기 239 및 242) 중 하나 또는 둘 모두에 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 화합물:

(여기서, N₃은 -N=N=N이다)

을 연결하여 연결된 절반-항체 A를 형성하는 단계;

(c) 항체 B 힌지 코어 서열의 Cys 잔기 226 및 229(EU-인덱스 넘버링: 잔기 226 및 229; 카밧 넘버링: 잔기 239 및 242) 중 하나 또는 둘 모두에 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 화합물:

을 연결하여 연결된 항체 B를 형성하는 단계; 및

(d) 대략 동등한 몰량의 연결된 항체 A를 연결된 항체 B와 중성 조건 하에 항온배양하여 연결된 이중특이적 항체 AB를 형성하는 단계를 포함한다.

바람직하게는, 절반-항체 A를 형성하기 위한 항체 A, 및 절반-항체 B를 형성하기 위한 항체 B의 환원은 환원제에서 수행되며, 여기서 환원제는 L-시스테인, 디티오트레이톨, 베타-머캅토 에탄올, 시스테아민, TCEP(트리스(2-카복시에틸)포스핀), 2-MEA(2-머캅토에틸아민) 및 이들의 배합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 바람직하게는 1개 또는 2개의 Cys 잔기를 갖는, 항체 A의 힌지 영역은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 구조를 갖는 모이어티 A와 연결된다.

(여기서, N₃은 -N=N=N이다). 바람직하게는 1개 또는 2개의 Cys 잔기를 갖는, 항체 B의 힌지 영역은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 구조를 갖는 모이어티 B와 연결되어 연결된 절반-항체 B를 형성한다.

본 발명은 추가로 화학적으로-로킹된 이중특이적 항체 AB를 제공하며, 여기서, 연결된 절반-항체 A:

(여기서, N₃은 -N=N=N이다)

를 연결된 항체 B:

와 연결하여 도 10에 도시된 구조를 갖는 이중특이적 항체 AB를 형성한다.

본 발명은, 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 구조를 갖는 절반-항체 A:

(여기서, N₃은 -N=N=N이고, Z는 이탈 그룹이다); 및

하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 구조를 갖는 절반-항체 B:

를 포함하는, IgG 부류 항체 "A" 또는 이의 단편 및 IgG 부류 항체 "B"로부터 화학적으로-로킹된 이중특이적 항체 "AB" 또는 "BA"를 제공한다.

본 발명은 추가로

(a) 항체 A로부터의 단일 중쇄 및 경쇄를 포함하는 제1 항체 단편 A'로서, 상기 중쇄는 하나 이상의 반응성 티올 그룹을 갖는, 제1 항체 단편 A';

(b) 단일 중쇄 및 경쇄를 포함하는 제2 항체 단편 B'로서, 상기 중쇄는 하나 이상의 반응성 티올 그룹을 갖는, 제2 항체 단편 B'

를 포함하는 이중특이적 항체를 제공하며;

여기서, 상기 제1 및 제2 항체 단편은 상기 제1 항체 단편 상의 반응성 티올에 대해 링커를 통해 부착된 아지드, 및 상기 제2 항체 단편 상의 반응성 티올에 대해 링커를 통해 부착된 알킨의 사이클로첨가 반응에 의해 형성된 1,2,3-트리아졸을 통해 공유 결합된다. 링커는 상기 기재된다. 항체 단편 A' 및 B'는 IgG1, IgG2 또는 IgG4 면역글로불린의 이의 Fab2 단편으로부터 유도된다.

본 발명은 추가로 링커에 공유 결합된 항체 단편을 제공하며, 여기서 상기 링커는 아지드와 사이클로첨가 반응을 진행할 수 있는 -C≡C- 결합을 갖는 C₈ 환을 포함한다. 본 발명은 추가로 링커에 공유 결합된 항체 단편을 제공하며, 여기서 상기 링커는 -C≡C- 결합과 사이클로첨가 반응을 진행할 수 있는 아지드를 포함한다.

바람직하게는, 절반-항체 A를 형성하기 위한 항체 A, 및 절반-항체 B를 형성하기 위한 항체 B의 환원은 환원제에서 수행되며, 여기서 환원제는 L-시스테인, 디티오트레이톨, 베타-머캅토 에탄올, 시스테아민, TCEP(트리스(2-카복시에틸)포스핀), 2-MEA(2-머캅토에틸아민), 및 이들의 배합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 바람직하게는 1개 또는 2개의 Cys 잔기를 갖는, 항체 A의 힌지 영역은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 구조를 갖는 모이어티 A:

(여기서, N₃은 -N=N=N이다)

와 함께 절반-항체 A의 힌지 코어 서열의 Cys 잔기(EU-인덱스 넘버링: 잔기 226 및 229; 카밧 넘버링: 잔기 239 및 242) 중 하나 또는 둘 모두에 연결되어 연결된 절반-항체 A를 형성하고;

을 연결하여 연결된 항체 B를 형성하고;

(d) 중성 조건 하에 대략 동등한 몰량의 연결된 항체 A를 연결된 항체 B와 항온배양하여 연결된 이중특이적 항체 AB를 형성한다.

바람직하게는, 절반-항체 A를 형성하기 위한 항체 A, 및 절반-항체 B를 형성하기 위한 항체 B의 환원은 환원제에서 수행되며, 여기서 환원제는 L-시스테인, 디티오트레이톨, 베타-머캅토 에탄올, 시스테아민, TCEP(트리스(2-카복시에틸)포스핀), 2-MEA(2-머캅토에틸아민), 및 이들의 배합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 바람직하게는 1개 또는 2개의 Cys 잔기를 갖는, 항체 A의 힌지 영역은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 구조를 갖는 모이어티 A와 연결된다.

(여기서, N₃은 -N=N=N이다)

를 연결된 항체 B:

(여기서, N₃은 -N=N=N이고, Z는 이에 결합하는 이탈 그룹이다); 및

를 포함하는 IgG 부류 항체 "A" 및 IgG 부류 항체 "B"로부터 화학적으로-로킹된 이중특이적 항체 "AB" 또는 "BA"를 제공한다.

도 1은 IgG 부류 항체의 힌지 영역 내 단일 Cys 잔기에 대한 화학적 접합을 통해 이중특이적 mAb의 생성을 야기하는 도식적 실례를 보여준다.
도 2는 본원의 개시에 따라서 IgG 부류 항체의 힌지 영역 내 단일 Cys 잔기에 대해 화학적 접합을 통한 쇄간 교차-결합의 도식적 묘사를 보여준다.
도 3은 IgG 부류 항체의 힌지 영역 내의 2개의 Cys 잔기에 대한 쇄내 교차 결합의 도식적 묘사를 보여준다.
도 4는 IgG 부류 항체의 힌지 영역 내의 2개의 Cys 잔기에 대한 쇄간 교차 결합을 통한 이중특이적 mAb의 생성을 위한 도식적 묘사를 보여준다(상단 및 하단).
도 5는 화학적으로 로킹된 절반-mAb 단편의 SDS PAGE 분석을 보여준다.
도 6은 네이키드(naked) mAb(상단), 아지드-접합된 mAb 단편(중간) 및 알킨-접합된 mAb 단편(하단)로부터의 HC Fab의 MS 분석을 도시한다.
도 7은 아지드-부착된 절반 mAb 및 알킨-부착된 절반 mAb 단편으로부터의 교차-결합 생성물의 SDS PAGE를 보여준다.
도 8은 개시 mAb로부터의 (Fab)₂(상단) 및 교차-결합 생성물(하단)의 MS 분석을 도시한다.
도 9는 본원의 실시예 4에서 생성된 화학적으로 변형된 절반 항체 단편(레인 2 및 3)의 비-환원 SDS PAGE를 도시한다.
도 10은 2개의 절반-항체 단편 사이에 클릭 접합(Click conjugation)을 통한 이중특이적 항체의 생성을 보여준다.
도 11은 절반-항체 단편(a) 및 클릭 생성물(b)의 비-환원 SDS PAGE를 보여준다. 절반-항체-아지드는 겔(a)에서 레인 2이고, 절반-항체-DBCO는 겔(a)에서 레인 3이다. 클릭 생성물은 겔(b)에서 레인 2에 있다.
도 12는 이중특이적 항체 CBA-0710의 질량을 보여주는 IdeS 소화된 클릭 생성물의 질량 스펙트럼을 도시한다.
도 13은 이중특이적 항체 CBA-0710의 SEC 크기-배제 크로마토그래피를 도시한다.
도 14는 비아코어(BIAcore) 상에서 이중특이적 항체 CBA-0710의 결합을 보여준다. 더 구체적으로는, 도 14는 BIAcore 상에서 2개의 항원에 대한 이중특이적 항체 CBA-0710의 동시 결합을 보여준다.
도 15는 삼중 음성 유방암 세포 MDA-MB-231에 대한 이중특이적 항체 CBA-0710 결합을 보여준다. 상기 세포는 항원-1 및 항원-2 둘 모두를 발현시킨다. STI-A0607은 항-항원-1 모노클로날 항체이고, STI-A1010은 항-항원-2 모노클로날 항체이다.
도 16은 삼중 음성 유방암 세포에서 이중특이적 항체 CBA-0710의 길항 활성을 보여준다. STI-A0607은 항-항원-1 모노클로날 항체이고, STI-A1010은 항-항원 2 모노클로날 항체이다. HGF는 항원-1의 천연 리간드이다.
도 17은 이중특이적 항체 CBA-0710에 반응하여 증가된 IFN-γ 방출을 보여준다. STI-A1010은 항-항원-2(면역 체크포인트) 모노클로날 항체이다. 경쟁자(competitor) mAb는 사람화된 항-항원-2(면역 체크포인트) 모노클로날 항체이다.
도 18은 이중특이적 항체 CBA-0710에 반응하여 증가된 IL-2 방출을 보여준다. STI-A1010은 항-항원-2(면역 체크포인트) 모노클로날 항체이다. 경쟁자 mAb는 사람화된 항-항원-2(면역 체크포인트) 모노클로날 항체이다.
도 19는 표준적인 항-c-Met IgG1 및 항-PD-L1 IgG1 항체와 비교하여 A 항-c-Met 항체 및 B 항-PD-L1 항체로 구성된 화학적으로 로킹된 이중특이적 항체에 대해 개선된 효능을 보여준다.
도 20은 화학적 접합을 통한 이중특이적 F(ab)'₂의 생성의 도식적 실례를 보여준다.
도 21은 F(ab)'2 및 F(ab)'의 SDS_PAGE 겔 분석을 보여준다. 컬럼 1은 IdeS로 소화된 항체 A이다. 컬럼 2는 IdeS로 소화된 항체 B이다. 컬럼 3은 소화되고 FC 제거된 항체 A이다. 컬럼 4는 소화되고 FC 제거된 항체 B이다. 컬럼 5는 소화되고 FC 제거되고 2MEA 및 TCEP로 환원되고 DBCO(디벤조사이클로옥틸)-말레이미드와 접합된 항체 A이다. 컬럼 6은 소화되고 FC 제거되고 2MEA 및 TCEP로 환원되고 아지드-말레이미드와 접합된 항체 B이다.
도 22는 2개의 F(ab)' 단편 사이의 클릭 접합을 통한 F(ab)'₂ 화학적으로 로킹된 이중특이적 항체를 생성하는 도식을 보여준다.
도 23은 본원의 실시예 7로부터의 클릭 F(ab)'2의 SEC를 도시한다.
도 24는 클릭 이중특이적 F(ab)'₂ 단편 분석 SDS PAGE를 보여준다. 컬럼 1은 소화되고 FC 제거되고 2MEA 및 TCEP로 환원되고 DBCO(디벤조사이클로옥틸)-말레이미드와 접합된 항체 A이다. 컬럼 2는 소화되고 FC 제거되고 2MEA 및 TCEP로 환원되고 아지드-말레이미드와 접합된 항체 B이다. 컬럼 3은 클릭_이중특이적 F(ab)'₂이다.
도 25는 이중특이적 F(ab)'₂의 질량을 보여주는 클릭 생성물의 질량 스펙트럼을 도시한다.
도 26은 클릭 F(ab)'2의 SEC를 도시한다.
도 27은 옥텟 레드(Octet Red) 상에서 2개의 항원에 대한 이중특이적 F(ab)'₂의 동시 결합을 보여준다.
도 28은 화학적 접합을 통한 이중특이적 IgG2의 생성의 도식적 실례를 보여준다.
도 29는 IgG2 단편 분석 SDS PAGE를 보여준다. 컬럼 1은 항체 A이다. 컬럼 2는 TCEP로 환원되고 아지드-말레이미드와 접합된 항체 A이다. 컬럼 3은 항체 B이다. 컬럼 4는 TCEP로 환원되고 아지드-말레이미드와 접합된 항체 B이다.
도 30a 내지 30c는 (도 30a) 링커와 접합된 IgG2_A, (도 30b) 링커와 접합된 IgG2_B, 및 (도 30c) IgG2_A 및 B 사이에 형성된 이중특이적-IgG2의 질량을 보여주는 질량 스펙트럼을 도시한다.
도 31은 IgG2_A, IgG2_B 및 클릭 생성물의 SEC를 도시한다.

