CN109053924A - 一种青钱柳提取物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明为一种青钱柳提取物及其应用，首先提取、精制青钱柳提取物，吡啶经无水硫酸钠处理后于冰水浴中充分加入适量氯化酸，获得试剂A，然后再用试剂A。试剂A加入青钱柳‑无水甲酰溶液(A:青钱柳多糖，1:10，mL/mg)，在60℃夏反应120min，所得处理后的青钱柳提取物的自由基清除活性最强，同时选用小鼠巨噬细胞RAW 264.7建立体外损伤模型，可知修饰可以显著提高多糖的细胞损伤保护作用。

Description

一种青钱柳提取物及其应用
技术领域
本发明涉及一种青钱柳提取物及其应用，涉及青钱柳提取物的修饰方法，属于中药多糖的结构改造技术领域。
背景技术
青钱柳(Cyclocarya paliurus(Batal.)Iljinskaja)又名摇钱树、青钱李等，系胡桃科青钱柳属植物，是我国境内特有的单种属植物。目前人们已经对青钱柳中提取物的提取纯化、结构表征、生物活性等做出较全面的研究。提取精制，修饰后的青钱柳提取物具有良好的生物活性，尤其是在抗氧化、抗肿瘤方面表现优异。就目前研究进展来看，对青钱柳表面进行修饰是结构研究中较为深入的领域。
根据文献和本研究室的前期工作证明，修饰能够显著提高多糖的生物活性、尤其是抗氧化活性，本发明首次对青钱柳提取物进行修饰，建立了青钱柳提取物的修饰方法，基于产物的抗氧化活性优化了修饰条件，发现通过修饰能显著提高青钱柳提取物的自由基清除活性的细胞损伤的保护作用。
发明内容
本发明针对中药多糖生物活性低的问题，提供一种提高青钱柳提取物抗氧化活性的修饰方法，达到显著提高青钱柳提取物的自由基清除活性和细胞损伤抑制作用的目的。
所述提取物提取方法由以下以下步骤组成：
(1)青钱柳提取物的提取与精制；
(2)青钱柳提取物的修饰；
所述青钱柳提取物的提取与精制包括以下步骤：
A:青钱柳提取物的提取：用热水浸提法提取青钱柳提取物，称取800g干燥的青钱柳叶片粉末，按照1:10配比加入8000mL95％乙醇，浸泡过夜，除去脂质、单糖、色素小分子物质，过滤，挥干乙醇，收集残渣，在料液比1:8的条件下，将青钱柳置于80℃水浴浸提120min，浸提后过滤，收集滤液，滤渣继续水浴浸提，反复对滤渣进行2次浸提后合并所有滤液，置于旋转蒸发仪中真空浓缩后保存；
B:青钱柳提取物的精制：按照体积比正丁醇：三氯甲烷＝1:5的比例配置Sevag试剂，加入浓缩液体积1/5的Sevag试剂，震荡10min，再将混合液放入离心机中离心10min，直至无蛋白沉淀，合并上清液，真空旋蒸除去有机溶剂，然后将其转入截留分子量为8000-14000U透析袋中，依次使用自来水透析48h，蒸馏水透析24h，超纯水透析24h，透析后，使用80％乙醇反复醇沉4次，挥干乙醇，冷冻干燥即得精制的青钱柳提取物；
所述青钱柳提取物修饰的步骤为：10mL吡啶经无水硫酸钠处理后，加入三颈烧瓶中置于冰水浴中充分搅拌5min，使用胶头滴管逐滴加入2mL氯化酸，并保持冰水浴不断搅拌，在60min内加完，反应完成后，移出冰水浴，恢复室温后继续搅拌50min，得试剂A，备用上述提取的冷冻干燥的青钱柳提取物100mg，充分分散于100mL无水甲酰胺中，倒入三颈烧瓶中置于冰水浴中振荡，充分搅拌5min，混均后，缓慢搅拌的同时逐步加入试剂A10mL，加入完毕，混匀后，烧瓶放置可控制温度的保温套，设置反应温度60℃，反应为100min，反应完成后，恢复至室温，采用4moL/L氢氧化钠溶液调节pH至7.0，离心，收集上清，自来水透析1d，蒸馏水透析1d，超纯水透析1d，透析后旋蒸浓缩，加95％乙醇醇沉过夜，离心，收集沉淀，加水复溶，旋蒸浓缩，冻干即得青钱柳提取物粉末。
所制备的多糖应用为：对体外自由基清除活性有显著的提高效果，对由过氧化氢导致的细胞损伤具有良好的抑制作用，修饰能够显著提高青钱柳提取物的抗氧化活性，可以作为潜在的新型抗氧化剂。
