CN106727560A

CN106727560A - 一种喜树碱化合物作为拓扑异构酶抑制剂在治疗慢性肝脏疾病药物中的应用

Info

Publication number: CN106727560A
Application number: CN201611126544.8A
Authority: CN
Inventors: 陈渝萍; 汪辛; 程江; 张艳军
Original assignee: Southwest Jiaotong University
Current assignee: Southwest Jiaotong University
Priority date: 2016-12-09
Filing date: 2016-12-09
Publication date: 2017-05-31

Abstract

本发明公开了一种喜树碱化合物作为拓扑异构酶抑制剂在治疗慢性肝脏疾病药物中的应用，其特征在于，该化合物化学式为C₂₀H₁₆N₂O₄，相对分子量为348.34；该抑制剂由上述化合物溶于二甲基亚砜组成；本发明的抑制剂对活化态肝星状细胞缺氧因子HIF‑1‑α、糖酵解限速酶基因表达和糖酵解代谢活动有抑制作用，并且可以促进肝星状细胞从活化态向静息态表型逆转；本发明的抑制剂特异性好，针对性强，作为治疗肝纤维化的药物能够更低的炎症反应及毒副作用的情况下达到治疗效果。

Description

一种喜树碱化合物作为拓扑异构酶抑制剂在治疗慢性肝脏疾病药物中的应用

技术领域

本发明涉及药物领域，具体涉及一种喜树碱化合物作为拓扑异构酶抑制剂在治疗慢性肝脏疾病药物中的应用。

背景技术

肝纤维化是肝脏遭受各种病因引起的慢性损伤后的修复反应，是肝硬化早期的可逆阶段；目前唯有通过肝移植对肝硬化进行治疗，因此，对肝纤维化的防治极其重要；肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)是位于肝脏血窦中一类富含维生素A的间充质细胞；在正常肝脏中肝星状细胞HSC处于不分裂静息状态；当肝脏受损时，肝星状细胞HSC为各类刺激因素激活、转变成旺盛增殖和过度合成细胞外基质蛋白的肌成纤维母(myofibroblastic,MF)表型细胞；活化态肝星状细胞HSC的大量扩增在肝纤维化发生过程中占有非常重要的地位；因此通过抑制炎症反应、对抗氧化应激、调节相关刺激细胞因子的活性和信号传导等途径抑制肝星状细胞HSC的增殖、活化和诱导其凋亡已经成为治疗肝纤维化的重要手段；目前有人尝试使用紫杉醇、姜黄素、10-羟基喜树碱(HCPT)和一氧化氮(NO)类等药物来抑制活化态肝星状细胞HSC的增殖和细胞外基质ECM的沉积；还有采用RNAi技术沉默I型胶原蛋白基因的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种喜树碱化合物作为拓扑异构酶抑制剂在的应用，所述抑制剂能够抑制活化态肝星状细胞HSC的糖酵解代谢活动、从而有效逆转HSC为静息态表型。

本发明采用的技术方案是：一种喜树碱化合物作为拓扑异构酶抑制剂在治疗慢性肝脏疾病药物中的应用，该化合物化学式为C₂₀H₁₆N₂O₄，相对分子量为348.34，CAS号：7689-03-4，该化合物为成都兰贝植化有限公司产品；该化合物是由珙桐科旱莲属植物喜树的根、皮、果实提取制得的生物碱，由喜树根或果粉以有机溶剂提取而得，呈淡黄色针状结晶；其结构式如下所示：

该抑制剂由上述化合物溶于二甲基亚砜组成。

进一步的，所述抑制剂对活化态肝星状细胞缺氧因子HIF-1-α有抑制作用。

进一步的，所述抑制剂对活化态肝星状细胞中糖酵解限速酶基因表达有抑制作用。

进一步的，所述抑制剂对肝星状细胞中糖酵解代谢活动有抑制作用。

进一步的，所述抑制剂对肝星状细胞从活化态向静息态表型逆转有促进作用。

所述抑制剂由以下方法制备，将2mg喜树碱CPT溶于10ml DMSO溶液中充分溶解制备成原始浓度为200μg/ml的细胞母液；将上述配置好的抑制剂母液用DMSO进行梯度稀释，使抑制剂的最终浓度分别为：0.25μg/ml、0.125μg/ml 0.062μg/ml、0.031μg/ml、0.016μg/ml、0.008μg/ml、0.004μg/ml、0.002μg/ml。

