CN106574285A - 糖化酶组合物、糖化反应液和糖的制造方法 - Google Patents
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Abstract
将纤维素和半纤维素的至少一方进行糖化的糖化反应液,其中,以分散状态含有纤维素和半纤维素的至少一方、糖化酶和胶态二氧化硅,且未固定化于胶态二氧化硅的糖化酶相对于全部糖化酶的比例为25%~100%。
Description
技术领域
本发明涉及糖化酶组合物、糖化反应液和糖的制造方法。
背景技术
一直以来,已知以包含纤维素或半纤维素的纤维素系生物质为原料制造乙醇的纤维素系生物乙醇。
作为从包含纤维素或半纤维素的纤维素系生物质生成葡萄糖这样的糖的方法(糖化技术),已知在纤维素系生物质中加入硫酸进行水解的方法,但有反应器的腐蚀、废液处理的问题。另外,例如,还提出了使用在碳、沸石等上担载了磺基的固体酸催化剂将纤维素系生物质糖化的方法,但因为是固体彼此的反应,所以不仅反应速度极慢,而且还有未反应残渣与固体酸催化剂的分离困难这样的问题。进而,上述任一方法中水解的控制均困难,反应过度进行的结果还有糖自身分解、糖的收率降低的问题。
另一方面,还已知使用酶进行糖化的方法(参照专利文献1)。该方法包括将原料用加压热水处理的热水处理工序,将该热水处理物进行机械粉碎处理的机械粉碎处理工序和将该机械粉碎物用酶进行糖化处理的糖化处理工序。然而,在该方法中,有用酶进行糖化时的反应速度慢、所得的糖化液的浓度不能说充分这样的问题。
于是,提出了通过使酶担载于二氧化硅系介孔材料上使用,可以使酶比溶解状态更高浓度地在反应系中存在,从而更有效地进行酶反应这样的方法(参照专利文献2)。然而,在该方法中,有需要将酶吸附固定化于担载体的工序这样的问题,另外,有可能固定化后的酶与未固定化的酶相比反应效率降低至40~50%左右这样的问题。进而,因为是固体彼此的反应,所以还有未反应残渣与固定了酶的担载体的分离困难这样的问题。
另外,还已知将硅溶胶与酶混合,制成硅胶后粉末化而得的固定化酶(参照专利文献3、4)。这样的固定化酶虽然能够进行酶的回收,但反应效率本身低。此外,还已知将0.5μm~100μm的二氧化硅粉末与酶混合而水解包含纤维素的植物纤维的方法,但存在混合二氧化硅粉末的效果不明,未反应残渣与悬浮的二氧化硅粉末的分离困难这样的问题(参照专利文献5)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特开2006-136263号公报
专利文献2:日本特开2009-125006号公报
专利文献3:日本特公昭63-2595号公报
专利文献4:日本特公昭63-21475号公报
专利文献5:日本特开平10-66594号公报
发明内容
发明要解决的课题
本发明是鉴于上述事实而做出的,目的是提供通过简便的工序提高利用酶的糖化反应的速度的糖化酶组合物、糖化反应液和糖的制造方法。
用于解决课题的方法
用于实现所述目的发明的第1方式是糖化反应液,其特征在于,是将纤维素和半纤维素的至少一方进行糖化的糖化反应液,其中,以分散状态含有纤维素和半纤维素的至少一方、糖化酶和胶态二氧化硅,且未固定化于胶态二氧化硅的糖化酶相对于全部糖化酶的比例为25%~100%。
其中,优选所述胶态二氧化硅的平均一次粒径为1nm~400nm,且利用动态光散射法的测定粒径为大于等于5nm且小于500nm。
另外,优选所述糖化酶的浓度为0.005质量%~3.0质量%。
另外,优选所述胶态二氧化硅的浓度为0.005质量%~40质量%。
另外,优选所述糖化酶与所述胶态二氧化硅的质量比率(糖化酶/胶态二氧化硅)为0.002~300。
另外,优选pH值为3~11。
另外,优选所述糖化酶包含来源于曲霉属(Aspergillus)的糖化酶和来源于木霉属(Trichoderma)的糖化酶的至少一方。
另外,本发明的第2方式是糖化酶组合物,其特征在于,是将纤维素和半纤维素的至少一方的糖化组合物,其中,以分散状态含有糖化酶、和平均一次粒径为1nm~400nm且利用动态光散射法的测定粒径大于等于5nm且小于500nm的胶态二氧化硅,且未固定化于胶态二氧化硅的糖化酶相对于全部糖化酶的比例为25%~100%。
另外,本发明的第3方式是糖的制造方法,其特征在于,使用权利要求1~7的任一项所述的糖化反应液来制造糖。
另外,优选糖化反应的反应温度为5℃~100℃。
附图说明
图1显示糖化组合物中未固定化于胶态二氧化硅的糖化酶相对于全部糖化酶的比例的pH值依赖性。
图2显示糖化反应液的酶反应14天后的糖化率的pH值依赖性。
图3显示糖化反应液的酶反应7天后的糖化组合物中未固定化于胶态二氧化硅的糖化酶相对于全部糖化酶的比例的依赖性。
图4显示糖化反应液的酶反应14天后的糖化率的二氧化硅浓度依赖性。
图5显示糖化反应液的酶反应14天后的糖化率在糖化酶/胶态二氧化硅比0.1~300的范围内的依赖性。
图6显示糖化反应液的酶反应14天后的糖化率在糖化酶/胶态二氧化硅比0.003~0.1的范围内的依赖性。
图7显示糖化反应液的酶反应14天后的糖化率的平均一次粒径依赖性。
具体实施方式
本发明中,作为原料使用纤维素和半纤维素的至少一方。