이중특이적 항체(BsAb)는 힌지 영역에서 화학적으로 연결된 2개의 절반-항체 단편로 구성된다(도 1). 개시 항체는 IgG1 또는 IgG4 이소형(isotype)이다. 개시 항체는 변형된 힌지 영역을 함유할 수 있으며, 여기서, Cys 잔기는 우선 Ser에 대해 돌연변이되어 힌지에서 오직 하나의 디설파이드만을 남겨둔다. 이중특이적 항체의 생성은 3개의 주요 단계를 수반한다. 제1 단계는 절반 항체 단편을 형성하기 위해 항체 A 및 B 둘 모두를 선택적으로 환원시키는 것이다. 제2 단계는 작용성 모이어티, X 또는 Y를 시스테인-기반 접합을 통해 각각의 항체 절반 단편의 힌지 영역에 도입하여 각각 화학적으로 변형된 항체 단편 절반, A' 및 B'를 야기하는 것이다. 마지막 단계에서, 2개의 항체 단편 절반은 X 및 Y 모이어티 사이의 화학적 결찰을 통해 함께 연결되어 이중특이적 항체를 형성한다.

본 발명은 IgG 부류 항체 "A" 및 IgG 부류 항체 "B"로부터 화학적으로-로킹된 이중특이적 항체 "AB" 또는 "BA"의 생성 방법을 제공하며,

(a) 힌지 잔기 서열(EU-인덱스 넘버링: 잔기 226-229; 카밧 넘버링: 잔기 239-242) CPPC 또는 CPSC 또는 SPPC 또는 SPSC를 갖는 제1 항체 "A", 및 힌지 잔기 서열(EU-인덱스 넘버링: 잔기 226-229; 카밧 넘버링: 잔기 239-242) CPPC 또는 CPSC 또는 SPPC 또는 SPSC를 갖는 제2 항체 "B"를, 힌지 잔기 서열(잔기 226-229) CPPC 또는 CPSC 또는 SPPC 또는 SPSC를 갖는 부류 항체의 힌지 영역 내 임의의 쇄간 또는 쇄내 디설파이드 결합을 파괴시키는 환원 조건 하에 환원시켜 절반-항체 A 및 절반-항체-B를 형성하는 단계로서, 상기 항체 A는 제1 표적에 결합하고, 항체 B는 제2 표적에 결합하는, 절반-항체 A 및 절반-항체-B를 형성하는 단계;

(b) 화학식 I의 화합물을 절반-항체 A의 힌지 코어 서열의 1개 또는 2개 Cys 잔기(EU-인덱스 넘버링: 잔기 226 및 229; 카밧 넘버링: 잔기 239 및 242)에 연결하여 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 구조를 갖는 연결된 절반-항체 A를 형성하는 단계:

(여기서, N₃은 -N=N=N이다);

(c) 화학식 II의 화합물을 항체 B의 힌지 코어 서열의 1개 또는 2개 Cys 잔기(EU-인덱스 넘버링: 잔기 226 및 229; 카밧 넘버링: 잔기 239 및 242)에 연결하여 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 구조:

를 갖는 연결된 항체 B를 형성하는 단계; 및

(d) 대략 동등한 몰량의 연결된 항체 A를 연결된 항체 B와 연결된 이중특이적 항체 AB를 형성하기 위한 중성 조건 하에 항온배양하는 단계를 포함한다.

바람직하게는, 절반-항체 A를 형성하는 항체 A, 및 절반-항체 B를 형성하는 항체 B의 환원은 환원제, 예를 들면, L-시스테인, 디티오트레이톨, 베타-머캅토 에탄올, 시스테아민, TCEP(트리스(2-카복시에틸)포스핀), 2-MEA(2-머캅토에틸아민), 및 이들의 배합물에서 수행된다. 바람직하게는 2개의 Cys 잔기를 갖는, 항체 A의 힌지 영역은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 구조를 갖는 모이어티 A와 연결된다.

(여기서, N₃은 -N=N=N이다). 바람직하게는 2개의 Cys 잔기를 갖는, 항체 B의 힌지 영역은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 구조를 갖는 모이어티 B와 연결된다.

(여기서, N₃은 -N=N=N이다)

를 연결된 항체 B:

본 발명은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 구조를 갖는 절반-항체 A:

(여기서, N₃은 -N=N=N이다); 및

바람직하게는, 절반-항체 A를 형성하기 위한 항체 A의 환원, 및 절반-항체 B를 형성하기 위한 항체 B의 환원은 환원제, 예를 들면, L-시스테인, 디티오트레이톨, 베타-머캅토 에탄올, 시스테아민, TCEP (트리스(2-카복시에틸)포스핀), 2-MEA (2-머캅토에틸아민), 및 이들의 배합물에서 수행된다.

바람직하게는, 항체 A 및 B는 모노클로날 항체이다. 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법 또는 재조합 DNA 및 단백질 발현 방법에 의해 제조될 수 있다. 추가로, 항체 A 및 B는 전장 항체 또는 항체 단편이다.

항체 A 및 B는 CPPC 코어 힌지 영역 서열 또는 CPSC 코어 힌지 영역 서열 또는 SPPC 코어 힌지 영역 서열 또는 SPSC 코어 힌지 영역 서열(EU-인덱스 넘버링: 잔기 226-229; 카밧 넘버링: 잔기 239-242)을 갖는다. 추가로, 단계 (d) 항온배양은 환원제의 첨가 단계를 추가로 포함하며, 여기서 환원제는 L-시스테인, 디티오트레이톨, 베타-머캅토 에탄올, 시스테아민, TCEP(트리스(2-카복시에틸)포스핀), 2-MEA(2-머캅토에틸아민), 및 이들의 배합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

수득된 이중특이적 항체의 품질 및 순도는 일상적인 생화학적 기술, 예를 들면, 흡광도 측정, HP-SEC, SDS-PAGE, 네이티브(native) PAGE 및 RP-HPLC를 사용하여 분석될 수 있다. 개시된 방법은 일반적으로 화학식 II의 링커에 대한 화학식 I의 링커의 친화성의 특이성으로 인해 임의의 정제 단계가 회피된다는 것이 주지되어야 한다. 그러나, 개시내용이 본원에 참고로 포함된 US2010/0105874에서는 다양한 정제 단계가 제공된다.

