CN106577287A - 一种萝芙木诱导培养基及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于组织培养技术的植物再生领域，具体涉及到一种萝芙木诱导培养基及其应用，所述的诱导培养基组成为2/3MS培养基、0.1‑0.2mg/L N‑苯基‑N’‑1,2,3‑噻二唑‑5‑脲、0.1‑0.2mg/L 2,4‑二氯苯氧乙酸和800‑1500mg/L萝芙木乳汁，本发明公开的诱导培养基对萝芙木具有诱导速度快，植株健壮的优点，并且培养的萝芙木幼苗移栽成活率在90％以上，而且本发明培养基成分来源广泛，诱导速度快，适合大规模培养。

Description

一种萝芙木诱导培养基及其应用
技术领域
本发明属于组织培养技术的植物再生领域，具体涉及到一种萝芙木诱导培养基及其应用。
背景技术
萝芙木：直立常绿灌木，高可达3m，具乳汁，属于一种药材，功能主治镇静，降压，活血止痛，清热解毒。用于高血压病，头痛，眩晕，失眠，高热不退，外用治跌打损伤，毒蛇咬伤等。萝芙木根中分离出利血平、阿吗碱、萝莱碱、蛇根亭碱、阿吗灵、山马蹄碱、萝芙木甲素、锥洛斯明碱、霹雳萝芙辛碱、一种单萜类生物碱等多种生物碱，含量为1～2％，其中利血平具有良好的降压作用。萝芙木中尚含熊果酸0.2％，熊果酸的抗肿瘤作用广泛，极有可能成为低毒有效的新型抗癌药物。因此，萝芙木具有很高的药用价值，而且萝芙木的种植也已经得到国家的推广。
由于连年的采挖，资源急剧减少，从20世纪80年代中期开始，生产厂家就把药用部位由根扩展到全株，而且为保护野生资源，满足企业生产需求，越来越多的研究机构开展了萝芙木规范化种植研究。
萝芙木的繁殖主要是种子与扦插繁殖，但是种子繁殖发芽率低，生长速度慢，周期长等缺点，而扦插繁殖操作复杂，成活率低等缺点而不能广泛推广，因此，为了促进萝芙木快速繁殖，对萝芙木组织进行了培养基的研究，摆脱了外部环境对植株的影响，而且可以对优良的品种进行筛选，对品种进行优化，因此，植物培养基对萝芙木的快速繁殖十分重要。
《红果萝芙木植物组织培养及快速繁殖》，张丽珍，等，江苏农业科学出版社，2015年第43卷第6期公开了红果萝芙木不同时期的培养基，以红果萝芙木茎段为外植体，研究其再生条件，结果表明：丛生芽诱导培养基为MS+1.0mg/L6－BA+0.05mg/L IBA；继代增殖、壮苗培养基分别为MS+0.3～0.5mg/L 6－BA+0.02mg/L IBA、MS+0.1～0.2mg/L 6-BA+0.01mg/L IBA；根分化的最适培养基为1/2MS+0.5mg/L NAA+0.2mg/L IBA。
公开号为101731149A的中国专利申请公开了一种利用组织培养技术快速繁殖云南萝芙木的方法，该发明以萝芙木嫩枝带芽茎段作外植体，接种在启动培养基上诱导腋芽产生，启动培养基组成为MS+2.0-4.0mg/LBA+0.05-0.1mg/LNAA。增殖培养MS+2.5-5.0mg/LBA+0.1-0.5mg/LNAA，增殖系数为8-12，每4-5周重复继代一次。生根培养基为添加1.0mg/LNAA或IBA或NAA+IBA＝1.0mg/L的1/2MS培养基，5-6周后将生根苗移栽到炼苗基质中，20-30℃保湿遮阴炼苗3-4周转栽或大田种植，成活率达90％。此发明方法操作简单，繁殖速度快，遗传稳定性好，为工厂化育苗提供技术支撑。
但是上述技术中诱导培养使用的是1个单位的MS培养基，铵态氮含量过高，容易伤害外植体，造成成活率低。
发明内容
为了解决现有技术的不足，进一步加快萝芙木组织的诱导繁殖，提高成活率，本发明公开了一种萝芙木诱导培养基及其应用，本发明公开的培养基是在改良MS培养基的基础上，添加适量的植物激素，并且加入了萝芙木乳汁，极大地加快了萝芙木的诱导速度。