本发明的有益效果
1、青钱柳提取物的修饰国内外未见报道，本发明提供了一种提高青钱柳提取物抗氧化活性的修饰方法及其优化的修饰条件，填补了国内外研究的空白。
2、青钱柳提取物的抗氧化活性未见报道，通过本发明的实施，证明通过修饰能够显著提高其抗氧化活性，极大地抑制过氧化氢具免疫细胞的损伤，并筛选出一种活性最好的修饰后青钱柳提取物，可以作为潜在的新型抗氧化剂。
附图说明
图1为修饰后青钱柳提取物的DPPH自由基清除活性。
图2为青钱柳提取物修饰后对过氧化氢损伤下巨噬细胞存活率的影响。
具体实施方式
实施例1
青钱柳提取物的提取与精制：采用热水浸提法提取青钱柳提取物，称取800g干燥的青钱柳叶片粉末，按照1:10(g/mL)加入8000mL95％乙醇，浸泡过夜，除去脂质、单糖、色素等小分子物质。过滤后，挥干乙醇，收集残渣，在料液比1:8(g/mL)的条件下，将青钱柳置于80℃水浴浸提120min。浸提后过滤，收集滤液，滤渣继续水浴浸提。反复对滤渣进行两次浸提后合并所有滤液，置于旋转蒸发仪中真空浓缩后保存备用。采用Sevag法进行脱蛋白，按照体积比正丁醇：三氯甲烷＝1:5(V:V，mL/mL)的比例配置Sevag试剂，以浓缩液体积的1/5加入Sevag试剂，并持续震荡10min使浓缩液与Sevag试剂充分接触，再将混合液放入离心机中离心10min，反复多次至无蛋白沉淀。合并上清液，真空旋蒸以除去有机溶剂，然后将其转入截留分子量8000-14000U透析袋中，依次使用自来水透析48h，蒸馏水透析24h，超纯水透析24h。透析后，使用80％乙醇反复醇沉4次，挥干乙醇后，冷冻干燥即得精制的青钱柳提取物，干燥保存备用。
实施例2
青钱柳提取物的修饰：采用氯磺酸吡啶法对青钱柳提取物进行修饰，将经过无水硫酸钠脱水后的吡啶置于三颈烧瓶中，冰水浴持续搅拌5min，待其冷却后，逐滴加入一定比例的氯磺酸，并不断搅拌。加完后，恢复至室温，搅拌30min，以使其反应完全，低温保存备用。
称取0.6g青钱柳提取物，溶于60mL无水甲酰胺中，加入三颈烧瓶，冰水浴搅拌。将已经制备好的酯化试剂逐滴加入，加完后，调节温度至60℃，反应2h，反应完成后，恢复至室温，使用4moL/L氢氧化钠溶液调节pH至7.0，离心，收集上清，自来水透析1d(若仍有吡啶味，继续透析)，蒸馏水透析1d，超纯水透析1d。透析后旋蒸浓缩，加95％乙醇醇沉过夜，离心，收集沉淀，加水复溶，旋蒸浓缩，冻干得硫酸化多糖粉末。依次标记为S-CP1，S-CP2和S-CP3。用苯酚-硫酸法测定多糖含量，考马斯亮蓝法测定蛋白质含量，氯化钡-明胶法测定硫酸根含量，按下式计算取代度(DS)：DS＝(1.62×S％)/(32-1.02×S％)。
表1不同酯化试剂比例下硫酸化青钱柳提取物理化性质差异
从表1可以看出，当其他条件一定时，增加氯磺酸与吡啶的比例，所制得的青钱柳提取物取代度逐渐升高，S-CP1的取代度最高，硫酸化多糖取代度越高，其总糖含量越低，蛋白质含量的变化趋势与糖含量趋势一致，青钱柳提取物的蛋白质含量随着取代度升高而降低。
实施例3
修饰后的青钱柳提取物的DPPH自由基清除活性比较：硫酸化青钱柳提取物待测液的配置：准确称取25mg修饰后的青钱柳提取物样品定容至25mL，配置成1mg/mL溶液，分别稀释至15.125、31.25、62.5、125、250、500μg/mL。以维生素C为对照，称取DPPH 4mg定容于100mL容量瓶中，DPPH浓度为1mmoL/L。
将实验分为样品组、对照组和空白组：2mL DPPH有机溶液加入10mL具塞试管中，再加入0.5mL样品溶液，然后再加入1.5mL水充分混匀，静置30min后在517nm处测定吸光度。
计算公式清除率＝[1-(A2-A1)/A0]×100％