本发明通过细胞计数试剂盒分析喜树碱CPT抑制剂的细胞毒性；取和不同浓度的CPT溶液共孵育48小时的大鼠活化态肝星状细胞株HSC-T6、人乳腺癌细胞株Hela细胞制备总蛋白；然后以蛋白质印迹法Western Blot检测细胞中α-SMA、PKM2、HIF-1-α蛋白含量；取和CPT共孵育48小时的大鼠活化态肝星状细胞株HSC-T6和原代活化态HSC细胞，制备细胞总RNA，以QRT-PCR检测细胞中Pkm、α-Sma、Collagen1a1基因的RNA表达水平；以DMSO和10-羟基喜树碱HCPT作为药物处理对照组。

实验结果表明：低剂量的喜树碱可以通过削弱活化态肝星状细胞中缺氧因子HIF-1-α的蛋白水平而抑制其对下游一系列糖酵解相关基因(如Pkm)的转录调控活性，进而减退细胞的糖酵解代谢活动，最终抑制细胞中典型肌成纤维母细胞MF表型标记分子基因(如α-Sma)的表达；喜树碱的这一抑制作用表现出对活化态肝星状细胞细胞的选择性；而已报道的抗肝纤维化药物10-羟基喜树碱虽然对活化态肝星状细胞有相当的细胞毒性，但在不高于半抑制浓度(IC50药物浓度)时并不抑制细胞中缺氧因子HIF-1-α活性和糖酵解限速酶PKM2及MF表型代表标记分子ɑ-SMA的蛋白水平。

本发明的有益效果是：

(1)本发明涉及的抑制剂特异性好，针对性强，能够通过抑制活化态肝形状细胞HSC的糖酵解代谢活动有效逆转HSC为静息态表型；

(2)本发明涉及的抑制剂作为治疗肝纤维化的药物能够在引起更低的炎症反应及毒副作用的情况下达到治疗效果；

(3)本发明结构相对简单，制备方便。

附图说明

图1为CPT和HCPT对大鼠肝星状细胞系HSC-T6细胞生存率的影响。

图2为CPT半抑制浓度和1/2半抑制浓度对大鼠肝星状细胞系HSC-T6细胞处理48小时后蛋白水平变化。

图3为CPT半抑制浓度和1/2半抑制浓度对大鼠肝星状细胞系HSC-T6细胞处理48小时后基因水平变化。

图4为CPT半抑制浓度和1/2半抑制浓度对大鼠原代肝星状细胞HSC细胞处理48小时后基因水平变化。

图5为HCPT半抑制浓度和1/2半抑制浓度对大鼠肝星状细胞系HSC-T6细胞处理48小时后蛋白水平变化。

图6为CPT和HCPT半抑制浓度和1/2半抑制浓度对人乳腺癌细胞系Hela细胞处理48小时后蛋白水平变化。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。

本实施例实验中用到的药品与试剂如下：

α-SMA单克隆抗体为Abcam公司产品；PKM2单克隆抗体为Cell signalingtechnology公司产品；HIF-1-α单克隆抗体为Affinity公司产品；β-actin为Genescript公司产品；CCK8(WST)细胞计数试剂盒为北京庄盟国际生物基因科技有限公司产品；喜树碱CPT、10-羟基喜树碱HCPT为成都兰贝植化有限公司产品。

