CN106632711A - 一种亚微米级银杏外种皮多糖及其制剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种亚微米级银杏外种皮多糖及其制剂的制备方法。将被乙醇浸泡过的银杏外种皮置于煮提锅中常规加水煎煮,过滤,减压浓缩,向浓缩液中加入乙醇,静置沉淀,将沉淀物真空干燥或冷冻干燥,得银杏外种皮多糖粗粉;将该粗粉加入气流粉碎机,调节分级机频率和进料速度,在适当压力下粉碎数次,即可得到亚微米级银杏外种皮多糖。将该多糖加入赋型剂或矫味剂和防腐剂制成抗肿瘤胶囊制剂或抗肿瘤口服液制剂。该方法得到的银杏外种皮多糖粒径达到亚微米级,水溶性好,效价强度高,可以制备成抗肿瘤固体和液体制剂。
Description
技术领域
本发明涉及一种亚微米级银杏外种皮多糖及其制剂的制备方法,属于中药制药领域。
背景技术
银杏外种皮,俗称白果衣,我们在对银杏外种皮进行综合研究的过程中首先提取分离得到了银杏外种皮多糖(Ginkgo biloba exocarp polysaccharide,GBEP),并发现其对多种肿瘤细胞具有直接抑制作用,而且还具有免疫促进等药理学活性,其胶囊制剂曾作为医院制剂在临床应用于肿瘤患者多年。但用传统工艺(ZL00134363.7)制备的GBEP由于水溶性问题而限制了液体剂型的选择,例如不宜制备口服液;在制备过程中于乙醇沉淀前对浓缩液采用盐溶液处理可以去除一些难溶性物质,增加提取物水溶液的澄明度,但后续要进行透析处理(ZL201010251068.9),因而显著延长了制备时间,也增加了经济成本。如何改进工艺、减少工序进而达到提高GBEP溶解性的目的,一直是本领域技术人员努力解决的技术难题。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足,提供一种亚微米级银杏外种皮多糖及其制剂的制备方法。
本发明的第一个目的是通过以下技术方案实现的,亚微米级银杏外种皮多糖的制备方法,包括以下步骤:
(1)将被乙醇浸泡过的银杏外种皮置于煮提锅中常规加水煎煮 2 - 3 次并分别过滤,将滤液合并减压浓缩至比重在 1.21 – 1.30,将乙醇缓慢加入浓缩液中,使乙醇终浓度在60 - 80%(V/V),边加边快速搅动,静置后将沉淀物再用高浓度乙醇洗涤数次后真空干燥或冷冻干燥,得银杏外种皮多糖粗粉;
(2)开启气流粉碎机,调节分级机频率为25-50Hz,启动引风机,待风机运转平衡后,打开空气压缩机,压缩空气冷却、除水除油后送至贮气罐,待贮气罐中空气压力达0.4MPa时,将银杏外种皮多糖粗粉以1.0-3.0kg/h的速度进料,进料结束后在进气压力为0.7MPa下粉碎5-30min,重复2-5次,即可得到亚微米级银杏外种皮多糖。
本发明的第二个目的是通过以下技术方案实现的,亚微米级银杏外种皮多糖制剂的制备方法,其特征是将上述方法制备的亚微米级银杏外种皮多糖加入少量赋型剂或矫味剂和防腐剂制成抗肿瘤胶囊制剂或抗肿瘤口服液制剂。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明提取、分离的工序少,采用气流粉碎机对银杏外种皮多糖粗粉进行粉碎,由于气流超细粉碎的压缩气体是在绝热膨胀下进行,在低温或室温状态下皆可进行粉碎,速度快,瞬间即可完成,一般不改变粉体的活性成分。经过粉碎后的银杏外种皮多糖粒径达到亚微米级,药理活性增强,效价强度提高,且其水溶液稳定,除了可制成固体剂型,还可直接制成液体剂型。该方法操作简单,适合工业化大生产。
1、粒径测定
