CN106577476B - 一种高同型半胱氨酸血症诱导肝脏纤维化模型的建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种小鼠肝脏纤维化模型的建立方法，属于医学肝脏疾病研究领域。本发明利用目前蛋氨酸口服给药建立高同型半胱氨酸血症来诱导建立小鼠肝脏纤维化模型，然后通过血中同型半胱氨酸测定，蛋白印记法测定和组织马松染色和免疫组化方法鉴定。本发明建立的小鼠肝脏纤维化模型操作简单，周期短，成功率高。该纤维化模型的建立为深入研究纤维化的发病机制，各种治疗药物的初步筛选等提供了一个可靠的动物模型。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种高同型半胱氨酸血症诱导肝脏纤维化模型的建立方法。
背景技术
Hcy是一种含硫氨基酸，是蛋氨酸代谢的中间产物，参与了蛋氨酸循环的关键环节。血液中的HCY升高到一定程度(通常>16uM)即形成高同型半胱氨酸血症。高同型半胱氨酸血症的临床表现是多种多样的，包括脂肪肝、肝纤维化。
肝纤维化是一个世界范围内的严重的疾病。它是由肝内结缔组织异常增生导致肝细胞损伤引起的。病理因素包括病毒性肝炎、酒精中毒、免疫性损伤，细胞外基质等。在肝硬化阶段，大量的细胞外基质(ECM)沉积引起的肝功能损害是不可逆的。肝纤维化的病理过程可以停止甚至可以部分逆转。
泛素水解酶22(USP22)是新发现的泛素水解酶家族成员，是一种组蛋白去泛素化酶，在核受体介导的基因转录调控中起增强转录活性的作用。目前报道的泛素水解酶22多与肿瘤的恶性程度、增殖、转移及预后等相关，但在肝纤维化中的表达情况尚不清楚。
发明内容
有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种高同型半胱氨酸血症诱导肝脏纤维化模型的建立方法。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种高同型半胱氨酸血症诱导肝脏纤维化模型的建立方法，包括以下步骤：
步骤1、制备体内高蛋氨酸饮食诱导高同型半胱氨酸血症模型：
步骤2、高同型半胱氨酸血症通过USP22诱导肝脏纤维化，建立高同型半胱氨酸血症诱导肝脏纤维化模型。
进一步地，步骤1中的制备体内高蛋氨酸饮食诱导高同型半胱氨酸血症模型具体为：
步骤1.1、选择20只6-8周龄的C57BL/6小鼠，随机分成2组，每组10只，一组为正常组，喂养正常的饲料，一组为造模组，喂养含质量百分含量为2％的高蛋氨酸饲料，2周后，处死小鼠，下腔静脉采血，收集小鼠的血液检测同型半胱氨酸的水平，收集小鼠肝脏组织进行马松染色评估肝脏纤维化的情况，蛋白印记法，免疫组化法检测胶原蛋白I的表达情况，如果马松染色结果看到造模组明显纤维化，免疫组化看到造模组中细胞胞外，胞质中胶原蛋白I表达明显，具有明显的统计学意义，则造模成功；
步骤1.2、确定体内HCY诱导肝星状细胞纤维化的最佳处理时间：正常培养的肝星状细胞，采用初定浓度为24μM同型半胱氨酸预处理，分别12h，24h，48h，72h后收集细胞，采用蛋白印记法，免疫荧光法检测胶原蛋白I的表达情况；
步骤1.3、确定处理浓度：正常培养的肝星状细胞，采用浓度为6-48μM同型半胱氨酸预处理，48小时后收集细胞，采用蛋白印记法，免疫荧光法检测胶原蛋白I的表达情况。
进一步地，步骤2中的高同型半胱氨酸血症通过USP22诱导肝脏纤维化，建立高同型半胱氨酸血症诱导肝脏纤维化模型具体为：