实施例中，所有数据均采用统计软件SPSS进行统计分析，以t检验分析组间差异，计量数据以平均数±标准差表示。

实施例1

喜树碱抑制剂细胞毒性检测

取对数生长期大鼠肝星状细胞株HSC-T6以0.25％胰酶消化，配置成单细胞悬液；再以5×10³/孔的细胞密度接种于96孔板置于37℃，5％二氧化碳(CO₂)的孵化箱进行培养；一天后采用含有10％血清及1％双抗的DMEM高糖培养基将200μg/ml喜树碱溶液稀释至0.25μg/ml、0.125μg/ml 0.062μg/ml、0.031μg/ml、0.016μg/ml、0.008μg/ml、0.004μg/ml、0.002μg/ml终浓度；羟基喜树碱溶液稀释至：0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.125μg/ml、0.063μg/ml、0.01μg/ml、0.016μg/ml、0.008μg/ml、0.004μg/ml；吸弃孔板内旧培养基，每孔分别换上100μL以上浓度的喜树碱和羟基喜树碱培养基溶液，孵箱中继续培养48h；以CCK-8法检测孔内存活的大鼠活化态肝星状细胞株HSC-T6相对细胞数量并计算细胞的存活率；以未加空白胶束的细胞组为阴性对照，以无细胞的培养基为空白对照；细胞的存活率计算公式如下：

细胞存活率％＝(OD_sample－OD_blank/OD_control－OD_blank)×100％

在公式中，OD_sample为样品组吸光度值，OD_blank为空白对照吸光度值，OD_control为阴性对照吸光度值；根据细胞存活情形计算CPT的IC₅₀。

实验如图1所示，与不含药物的阴性对照组相比，CPT和HCPT均对大鼠活化态肝星状细胞株HSC-T6细胞的生长有显著抑制作用，随着药物浓度的升高细胞生存率下降；根据SPSS软件拟合得到CPT和HCPT的IC₅₀值分别为0.025μg/ml和0.04μg/ml；CPT较HCPT对大鼠活化态肝星状细胞株HSC-T6细胞表现出更强的细胞毒性。

实施例2

HSC中缺氧因子HIF-1-ɑ蛋白/糖酵解酶基因/肌成纤维母细胞MF表型分子标记基因的表达

大鼠活化态肝星状细胞株HSC-T6和体外培养14天的原代HSC，CPT或者HCPT共孵育48小时备用；根据CPT和HCPT细胞毒性检测结果拟合得到药物浓度与细胞生存率曲线；计算半抑制浓度IC₅₀值，并设置IC₅₀浓度为高剂量、1/2IC₅₀为低剂量进行RNA分析；

将含有10％血清及1％双抗的DMEM高糖培养基将200μg/ml浓度溶液稀释至CPTIC50浓度(高剂量：0.025μg/ml)和1/2CPT IC50浓度并与孔板内大鼠活化态肝星状细胞株HSC-T6细胞共孵育48h。

采用RT-QPCR实验方法进行分析，实验方法如下：

以Trizol试剂(总RNA抽提试剂)裂解细胞、提取总RNA并定量；随后对RNA样品进行脱氧核糖核酸酶I(DNase I酶)消化以去除DNA污染，采用随机引物和反转录酶合成互补脱氧核糖核酸(cDNA)第一链；最后取稀释的cDNA样品模板和各基因特异扩增引物，采用SYBRgreen绿色荧光试剂盒分别进行QPCR反应；以S9基因为内对照，采用ΔCt计算方法对各基因mRNA进行定量。

如图2所示，较无CPT处理组，CPT处理组细胞中缺氧因子HIF-1-ɑ的蛋白水平随浓度增加而下降；与之相应的是糖酵解限速酶PKM2和MF表型典型标记分子ɑ-SMA的蛋白水平也呈现相似的下降趋势；MF表型代表标记分子ɑ-Sma基因和I型胶原蛋白分子基因的mRNA水平也随着CPT处理而显著下降(图3)，表明HSC-T6的MF表型被抑制；进一步采用两种同样浓度的CPT分别处理体外激活的原代HSC细胞48小时，结果发现细胞中Pkm、α-Sma和Collagen1a1基因的mRNA水平也均随着CPT处理而下降，且表现出剂量依赖性的抑制效果(图4)，说明原代活化态肝星状细胞MF表型被CPT抑制。