개시된 방법은 치료적 용도를 위해 이중특이적 항체를 제형화하는 단계를 추가로 포함한다. 이는 유효량의 이중특이적 항체를, 사람 용도에 적합한, 특히 비경구 또는 정맥내 투여에 적합한 수용액에서 제형화하여 달성된다.

도 2는 화학적 접합을 통해 이중특이적 모노클로날 항체(mAb)를 생성하는 도식을 보여준다. 본원에 기재된 이중특이적 mAb는 힌지 영역에서 화학적으로 연결된 2개의 절반-항체 단편으로 구성된다. 이중특이적 mAb의 생성 방법은 3개의 주요 단계를 수반한다(도 2). 제1 단계는 각각 2개의 상이한 mAb A 및 B 내 힌지 디설파이드를 선택적으로 환원시키는 것이다. 제2 단계는 링커 X 또는 Y를 통해 각각의 mAb 내 동일한 중쇄 상의 2개의 시스테인 사이에서 쇄내-연결을 유도하는 것이다. 쇄내-연결 과정은 2개의 화학적으로 로킹된 mAb 단편 A' 및 B'를 생성한다. 마지막 단계에서, 2개의 mAb 단편은 X 및 Y 사이에 화학적 결찰을 통해 함께 연결되어 이중특이적 항체 AB를 형성한다.

힌지 돌연변이(CPSC)를 갖는 IgG1, wt IgG4, 및 힌지 돌연변이(SPSC)를 갖는 IgG4가 본 연구에 사용되었다.

제1 단계는 각각의 항체 A 및 항체 B를 환원시키는 것이다. 한 양태에서, 항체(10mg)를 0.1M PBS pH 7.4, 1.0mM 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA) 중에서 10 몰당량의 2-머캅토에틸-아민(2-MEA)으로 37℃에서 2시간 동안 처리했다. 과량의 2-MEA는, 50kDa 필터 원심분리기 튜브를 사용하여 3,000RPM에서 20분 동안 원심분리를 수행하여 부분적으로 환원된 mAb로부터 정제되었다. 0.1M PBS를 사용하여 총 3회 세척을 수행했다. 단백질 농도는 1.0mg/mL 용액에 대해 280nm에서 1.58의 흡광도 수치를 사용하여 정량화되었고, 150,000g/mol의 분자량을 사용하여 몰 농도를 결정했다.

환원 단계의 또 다른 양태에서, 항체(10mg)를 0.1M PBS pH 7.4, 1.0mM 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA) 중에서 3.0 몰당량의 디티오트레이톨(DTT)로 24℃에서 2시간 동안 처리했다. 과량의 DTT를, 50kDa 필터 원심분리기 튜브를 사용하여 3,000RPM에서 20분 동안 원심분리를 수행하여 부분적으로 환원된 mAb로부터 정제했다. 0.1M PBS를 사용하여 총 3회 세척을 수행했다.

환원 단계의 또 다른 양태에서, mAb(10mg)를 0.1M PBS pH 8.0, 1.0mM 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA) 중에서 2.0 몰당량의 트리스 (2-카복시에틸)-포스핀(TCEP)으로 24℃에서 2시간 동안 처리했다. mAb 농도는 8.0mM이었다. 정제 없이, 부분적으로 환원된 mAb를 접합 단계에서 직접 사용했다.

제2 단계는 접합 단계이다. 0.1M PBS 중에서 환원 단계로부터의 부분적으로 환원된 mAb "항체 A"를 2.5 몰당량의 교차 결합제 Z-X-Z에 첨가했다(도 2 및 도 3). 교차 결합제는 DMSO 중에서 미리 제조된 스톡 용액(1mg/mL)으로부터 취해졌다. 반응 혼합물에서, 부분적으로 환원된 항체 농도는 8.0mg/mL였고, DMSO 함량은 5%(v/v)였다. 접합은 24℃에서 2시간 동안 수행되었다. 시스테인(1mM 최종)을 사용하여 임의의 미반응된, 과량의 교차 결합제를 켄칭시켰다. 접합된 mAb를 인산염 완충된 염수로 평형화된 PD-10 컬럼을 사용하여 정제했다. 접합된 mAb 구조물은 도 4에서 서술된다. 동일한 조건 하에, 2차 mAb(항체 B)를 교차 결합제 Z-Y-Z와 접합시키고(도 5 및 도 6) 정제했다. 접합된 mAb 구조물은 도 7 및 도 8에서 서술된다.

제3 단계는 쇄간 접합 단계이다. 쇄간 교차-결합을 위한 클릭 접합은 도 9에서 서술된다. 간략히, PBS(0.1M, pH 7.4) 0.5mL 중의 아지드-제공된 항체 단편에 PBS(0.1M, pH 7.4) 0.5mL 중의 알킨-제공된 항체 단편 3.0mg을 첨가한다. 이 혼합물에 아세토니트릴 50μL를 첨가하고, 아세토니트릴의 최종 함량은 5%(v/v)이다. 실온에서 반응 3시간 후, 혼합물을 100 kDa 필터 원심분리기 튜브를 사용하여 3,000RPM에서 20분 동안 원심분리를 수행하여 정제한다. 혼합물을 PBS로 3회 세척하고, 수득된 생성물은 시험관내 특성화에 적용된다.

실시예 1

이 실시예는 개시된 방법에 따른 이중특이적 항체의 합성을 보여준다. 도 4는 IgG 부류 항체의 힌지 영역 내 2개의 Cys 잔기에 대한 화학적 접합에 의해 이중특이적 모노클로날 항체(mAb)를 생성하는 도식을 보여준다. 개시된 이중특이적 mAb는 각각의 힌지 영역에서 화학적으로 연결된 2개의 절반-항체 단편으로 구성된다. 이중특이적 mAb의 합성 방법은 도 5에 나타난 3개의 주요 단계를 수반한다. 제1 단계는 2개의 상이한 mAb, 각각 A 및 B 내 힌지 디설파이드를 선택적으로 환원시키는 것이다. 제2 단계는 링커 X 또는 Y를 통해 각각의 mAb 내 동일한 중쇄 상의 2개의 시스테인 사이에 쇄내-연결을 유도하는 것이다. 쇄내-연결 과정은 2개의 화학적으로 로킹된 mAb 단편 A' 및 B'를 생성한다. 마지막 단계에서, 2개의 mAb 단편은 X 및 Y 사이의 화학적 결찰을 통해 함께 연결되어 이중특이적 항체 AB를 형성한다.

더 구체적으로는, 본 발명자들은 힌지 돌연변이(CPSC)를 갖는 IgG1인 항체 "A", 및 야생형 IgG4인 항체 "B"를 수득했다. 제1 단계는 항체 환원이었다. 조건 1: 항체(10mg)를 0.1M PBS pH 7.4 중 2-머캅토에틸-아민(2-MEA) 10 몰당량, 1.0mM 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA)으로 37℃에서 2시간 동안 따로 처리했다. 과량의 2-MEA는 50kDa 필터 원심분리기 튜브를 사용하여 3,000RPM에서 20분 동안 원심분리를 수행하여 부분적으로 환원된 mAb로부터 정제되었다. 0.1M PBS를 사용하여 총 3회 세척을 수행했다. 단백질 농도는 1.0mg/mL 용액에 대해 280nm에서 1.58의 흡광도 수치를 사용하여 정량화되었고, 150,000g/mol의 분자량을 사용하여 몰 농도를 측정했다.

조건 2: 항체(10mg)를 0.1M PBS pH 7.4 중의 디티오트레이톨(DTT) 3.0 몰당량, 1.0mM 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA)으로 24℃에서 2시간 동안 처리했다. 과량의 DTT를 50kDa 필터 원심분리기 튜브를 사용하여 3,000RPM에서 20분 동안 원심분리를 수행하여 부분적으로 환원된 mAb로부터 정제했다. 0.1M PBS를 사용하여 총 3회 세척을 수행했다.

조건 3: mAb(10mg)를 0.1M PBS pH 8.0 중의 트리스 (2-카복시에틸)-포스핀(TCEP) 2.0 몰당량, 1.0mM 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA)으로 24℃에서 2시간 동안 처리했다. mAb 농도는 8.0mM이었다. 정제 없이, 부분적으로 환원된 mAb를 접합에 직접 사용했다.

실시예 2

이 실시예는 실시예 1에서 제조된 이중특이적 항체가 이의 원래의 절반 Mab 결합 특성 둘 모두를 보유했음을 보여준다.

1-(2-(2- 아지도에톡시 )에틸)-3,4- 디브로모 -1H-피롤-2,5- 디온의 합성:

THF 60mL 중의 3,4-디브로모-1H-피롤-2,5-디온(10mmol) 2.5g 및 NMM 1g에 MeOCOCl(10mmol, 10ml DCM 중 940mg)을 적가하고, 20분 동안 교반시킨 후 반응 용액을 DCM 60mL로 희석하고, 물로 3회 세척하고, 유기 상을 무수황산나트륨으로 교반시키고, 농축시켜 메틸 3,4-디브로모-2,5-디옥소-2H-피롤-1(5H)-카복실레이트 2.65g을 수득했다. 1mmol의 이 화합물 311mg에, 2-(2-아지도에톡시)에탄아민(130mg, 1mmol) 및 DCM 5mL를 첨가하고, TLC에 의해 반응이 20분 내에 종료되었음을 보여주었고, 이후 DCM 및 염수로 추출하고, NH₄Cl 용액으로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시킨 후 컬럼 정제를 위해 농축시키고, 2:1 헥산 및 에틸 에틸레이트로 플래시(flash)하여 1-(2-(2-아지도에톡시)에틸)-3,4-디브로모-1H-피롤-2,5-디온 230mg을 수득했다.

Fw: 365.9, C₈H₈Br₂N₄O₃; 질량 피크(1:2:1): 366.9, 368.9, 370.9.