步骤2.1、体内：采用蛋白印记法，免疫组化法检测泛素水解酶22在正常小鼠和肝脏纤维化小鼠肝脏组织中的表达情况，模型组中尾静脉注射siRNA USP22预处理，下调泛素水解酶22在纤维化小鼠肝脏中的表达，收集肝脏组织进行HE，马松染色评估肝脏纤维化的情况，蛋白印迹，免疫组化检测泛素水解酶22、胶原蛋白I的表达情况；
步骤2.2、体外：采用蛋白印记法，免疫荧光法检测肝星状细胞中泛素水解酶22的表达情况，肝星状细胞模型组内转染si RNA，下调泛素水解酶22在肝星状细胞中的表达，收集肝星状细胞进行蛋白印迹，免疫荧光法检测泛素水解酶22，胶原蛋白I的表达情况。
与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
1)本发明检测USP22基因在高同型半胱氨酸血症诱导的肝脏纤维化中的表达水平，并在体内，体外合成siRNA沉默肝细胞中USP22基因的表达，研究对肝脏纤维化的影响。
2)本发明用高蛋氨酸饮食诱导小鼠高同型半胱氨酸血症。
3)本发明用高蛋氨酸饮食诱导肝脏纤维化模型。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明高蛋氨酸饮食诱导小鼠高同型半胱氨酸血症模型；
图2是本发明同型半胱氨酸诱导肝星状细胞纤维化的最佳作用时间；
图3是本发明同型半胱氨酸诱导肝星状细胞的最佳作用浓度；
图4是本发明体内同型半胱氨酸血症通过USP22诱导肝脏纤维化模型；
图5是本发明体外同型半胱氨酸通过USP22诱导肝星状细胞纤维化模型；
图6是本发明在步骤1.1处理后的肝脏细胞对比图；其中，a为未经处理的小鼠正常肝脏细胞的免疫组织化学染色图，b为经过2％的高蛋氨酸饲料饲养的小鼠肝脏细胞的免疫组织化学染色图。
具体实施方式
以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
本发明提供一种高同型半胱氨酸血症诱导肝脏纤维化模型的建立方法，包括以下步骤：
步骤1、制备体内高蛋氨酸饮食诱导高同型半胱氨酸血症模型：
步骤1.1、如图1所示，选择20只6-8周龄的C57BL/6小鼠，随机分成2组，每组10只，一组喂养正常的饲料(正常的小鼠肝脏组织)，一组喂养含质量百分含量为2％的高蛋氨酸饲料(含足够B族维生素)(造模组)，2周后，处死小鼠，下腔静脉采血，收集小鼠的血液检测同型半胱氨酸的水平，收集小鼠肝脏组织进行马松染色评估肝脏纤维化的情况，蛋白印记法，免疫组化法检测胶原蛋白I的表达情况。如图6所示，马松染色结果可以看到造模组明显纤维化，免疫组化可以看到造模组中细胞胞外，胞质中胶原蛋白I表达明显，具有明显的统计学意义。
步骤1.2、如图2所示，确定体内HCY诱导肝星状细胞纤维化的最佳处理时间：正常培养的肝星状细胞(LX2)，采用初定浓度为24μM同型半胱氨酸预处理，分别12h，24h，48h，72h后收集细胞，采用蛋白印记法，免疫荧光法检测胶原蛋白I的表达情况。在48小时时胶原蛋白表达最明显，和不加HCY处理组相比，高出25倍，差异具有明显的统计学意义。
步骤1.3、如图3所示，确定处理浓度：正常培养的肝星状细胞(LX2)，采用同型半胱氨酸(6μM，12μM，24μM，48μM)预处理，48小时后收集细胞，采用蛋白印记法，免疫荧光法检测胶原蛋白I的表达情况。在24μM时，胶原蛋白I的表达最明显，和不加HCY处理组相比，具有明显的统计学意义。