该纤维素或半纤维素在例如阔叶树、针叶树等农林水产物资源、或该农林水产物资源的废弃物这样的纤维素系生物质中含有。更具体地,可列举甘蔗渣、稻草、玉米秸秆、油棕空果串、木材纤维、木材碎片、单板屑、木粉、纸浆类、废纸类、棉、海鞘、醋酸菌等。另外,这些原料只要是来源于纤维素系生物质的原料就不特别限定,可以单独使用1种,也可以2种以上混合使用。
其中,优选为桉树木粉(阔叶树)、柳杉木粉(针叶树)、甘蔗渣、稻草、玉米秸秆、油棕空果串、棉所含的纤维素或半纤维素。虽然原因不确定,但这些情况下容易解纤,能够以比较高的收率获得糖。
其中,纤维素是指葡萄糖通过β-1,4糖苷键聚合而成的聚合物。半纤维素是指葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖等通过糖苷键聚合而成的聚合物,是指纤维素以外的水不溶性的多糖类。
另外,纤维素也可以包含作为其部分分解物的纤维寡糖、纤维二糖,可以是结晶性的也可以是非结晶性的。另外,也可以是羧甲基化、醛化或酯化的衍生物。此外,纤维素或半纤维素如上所述,只要是来源于生物质的就不特别限定,可以来源于植物、来源于真菌、来源于细菌。
作为本发明的糖化酶,使用以纤维素酶为主体的糖化酶。该纤维素酶是指将纤维素或半纤维素分解到葡萄糖等糖的酶。
作为生产该糖化酶的微生物,不特别限定,可列举例如,支顶孢属(Acremonium)菌、曲霉属(Aspergillus)菌、毛壳属(Chaetomium)菌、镰孢属(Fusarium)菌、腐质霉属(Humicola)菌、耙齿菌属(Irpex)菌、平革菌属(Phanerochaete)菌、青霉属(Penicillium)菌、裂褶菌属(Schizophyllum)菌、分枝孢属(Sporotrichum)菌、栓菌属(Trametes)菌、木霉属(Trichoderma)菌等,除此以外,还可列举梭菌属(Clostridium)菌、假单胞菌属(Pseudomonas)菌、纤维单胞菌属(Cellulomonas)菌、瘤胃球菌属(Ruminococcus)菌、芽孢杆菌属(Bacillus)菌等细菌、硫化叶菌属(Sulfolobus)菌、链霉菌属(Streptomyces)菌、高温放线菌属(Thermoactinomyces)菌、高温单孢菌属(Thermomonospora)菌等放线菌。此外,这些酶可以被人工改变。另外,这些酶可以单独使用1种,也可以2种以上混合使用。
其中,特别优选来源于曲霉属(Aspergillus)的酶和来源于木霉属(Trichoderma)的酶。因为对结晶性纤维素活性高。
另外,纤维素酶也可以是一系列的酶群。作为该酶群,可列举内切葡聚糖酶(EC3.2.1.74)、纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)、β-葡糖苷酶(EC 23.2.4.1,EC 3.2.1.21)等。此外,优选将来源于不同微生物的纤维素酶混合使用。此时,通过它们的协同效果,可以进一步促进纤维素或半纤维素的糖化。
一般上述纤维素酶大多在pH值3~6的范围具有最适酶活性,但也可以是在pH值6~10的范围具有最适酶活性的被称为碱性纤维素酶的酶。另外,上述纤维素酶大多在反应温度25℃~50℃的范围具有最适酶活性,但也可以是在70℃~100℃的范围具有最适酶活性的被称为耐热性纤维素酶的酶。
本发明中胶态二氧化硅,平均一次粒径为1nm~400nm,优选为5nm~350nm,分散在糖化反应液中使用。平均一次粒径是由通过氮吸附法(BET法)测定的比表面积S(m2/g)通过换算式D(nm)=2720/S算出的。所述胶态二氧化硅,其一部分或全部成为糖化酶的担载体,与未固定化于胶态二氧化硅的糖化酶一起以分散状态使用。胶态二氧化硅作为分散的液中的粒径,用利用动态光散射法的测定粒径表示。在本发明中,期望动态光散射法的测定粒径大于等于5nm且小于500nm,优选为10nm~450nm。另外,二氧化硅不是多孔质、而是实心的二氧化硅。此外,胶态二氧化硅可以制成分散在水、甲醇、乙醇、丙酮、甲乙酮、乙二醇等分散介质中的分散液使用,分散液称为胶体溶液或溶胶等。可以在不抑制酶的活性的范围选择分散介质,但优选为水、乙醇。
另一方面,被称为沉降法二氧化硅的二氧化硅粉末是平均一次粒径为400nm以下、利用动态光散射法的测定粒径为500nm以上的多孔质粉末,即使悬浮在分散介质中也不显示胶体溶液的性质,且不具有本发明的胶态二氧化硅那样的高分散性。
作为胶态二氧化硅的制造方法,有以水玻璃为原料的水玻璃法、以金属醇盐为原料的醇盐法、以氯化硅化合物为原料的气相法等。可以使用通过任一制造法获得的胶态二氧化硅,但优选水玻璃法。
本发明的糖化反应液是以纤维素和半纤维素的至少一方为原料,使糖化酶和胶态二氧化硅分散而成的,且未固定化于胶态二氧化硅的糖化酶相对于全部糖化酶的比例为25%~100%。更优选未固定化于胶态二氧化硅的糖化酶相对于全部糖化酶的比例为50%~100%。如果未固定化于胶态二氧化硅的糖化酶相对于全部糖化酶的比例低于25%,则反应效率恶化,因而不优选。
其中,在糖化反应液中,糖化酶的浓度为0.005质量%~3.0质量%,优选为0.01质量%~1.0质量%。如果糖化酶的浓度低于0.005质量%,则反应效率降低而不优选,另一方面,如果高于3.0质量%,则不仅糖化酶难以溶解在溶液中,而且在经济上不适合。
