CN106645475B - 原料药蜂蜡gc标准指纹图谱及其构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了原料药蜂蜡GC标准指纹图谱及其构建方法，属于化学分析和蜂蜡质量检测技术领域。该构建方法包括供试品溶液的制备，采用HP‑5色谱柱，氮气为载气，流速为5mL/min，检测器为氢火焰检测器，检测器温度为310℃，进样口温度为330℃，分流比为20：1，氢气流速为40mL/min，空气流速为30mL/min，进样量为1μL，柱箱升温方式为280℃维持15min，以气相色谱法进行测定蜂蜡的指纹图谱，以至少10批指纹图谱的共有特征峰作为标准指纹图谱的特征峰，标准指纹图谱共有11个特征峰，图谱经过计算机辅助相似度评价软件进行相似度评价。本发明方法及标准指纹图谱能全面、准确评价蜂蜡原料药的质量，有利于保证蜂蜡原料的质量及临床疗效。

Description

原料药蜂蜡GC标准指纹图谱及其构建方法
技术领域
本发明涉及一种蜂蜡药物的检测方法，特别涉及一种蜂蜡GC标准指纹图谱的构建方法，以及由此法得到的蜂蜡GC标准指纹图谱。
背景技术
中药指纹图谱是指中药原料药材、饮片、成品、半成品等经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其特征共有峰的图谱。中药指纹图谱能客观地揭示和反映中药内在质量的整体性和特征性,用以评价中药的真实性、有效性、稳定性和一致性。中药的临床疗效并非由单一活性成分的作用或多种活性成分作用的简单相加,用已知某一个或几个活性成分或有效成分为质量指标,通过定性和定量分析来判断药品质量的优劣,显然是不全面的。中药质量的评价需要综合的、宏观的、非线性的质量评价体系,中药指纹图谱就是能较好地适应这一特点的一种质量评价与控制模式。天然药和草药,都把指纹图谱作为质量控制标准的内容之一。欧共体对草药质量的指南中也称,单靠测定某有效成分考察质量的稳定性是不够的,因为草药及其制剂是以整体为活性物质。世界卫生组织(WHO)在1996年草药评价指导原则中规定:如果草药的活性成分不明,可以提供特征色谱图谱,以证明产品质量的一致。因此指纹图谱是中药现代化和国际化的关键技术之一。
蜂蜡为蜜蜂科昆虫中华蜂蜜或意大利蜂分泌的蜡质。其主要成分有酯类、游离的烷醇类、烷酸类、维生素、芳香类物质等。蜂蜡具有多种药理作用，比如降血脂、抑菌、治疗胃溃疡等药理作用，因此蜂蜡在医药行业具有广泛的应用。
2010版《中国药典》仅有性状鉴别的描述，理化鉴别、检查项、含量测定等项均为空白，上述标准不能有效的监控蜂蜡的质量优劣。
发明内容
为了解决上述问题，本发明建立了一种合理、准确评价蜂蜡整体性质量的标准指纹图谱，以及该指纹图谱的构建方法。
本发明的目的在于提供一种原料药蜂蜡GC标准指纹图谱的构建方法。
本发明的另一目的在于提供原料药蜂蜡GC标准指纹图谱。
本发明所采用的技术方案是：
一种原料药蜂蜡GC标准指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：
1)从全国各不同地区收集不同批次的蜂蜡10批，进行编号。
2)对蜂蜡进行预处理，清理其中的杂质。方法是水浴加热至80℃然后冷凝，取上层固体蜂蜡使用。
3)制备蜂蜡供试品溶液：精密称取蜂蜡50mg置于50ml容量瓶中，加入三氯甲烷，超声使其完全溶解，定容，使得蜂蜡溶液的浓度为1mg/ml左右。
4)空白溶液的制备：取少量三氯甲烷溶液置于气相色谱进样瓶中，作为空白溶液和色谱峰相对保留时间的对照。
5)蜂蜡的GC指纹图谱的建立：分别取供试品溶液和空白溶液，进样，用安捷伦气相色谱仪进行测定，色谱柱HP-5用(5％-苯基)-甲基聚硅氧烷为填充剂，氮气为载气流速为5mL/min，检测器为氢火焰检测器，检测器温度为310℃，进样口温度为330℃，分流比为20：1，氢气流速为40mL/min，空气流速为30mL/min，进样量为1μL，柱箱升温方式为280℃维持15min。记录供试品的保留时间和峰面积，即得蜂蜡的GC指纹图谱。
本发明的步骤1)所述的收集蜂蜡的不同产地，从1-10进行编号。
以上本发明的该指纹图谱中有11个共有特征峰，从左到右编号为1-11，记录11个共有峰的保留时间，编号为1至11号的特征峰的保留时间依次分别为2.105-2.117min，2.490-2.514min，2.759-2.790min，3.102-3.112min，3.512-3.564min，4.028-4.091min，4.664-4.742min，5.304-5.396min，5.441-5.536min，6.387-6.483min，7.279-7.414min。
气相色谱仪测定至少10批蜂蜡供试品溶液的指纹图谱，并进行分析比较，并采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版进行相似度分析，相似度评价见下表1，各批次供试品相似度与第一批相比均大于0.8。
表1
Figure BDA0001186729730000021
本发明的有益效果是：