실시예 3

이 실시예는 IgG 부류 항체의 힌지 영역에 위치한 단일 Cys 잔기를 사용한 이중특이적 항체의 화학적 생성을 설명한다. 본원에 기재된 개시 mAb는 각각의 쇄 상의 동일한 위치에서의 하나의 Cys가 Ser으로 돌연변이되어 단일 디설파이드만이 남아 있는 힌지를 초래하는, 조작된 힌지 영역을 함유한다. 이중특이적 mAb 생성 방법은 3개의 주요 단계를 수반한다(도 1). 제1 단계는 각각 2개의 상이한 mAb A 및 B 내 힌지 디설파이드를 선택적으로 환원시키는 것이다. 제2 단계는 시스테인-기반 접합을 통한 작용성 모이어티 X 또는 Y를 유도하는 것이다. Cys-연결 단계는 2개의 화학적으로 로킹된 mAb 단편 A' 및 B'를 생성한다. 마지막 단계에서, 2개의 mAb 단편은 X 및 Y 사이의 화학적 결찰을 통해 함께 연결되어 이중특이적 항체 AB를 형성한다. 힌지 영역 돌연변이(SPPC)를 갖는 IgG1 모노클로날 항체를 본 연구에 사용했다.

조건 1: 항체(10mg)를 0.1M PBS pH 7.4 중의 2-머캅토에틸-아민(2-MEA) 10 몰당량, 1.0mM 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA)으로 37℃에서 2시간 동안 처리했다. 과량의 2-MEA는 50kDa 필터 원심분리기 튜브를 사용하여 3,000RPM에서 20분 동안 원심분리를 수행하여 부분적으로 환원된 mAb로부터 정제되었다. 0.1M PBS를 사용하여 총 3회 세척을 수행했다. 단백질 농도는 1.0mg/mL 용액에 대해 280nm에서 1.58의 흡광도 수치를 사용하여 정량화되었고, 150,000g/mol의 분자량을 사용하여 몰 농도를 측정했다.

조건 2: 항체(10mg)를 0.1M PBS pH 7.4 중의 디티오트레이톨(DTT) 3.0 몰당량, 1.0mM 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA)으로 24℃에서 2시간 동안 처리했다. 과량의 DTT는 50kDa 필터 원심분리기 튜브를 사용하여 3,000RPM에서 20분 동안 원심분리를 수행하여 부분적으로 환원된 mAb로부터 정제되었다. 0.1M PBS를 사용하여 총 3회의 세척을 수행했다.

실시예 4

이 실시예는 각각의 절반 항체 단편의 힌지 영역을 서로 연결하는 개시된 화학적 연결 구조를 갖는, 본원에 개시된 방법에 따르는 이중특이적 항체의 제조 방법을 보여준다. 항체 스캐폴드는 힌지 돌연변이(SPSC)를 갖는 IgG4였다.

본 발명자들은 우선 각각의 Ig 항체를 변형시켜 화학적 변형을 통한 절반 항체를 생성했다. 구체적으로, 완충제 교환 반응을 위해 항체(0.5 내지 3mg)를 15mL 필터 원심분리기 튜브(Millipore, UFC903024)에 첨가하고, 상기 튜브 상의 50mL 표시까지 적절한 용적의 pH 8.0 PBS 1mM DTPA(디에틸렌 트리아민 펜타아세트산) 완충제를 첨가했다. 상기 튜브를 5℃에서 3,000RPM에서 20분 동안 원심분리했다. 항체를 1.5mL 플라스틱 바이알로 옮기고, 나노드롭(Nanodrop, Fisher, ND-2000 UV-Vis 분광광도계)을 사용하여 농도를 확인했다. 최종 항체 농도는 5 내지 8mg/mL였다.

pH 8.0 PBS(1.0mM DTPA) 완충제 중 1mg/mL TCEP((트리스(2-카복시에틸)포스핀)), Sigma-Aldrich, C4706)의 스톡 용액을 제조했다. 본 발명자들은 완충제 교환 후 회수된 항체의 당량수 및 수득된 질량에 따라, 항체에 첨가하는데 필요한 TCEP 용액의 용적을 계산하기 위해 하기 표를 사용했다.

적절한 용적의 TCEP 용액(상기 표에 의해 계산됨)을 항체 용액에 첨가하고, 가볍게 와동시키고, 바이알을 캐러셀(carousel) 위에 놓았다. 환원 반응을 실온에서 90분 동안 수행했다.

DMSO(Sigma-Aldrich, 472301) 중 DBCO-말레이미드(Click Chemistry Tools, A108-100)의 스톡 용액을 상기 표로부터의 계산에 기초하여 제조했다. DMSO 중 DBCO-말레이미드를 항체 샘플에 첨가했다(TCEP의 정제 없음). 항체 샘플 중 DMSO의 최종 용적은 약 5%(v/v)였다. 접합 반응을 캐러셀에 의한 혼합 하에 실온에서 1시간 동안 수행했다. 각각의 샘플을 별도의 15mL 필터 원심분리기 튜브(Millipore, UFC903024)에 넣고, 적절한 용적의 1X DPBS (Corning, 21-031-CM, 칼슘 또는 마그네슘 없음) 완충제를 상기 튜브 상의 50mL 표시까지 첨가했다. 샘플을 5℃에서 3,000RPM에서 20분 동안 원심분리했다. 세척 단계를 1회 더 반복했다. 세척 후, 샘플을 별도의 1.5mL 플라스틱 바이알로 옮기고 냉장고(5℃)에 두었다.

IgG4 항체의 경우, 4.0 당량의 TCEP가 다량의 절반-항체를 제공했다. IgG1 항체의 경우, 3.5 당량의 TCEP가 다량의 절반-항체를 제공했다. 5.0 당량의 DBCO가 모든 유형의 항체에 대해 사용되었다.

DMSO(0.12mL) 중의 DBCO-말레이미드(1.0mg, 1.0 당량)의 용액에 DMSO(0.6mL) 중의 아지도-PEG4-아지드(2.5mg, 5.0 당량)를 첨가했다. 상기 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반시켰다. 상기 반응은 LC/MS에 의해 지시된 바와 같이 완료되었다. 수득된 아지드-말레이미드의 분자량은 627.65g/mol이었다. 아지드-말레이미드 합성(반응식 1)

반응식 1. 아지드-말레이미드의 합성

DMSO 중 아지드-말레이미드(5.0 당량)를 항체 샘플에 첨가했다. 항체 샘플에서 DMSO의 최종 용적은 약 5%(v/v)였다. 접합 반응은 캐러셀에 의한 혼합 하에 실온에서 1시간 동안 수행되었다. 샘플을 이전에 기재된 바와 같이 세척했다.

각각의 절반-항체 단편을 소수성 상호작용 컬럼(HIC)으로 정제했다. HIC 검정을 40℃ 컬럼 온도 및 0.6mL/분 유속에서 TOSOH 부틸-NPR 컬럼으로 수행했다. 용출은 pH 7.0의 50mM 인산나트륨 완충제 중에서 염 농도를 감소시키고(1.5M로부터 0M까지의 황산암모늄), 유기 개질제를 증가시키는(0%로부터 25%까지의 이소프로필 알코올) 30분 구배에 의해 달성되었다. 절반-항체 단편을 SDS PAGE로 분석했다. 구체적으로, 분석될 각각의 샘플에 대해, 0.6mg/mL의 농도에서 20μL의 샘플을 필요로 했다. 본 발명자들은 러닝(running) SDS-PAGE 겔(RTP AD001-01 및 AD002-01)을 위한 확립된 프로토콜을 따랐다. 도 9는 화학적으로 변형된 절반 항체 단편의 비-환원 SDS PAGE를 보여준다(레인 2 및 3).

실시예 5

이 실시예는 클릭 반응을 통한 이중특이적 항체의 생성을 설명한다. 도 10은 2개의 절반-항체 단편 사이의 클릭 접합을 통한 이중특이적 항체의 생성을 보여준다. 2개의 절반-항체 단편 사이의 클릭 반응은 도 10에서 보여준다. PBS(5.0mg/mL) 중 절반-항체-아지드 단편(500μg)에 PBS(5.0mg/mL) 중 절반-항체-DBCO 단편(500μg)을 첨가했다. 반응을 캐러셀에 의한 혼합 하에 실온에서 2시간 동안 수행했다. 혼합물을 SDS PAGE 분석(도 11) 및 이온-교환 크로마토그래피에 의한 정제에 적용했다.

이중특이적 항체를 0.6mL/분 유속에서 Thermo WCX-10 컬럼을 사용하여 애질런트(Agilent) 1200 HPLC 상에서 정제했다. 용출은 pH 5.7의 10mM MES 완충제 중에서 염 농도를 증가시키는(0mM로부터 100M까지의 NaCl) 30분 구배에 의해 달성되었다. 이중특이적 항체 STI CBA-0710을 IdeS 프로테아제로 소화시키고 분석하고 워터 제보(Water Xevo) G-2 QTOF 질량 분석법 상에서 확인했다(도 12).

이중특이적 항체 STI CBA-0710의 생물물리학적 특성은 이중특이적 항체의 크기-배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 측정되었다(도 13). 구체적으로, 이중특이적 항체를 TSK 겔 수퍼SW3000 컬럼(4.6mm ID x 30cm, 4μm)을 사용하여 애질런트 1200 HPLC 상에서 분석했다. 완충제는 0.2M 인산칼륨, 0.25M KCl, pH 6.2였다.

도 14는 비아코어 상에서 이중특이적 항체 CBA-0710의 결합을 보여준다. 제1 항원을 표준 NHS/EDC 커플링 방법을 사용하여 대략 1500RU로 CM5 센서 칩 상에 고정시켰다. 기준선을 위해 완충제를 실행시켰다. 이중특이적 항체를 부하하고, 이어서 완충제를 부하한 후 제2 항원에 대한 결합을 실행시켰다.