另外,在糖化反应液中,胶态二氧化硅的浓度为0.005质量%~40质量%,优选为0.01质量%~10质量%。如果胶态二氧化硅的浓度低于0.005质量%,则反应效率降低而不优选,另一方面,如果高于40质量%,则不仅分散性恶化,而且在经济上不适合。
另外,在糖化反应液中,糖化酶与所述胶态二氧化硅的质量比率(糖化酶/胶态二氧化硅)为0.002~300,优选为0.1~10以下。如果两者的质量比率离开该范围,则反应效率的提高变得不显著。
另外,糖化反应液的pH值为3~11,优选为3~9,更优选为4~7。如果pH值低于3,则胶态二氧化硅发生凝集,糖化酶的反应效率降低,另一方面,如果高于11,则胶态二氧化硅变得容易溶解,因此不优选。
作为糖化反应液的pH值调节剂,可列举硫酸、盐酸、硝酸这样的无机酸、醋酸、草酸这样的羧酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸这样的羟酸、氢氧化钠、氢氧化钾这样的氢氧化物碱、氨、尿素等。只要在不阻碍本发明的效果的范围内,使用不特别限制其种类、浓度。另外,这些pH值调节剂可以单独使用1种,也可以2种以上混合使用。进而也可以以具有缓冲作用的缓冲液的状态使用。
另外,本发明的糖化反应液的反应温度为5℃~100℃,优选为20℃~55℃。如果反应温度低于5℃,则糖化反应的效率显著降低,如果高于100℃,则糖化酶可能失活,不优选。
此外,含有纤维素或半纤维素的纤维素系生物质的前处理以公知的范围进行即可。一般可以通过利用绞磨机等的物理粉碎、和利用酸或碱性处理化学地破坏木质素以及纤维素和半纤维素的结构,从而作为糖化反应用原料。
在制作糖化反应液时,可以在分散了糖化酶的反应液中添加胶态二氧化硅,也可以在分散了胶态二氧化硅的反应液中添加糖化酶。只要是在不抑制本发明的效果的范围,pH值调节剂等其他添加剂可以以任意的顺序添加。
进行糖化反应时,可以使用适当截留分子量的反渗透膜(RO)膜、超滤(UF)膜,将糖化酶和胶态二氧化硅、与葡萄糖等糖分离。优选截留分子量为1000~100000。如果截留分子量小于该范围,则虽然能够进行糖的分离但容易堵塞,膜透过速度显著降低,另外,如果大于该范围,则可能糖化酶、胶态二氧化硅与糖一起流出,不优选。
实施例
以下基于实施例更详细地叙述,但本发明不受该实施例任何限定。
胶态二氧化硅的平均一次粒径和利用动态光散射法的测定粒径分别使用以下的测定装置进行测定。
氮吸附法测定装置(平均一次粒径的测定):Monosorb MS-16(カンタクローム·インスツルメンツ·ジャパン合同会社制)
动态光散射法粒径测定装置:Zetasizer Nano S(マルバーンインスツルメンツ制)
(实施例1~7、比较例1的糖化酶组合物)
首先,按照以下的步骤制作纤维素酶水溶液作为糖化酶水溶液。此外,作为纤维素酶,使用在pH值3~6的范围具有最适酶活性的来源于黑曲霉(Aspergillus niger)属的纤维素酶(MP biomedicals制)。
首先,在去离子水85g中添加纤维素酶粉末15g,在室温下用磁力搅拌器一边搅拌一边溶解2小时,得到15质量%的纤维素酶水溶液。接着,将在水中分散了通过水玻璃法制造的实心球状胶态二氧化硅(平均一次粒径:35nm、利用动态光散射法的测定粒径:55nm)而得的碱性硅溶胶(pH值9.0、二氧化硅浓度40质量%)200g用强酸性氢型阳离子交换树脂アンバーライト(注册商标)IR-120B(オルガノ制)处理而除去碱金属离子,得到酸性硅溶胶(pH值2.1、二氧化硅浓度40质量%)200g。在所得的酸性硅溶胶15g中一边搅拌一边添加上述纤维素酶水溶液4.0g,进而为了调节pH值,添加1M当量的醋酸、醋酸钠(以下有时记为醋酸Na)、醋酸-醋酸Na缓冲液(pH值3.5~5.0)、0.5M当量的NaOH、HCl中的1种1.0g,得到二氧化硅浓度30质量%、纤维素酶浓度3质量%的糖化酶组合物。对于所得的糖化酶组合物确认利用动态光散射法的测定粒径,结果为55nm,胶态二氧化硅的分散体中的粒径未变化。
(实施例8的糖化酶组合物)
在水中分散了通过水玻璃法制造的实心球状胶态二氧化硅(平均一次粒径:35nm、利用动态光散射法的测定粒径:55nm)而得的碱性硅溶胶(pH值9.0、二氧化硅浓度40质量%)15g中,一边搅拌一边添加上述纤维素酶水溶液4.0g,进而为了调节pH值,添加1M当量的醋酸Na 0.5g和1M当量NaOH 0.5g,获得二氧化硅浓度30质量%、纤维素酶浓度3质量%的糖化酶组合物。对于所得的糖化酶组合物确认利用动态光散射法的测定粒径,结果为55nm,胶态二氧化硅的分散体中的粒径未变化。表1显示实施例1~8的糖化酶组合物。
(未固定化于胶态二氧化硅的糖化酶相对于全部糖化酶的比例的测定)
本发明的糖化酶组合物中,未固定化于胶态二氧化硅的糖化酶相对于全部糖化酶的比例,通过Bradford法(考马斯亮蓝法,CBB法)定量利用离心分离法获得的上清中的糖化酶的浓度,从而算出。
具体步骤如下。
在50mL离心沉降管中采取糖化酶组合物1.0mL,用高速冷却离心分离机SRX-201(トミー精工社制)以25,000G、30分钟、4℃的条件进行离心分离,获得上清液。接着,将蛋白质分析CBB溶液(5倍浓缩)(ナカライテスク制)用去离子交换水稀释至5倍而得的液体2.5mL添加到池长度10mm的一次性样品池中,接下来,添加上述的上清液0.05mL,密封。将混合溶液反复上下翻转而均匀混合。然后,静置30分钟,使用分光光度计UV-3150(岛津制作所制)测定波长595nm的吸光度。制作糖化酶浓度已知的试样,同样地测定吸光度而制成标准曲线。由所得的标准曲线计算出上清液的糖化酶浓度。