实施例3

蛋白表达水平

实验采用大鼠肝星状细胞株HSC-T6和人乳腺细胞株Hela，与CPT或HCPT共孵育48小时；根据喜树碱和羟基喜树碱细胞毒性检测结果拟合得到药物浓度与细胞生存率曲线，计算IC₅₀值，并设置CPT IC₅₀浓度(高剂量)和1/2IC₅₀浓度(低剂量)进行蛋白分析；处理方法为含有10％血清及1％双抗的DMEM高糖培养基将200μg/ml药物溶液稀释至指定剂量并与孔板内细胞共孵育48小时。

实验方法如下：

以RIPA裂解液裂解细胞制备总蛋白，采用BCA蛋白浓度检测法测定蛋白浓度；然后以聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE电泳)对蛋白进行分离、并通过电转进行蛋白印迹至聚偏氟乙烯(PDVF)膜；然后进行封闭、一抗和二抗依次孵育，最后以增强化学发光法(ECL显色法)进行显色、并于Image Lab成像仪中成像。

如图5所示，无论是采用IC₅₀还是1/2IC₅₀浓度，10-羟基喜树碱都未能减少T6细胞中的缺氧因子HIF-1-ɑ蛋白；细胞中糖酵解限速酶PKM2和MF表型典型标记分子ɑ-SMA的蛋白水平也并未受到影响；如图6所示，在不高于IC₅₀药物浓度下，CPT和HCPT也均未能明显改变Hela细胞中的HIF-1-α、PKM2和α-SMA的蛋白水平。

低剂量的喜树碱可以通过削弱活化态肝星状细胞中缺氧因子HIF-1-α的蛋白水平而抑制其对下游一系列糖酵解相关基因(如Pkm)的转录调控活性，进而减退细胞的糖酵解代谢活动，最终抑制细胞中典型肌成纤维母细胞MF表型标记分子基因(如α-Sma)的表达；喜树碱的这一抑制作用表现出对活化态肝星状细胞细胞的选择性；除此之外，已经报道的抗肝纤维化药物10-羟基喜树碱虽然对活化态肝星状细胞有相当的细胞毒性，但在不高于半抑制浓度(IC₅₀药物浓度)时并不抑制细胞中缺氧因子HIF-1-α活性和糖酵解限速酶PKM2及MF表型代表标记分子ɑ-SMA的蛋白水平；因此，通过使用喜树碱可以抑制活化态肝星状细胞细胞中的HIF-1-α和相应的糖代谢活动，从而逆转其肌成纤维母细胞(myofibroblastic,MF)表型、最后达到治疗肝纤维化的目的。

本发明与抑制肌成纤维母细胞表型的活化态肝星状细胞(MF-HSC细胞)的增殖和促进其凋亡的治疗手段相比，诱导其MF表型向静息态逆转能够在不引起炎症反应及更低毒副作用的情况下达到治疗肝纤维化的目的；研究发现，通过抑制活化态肝星状细胞HSC的糖酵解代谢活动可以有效逆转HSC为静息态表型；选用了我国特有喜树碱(CPT)处理活化态HSC，通过减少缺氧诱导因子HIF-1-α蛋白来削弱细胞的糖酵解活动、进而逆转细胞活化态表型。

Claims

1.一种喜树碱化合物作为拓扑异构酶抑制剂在治疗慢性肝脏疾病药物中的应用，其特征在于，该化合物化学式为C₂₀H₁₆N₂O₄，相对分子量为348.34，其结构式如下所示：

该抑制剂由上述化合物溶于二甲基亚砜组成。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制剂对活化态肝星状细胞缺氧因子HIF-1-α有抑制作用。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制剂对活化态肝星状细胞中糖酵解限速酶基因表达有抑制作用。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制剂对肝星状细胞中糖酵解代谢活动有抑制作用。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制剂对肝星状细胞从活化态向静息态表型逆转有促进作用。