本发明技术方案如下所示：
一种萝芙木诱导培养基，所述的诱导培养基组成为2/3MS培养基、0.1-0.2mg/L N-苯基-N’-1,2,3-噻二唑-5-脲、0.1-0.2mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸和800-1500mg/L萝芙木乳汁。
进一步的，所述的诱导培养基组成为2/3MS培养基、0.16mg/L N-苯基-N’-1,2,3-噻二唑-5-脲、0.15mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸和1200mg/L萝芙木乳汁。
N-苯基-N’-1,2,3-噻二唑-5-脲：CAS.NO：51707-55-2
其中MS培养基的配比为：大量元素为：NH4NO31650，KNO31900，CaCl2·2H2O 440，MgSO4·7H2O 370，KH2PO4170；微量元素：KI 0.83，H3BO36.2，MnSO4·4H2O 22.3，ZnSO4·7H2O8.6，Na2MoO4·2H2O 0.25，CuSO4·5H2O0.025，CoCl2·6H2O 0.025；铁盐：FeSO4·7H2O 27.8，Na2-EDTA·2H2O 37.3；有机物质：肌醇100，烟酸0.5，盐酸吡哆醇(维生素B6)0.5，盐酸硫胺素(维生素B1)0.1，甘氨酸2.0，单位为mg/L。
进一步的，所述的萝芙木乳汁采用冷冻的萝芙木乳汁。
进一步的，所述的冷冻的萝芙木乳汁为：将新鲜萝芙木乳汁采摘后迅速冷藏，为了防止污染与保持营养，我们要对新鲜萝芙木乳汁进行冷藏处理。
进一步的，所述的冷冻时间为2-4天，冷冻温度为1-3℃。
进一步的，所述的冷冻时间为3天，冷冻温度为2℃。
本发明还提供了所述的培养基在萝芙木诱导组织再生中的应用。
所述的萝芙木诱导培养基的制备方法：将N-苯基-N’-1,2,3-噻二唑-5-脲、2,4-二氯苯氧乙酸和萝芙木乳汁，加入到稀释后的MS培养基中，搅拌均匀，使用1M的NaOH或是HCl溶液将pH调整至5.8，120℃灭菌25min，即得。
由于1个单位的MS培养基，铵态氮含量过高，容易伤害外植体，造成成活率低，本发明对MS培养基进行了稀释，在培养诱导期时，添加植物生长激素与萝芙木乳汁，发现与只添加植物生长激素的培养基相比，本发明培育出来的幼苗更加健壮。
与现有技术相比，本发明是对MS的进一步改良，添加的萝芙木乳汁促进了萝芙木的诱导再生。
具体实施方式
通过以下具体实施例对本发明作进一步说明，使本领域技术人员更加理解本发明技术方案，但并非是对本发明的限制。本发明培养基购自北京拜尔迪生物技术有限公司供应的Sigma的MS培养基。
实施例1
一种萝芙木诱导培养基，组成为2/3MS培养基、0.16mg/L N-苯基-N’-1,2,3-噻二唑-5-脲、0.15mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸和1200mg/L萝芙木乳汁。
所述的萝芙木乳汁为冷冻萝芙木乳汁，冷冻时间为3天，冷冻温度为2℃。
所述的萝芙木诱导培养基的制备方法：将N-苯基-N’-1,2,3-噻二唑-5-脲、2,4-二氯苯氧乙酸和萝芙木乳汁，加入到稀释后的MS培养基中，搅拌均匀，使用1M的HCl溶液，将pH调整至5.8，120℃灭菌25min，即得。
实施例2
一种萝芙木诱导培养基，组成为2/3MS培养基、0.1mg/L N-苯基-N’-1,2,3-噻二唑-5-脲、0.1mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸和1500mg/L萝芙木乳汁。
所述的萝芙木乳汁为冷冻萝芙木乳汁，冷冻时间为2天，冷冻温度为3℃。