将上述方法所得的上清液的糖化酶浓度除以添加的糖化酶浓度再乘以100倍而得的值,作为未固定化于胶态二氧化硅的糖化酶相对于全部糖化酶的比例。将实施例1~8的糖化酶组合物的未固定化于胶态二氧化硅的糖化酶相对于全部糖化酶的比例与pH值的关系示于图1。判断未固定化于胶态二氧化硅的糖化酶相对于全部糖化酶的比例依赖于糖化酶组合物的pH值。
(比较例2~10的糖化酶组合物)
除了不添加胶态二氧化硅,取而代之用去离子水进行糖化酶的浓度调整以外,与实施例1~8同样地进行,得到不含胶态二氧化硅的糖化酶组合物。该糖化酶组合物示于表1。
(比较例11的糖化酶组合物)
将在水中分散了通过水玻璃法制造的实心球状胶态二氧化硅(平均一次粒径:35nm、利用动态光散射法的测定粒径:55nm)而得的碱性硅溶胶(pH值9.0、二氧化硅浓度40质量%)20g用强酸性氢型阳离子交换树脂アンバーライト(注册商标)IR-120B(オルガノ制)处理而除去碱金属离子,得到酸性硅溶胶(pH值2.1、二氧化硅浓度40质量%)20g。在所得的酸性硅溶胶15g中添加去离子水5g,得到二氧化硅浓度30质量%的糖化酶组合物。糖化酶组合物一并示于表1。
(实施例1~8的糖化反应液)
在实施例1~8的糖化酶组合物中添加微结晶纤维素粉末2.5质量%,使其分散制成糖化反应液。
具体步骤如下。
在20mL的玻璃瓶中加入各糖化酶组合物10mL,在用10mm的搅拌子搅拌的状态下,添加微结晶纤维素粉末(MP biomedicals制)0.25g(相当于25mg/mL),然后密封。
(实施例1~8的糖的制造方法)
使实施例1~8的糖化反应液在24℃的恒温室中、在搅拌下进行14天酶反应。
糖化反应液的酶反应的反应温度、以及3天后和14天后如下测定糖化率的结果示于表2。实施例1~8的糖化反应液的酶反应14天后的糖化率与pH值的关系示于图2。
(比较例1~11)
糖化反应液的制作和糖的制造方法与实施例1~8同样地进行。结果示于表2。另外,比较例1~8的糖化反应液的酶反应14天后的糖化率与pH值的关系示于图2。由图1、图2判断,各pH值区域中,与单独的糖化酶相比,配合了胶态二氧化硅、且未固定化于胶态二氧化硅的糖化酶相对于全部糖化酶的比例为42%~100%的糖化反应液的糖化率更高。
(糖化率的测定)
使用酶法(G6PDH-HK法)定量糖化反应液的酶反应时的葡萄糖生成浓度,计算出糖化率。
在2mL微芯片上采取糖化反应液的试样0.5mL,在110℃加热30分钟使酶失活。接着,为了除去未反应的纤维素和胶态二氧化硅,将试样移入50mL离心沉降管,用高速冷却离心分离机SRX-201(トミー精工社制)以25,000G、30分钟、4℃的条件进行离心分离。离心分离后立即回收其上清液。酶法使用F-キットグルコース(J.K.インターナショナル制)。使用分光光度计UV-3150(岛津制作所制)测定波长340nm的吸光度(池长度10mm)。
具体步骤如下。
在池长度10mm的一次性样品池中添加F-キット溶液I 1.0mL,接下来,添加上述上清液0.1mL和去离子水1.9mL,密封。接着将该混合溶液反复上下翻转而均匀地混合。然后,静置3分钟,使用分光光度计测定生成的上清部分的波长340nm的吸光度,作为E1。接着,添加F-キット溶液II 0.02mL,反复上下翻转而均匀地混合。然后,静置15分钟,使用分光光度计测定生成的上清部分的波长340nm的吸光度,作为E2。空白的吸光度使用代替上清液而使用去离子水进行测定而得的值。
D-葡萄糖的浓度由以下式求得。
ΔE=(E2-E1)试样-(E2-E1)空白
V(反应液量):3.02[mL]
Mw(分子量):180.16[g/mol]
d(光路长):1[cm]
ε(吸光系数):6.3[mmol-1·cm-1]
v(样本量):0.1[mL]
将通过上述方法测定的糖化反应液的酶反应时的葡萄糖生成浓度除以添加的微结晶纤维素粉末浓度(相当于25mg/mL)再乘以100倍而得的值作为糖化率。
[表1]
pH值调节剂
A:醋酸
B:醋酸钠缓冲液(pH值=3.5)
C:醋酸钠缓冲液(pH值=4.0)
D:醋酸钠缓冲液(pH值=4.5)
E:醋酸钠缓冲液(pH值=5.0)
F:醋酸钠
G:NaOH
H:HCl
[表2]
(实施例9~26的糖化酶组合物)
首先,通过以下步骤制作纤维素酶水溶液糖化酶水溶液。此外,作为纤维素酶,使用在pH值3~6的范围具有最适酶活性的来源于黑曲霉(Aspergillus niger)属的纤维素酶(MP biomedicals制)。
首先,在去离子水90g中添加纤维素酶粉末10g,在室温下用磁力搅拌器一边搅拌一边溶解2小时,得到10质量%的纤维素酶水溶液。接着,将在水中分散了通过水玻璃法制造的实心球状胶态二氧化硅(平均一次粒径:35nm、利用动态光散射法的测定粒径:55nm)而得的碱性硅溶胶(pH值9.0、二氧化硅浓度40质量%)200g用强酸性氢型阳离子交换树脂アンバーライト(注册商标)IR-120B(オルガノ制)处理而除去碱金属离子,获得酸性硅溶胶(pH值2.1、二氧化硅浓度40质量%)200g。在所得的酸性硅溶胶中一边搅拌一边添加去离子水、上述的10质量%纤维素酶水溶液,进而为了调节pH值,添加1M当量的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH值4.0)0.05M当量,获得二氧化硅浓度0.01~38质量%、纤维素酶浓度0.1~3质量%的糖化酶组合物。对于所得的糖化酶组合物确认利用动态光散射法的测定粒径,结果为55nm,胶态二氧化硅的分散体中的粒径未变化。