A2：2mL DPPH溶液+0.5mL提取物样品溶液+0.5mL水的吸光度；
A1：2mL乙醇+0.5mL提取物样品溶液+0.5mL水的吸光度；
A0：2mL DPPH溶液+2mL水的吸光度。
表2修饰后的青钱柳提取物对DPPH有机自由基的清除能力
在一定的浓度范围内，修饰后的青钱柳提取物对DPPH的清除效率随硫酸化多糖浓度的升高而增强，呈非线性的量效关系。一般认为DPPH清除率在50％左右时，抗氧化剂的清除效率最高。比较四种修饰后的青钱柳提取物S-CP2可在62.5μg/mL处，达到50％左右的清除率，可得出氯磺酸-吡啶体积比1:8是一个较优的修饰条件。
实施例4
修饰后青钱柳提取物对过氧化氢诱导的细胞损伤的抑制作用：使用CCK-8法测定细胞增值活性。取对数期生长的细胞调节浓度至1×105加入到96孔板中，培养12h后，吸去培养基，分别加入25，50，100，200μg/mL多糖样品进行培养，补充培养液至200μL，使用1mmol/L的H2O2溶液刺激细胞4h后，吸去培养基，使用新鲜培养基清洗96孔板2次，之后加入100μL培养基和10μLCCK-8试剂，培养1h后测定其570nm下的吸光度值，具体见说明书附图2。
如说明书附图2所示，H2O2组细胞在过氧化氢的损伤下，存活率显著下降至58％。与H2O2组相比，添加有多糖的细胞组，其增值率明显升高。尤其是S-CP3组，其细胞存活率较接近于正常组，说明修饰可以显著提高巨噬细胞对H2O2损伤的抵抗作用。

Claims (2)

1.一种青钱柳提取物，其特征在于：所述提取物提取方法由以下以下步骤组成：
(1)青钱柳提取物的提取与精制；
(2)青钱柳提取物的修饰；
所述青钱柳提取物的提取与精制包括以下步骤：
A:青钱柳提取物的提取：用热水浸提法提取青钱柳提取物，称取800g干燥的青钱柳叶片粉末，按照1:10配比加入8000mL95％乙醇，浸泡过夜，除去脂质、单糖、色素小分子物质，过滤，挥干乙醇，收集残渣，在料液比1:8的条件下，将青钱柳置于80℃水浴浸提120min，浸提后过滤，收集滤液，滤渣继续水浴浸提，反复对滤渣进行2次浸提后合并所有滤液，置于旋转蒸发仪中真空浓缩后保存；
B:青钱柳提取物的精制：按照体积比正丁醇：三氯甲烷＝1:5的比例配置Sevag试剂，加入浓缩液体积1/5的Sevag试剂，震荡10min，再将混合液放入离心机中离心10min，直至无蛋白沉淀，合并上清液，真空旋蒸除去有机溶剂，然后将其转入截留分子量为8000-14000U透析袋中，依次使用自来水透析48h，蒸馏水透析24h，超纯水透析24h，透析后，使用80％乙醇反复醇沉4次，挥干乙醇，冷冻干燥即得精制的青钱柳提取物；
所述青钱柳提取物修饰的步骤为：10mL吡啶经无水硫酸钠处理后，加入三颈烧瓶中置于冰水浴中充分搅拌5min，使用胶头滴管逐滴加入2mL氯化酸，并保持冰水浴不断搅拌，在60min内加完，反应完成后，移出冰水浴，恢复室温后继续搅拌50min，得试剂A，备用上述提取的冷冻干燥的青钱柳提取物100mg，充分分散于100mL无水甲酰胺中，倒入三颈烧瓶中置于冰水浴中振荡，充分搅拌5min，混均后，缓慢搅拌的同时逐步加入试剂A10mL，加入完毕，混匀后，烧瓶放置可控制温度的保温套，设置反应温度60℃，反应为100min，反应完成后，恢复至室温，采用4moL/L氢氧化钠溶液调节pH至7.0，离心，收集上清，自来水透析1d，蒸馏水透析1d，超纯水透析1d，透析后旋蒸浓缩，加95％乙醇醇沉过夜，离心，收集沉淀，加水复溶，旋蒸浓缩，冻干即得青钱柳提取物粉末。
2.一种青钱柳提取物的应用，其特征在于：应用为：对体外自由基清除活性有显著的提高效果，对由过氧化氢导致的细胞损伤具有良好的抑制作用，修饰能够显著提高青钱柳提取物的抗氧化活性，可以作为潜在的新型抗氧化剂。
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