1)本发明建立了原料药蜂蜡GC标准指纹图谱，代表着蜂蜡中的部分化学成分，能有效的表征蜂蜡原料药的质量，从而实现对蜂蜡中含量较多的化学成分的检测，有利于其质量的全面监控。
2)本发明建立原料药蜂蜡GC标准指纹图谱作为一个整体，注重各个构成指纹特征峰的前后顺序，注重整体面貌特征，避免了因只测定一、二个化学成分而判定蜂蜡整体质量的片面性。本发明为更全面、准确评价蜂蜡的质量提供了新的对照标准，能更好保证蜂蜡的质量及其临床疗效。
3)本发明具有方法简单、稳定性好、精密度高的特点，使用于蜂蜡原料药的整体质量控制。
4)本发明建立的指纹图谱中共有峰分离度良好，特征明显，具有较好的专属性。
附图说明
图1是蜂蜡的GC参照指纹图谱；
图2是1-8号产地蜂蜡相似度结果评价示意图；
图3是9-10号产地蜂蜡相似度结果评价示意图。
具体实施方式
下面结果实施例对本发明做进一步的详述，但并不局限于此。
实施例1：
由1-10批蜂蜡的产地分别为兰州、郑州、庆阳、威海、成都、烟台、哈尔滨、大连、广元、济南10个地方。
1.仪器与试剂
仪器：岛津GC-2014C气相色谱仪，日本岛津公司；BS224S电子分析天平，感量0.0001g，德国Sartorius公司；中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版，国家药典委员会。
试剂：三氯甲烷，分析纯，500mL/瓶，批号：20131201，广州化学试剂厂。
2.气相测定的色谱条件：
色谱柱为HP-5，规格为30m*0.25mm*0.1um(安捷伦公司产品)，色谱柱填料为(5％-苯基)-甲基聚硅氧烷，检测器为氢火焰检测器，检测器温度为310℃，进样口温度为330℃，载气为N2，载气流速为5mL/min，氢气流速为40ml/min，空气流速为30ml/min，进样量:1μL(设置进样前清洗进样针5次和进样后清洗进样针10次)，分流比为20：1，柱箱升温方式：280℃维持15min。
3.蜂蜡GC指纹图谱的建立：
1)供试品溶液制备
分别精密称取蜂蜡50mg置于50ml容量瓶中，加入三氯甲烷，超声使其完全溶解，定容，使得蜂蜡溶液的浓度为1mg/ml左右。
2)蜂蜡指纹图谱的建立
分别精密吸取适量供试品溶液置于进样瓶中，进行气相测定，得到色谱图。比较供试品的指纹图谱，挑选11个特征共有峰，记录共有峰的保留时间和峰面积，如图2、3所示。
3)稳定性检测
为进一步确定该检测方法有效，取同一批蜂蜡供试品溶液，分别在0h、4h、8h、12h、16h、20h几个时间点进样，记录11个共有峰的保留时间和峰面积，计算其RSD，如图一所示。
稳定性实验结果11个共有峰的保留时间和峰面积的RSD均小于1％，供试品稳定性良好。
4)重复性检测。
取同批次蜂蜡的供试品溶液，连续进样6次，检测所得指纹图谱，考察11个共有色谱峰的相对保留时间和峰面积的一致性，由RSD大小进行判定。
重复性实验结果表明蜂蜡11个共有峰的相对保留时间及峰面积的RSD均在1％以内，实验重复性符合要求。
为本领域的专业技术人员容易理解,以上所述仅为本发明专利的较佳实施例,并不用以限制本发明,凡本发明的精神和原则之内所作的任何修改。等同替换和改进等,均落在本发明要求的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种蜂蜡GC标准指纹图谱的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
①蜂蜡的收集
A)由于环境和地形的不同，全国各地的蜂蜡质量参差不齐，形态差异较大，统一从兰州、郑州、庆阳、威海、成都、烟台、哈尔滨、大连、广元、济南十个地区收集蜂农挑选过的蜂蜡10批，进行编号，
②溶液制备
B)对蜂蜡进行预处理，清理其中的杂质，方法是将蜂蜡加热至80℃以上，趁蜂蜡熔融状态进行处理，然后等其冷凝取上层固体备用，
③供试液制备
C)制备蜂蜡供试品溶液：精密称取蜂蜡50mg置于50ml容量瓶中，加入三氯甲烷，超声并水浴80℃加热5-10min使其完全溶解，定容，使得蜂蜡溶液的浓度为1mg/ml左右，
④蜂蜡GC指纹图谱建立
用岛津气相色谱仪进行测定，色谱柱HP-5用5％-苯基-甲基聚硅氧烷为填充剂，氮气为载气流速为5mL/min，检测器为氢火焰检测器，检测器温度为310℃，进样口温度为330℃，分流比为20：1，氢气流速为40mL/min，空气流速为30mL/min，进样量为1μL，柱箱升温方式为280℃维持15min，
⑤蜂蜡GC标准指纹图谱的确定
研究所有结果图谱，该指纹图谱中有11个共有特征峰，图谱总长度为15min，共有峰从左到右编号为1-11，记录11个共有峰的保留时间，编号为1至11号的特征峰的保留时间依次分别为2.105-2.117min，2.490-2.514min，2.759-2.790min，3.102-3.112min，3.512-3.564min，4.028-4.091min，4.664-4.742min，5.304-5.396min，5.441-5.536min，6.387-6.483min，7.279-7.414min；11个特征峰为蜂蜡GC标准指纹图谱。
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