所述的萝芙木诱导培养基的制备方法与实施例1类似。
实施例3
一种萝芙木诱导培养基，组成为2/3MS培养基、0.2mg/L N-苯基-N’-1,2,3-噻二唑-5-脲、0.2mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸和800mg/L萝芙木乳汁。
所述的萝芙木乳汁为冷冻萝芙木乳汁，冷冻时间为4天，冷冻温度为1℃。
所述的萝芙木诱导培养基的制备方法与实施例1类似。
对比例1
一种萝芙木诱导培养基，组成为MS培养基、0.16mg/L N-苯基-N’-1,2,3-噻二唑-5-脲和0.15mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸。
与实施例1的区别是，所述的诱导培养基采用1个单位的MS培养基，不添加萝芙木乳汁。
所述的萝芙木诱导培养基的制备方法与实施例1类似
试验例1培养试验
试验对象为：实施例1-3与对比例1制备的萝芙木诱导培养基。
诱导培养：采摘长势较优的萝芙木嫩枝，在无菌条件下，消毒后用水冲洗1个小时，剪取带节的2cm茎段作为外植体，接种在诱导培养基上，诱导腋芽的产生，培养条件为24℃，光照时间为16小时，光照强度为2500LX，观察20天内的生长。
具体结果如表1所示，数值均为平均值：
表1诱导培养基上的生长状况
从表1中可以看出，本发明公开的实施例1-3培养基相对于对比例1培养基，诱导率更高，其中本发明公开的培养基诱导率均在98％以上，而且生长速度快，不定芽较粗，叶片为深绿色，幼苗质量更好。
试验例2移栽成活率
试验方法：将试验例1得到的幼苗继续培养20天，生出若5-7条根，将培养装置移到普通房间，并将封口打开，3天后移出，然后洗去培养基，移栽到炼苗基质中浇透水(珍珠岩：泥炭土重量比为2：1)，放置在植物恒温室中25℃下进行培养，20天后，移栽到外部环境中进行种植，计算一个月后植株的成活量，具体结果如表2所示。
表2移栽成活率与生长状况
培养基 移栽成活率 生长状况
实施例1 92％ 长势旺盛、叶片深绿、茎部粗壮
实施例2 91.5％ 长势旺盛、叶片深绿、茎部粗壮
实施例3 90％ 长势旺盛、叶片深绿、茎部粗壮
对比例1 81％ 长势旺盛、叶片绿色、茎部稍细
从表2中可以里看出，本发明实施例1-3的移栽成活率均在90％以上，大于对比例1中81％的移栽成活率，说明本发明公开的培养基进一步的提高了萝芙木植株质量，提高了移栽成活率，有利于萝芙木的组织培养。

Claims (6)

1.一种萝芙木诱导培养基，其特征在于，所述的诱导培养基组成为2/3MS培养基、0.1-0.2mg/L N-苯基-N’-1,2,3-噻二唑-5-脲、0.1-0.2mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸和800-1500mg/L萝芙木乳汁。
2.根据权利要求1所述的萝芙木诱导培养基，其特征在于，所述的诱导培养基组成为2/3MS培养基、0.16mg/L N-苯基-N’-1,2,3-噻二唑-5-脲、0.15mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸和1200mg/L萝芙木乳汁。
3.根据权利要求1或2所述的萝芙木诱导培养基，其特征在于，所述的萝芙木乳汁采用冷冻的萝芙木乳汁。
4.根据权利要求3所述的萝芙木诱导培养基，其特征在于，所述的冷冻时间为2-4天，冷冻温度为1-3℃。
5.根据权利要求4所述的萝芙木诱导培养基，其特征在于，所述的冷冻时间为3天，冷冻温度为2℃。
6.权利要求1-5任一项所述的培养基在萝芙木诱导组织再生中的应用。
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