表3显示实施例9~26的糖化酶组合物。
(比较例12~14的糖化酶组合物)
除了不添加胶态二氧化硅,取而代之用去离子水进行糖化酶的浓度调整以外,与实施例9~26同样地进行。糖化酶组合物示于表3。
糖化反应液的制作、糖的制造方法、糖化反应效率的测定与实施例1~8同样地进行。糖化率的测定结果示于表4。另外,实施例3、9~13、比较例4的糖化反应液的酶反应14天后的糖化率与二氧化硅浓度的关系示于图4。判断在未固定化于胶态二氧化硅的糖化酶相对于全部糖化酶的比例为25%~100%的糖化反应液中,在二氧化硅浓度为0.01~30质量%的范围显示高糖化率,也比不含胶态二氧化硅的情况糖化率高。在实施例22中,判断二氧化硅浓度为38质量%也显示高糖化率,也也比不含胶态二氧化硅的情况糖化率高。
进而判断,在未固定化于胶态二氧化硅的糖化酶相对于全部糖化酶的比例为25%~100%的糖化反应液中,在糖化酶浓度为0.1~3.0质量%的范围显示高糖化率,也比不含胶态二氧化硅的情况糖化率高。
另外,实施例3、9~13、比较例4的糖化反应液的酶反应14天后的糖化率、和糖化酶与胶态二氧化硅的质量比率(糖化酶/胶态二氧化硅)的关系示于图5。
实施例22~26、比较例14的糖化反应液的酶反应14天后的糖化率、和糖化酶与胶态二氧化硅的质量比率(糖化酶/胶态二氧化硅)的关系示于图6。
由图5、6判断,在未固定化于胶态二氧化硅的糖化酶相对于全部糖化酶的比例为25%~100%的糖化反应液中,在糖化酶与胶态二氧化硅的质量比率(糖化酶/胶态二氧化硅)为0.003~300的范围显示高糖化率,也比不含胶态二氧化硅的情况糖化率高。
进而,实施例20、27~31、比较例13的糖化反应液的酶反应14天后的糖化率与一次粒径的关系示于图7。判断在未固定化于胶态二氧化硅的糖化酶相对于全部糖化酶的比例为25%~100%的糖化反应液中,在胶态二氧化硅的平均一次粒径为5nm~310nm显示高糖化率,也比不含胶态二氧化硅的情况糖化率高。
[表3]
[表4]
(实施例27的糖化酶组合物)
首先,通过以下步骤制作纤维素酶水溶液作为糖化酶水溶液。此外,作为纤维素酶,使用在pH值3~6的范围具有最适酶活性的来源于黑曲霉(Aspergillus niger)属的纤维素酶(MP biomedicals制)。
接着,在水中分散了通过水玻璃法制造的实心球状胶态二氧化硅(平均一次粒径:5nm、利用动态光散射法的测定粒径:15nm)而得的酸性硅溶胶(pH值2.8、二氧化硅浓度10质量%)10g中,一边搅拌一边添加去离子水8.0g、上述的10质量%纤维素酶水溶液1.0g,进而为了调节pH值,添加1M当量的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH值4.0)1.0g添加,获得二氧化硅浓度5质量%、纤维素酶浓度0.5质量%的糖化酶组合物。对于所得的糖化酶组合物确认利用动态光散射法的测定粒径,结果为15nm,胶态二氧化硅的分散体中的粒径未变化。
(实施例28的糖化酶组合物)
在水中分散了通过水玻璃法制造的实心球状胶态二氧化硅(平均一次粒径:12nm、利用动态光散射法的测定粒径:20nm)而得的酸性硅溶胶(pH值2.6、二氧化硅浓度20质量%)5.0g中,一边搅拌一边添加去离子水13.0g、上述的10质量%纤维素酶水溶液1.0g,进而为了调节pH值,添加1M当量的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH值4.0)1.0g,获得二氧化硅浓度5质量%、纤维素酶浓度0.5质量%的糖化酶组合物。对于所得的糖化酶组合物确认利用动态光散射法的测定粒径,结果为20nm,胶态二氧化硅的分散体中的粒径未变化。
(实施例29的糖化酶组合物)
将在水中分散了通过水玻璃法制造的实心球状胶态二氧化硅(平均一次粒径:80nm、利用动态光散射法的测定粒径:120nm)而得的碱性硅溶胶(pH值9.5、二氧化硅浓度40质量%)20g用强酸性氢型阳离子交换树脂アンバーライト(注册商标)IR-120B(オルガノ制)处理而除去碱金属离子,获得酸性硅溶胶(pH值2.0、二氧化硅浓度40质量%)20g。在所得的酸性硅溶胶2.5g中一边搅拌一边添加去离子水15.5g、上述的10质量%纤维素酶水溶液1.0g,进而为了调节pH值,添加1M当量的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH值4.0)1.0g,获得二氧化硅浓度5质量%、纤维素酶浓度0.5质量%的糖化酶组合物。对于所得的糖化酶组合物确认利用动态光散射法的测定粒径,结果为120nm,胶态二氧化硅的分散体中的粒径未变化。
(实施例30的糖化酶组合物)