精密称取粉碎前和粉碎后的GBEP各2.5mg,分别溶于蒸馏水,定容至50 ml,得到浓度为50 μg/mL的GBEP水溶液。取该水溶液置于具塞试管中,超声20min后,采用马尔文激光粒度仪,测定粒径。结果显示,粉碎前的银杏外种皮多糖粗粉的粒径为1.5-2.0μm,而采用该方法制得的银杏外种皮多糖粒径达到亚微米级,为200-300nm。
2、水溶性测定
粉碎前的GBEP在1.5%(W/V)浓度下肉眼观察完全溶解于水,而粉碎后的GBEP在2.0%(W/V)浓度下肉眼观察完全溶解于水,提示水溶性提高。
3、ζ电位测定
精密称取粉碎前和粉碎后的GBEP各2.5mg,分别溶于蒸馏水,定容至50 ml,得到浓度为50 μg/mL的GBEP水溶液。取50μg/mL的GBEP水溶液置于具塞试管中,超声20min后,采用马尔文激光粒度仪,测定ζ电位。结果显示,粉碎前的银杏外种皮多糖ζ电位为(-14)-(-11) mV,而采用该方法制得的银杏外种皮多糖ζ电位为(-26)-(-24) mV,提示粉碎后的银杏外种皮多糖水溶液更稳定。
4、肽多糖含量的测定
采用苯酚硫酸法测多糖含量:精密称取无水葡萄糖标准品适量,用蒸馏水配成1mg/ml的葡萄糖标准液,再进一步稀释为不同浓度。精密量取浓度为30μg/ml、60μg/ml、90μg/ml、120μg/ml、150μg/ml、180μg/ml的葡萄糖标准溶液0.5ml于6支10ml具塞试管中,加入50mg/ml的重蒸酚溶液1ml,混合均匀后,加入5ml浓硫酸,混合均匀,沸水浴15min,冷水浴30min。用紫外分光光度计于490nm处测定吸光度,对葡萄糖溶液浓度和吸光度进行线性回归,建立回归方程。取供试品溶液0.5ml,按上述操作测吸光度值,代入回归方程,计算出多糖含量。
采用考马斯亮蓝法测蛋白质含量:精密称取牛血清白蛋白标准品适量,用蒸馏水配成100μg/ml的蛋白标准溶液,再进一步稀释为不同浓度。精密量取浓度为20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml蛋白标准溶液0.5ml分别于5支10ml具塞试管,再加入2.5ml考马斯亮蓝G-250溶液,摇匀后,放置5~10min,待其充分反应后,用紫外分光光度计于595nm处测定吸光度,对牛血清白蛋白溶液浓度和吸光度进行线性回归,建立回归方程。取供试品溶液0.5ml,按上述操作测吸光度值,代入回归方程,计算出蛋白质含量。
采用红外光谱分析仪进行定性分析。结果显示银杏外种皮多糖含酰胺键,提示为肽多糖。肽多糖含量%=(多糖含量+蛋白质含量)%。
粉碎前的银杏外种皮多糖其多糖含量为36%、蛋白质含量为28%,所以肽多糖含量为36%+28%=64%。采用该方法制得的亚微米级银杏外种皮多糖其多糖含量为38%、蛋白质含量为27%,所以肽多糖含量为38%+27%=65%,提示粉碎前后银杏外种皮多糖抗肿瘤有效部位含量基本保持不变。
5、药效研究
取处于对数生长期的B16细胞,用胰蛋白酶消化、Hank’s液洗涤后,用含10%小牛血清RPMI1640培养液调整细胞至1×105/ml。向96孔培养板各孔中分别加入上述细胞悬液100μl,在5%CO2、37℃饱和湿度的培养箱中培养24h后,加入用含10%小牛血清RPMI1640培养液配制的不同浓度的样品各100μl,每个浓度设6个复孔,培养48h。培养结束前4h加入MTT(终浓度5mg/ml),继续培养4h后弃去培养液,加入酸化异丙醇,振荡10min,用酶标仪于570nm处测定各孔的OD值。按公式“抑制率=(1-药物孔OD值/对照孔OD值)×100%”,计算体外对B16细胞增殖的抑制率。结果见表1。