실시예 6

이 실시예는 본원에서 제조된 이중특이적 항체에 대한 다양한 검정 결과를 보여준다. 이중특이적 항체의 세포-기반 결합 및 기능이 있다. 이중특이적 항체 CBA-0710은 유동 세포 분석법에 의해 검정될 때 MDA-MB-231(사람 유방암) 세포(도 15)에 결합했다. 항체에 대한 EC₅₀ 값을 측정했다. 항원-1 및 항원-2 둘 모두를 발현시키는 MDA-MB-231 삼중-음성 유방암(TNBC) 세포를 효소-비함유 세포 해리 완충제(GIBCO)와 함께 수거하고, V-하부 96 웰-플레이트로 옮겼다(50,000개 세포/웰). 세포를 FACS 완충제(PBS+ 2% FBS) + NaN₃ 중에서 이중특이적 항체 CBA-0710, 또는 모(parental) 단일특이적 항-항원-1 또는 항-항원-2 항체의 연속 희석물과 함께 45분 동안 얼음 위에서 항온배양했다. FACS 완충제로 2회 세척 후, 피코에리트린 접합된 항-사람 IgG(γ-쇄 특이적)의 1:1000 희석물을 첨가하고, 30분 동안 항온배양했다. 최종 세척 후, 형광 강도를 인텔리사이트 고속 대량 유동 세포 분석법(Intellicyt High Throughput Flow Cytometer; HTFC) 상에서 측정했다. 데이타를 그래프패드 프리즘(Graphpad Prism) 소프트웨어 및 비-선형 회귀 피트(non-linear regression fit)를 사용하여 분석했다. 데이타 점들은 양으로 표지된 세포 +/- 표준 오차의 중간 형광 강도(MFI)로서 보여준다. EC₅₀ 값은 세포에 대한 최대 결합의 50%를 달성하는 항체의 농도로서 보고된다.

결과는 표 3 및 도 15에서 보여주며, MDA-MB-231 세포에 대한 이중특이적 항체의 결합은 모 유형과 비교하여 개선되었고, 항-항원-2 항체와 유사한 나노몰이하(subnanomolar) EC50 값 및 항-항원-1 항체만큼 높은 결합 강도를 가졌음을 보여준다.

이중특이적 항체 CBA-0710의 길항 활성을 보여주었다. 구체적으로, 이중특이적 항체 CBA-0710에 의한 c-MET 인산화의 억제는 패스스캔 포스포-Met(PathScan^®　Phospho-Met; panTyr) 샌드위치 ELISA 키트 #7333 프로토콜에 따라 실행되었다. 간략히, 세포 용해물에 재구성된(reconstituted) 검출 항체를 첨가하고, 항온배양한 후 재구성된 HRP-링커 2차 항체를 첨가했다. 세척 후, TMB 기질을 첨가하고, 항온배양했다. STOP 용액의 첨가 후, 결과를 판독했다. 도 16은 삼중 음성 유방암 세포에서 이중특이적 항체 CBA-0710의 길항 활성을 보여준다. STI-A0607은 항-항원-1 모노클로날 항체이고, STI-A1010은 항-항원 2 모노클로날 항체이다. HGF는 항원-1의 중성 리간드이다.

이중특이적 항체 CBA-0710의 면역조절 활성이 존재했다. T 세포 반응성을 조절하는 이중특이적 항체 CBA-0710의 능력을 측정하기 위해, 정제된 CD4+ 세포를 동종이형 수지상 세포와 함께 배양하고, 7일 동안 GM-CSF 및 IL-4에서 단핵구를 배양함으로써 제조했다. 평행 플레이트를, 상업적 ELISA 키트를 사용하여 IL-2 및 IFNγ를 각각 측정하기 위한 3일 및 5일에서의 상청액의 수집을 가능하게 하도록 설정했다. 경쟁자 사람화된 항-항원-2(면역 체크포인트) mAb를 인-하우스(in-house) 제조하고, 양성 대조군으로서 IgG1을 사용했으며, 관련 없는 STI 사람 mAb는 음성 대조군 IgG 항체로서 이용되었다. 도 17은 이중특이적 항체 CBA-0710에 반응하여 IFN-γ 방출 증가를 보여준다. STI-A1010은 항-항원-2(면역 체크포인트) 모노클로날 항체이다. 경쟁자 mAb는 사람화된 항-항원-2(면역 체크포인트) 모노클로날 항체이다.

실시예 7

이 실시예는 F(ab)'₂ 항체 A' 및 B'를 사용하여 개시된 이중특이적 항체의 합성을 위한 도식을 설명한다. 본원에 기재된 이중-특이적 F(ab)'₂는 힌지 영역에서 화학적으로 연결된 2개의 F(ab)' 단편으로 구성된다(도 20). 개시 항체는 IgG1 또는 IgG4 이소형이다. 개시 항체는 Cys 잔기가 Ser 잔기로 돌연변이되어 힌지 영역에서 오직 하나의 디설파이드만이 남아 있는 변형된 힌지 영역을 함유한다. 이중특이적 F(ab)'₂ 화학적으로-로킹된 이중특이적 항체의 생성은 4개의 주요 단계를 수반한다. 제1 단계는 Fc 단편을 제거하는 것이다. 제2 단계는 각각 항체 A 및 B를 선택적으로 환원시키는 것이다. 제3 단계는 시스테인-기반 접합을 통해 힌지 영역에 작용성 모이어티 X 또는 Y를 도입하여 각각 화학적으로 변형된 항체 단편 A' 및 B'를 유도하는 것이다. 마지막 단계에서, 2개의 항체 단편을, X 및 Y 사이의 화학적 결찰을 통해 함께 연결하여 이중특이적 F(ab)'₂를 형성한다. 이러한 합성 도식은 도 21에서 보여준다.

구체적으로, 본 발명자들은 힌지 돌연변이(SPPC)를 갖는 IgG1 A 항체, 및 힌지 돌연변이(SPSC)를 갖는 IgG4 B 항체를 사용하여 F(ab)'₂ 화학적으로 로킹된 이중특이적 항체를 합성하는 방법을 수행했다. 힌지 영역 아래 하나의 특이적 부위에서만 IgG를 절단하는 소화 효소인 효소 IdeS를 사용하여, 항체(1.5mg)를 IdeS(A0-FR1-008)의 각각의 튜브에 첨가하고, 헤드 투 헤드 스피너(head to head spinner)에서 37℃에서 밤새 항온배양했다. 이후 Fc 단편을 단백질 A 정제를 사용하여 제거했다.

항체(1-10mg)를 15mL 필터 원심분리기 튜브(Millipore, UFC903024)에 첨가하고, 상기 튜브 상의 50mL 표시까지 적절한 용적의 50mM 인산나트륨, 150mM NaCl, 5mM EDTA, pH 7.7 완충제를 첨가했다. 튜브를 22℃에서 3,000RPM에서 20분 동안 원심분리했다. 항체를 1.5mL 플라스틱 바이알로 옮기고, 농도를 나노드롭(Fisher, ND-2000 UV-Vis 분광광도계)을 사용하여 확인했다. 최종 항체 농도는 10mg/mL 이하였다.

50mM 인산나트륨, 150mM NaCl, 5mM EDTA, pH 7.7 완충제 1mL를, 2-머캅토에틸아민·HCl 6mg(50mM 2-MEA가 초래됨)을 함유하는 하나의 바이알에 첨가했다. 50mM 2-MEA를 F(ab)'₂ 최종 농도 15mM에 첨가하고, 잘 혼합했다. 37℃에서 15분 동안 항온배양했다. NAP-5(GE17-0853-02) 탈염 컬럼을 사용하여 환원된 F(ab)'₂로부터 2-MEA를 분리했다.

pH 8.0 PBS(1.0mM DTPA) 완충제 중의 1mg/mL TCEP((트리스(2-카복시에틸)포스핀)), Sigma-Aldrich, C4706)의 스톡 용액을 제조했다. 단백질 A 정제 후 회수된 F(ab)'₂의 당량수 및 수득된 질량에 따라, 5 당량의 TCEP를 탈염된 F(ab)'에 첨가하고, 충분히 진탕하고, 실온에서 5분 동안 항온배양했다.

DBCO(디벤조사이클로옥틸)-말레이미드 및 아지드-말레이미드 접합을 위해, DMSO(Sigma-Aldrich, 472301) 중의 DBCO-말레이미드(Click Chemistry Tools, A108-100) 의 스톡 용액을 제조하고, DMSO 중 DBCO-말레이미드 20 당량을 F(ab)' (A) 샘플(TCEP의 정제 없음)에 첨가했다. 항체 샘플 중 DMSO의 최종 용적은 약 5%(v/v)였다. 접합 반응은 캐러셀에 의한 혼합 하에 실온에서 2시간 동안 수행했다. DMSO 중 아지드-말레이미드(20 당량)를 F(ab)' (B) 샘플에 첨가했다. 항체 샘플 중 DMSO의 최종 용적은 약 5%(v/v)였다. 접합 반응은 캐러셀에 의한 혼합 하에 실온에서 2시간 동안 수행했다.

세척 단계 동안, 각각의 샘플을 별도의 15mL 필터 원심분리기 튜브(Millipore, UFC903024)에 넣고, 상기 튜브 상의 50mL 표시까지 적당한 용적의 1X DPBS(Corning, 21-031-CM, 칼슘 또는 마그네슘 없음) 완충제를 첨가했다. 샘플을 22℃에서 3,000RPM에서 20분 동안 원심분리했다. 세척 단계를 한번 더 반복했다. 세척 후, 샘플을 별도의 1.5mL 플라스틱 바이알에 옮기고, 냉장고(5℃)에 두거나 클릭 단계를 위해 사용했다. F(ab)' 단편 분석을 위해 SDS PAGE 절차가 사용되었다. 분석될 각각의 샘플에 대해, 0.6mg/mL의 농도에서 20μL의 샘플을 필요로 했다. 러닝 SDS-PAGE 겔(RTP AD001-01 및 AD002-01)에 대한 확립된 프로토콜에 따랐다(도 21).