将在水中分散了通过水玻璃法制造的实心球状胶态二氧化硅(平均一次粒径:160nm、利用动态光散射法的测定粒径:200nm)而得的碱性硅溶胶(pH值9.3、二氧化硅浓度40质量%)20g用强酸性氢型阳离子交换树脂アンバーライト(注册商标)IR-120B(オルガノ制)处理而除去碱金属离子,获得酸性硅溶胶(pH值2.3、二氧化硅(SiO2)浓度40质量%)20g。在所得的酸性硅溶胶2.5g中一边搅拌一边添加去离子水15.5g、上述的10质量%纤维素酶水溶液1.0g,进而为了调节pH值,添加1M当量的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH值4.0)1.0g,获得二氧化硅浓度5质量%、纤维素酶浓度0.5质量%的糖化酶组合物。对于所得的糖化酶组合物确认利用动态光散射法的测定粒径,结果为200nm,胶态二氧化硅的分散体中的粒径未变化。
(实施例31的糖化酶组合物)
将在水中分散了通过水玻璃法制造的实心球状胶态二氧化硅(平均一次粒径:310nm、利用动态光散射法的测定粒径:450nm)而得的碱性硅溶胶(pH值8.5、二氧化硅浓度40质量%)20g用强酸性氢型阳离子交换树脂アンバーライト(注册商标)IR-120B(オルガノ制)处理而除去碱金属离子,获得酸性硅溶胶(pH值3.3、二氧化硅浓度40质量%)20g。在所得的酸性硅溶胶2.5g中一边搅拌一边添加去离子水15.5g、上述的10质量%纤维素酶水溶液1.0g,进而为了调节pH值,添加1M当量的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH值4.0)1.0g,获得二氧化硅浓度5质量%、纤维素酶浓度0.5质量%的糖化酶组合物。对于所得的糖化酶组合物确认利用动态光散射法的测定粒径,结果为450nm,胶态二氧化硅的分散体中的粒径未变化。
表5显示实施例27~31的糖化酶组合物。
糖化反应液的制作、糖的制造方法、糖化反应效率的测定与实施例1~8同样地进行。糖化率的测定结果示于表6。
[表5]
[表6]
(实施例32~37的糖化酶组合物)
首先,通过以下步骤制作纤维素酶水溶液作为糖化酶水溶液。此外,作为纤维素酶,使用在pH值3~6的范围具有最适酶活性的来源于里氏木霉(Trichoderma reesei)属的纤维素酶(Sigma Aldrich制)。
首先,在去离子水9g中添加纤维素酶粉末1g,在室温用磁力搅拌器一边搅拌一边溶解2小时,获得10质量%的纤维素酶水溶液。接着,将在水中分散了通过水玻璃法制造的实心球状胶态二氧化硅(平均一次粒径:35nm、利用动态光散射法的测定粒径:55nm)而得的碱性硅溶胶(pH值9.0、二氧化硅浓度40质量%)20g用强酸性氢型阳离子交换树脂アンバーライト(注册商标)IR-120B(オルガノ制)处理而除去碱金属离子,获得酸性硅溶胶(pH值2.1、二氧化硅浓度40质量%)20g。在所得的酸性硅溶胶中一边搅拌一边添加去离子水、上述的10质量%纤维素酶水溶液,进而为了调节pH值,添加1M当量的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH值4.0)0.05M当量,获得二氧化硅浓度0.01~10质量%、纤维素酶浓度0.01~1质量%的糖化酶组合物。对于所得的糖化酶组合物确认利用动态光散射法的测定粒径,结果为55nm,胶态二氧化硅的分散体中的粒径未变化。
表7显示实施例32~37的糖化酶组合物。
(比较例15~20的糖化酶组合物)
除了不添加胶态二氧化硅,取而代之用去离子水进行糖化酶的浓度调整以外,与实施例32~37同样地进行。糖化酶组合物示于表7。
糖化反应液的制作、糖的制造方法、糖化反应效率的测定与实施例1~8同样地进行。糖化率的测定结果示于表8。
判断在未固定化于胶态二氧化硅的糖化酶相对于全部糖化酶的比例为25%~100%的糖化反应液中,来源于里氏木霉(Trichoderma reesei)属的纤维素酶也与来源于黑曲霉(Aspergillus niger)属的纤维素酶同样地显示高糖化率,也比不含胶态二氧化硅的情况糖化率高。
另外判断,在未固定化于胶态二氧化硅的糖化酶相对于全部糖化酶的比例为25%~100%的糖化反应液中,在二氧化硅浓度为0.01~10质量%的范围显示高糖化率,也比不含胶态二氧化硅的情况糖化率高。
进而判断,在未固定化于胶态二氧化硅的糖化酶相对于全部糖化酶的比例为25%~100%的糖化反应液中,在糖化酶浓度为0.01~1.0质量%的范围显示高糖化率,也比不含胶态二氧化硅的情况糖化率高。
[表7]
[表8]
(实施例38~43的糖化酶组合物)
首先,通过以下步骤制作纤维素酶水溶液作为糖化酶水溶液。此外,作为纤维素酶,使用在pH值3~6的范围具有最适酶活性的来源于里氏木霉(Trichoderma reesei)属的纤维素酶(Sigma Aldrich制)。
首先,在去离子水9.5g中添加纤维素酶粉末0.5g,在室温用磁力搅拌器一边搅拌一边溶解2小时,获得5质量%的纤维素酶水溶液。接着,将在水中分散了通过水玻璃法制造的实心球状胶态二氧化硅(平均一次粒径:35nm、利用动态光散射法的测定粒径:55nm)而得的碱性硅溶胶(pH值9.0、二氧化硅浓度40质量%)20g用强酸性氢型阳离子交换树脂アンバーライト(注册商标)IR-120B(オルガノ制)处理而除去碱金属离子,获得酸性硅溶胶(pH值2.1、二氧化硅浓度40质量%)20g。在所得的酸性硅溶胶中一边搅拌一边添加去离子水、上述的5质量%纤维素酶水溶液,进而为了调节pH值,添加1M当量的醋酸-醋酸Na缓冲液(pH值4.0~6.0)中的1种0.05M当量,获得二氧化硅浓度5质量%、纤维素酶浓度0.01~0.5质量%的糖化酶组合物。对于所得的糖化酶组合物确认利用动态光散射法的测定粒径,结果为55nm,胶态二氧化硅的分散体中的粒径未变化。