表1 银杏外种皮多糖对B16黑色素瘤细胞的抑制作用
表1结果显示,银杏外种皮多糖在10-320μg/ml剂量下对黑色素瘤细胞具有直接抑制作用,随着剂量增加,其抑制作用也逐渐增强。而且,粉碎后的银杏外种皮多糖的半数抑制浓度IC50(μg/ml)显著低于粉碎前的,说明效价强度更高。
具体实施方式
实施例1
取被乙醇浸泡过的干银杏外种皮50千克,置于煮提锅中加水1000千克煎煮,当煎煮液达95℃时维持煎煮1小时,过滤后继续加水重复上述煎煮方法1 次并过滤,将2次的滤液合并,于70℃减压浓缩至比重为1.21,将95%的乙醇缓慢加入浓缩液中,使乙醇终浓度为60%,边加边快速搅动,静置6小时后将沉淀物离心甩干,再用高浓度乙醇(体积浓度98%以上)洗涤2次后真空干燥或冷冻干燥,得到银杏外种皮多糖粗粉。开启气流粉碎机,将分级机频率设为40Hz,启动引风机和空气压缩机,待贮气罐中空气压力达0.4MPa时,取银杏外种皮多糖粗粉800g,以1.0kg/h的速度进料。加料结束后在进气压力为0.7MPa下粉碎5min,重复3次。制得的亚微米级银杏外种皮多糖粒径为235.0nm,在2.0%(W/V)浓度下肉眼观察完全溶解于水,ζ电位为-25.9mV。采用苯酚硫酸法及考马斯亮蓝法分别检测其多糖及蛋白质含量,结果分别为38%及27%,肽多糖总含量为65%。采用MTT法体外检测对B16细胞增殖的影响,接种细胞24h后加入不同浓度的亚微米级银杏外种皮多糖,继续培养48h检测。结果显示,亚微米级银杏外种皮多糖终浓度在320μg/ml,160μg/ml,80μg/ml,40μg/ml,20μg/ml,10μg/ml下可直接抑制B16黑色素瘤细胞生长,且随着剂量增加,其抑制作用逐渐增强,抑制率(%)分别76,69,55,47,33及21,半数抑制浓度IC50(μg/ml)为103.9。取亚微米级银杏外种皮多糖干粉100g,加入赋型剂50g,拌匀,按每粒150mg装入空心胶囊,制成亚微米级银杏外种皮多糖胶囊制剂。
实施例2
取被乙醇浸泡过的干银杏外种皮100千克,置于煮提锅中加水1500千克煎煮,当煎煮液达98℃时维持煎煮0.5小时,过滤后继续加水重复上述煎煮方法2 次并过滤,将3次的滤液合并,于70℃减压浓缩至比重为1.30,将95%的乙醇缓慢加入浓缩液中,使乙醇终浓度在70%,边加边快速搅动,静置10小时后 将沉淀物离心甩干,再用高浓度乙醇洗涤3次后真空干燥或冷冻干燥,得到银杏外种皮多糖粗粉。开启气流粉碎机,将分级机频率设为50Hz,启动引风机和空气压缩机,待贮气罐中空气压力达0.4MPa时,取银杏外种皮多糖粗粉1500g,以3.0kg/h的速度进料。加料结束后在进气压力为0.7MPa下粉碎20min,重复5次。制得的亚微米级银杏外种皮多糖粒径为261.5nm,在2.0%(W/V)浓度下肉眼观察完全溶解于水,ζ电位为-24.4mV。采用苯酚硫酸法及考马斯亮蓝法分别检测其多糖及蛋白质含量,结果分别为36%及25%,肽多糖总含量为61%。采用MTT法体外检测对B16细胞增殖的影响,接种细胞24h后加入不同浓度的亚微米级银杏外种皮多糖,继续培养48h检测。结果显示,亚微米级银杏外种皮多糖终浓度在320μg/ml,160μg/ml,80μg/ml,40μg/ml,20μg/ml,10μg/ml下可直接抑制B16黑色素瘤细胞生长,且随着剂量增加,其抑制作用逐渐增强,抑制率(%)分别为73,68,54,46,32及20,半数抑制浓度IC50(μg/ml)为112.8。取亚微米级银杏外种皮多糖干粉100g溶解于纯净水中,按药物质量要求加入适量矫味剂及防腐剂,摇匀,按10ml规格装瓶,制成亚微米级银杏外种皮多糖口服液制剂。