2개의 F(ab)' 단편 사이의 클릭 반응 도식은 도 23에서 보여준다. PBS 중 F(ab)'-아지드 단편(500μg)(5.0mg/mL)에 PBS 중 F(ab)'-DBCO 단편(500μg)(5.0mg/mL)을 첨가했다. 상기 반응을 캐러셀에 의한 혼합 하에 실온에서 밤새 수행했다. 혼합물을 SEC 분석에 적용했다(도 24).

이 실시예에서 제조된 이중특이적 항체의 생물물리적 특성을 크기-배제 크로마토그래피(SEC)를 사용하여 수행했다. TSK 겔 수퍼SW3000 컬럼(4.6mM ID x 30cm, 4μm)을 사용하는 크기-배제 크로마토그래피(SEC) 애질런트 1200 HPLC를 F(ab)'_A, F(ab)'_B 및 이중특이적 클릭_F(ab)'₂를 분석하는데 사용했다(도 24). 완충제 0.2M 인산칼륨, 0.25M KCl, pH 6.2.

이중특이적 F(ab)'₂를 질량 분석법으로 확인했다. 이중특이적 F(ab)'₂를워터 제보 G-2 QTOF9 상에서 분석했다(도 25). 이중특이적 F(ab)'₂를 크기-배제 크로마토그래피(SEC)를 사용하여 정제했다. TSK 겔 수퍼SW3000 컬럼(4.6mm ID x 30cm, 4μm)을 사용한 크기-배제 크로마토그래피(SEC) 애질런트 1200 HPLC를 사용하여 이중특이적 클릭_F(ab)'₂를 정제했다(도 26). 완충제 0.2M 인산칼륨, 0.25M KCl, pH 6.2.

시험관내 친화도 측정은 옥텟 레드를 사용한 측정이었다(도 27). 센서 AR2G를 사용하여 옥텟 레드(ForteBio, Inc.) 상에서 이중특이적 F(ab)'₂ 항원 상호작용을 측정했다. 간략히, 측정 계획은 하기와 같았다: 300초 기저선; 10μg/ml 이중특이적 F(ab)'₂의 300초 부하, 120초 기저선; 300초 항원 A; 300초 해리; 300초 항원 B 및 300초 해리(도 27). 센서 수화 및 기저선- 및 해리 측정은 PBS에서 수행되었다.

실시예 8

이 실시예는 IgG2 항체 A' 및 B'를 사용하여 개시된 이중특이적 항체를 합성하기 위한 도식을 설명한다. 본원에 기재된 이중-특이적 IgG2는 힌지 영역에서 화학적으로 연결된 2개의 IgG2 단편으로 구성된다(도 29). 개시 항체는 IgG2 이소형이다. 이중-특이적 IgG2의 생성은 3개의 주요 단계를 수반한다. 제1 단계는 동종이량체 구조를 여전히 유지하면서 IgG2 항체의 힌지 영역 내 (4개 중) 1개 또는 2개의 디설파이드 결합을 환원시키는 것이다. 제2 단계는 시스테인-기반 접합을 통해 힌지에서 작용성 모이어티 X 또는 Y를 도입하여 각각 화학적으로 변형된 항체 단편 A' 및 B'를 야기하는 것이다. 마지막 단계에서, 2개의 항체는 X 및 Y 사이의 화학적 결찰을 통해 함께 연결되어 이중특이적_IgG2를 형성한다.

구체적으로, 본 발명자들은 IgG2 화학적으로 로킹된 이중특이적 항체의 합성 방법을 수행했다. 항체(1-10mg)를 15mL 필터 원심분리기 튜브(Millipore, UFC903024)에 첨가하고, 상기 튜브 상의 50mL 표시까지 적절한 용적의 50mM 인산나트륨, 150mM NaCl, 5mM EDTA, pH 7.7 완충제를 첨가했다. 상기 튜브를 22℃에서 3,000RPM에서 20분 동안 원심분리했다. 항체를 1.5mL 플라스틱 바이알로 옮기고, 농도를 나노드롭(Fisher, ND-2000 UV-Vis 분광광도계)을 사용하여 확인했다. 최종 항체 농도는 10mg/mL 이하였다.

pH 8.0 PBS(2.0mM DTPA) 완충제 중의 1mg/mL TCEP((트리스(2-카복시에틸)포스핀)), Sigma-Aldrich, C4706)의 스톡 용액을 제조했다. IgG2의 당량수 및 수득된 질량에 따라, 2 당량의 TCEP를 IgG2 용액에 첨가하고, 충분히 진탕시키고, 실온에서 90분 동안 항온배양했다. DBCO(디벤조사이클로옥틸)-말레이미드 및 아지드-말레이미드.

접합을 위해, DMSO(Sigma-Aldrich, 472301) 중 DBCO-말레이미드(Click Chemistry Tools, A108-100)의 스톡 용액을 제조하고, DMSO 중 DBCO-말레이미드 5 당량을 IgG2_A 샘플(TCEP의 정제 없음)에 첨가했다. 항체 샘플 중 DMSO의 최종 용적은 약 5%(v/v)였다. 접합 반응은 캐러셀에 의한 혼합 하에 실온에서 1시간 동안 수행되었다. DMSO 중 아지드-말레이미드(5 당량)를 IgG2(B) 샘플에 첨가했다. 항체 샘플 중 DMSO의 최종 용적은 약 5%(v/v)였다. 접합 반응은 캐러셀에 의한 혼합 하에 실온에서 1시간 동안 수행되었다.

세척 단계를 위해, 각각의 샘플을 별도의 15mL 필터 원심분리기 튜브(Millipore, UFC903024)에 넣고, 상기 튜브 상의 50mL 표시까지 적절한 용적의 1X DPBS(Corning, 21-031-CM, 칼슘 또는 마그네슘 없음) 완충제를 첨가했다. 샘플을 22℃에서 3,000RPM에서 20분 동안 원심분리했다. 세척 단계를 한번 더 반복했다. 세척 후, 샘플을 별도의 1.5mL 플라스틱 바이알로 옮기고 냉장고(5℃)에 넣거나 클릭 단계를 위해 사용했다.

분석될 각각의 샘플에 대해, 0.6mg/mL의 농도에서 20μL의 샘플을 필요로 했다. 러닝 SDS-PAGE 겔을 위한 확립된 프로토콜(RTP AD001-01 및 AD002-01)을 따랐다(도 29).

질량 분석법을 위해, 항체 A를 TCEP로 환원시키고, DBCO와 접합시키고, 워터 제보 G-2 QTOF 상에서 분석했다. 이 데이타는 본 발명의 IgG2에 대한 2개의 DBCO(오직 1개의 디설파이드 결합 환원) 또는 4개의 DBCO(2개의 디설파이드 결합 환원)의 접합을 시사한다.

이 실시예에서 제조된 이중특이적 항체의 생물물리학적 특성은 크기-배제 크로마토그래피(SEC)를 사용하여 수행되었다. 이중특이적 IgG2를 분석하기 위한 TSK 겔 수퍼SW3000 컬럼(4.6mm ID x 30cm, 4μm)을 사용하는 크기-배제 크로마토그래피(SEC) 애질런트 1200 HPLC(도 31). 완충제 0.2M 인산칼륨, 0.25M KCl, pH 6.2.

Claims

제1 항체 "A" 및 제2 항체 "B"로부터 이중-특이적 항체(bi-specific antibody) "AB" 또는 "BA"의 제조 방법으로서,
(a) 상기 제1 항체 A를, 힌지 영역 내 중쇄 사이의 실질적으로 모든 디설파이드 결합을 절단하기에 충분한 조건 하에 환원제와 접촉시켜 각각 단일 중쇄에 부착된 단일 경쇄를 포함하는 한 쌍의 제1 항체 단편 A'를 수득하는 단계로서, 상기 중쇄는 상기 디설파이드 결합의 환원으로부터 형성된 하나 이상의 반응성 티올 그룹을 갖는, 상기 한 쌍의 제1 항체 단편 A'를 수득하는 단계;
(b) 제1 헤테로-이작용성(hetero-bi-functional) 링커를 상기 제1 항체 단편 A'에 부착하여 아지드-작용화된 제1 항체 단편을 형성하는 단계로서, 상기 제1 헤테로-이작용성 링커는 (i) 상기 제1 항체 단편의 상기 중쇄의 반응성 티올 그룹에 공유 부착하기 위한 제1 티올-반응성 관능 그룹, 및 (ii) 아지드를 포함하는, 상기 제1 항체 단편을 형성하는 단계;
(c) 상기 제2 항체 B를, 힌지 영역 내 중쇄 사이의 실질적으로 모든 디설파이드 결합을 절단하기에 충분한 조건 하에 환원제와 접촉시켜 각각 단일 중쇄에 부착된 단일 경쇄를 포함하는 한 쌍의 제2 항체 단편 B'를 수득하는 단계로서, 상기 중쇄는 상기 디설파이드 결합의 환원으로부터 형성된 하나 이상의 반응성 티올 그룹을 갖는, 상기 한 쌍의 제2 항체 단편 B'를 수득하는 단계;
(d) 제2 헤테로-이작용성 링커를 상기 제2 항체 단편 B'에 부착하여 알킨-작용화된 제2 항체 단편을 형성하는 단계로서, 상기 제2 헤테로-이작용성 링커는 (i) 상기 제2 항체 단편의 상기 중쇄의 반응성 티올 그룹에 공유 부착하기 위한 제2 티올-반응성 관능 그룹, 및 (ii) 알킨을 포함하는, 상기 제2 항체 단편을 형성하는 단계; 및
(e) 상기 아지드 작용화된 제1 항체 단편을 상기 알킨 작용화된 제2 항체 단편과 반응시켜 상기 제1 항체 단편을 상기 제2 항체 단편에, 상기 알킨에 대한 상기 아지드의 사이클로첨가(cycloaddition)를 통해 공유 부착하여 화학적으로-로킹된(chemically-locked) 이중-특이적 항체 "AB" 또는 "BA"를 형성하는 단계를 포함하는, 제1 항체 "A" 및 제2 항체 "B"로부터 이중-특이적 항체 "AB" 또는 "BA"의 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 제1 헤테로-이작용성 링커가 형태 Q-L-N₃을 갖고, 여기서 Q는 알킬 할라이드, 벤질 할라이드, 말레이미드, 할로-말레아미드 또는 디할로-말레이미드를 포함하는 티올-반응성 관능 그룹이고, L은 3 내지 60개의 원자를 갖는 탄화수소 링커이며, N₃은 아지드 그룹인, 제1 항체 "A" 및 제2 항체 "B"로부터 이중-특이적 항체 "AB" 또는 "BA"의 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 제1 헤테로-이작용성 링커가 형태 Q-L-N₃을 갖고, 여기서 Q는 말레이미드, 할로-말레아미드 또는 디할로-말레이미드 그룹을 포함하는 티올-반응성 관능 그룹이고; L은 단위 -(CH₂CH₂-O)_n- 및/또는 -(O-CH₂CH₂)_n-을 갖는 중합체 배치에서 3 내지 60개의 원자를 갖는 탄화수소 링커이며, 여기서 "n"은 독립적으로 1 내지 20의 정수이고; N₃은 아지드 그룹인, 제1 항체 "A" 및 제2 항체 "B"로부터 이중-특이적 항체 "AB" 또는 "BA"의 제조 방법.
제2항에 있어서, 상기 제1 헤테로-이작용성 링커가 하기의 형태:

를 가지며, 여기서,
Q는 하기 형태의 티올-반응성 그룹:

이고, 여기서, Z는 H, Br, I 및 SPh로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되며, 단 Z의 적어도 하나는 H가 아니고; M은 독립적으로 CR^* 또는 N이고;
X₁, X₂, X₃, X₂, X₄ 및 X₅는 결합, -O-, -NR^N-, -N=C-, -C=N-, -N=N-, -CR^*=CR^*-(시스 또는 트랜스), -C≡C-, -(C=O)-, -(C=O)-O-, -(C=O)-NR^N-, -(C=O)-(CH₂)_n-, -(C=O)-O-(CH₂)_n-, -(C=O)-NR^N-(CH₂)_n-, 및 -(C=O)-NR^N-(CH₂CH₂-O)_n-으로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 "n"은 0 또는 1 내지 10의 정수이고;
R^a, R^b, R^c 및 R^d는 -O-, -NR^N-, -CH₂-, -(CH₂)_n-, -(CR^* ₂)_n-, -(CH₂CH₂-O)_n-, -(CR^* ₂CR^* ₂-O)_n-, -(O-CH₂CH₂)_n-, -(O-CR^* ₂CR^* ₂)_n-, -CR^*=CR^*-(시스 또는 트랜스), -N=C-, -C=N-, -N=N-, -C≡C-, -(C=O)-, -(CH₂) _n -(C=O)-, -(C=O)-(CH₂) _n -, -(CH₂) _n -(C=O)-(CH₂)_n-, -O-(C=O)-, -(C=O)-O-, -O-(C=O)-O-, -(CH₂)_n-(C=O)-O-, -O-(C=O)-(CH₂)_n, -(C=O)-O-(CH₂)_n-, -(CH₂)_n-O-(C=O)-, -(CH₂)_n-(C=O)-O-(CH₂)_n-, -(CH₂)_n-O-(C=O)-(CH₂)_n-, -NR^N-(C=O)-, -(C=O)-NR^N-, -NR^N-(C=O)-O-, -O-(C=O)-NR^N-, -NR^N-(C=O)-NR^N-, -(CH₂)_n-(C=O)-NR^N-, -NR^N-(C=O)-(CH₂)_n, -(C=O)-NR^N-(CH₂)_n-, -(CH₂)_n-NR^N-(C=O)-, -(CH₂)_n-(C=O)-NR^N-(CH₂)_n-, -(CH₂)_n-NR^N-(C=O)-(CH₂)_n-, -(C=O)-NR^N-(CH₂CH₂-O)_n-, -(CH₂CH₂-O)_n-(C=O)-NR^N-, -(CH₂)_n-(C=O)-NR^N-(CH₂CH₂-O)_n-, -(CH₂CH₂-O)_n-(C=O)-NR^N-(CH₂)_n-, 또는 2 내지 8원 사이클릭 탄화수소, 헤테로사이클, 아릴 또는 헤테로아릴 환으로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 "n"은 독립적으로 0 또는 1 내지 10의 정수이고;
"l", "p", "q" 및 "r"은 독립적으로 0 또는 1 내지 10의 정수이고;
Ω는 결합이거나 또는 임의로 4개 이하의 융합된 환을 포함하는, C₃ _-26 탄화수소 환 또는 융합된 환 시스템이고, 여기서 각각의 환은 3 내지 8개의 구성원을 갖고, 임의로 각각의 환 내에 O, S 및 N으로부터 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자를 포함하고;
여기서, R^* 및 R^N은 독립적으로 H, 또는 할로겐, O, S 및 N으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1 내지 6개의 헤테로원자로 임의로 치환된 C₁ _-12 탄화수소이고;
R^* 및/또는 R^N은 함께 3 내지 8원 환을 형성할 수 있는, 제1 항체 "A" 및 제2 항체 "B"로부터 이중-특이적 항체 "AB" 또는 "BA"의 제조 방법.
제4항에 있어서, Q가 말레이미드, 브로모-말레이미드 또는 디브로모말레이미드인, 제1 항체 "A" 및 제2 항체 "B"로부터 이중-특이적 항체 "AB" 또는 "BA"의 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 제2 헤테로-이작용성 링커가 형태 Q-L-G를 갖고, 여기서 Q는 알킬 할라이드, 벤질 할라이드, 말레이미드, 할로-말레아미드 또는 디할로-말레이미드를 포함하는 티올-반응성 관능 그룹이고, L은 3 내지 60개의 원자를 갖는 탄화수소 링커이고, G는 알킨 함유 그룹인, 제1 항체 "A" 및 제2 항체 "B"로부터 이중-특이적 항체 "AB" 또는 "BA"의 제조 방법.
제1항에 있어서, G가 -C≡CH인, 제1 항체 "A" 및 제2 항체 "B"로부터 이중-특이적 항체 "AB" 또는 "BA"의 제조 방법.
제1항에 있어서, G가 -C≡C- 결합을 갖는 C8 환을 포함하는, 제1 항체 "A" 및 제2 항체 "B"로부터 이중-특이적 항체 "AB" 또는 "BA"의 제조 방법.
제8항에 있어서, G가 하기 형태:

를 갖는, 제1 항체 "A" 및 제2 항체 "B"로부터 이중-특이적 항체 "AB" 또는 "BA"의 제조 방법.
제8항에 있어서, G가 하기 형태:

를 갖는, 제1 항체 "A" 및 제2 항체 "B"로부터 이중-특이적 항체 "AB" 또는 "BA"의 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 제2 헤테로-이작용성 링커가 형태 Q-L-G를 갖고, 여기서 Q는 말레이미드, 할로-말레아미드 또는 디할로-말레이미드 그룹을 포함하는 티올-반응성 관능 그룹이고; L은 3 내지 60개의 원자를 갖고, 단위 -(CH₂CH₂-O)_n- 또는 -(O-CH₂CH₂)_n-을 갖는 중합체를 포함하는 탄화수소 링커이며, 여기서 "n"은 독립적으로 1 내지 20의 정수이고; G는 아지드와 1,3 쌍극자 사이클로첨가 반응을 진행할 수 있는 -C≡C- 결합을 갖는 C₈ 환을 포함하는 C₈ _-20 탄화수소인, 제1 항체 "A" 및 제2 항체 "B"로부터 이중-특이적 항체 "AB" 또는 "BA"의 제조 방법.
제10항에 있어서, 상기 제2 헤테로-이작용성 링커가 하기 형태를 갖고:

여기서,
Q는 하기 형태의 티올-반응성 그룹이고:

여기서, Z는 H, Br, I 및 SPh로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고, 단 Z의 적어도 하나는 H가 아니고; M은 독립적으로 CR^* 또는 N이고;
G는 상기 아지드와 함께 1,3 쌍극자 사이클로첨가 반응을 진행할 수 있는 -C≡C- 결합을 갖는 C₈ 환을 포함하는 C_8-20 탄화수소 그룹이고;
X₁, X₂, X₃, X₂, X₄ 및 X₅는 각각 결합, -O-, -NR^N-, -N=C-, -C=N-, -N=N-, -CR*=CR*-(시스 또는 트랜스), -C≡C-, -(C=O)-, -(C=O)-O-, -(C=O)-NR^N-, -NR^N-(C=O)-, -NR^N-(C=O)-O-, -(C=O)-(CH₂)_n-, -(C=O)-O-(CH₂)_n-, -(C=O)-NR^N-(CH₂)_n- 및 -(C=O)-NR^N-(CH₂CH₂-O)_n-으로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 "n"은 0 또는 1 내지 10의 정수이고;
R^a, R^b, R^c 및 R^d는 -O-, -NR^N-, -CH₂-, -(CH₂) _n -, -(CR^* ₂)_n-, -(CH₂CH₂-O)_n-, -(CR^* ₂CR^* ₂-O)_n-, -(O-CH₂CH₂)_n-, -(O-CR^* ₂CR^* ₂)_n-, -CR^*=CR^*-(시스 또는 트랜스), -N=C-, -C=N-, -N=N-, -C≡C-, -(C=O)-, -(CH₂)_n-(C=O)-, -(C=O)-(CH₂)_n-, -(CH₂)_n-(C=O)-(CH₂)_n-, -O-(C=O)-, -(C=O)-O-, -O-(C=O)-O-, -(CH₂)_n-(C=O)-O-, -O-(C=O)-(CH₂)_n, -(C=O)-O-(CH₂)_n-, -(CH₂)_n-O-(C=O)-, -(CH₂)_n-(C=O)-O-(CH₂)_n-, -(CH₂)_n-O-(C=O)-(CH₂)_n-, -NR^N-(C=O)-, -(C=O)-NR^N-, -NR^N-(C=O)-O-, -O-(C=O)-NR^N-, -NR^N-(C=O)-NR^N-, -(CH₂)_n-(C=O)-NR^N-, -NR^N-(C=O)-(CH₂)_n, -(C=O)-NR^N-(CH₂)_n-, -(CH₂)_n-NR^N-(C=O)-, -(CH₂)_n-(C=O)-NR^N-(CH₂)_n-, -(CH₂)_n-NR^N-(C=O)-(CH₂)_n-, -(C=O)-NR^N-(CH₂CH₂-O)_n-, -(CH₂CH₂-O)_n-(C=O)-NR^N-, -(CH₂)_n-(C=O)-NR^N-(CH₂CH₂-O)_n-, -(CH₂CH₂-O)_n-(C=O)-NR^N-(CH₂)_n-, 또는 2 내지 8원 사이클릭 탄화수소, 헤테로사이클, 아릴 또는 헤테로아릴 환으로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고, 여기서, "n"은 독립적으로 0 또는 1 내지 10의 정수이고;
"l", "p", "q" 및 "r"은 독립적으로 0 또는 1 내지 10의 정수이고;
Ω는 독립적으로 결합이거나 또는 임의로 4개 이하의 융합된 환을 포함하는, C₃ _-26 탄화수소 환 또는 융합된 환 시스템이고, 각각의 환은 3 내지 8개의 구성원을 갖고, 임의로 각각의 환 내에 O, S 및 N으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자를 포함하고;
여기서, R^* 및 R^N은 각각 독립적으로 H, 또는 할로겐, O, S 및 N으로부터 선택된 1 내지 6개의 헤테로원자로 임의로 치환된 C₁ _-12 탄화수소이고; 2개의 그룹 R^* 및/또는 R^N은 함께 3 내지 8원 환을 형성할 수 있는, 제1 항체 "A" 및 제2 항체 "B"로부터 이중-특이적 항체 "AB" 또는 "BA"의 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 사이클로첨가 반응이 구리 이온의 존재 하에 발생하는, 제1 항체 "A" 및 제2 항체 "B"로부터 이중-특이적 항체 "AB" 또는 "BA"의 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 사이클로첨가 반응이 중성 pH에서 발생하는, 제1 항체 "A" 및 제2 항체 "B"로부터 이중-특이적 항체 "AB" 또는 "BA"의 제조 방법.
제1항에 있어서, 중쇄 및 경쇄 사이의 디설파이드 결합의 적어도 90%가 힌지 영역 내 디설파이드 결합의 절단 후 실질적으로 온전한 상태로 남아있는, 제1 항체 "A" 및 제2 항체 "B"로부터 이중-특이적 항체 "AB" 또는 "BA"의 제조 방법.
제1항에 있어서, 항체 A 또는 항체 B가 IgG1 면역글로불린인, 제1 항체 "A" 및 제2 항체 "B"로부터 이중-특이적 항체 "AB" 또는 "BA"의 제조 방법.
제1항에 있어서, 항체 A 또는 항체 B가 IgG4 면역글로불린인, 제1 항체 "A" 및 제2 항체 "B"로부터 이중-특이적 항체 "AB" 또는 "BA"의 제조 방법.
IgG1, IgG2 또는 IgG4 부류 항체 또는 이의 Fab2 단편 "A" 및 IgG1, IgG2 또는 IgG4 부류 항체 또는 이의 단편 "B"로부터의 화학적으로-로킹된 이중특이적 항체 "AB" 또는 "BA"를 생성하는 방법으로서,
(a) CPPC, CPSC, SPPC 및 SPSC로 이루어진 그룹으로부터 선택된 힌지 잔기 서열(EU-인덱스 넘버링: 잔기 226 - 229)을 갖는 제1 항체 "A" 및 CPPC, CPSC, SPPC 및 SPSC로 이루어진 그룹으로부터 선택된 힌지 잔기 서열(EU-인덱스 넘버링: 잔기 226 - 229)을 갖는 항체 "B"를, 항체 A 및 항체 B의 힌지 영역 내 임의의 쇄간 또는 쇄내 다이설파이드 결합을 파괴시키는 환원 조건 하에 환원시켜 절반-항체(half-antibody) A 및 절반-항체-B를 형성하는 단계로서, 상기 항체 A는 제1 표적에 결합하고, 상기 항체 B는 제2 표적에 결합하는, 절반-항체 A 및 절반-항체-B를 형성하는 단계;
(b) 상기 절반-항체 A의 항체 힌지 코어 서열의 Cys 잔기 226 또는/및 229(EU-인덱스 넘버링: 잔기 226 또는/및 229) 하나 또는 둘 모두에 제1 화합물을 연결하여 연결된 절반-항체 A를 형성하는 단계로서, 상기 제1 화합물은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 구조:

(여기서, N₃은 -N=N=N이다)
를 갖는, 연결된 절반-항체 A를 형성하는 단계;
(c) 힌지 잔기 서열(잔기 226-229) CPPC 또는 CPSC 또는 SPPC 또는 SPSC를 갖는 항체 B의 힌지 코어 서열의 Cys 잔기 226 및 229 중 하나 또는 둘 모두에 제2 화합물을 연결하여 연결된 항체 B를 형성하는 단계로서, 상기 제2 화합물은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 구조:

를 갖는, 연결된 항체 B를 형성하는 단계; 및
(d) 대략 동등한 몰량의 연결된 항체 A를 연결된 항체 B와 중성 조건 하에 항온배양하여 화학적으로-로킹된 이중특이적 항체 AB를 형성하는 단계를 포함하는, 방법.
제18항에 있어서, 절반-항체 A를 형성하는 상기 항체 A, 및 절반-항체 B를 형성하는 상기 항체 B의 환원이 환원제에서 수행되며, 상기 환원제는 L-시스테인, 디티오트레이톨, 베타-머캅토 에탄올, 시스테아민, TCEP(트리스(2-카복시에틸)포스핀), 2-MEA(2-머캅토에틸아민) 및 이들의 배합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 화학적으로-로킹된 이중특이적 항체를 생성하는 방법.
제18항에 있어서, 2개의 Cys 잔기(EU-인덱스 넘버링: 잔기 226 또는/및 229)를 갖는 상기 항체 A의 힌지 영역이 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 구조를 갖는 모이어티 A와 연결되는, 화학적으로-로킹된 이중특이적 항체를 생성하는 방법.

(여기서, N₃은 -N=N=N이다)
제18항에 있어서, 1개 또는 2개의 Cys 잔기(EU-인덱스 넘버링: 잔기 226 또는/및 229)를 갖는 상기 항체 B의 힌지 영역이 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 구조를 갖는 모이어티 B:

와 연결되어 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 구조를 갖는 연결된 절반-항체 A:

(여기서, N₃은 -N=N=N이다); 및
하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 구조를 갖는 연결된 항체 B:

를 형성하는, 화학적으로-로킹된 이중특이적 항체를 생성하는 방법.
하기 구조에 연결된, 연결된 절반-항체 A:

(여기서, N₃은 -N=N=N이다)
를 포함하고;
하기 구조에 연결된, 연결된 항체 B:

에 연결된, 화학적으로-로킹된 이중특이적 항체 AB.
하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 구조에 연결된 절반-항체 A:

(여기서, N₃은 -N=N=N이다)
를 포함하고;
하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 구조에 연결된 절반-항체 B:

에 연결되는, IgG 부류 항체 "A" 및 IgG 부류 항체 "B"로부터의 화학적으로-로킹된 이중특이적 항체 "AB" 또는 "BA".
(a) 항체 A로부터의 단일 중쇄 및 경쇄를 포함하는 제1 항체 단편 A'로서, 상기 단일 중쇄는 하나 이상의 반응성 티올 그룹을 갖는, 상기 제1 항체 단편 A';
(b) 항체 B로부터의 단일 중쇄 및 경쇄를 포함하는 제2 항체 단편 B'로서, 상기 단일 중쇄는 하나 이상의 반응성 티올 그룹을 갖는, 상기 제2 항체 단편 B'
를 포함하는 이중-특이적 항체로서,
상기 제1 및 제2 항체 단편은 상기 제1 항체 단편 상의 반응성 티올에 링커를 통해 부착된 아지드, 및 상기 제2 항체 단편 상의 반응성 티올에 링커를 통해 부착된 알킨의 사이클로첨가 반응에 의해 형성된 1,2,3-트리아졸을 통해 공유 연결된, 이중-특이적 항체.
제24항에 있어서, 상기 단편 A' 및 B'가 IgG1 또는 IgG4 면역글로불린으로부터 유도되는, 이중-특이적 항체.
아지드와 함께 사이클로첨가 반응을 진행할 수 있는 -C≡C- 결합을 갖는 C₈ 환을 포함하는 링커에 공유 결합된 항체 단편.