表9显示实施例38~43的糖化酶组合物。
(比较例21~26的糖化酶组合物)
除了不添加胶态二氧化硅,取而代之用去离子水进行糖化酶的浓度调整以外,与实施例38~43同样地进行。糖化酶组合物示于表9。
关于糖化反应液的制作,除了将微结晶纤维素粉末变更为添加5.0质量%以外,与实施例1~8同样地进行。关于糖的制造方法,除了将酶反应期间变更为7天、反应温度变更为40℃或50℃以外,与实施例1~8同样地进行。糖化反应效率的测定与实施例1~8同样地进行。糖化率的测定结果示于表10。
判断在未固定化于胶态二氧化硅的糖化酶相对于全部糖化酶的比例为25%~100%的糖化反应液中,在糖化酶与胶态二氧化硅的质量比率(糖化酶/胶态二氧化硅)为0.002~0.1的范围显示高糖化率,也比不含胶态二氧化硅的情况糖化率高。
[表9]
I:醋酸钠缓冲液(pH值=6.0)
[表10]
(实施例44的糖化酶组合物)
首先,通过以下步骤制作纤维素酶水溶液作为糖化酶水溶液。此外,作为纤维素酶,使用在pH值3~6的范围具有最适酶活性的来源于黑曲霉(Aspergillus niger)属的纤维素酶(MP biomedicals制)。
首先,在去离子水38g中添加纤维素酶粉末2.0g,在室温用磁力搅拌器一边搅拌一边溶解2小时,获得5质量%的纤维素酶水溶液。接着,在水中分散了通过水玻璃法制造的实心球状胶态二氧化硅(平均一次粒径:45nm、利用动态光散射法的测定粒径:75nm)而得的酸性硅溶胶(pH值2.9、二氧化硅浓度20质量%)5.0g中边搅拌一边添加去离子水12.0g、上述的5质量%纤维素酶水溶液2.0g,进而为了调节pH值,添加1M当量的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH值4.0)1.0g,获得二氧化硅浓度5质量%、纤维素酶浓度0.5质量%的糖化酶组合物。
(实施例45的糖化酶组合物)
在水中分散了通过水玻璃法制造的实心球状胶态二氧化硅(平均一次粒径:45nm、利用动态光散射法的测定粒径:75nm)而得的酸性硅溶胶(pH值2.9、二氧化硅浓度20质量%)5.0g中一边搅拌一边添加去离子水12.0g、アルファイン83(聚合氯化铝、大明化学工业制)7ppm、上述的5质量%纤维素酶水溶液2.0g,进而为了调节pH值,添加1M当量的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH值4.0)1.0g,获得二氧化硅浓度5质量%、纤维素酶浓度0.5质量%的糖化酶组合物。
(实施例46的糖化酶组合物)
在水中分散了通过水玻璃法制造的实心球状胶态二氧化硅(平均一次粒径:45nm、利用动态光散射法的测定粒径:75nm)而得的酸性硅溶胶(pH值2.9、二氧化硅浓度20质量%)5.0g中一边搅拌一边添加去离子水12.0g、アルファイン83(聚合氯化铝、大明化学工业制)10ppm、上述的5质量%纤维素酶水溶液2.0g,进而为了调节pH值,添加1M当量的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH值4.0)1.0g,获得二氧化硅浓度5质量%、纤维素酶浓度0.5质量%的糖化酶组合物。
(实施例47的糖化酶组合物)
在水中分散了通过水玻璃法制造的实心球状胶态二氧化硅(平均一次粒径:45nm、利用动态光散射法的测定粒径:75nm)而得的酸性硅溶胶(pH值2.9、二氧化硅浓度20质量%)5.0g中一边搅拌一边添加去离子水12.0g、アルファイン83(聚合氯化铝、大明化学工业制)14ppm、上述的5质量%纤维素酶水溶液2.0g,进而为了调节pH值,添加1M当量的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH值4.0)1.0g,获得二氧化硅浓度5质量%、纤维素酶浓度0.5质量%的糖化酶组合物。
(实施例48的糖化酶组合物)
在水中分散了通过水玻璃法制造的实心球状胶态二氧化硅(平均一次粒径:45nm、利用动态光散射法的测定粒径:75nm)而得的酸性硅溶胶(pH值2.9、二氧化硅浓度20质量%)5.0g中一边搅拌一边添加去离子水12.0g、アルファイン83(聚合氯化铝、大明化学工业制)15ppm、上述的5质量%纤维素酶水溶液2.0g,进而为了调节pH值,添加1M当量的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH值4.0)1.0g,获得二氧化硅浓度5质量%、纤维素酶浓度0.5质量%的糖化酶组合物。
(实施例49的糖化酶组合物)
在水中分散了通过水玻璃法制造的实心球状胶态二氧化硅(平均一次粒径:45nm、利用动态光散射法的测定粒径:75nm)而得的酸性硅溶胶(pH值2.9、二氧化硅浓度20质量%)5.0g中一边搅拌一边添加去离子水12.0g、アルファイン83(聚合氯化铝、大明化学工业制)16ppm、上述的5质量%纤维素酶水溶液2.0g,进而为了调节pH值,添加1M当量的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH值4.0)1.0g,获得二氧化硅浓度5质量%、纤维素酶浓度0.5质量%的糖化酶组合物。