实施例3
取被乙醇浸泡过的干银杏外种皮80千克,置于煮提锅中加水1500千克煎煮,当煎煮液达99℃时维持煎煮0.5-1小时,过滤后继续加水重复上述煎煮方法2-3 次并过滤,将数次的滤液合并,于70℃减压浓缩至比重为1.25,将90%的乙醇缓慢加入浓缩液中,使乙醇终浓度在80%,边加边快速搅动,静置8小时后将沉淀物离心甩干,再用高浓度乙醇洗涤2次后真空干燥或冷冻干燥,得到银杏外种皮多糖粗粉。开启气流粉碎机,将分级机频率设为25Hz,启动引风机和空气压缩机,待贮气罐中空气压力达0.4MPa时,取银杏外种皮多糖粗粉500g,以2.0kg/h的速度进料。加料结束后在进气压力为0.7MPa下粉碎30min,重复2次。制得的亚微米级银杏外种皮多糖粒径为249.5nm,在2.0%(W/V)浓度下肉眼观察完全溶解于水,ζ电位为-25.4mV。采用苯酚硫酸法及考马斯亮蓝法分别检测其多糖及蛋白质含量,结果分别为36%及27%,肽多糖总含量为63%。采用MTT法体外检测对B16细胞增殖的影响,接种细胞24h后加入不同浓度的亚微米级银杏外种皮多糖,继续培养48h检测。结果显示,亚微米级银杏外种皮多糖终浓度在320μg/ml,160μg/ml,80μg/ml,40μg/ml,20μg/ml,10μg/ml下可直接抑制B16黑色素瘤细胞生长,且随着剂量增加,其抑制作用逐渐增强,抑制率(%)分别为75,69,54,47,32及21,半数抑制浓度IC50(μg/ml)为107.2。取亚微米级银杏外种皮多糖干粉200g溶解于纯净水中,按药物质量要求加入适量矫味剂及防腐剂,摇匀,按5ml规格装瓶,制成亚微米级银杏外种皮多糖口服液制剂。
Claims (6)
1.一种亚微米级银杏外种皮多糖的制备方法,其特征是,所述制备方法包括以下步骤:
(1)将被乙醇浸泡过的银杏外种皮置于煮提锅中常规加水煎煮 2 - 3 次并分别过滤,将滤液合并减压浓缩,得到浓缩液,将乙醇缓慢加入浓缩液中,使乙醇终浓度在60- 80%(V/V),边加边快速搅动,静置后将沉淀物再用高浓度乙醇洗涤数次后真空干燥或冷冻干燥,得银杏外种皮多糖粗粉;
(2)开启气流粉碎机,调节分级机频率,启动引风机,待引风机运转平衡后,打开空气压缩机,压缩空气冷却、除水除油后送至贮气罐,待贮气罐中空气压力达0.4MPa时,将银杏外种皮多糖粗粉进料,进料结束后在进气压力为0.7MPa下粉碎,重复2-5次,即可得到亚微米级银杏外种皮多糖。
2.根据权利要求1所述的亚微米级银杏外种皮多糖的制备方法,其特征是步骤(1)中所述浓缩液的比重为1.21-1.30。
3.根据权利要求1所述的亚微米级银杏外种皮多糖的制备方法,其特征是步骤(2)中所述调节分级机频率至25-50Hz。
4.根据权利要求1所述的亚微米级银杏外种皮多糖的制备方法,其特征是步骤(2)中所述进料速度为1.0-3.0kg/h。
5.根据权利要求1所述的亚微米级银杏外种皮多糖的制备方法,其特征是步骤(2)中所述粉碎时间为5-30min。
6.一种亚微米级银杏外种皮多糖制剂的制备方法,其特征是,将权利要求1-5制备的亚微米级银杏外种皮多糖加入少量赋型剂或矫味剂和防腐剂制成抗肿瘤胶囊制剂或抗肿瘤口服液制剂。
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---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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