步骤2、高同型半胱氨酸血症通过USP22诱导肝脏纤维化：
步骤2.1、如图4所示，体内：采用蛋白印记法，免疫组化法检测泛素水解酶22在正常小鼠和肝脏纤维化小鼠肝脏组织中的表达情况。模型组中尾静脉注射si RNA USP22预处理，下调泛素水解酶22在纤维化小鼠肝脏中的表达，收集肝脏组织进行HE，马松染色评估肝脏纤维化的情况，蛋白印迹，免疫组化检测泛素水解酶22，胶原蛋白I的表达情况。注射siRNA USP22处理组胶原蛋白I，USP22的表达相对于高蛋氨酸饮食的小鼠来说表达下降，有统计学意义。
步骤2.2、如图5所示，体外：采用蛋白印记法，免疫荧光法检测肝星状细胞中泛素水解酶22的表达情况。可以看到肝星状细胞模型组内转染siRNA，下调泛素水解酶22在肝星状细胞中的表达，收集肝星状细胞进行蛋白印迹，免疫荧光法检测泛素水解酶22，胶原蛋白I的表达情况。转染siRNA组和造模组相比，胶原蛋白I，USP22的表达都下降了，具有统计学意义。
上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。
Claims (1)
1.一种高同型半胱氨酸血症诱导肝脏纤维化模型的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、制备体内高蛋氨酸饮食诱导高同型半胱氨酸血症模型：
步骤2、高同型半胱氨酸血症通过USP22诱导肝脏纤维化，建立高同型半胱氨酸血症诱导肝脏纤维化模型；
所述步骤1中的制备体内高蛋氨酸饮食诱导高同型半胱氨酸血症模型具体为：
步骤1.1、选择20只6-8周龄的C57BL/6小鼠，随机分成2组，每组10只，一组为正常组，喂养正常的饲料，一组为造模组，喂养含质量百分含量为2％的高蛋氨酸饲料，2周后，处死小鼠，下腔静脉采血，收集小鼠的血液检测同型半胱氨酸的水平，收集小鼠肝脏组织进行马松染色评估肝脏纤维化的情况，蛋白印记法，免疫组化法检测胶原蛋白I的表达情况，如果马松染色结果看到造模组明显纤维化，免疫组化看到造模组中细胞胞外，胞质中胶原蛋白I表达明显，具有明显的统计学意义，则造模成功；
步骤1.2、确定体内HCY诱导肝星状细胞纤维化的最佳处理时间：正常培养的肝星状细胞，采用初定浓度为24μM同型半胱氨酸预处理，分别12h，24h，48h，72h后收集细胞，采用蛋白印记法，免疫荧光法检测胶原蛋白I的表达情况；
步骤1.3、确定处理浓度：正常培养的肝星状细胞，采用浓度为6-48μM同型半胱氨酸预处理，48小时后收集细胞，采用蛋白印记法，免疫荧光法检测胶原蛋白I的表达情况；
所述步骤2中的高同型半胱氨酸血症通过USP22诱导肝脏纤维化，建立高同型半胱氨酸血症诱导肝脏纤维化模型具体为：
步骤2.1、体内：采用蛋白印记法，免疫组化法检测泛素水解酶22在正常小鼠和肝脏纤维化小鼠肝脏组织中的表达情况，模型组中尾静脉注射siRNAUSP22预处理，下调泛素水解酶22在纤维化小鼠肝脏中的表达，收集肝脏组织进行HE，马松染色评估肝脏纤维化的情况，蛋白印记 ，免疫组化检测泛素水解酶22、胶原蛋白I的表达情况；
步骤2.2、体外：采用蛋白印记法，免疫荧光法检测肝星状细胞中泛素水解酶22的表达情况，肝星状细胞模型组内转染si RNA，下调泛素水解酶22在肝星状细胞中的表达，收集肝星状细胞进行蛋白印记 ，免疫荧光法检测泛素水解酶22，胶原蛋白I的表达情况。
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