(比较例27的糖化酶组合物)
在水中分散了通过水玻璃法制造的实心球状胶态二氧化硅(平均一次粒径:45nm、利用动态光散射法的测定粒径:75nm)而得的酸性硅溶胶(pH值2.9、二氧化硅浓度20质量%)5.0g中一边搅拌一边添加去离子水12.0g、アルファイン83(聚合氯化铝、大明化学工业制)20ppm、上述的5质量%纤维素酶水溶液2.0g,进而为了调节pH值,添加1M当量的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH值4.0)1.0g,获得二氧化硅浓度5质量%、纤维素酶浓度0.5质量%的糖化酶组合物。
(比较例28的糖化酶组合物)
在水中分散了通过水玻璃法制造的实心球状胶态二氧化硅(平均一次粒径:45nm、利用动态光散射法的测定粒径:75nm)而得的酸性硅溶胶(pH值2.9、二氧化硅浓度20质量%)5.0g中一边搅拌一边添加去离子水12.0g、アルファイン83(聚合氯化铝、大明化学工业制)27ppm、上述的5质量%纤维素酶水溶液2.0g,进而为了调节pH值,添加1M当量的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH值4.0)1.0g,获得二氧化硅浓度5质量%、纤维素酶浓度0.5质量%的糖化酶组合物。
(比较例29的糖化酶组合物)
除了不添加胶态二氧化硅,取而代之用去离子水进行糖化酶的浓度调整以外,与实施例44~49同样地进行,获得不含胶态二氧化硅的糖化酶组合物。该糖化酶组合物示于表11。
表11显示实施例44~49的糖化酶组合物。
糖化反应液的制作、糖化反应效率的测定与实施例1~8同样地进行。关于糖的制造方法,除了将酶反应期间变更为7天以外与实施例1~8同样地进行。糖化率的测定结果示于表12。另外,实施例44~49的糖化反应液的酶反应7天后的糖化组合物中的未固定化于胶态二氧化硅的糖化酶相对于全部糖化酶的比例的依赖性示于图3。判断糖化酶与胶态二氧化硅的质量比率(糖化酶/胶态二氧化硅)和pH值一定的情况下,糖化率依赖于未固定化于胶态二氧化硅的糖化酶相对于全部糖化酶的比例,在未固定化于胶态二氧化硅的糖化酶相对于全部糖化酶的比例为27%~77%显示高糖化率。
[表11]
[表12]
(比较例30的糖化酶组合物)
首先,在去离子水9g中添加纤维素酶粉末1g,在室温用磁力搅拌器一边搅拌一边溶解2小时,获得10质量%的纤维素酶水溶液。接着,在沉降法二氧化硅粉末(商品名:カープレックス#80、DSL.ジャパン制、平均一次粒径:7nm、利用动态光散射法的测定粒径:1750nm)0.1g中一边搅拌一边添加去离子水17.9g、上述的10质量%纤维素酶水溶液1.0g,进而为了调节pH值,添加1M当量的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH值4.0)1.0g,获得二氧化硅浓度5质量%、纤维素酶浓度0.5质量%的糖化酶组合物。
(比较例31的糖化酶组合物)
在沉降法二氧化硅粉末(商品名:トクシールGU-N、トクヤマ制、平均一次粒径:11nm、利用动态光散射法的测定粒径:4740nm)0.1g中一边搅拌一边添加去离子水17.9g、上述的10质量%纤维素酶水溶液1.0g,进而为了调节pH值,添加1M当量的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH值4.0)1.0g,获得二氧化硅浓度5质量%、纤维素酶浓度0.5质量%的糖化酶组合物。
表13显示比较例30、31的糖化酶组合物。
糖化反应液的制作、糖的制造方法、糖化反应效率的测定与实施例1~8同样地进行。糖化率的测定结果示于表14。与胶态二氧化硅不同,判断利用沉降法所得的二氧化硅粉末时糖化率不提高。
[表13]
[表14]
Claims (9)
1.一种糖化反应液,其特征在于,是将纤维素和半纤维素的至少一方进行糖化的糖化反应液,其中,以分散状态含有纤维素和半纤维素的至少一方、糖化酶和胶态二氧化硅,且未固定化于胶态二氧化硅的糖化酶相对于全部糖化酶的比例为25%~100%。
2.根据权利要求1所述的糖化反应液,其特征在于,所述胶态二氧化硅的平均一次粒径为1nm~400nm,且利用动态光散射法的测定粒径为大于等于5nm且小于500nm。
3.根据权利要求1或2所述的糖化反应液,其特征在于,所述糖化酶的浓度为0.005质量%~3.0质量%。
4.根据权利要求1~3的任一项所述的糖化反应液,其特征在于,所述胶态二氧化硅的浓度为0.005质量%~40质量%。
5.根据权利要求1~4的任一项所述的糖化反应液,其特征在于,所述糖化酶与所述胶态二氧化硅的质量比率即糖化酶/胶态二氧化硅为0.002~300。
6.根据权利要求1~5的任一项所述的糖化反应液,其特征在于,pH值为3~11。
7.根据权利要求1~6的任一项所述的糖化反应液,其特征在于,所述糖化酶包含来源于曲霉属(Aspergillus)的糖化酶和来源于木霉属(Trichoderma)的糖化酶的至少一方。
8.一种糖化酶组合物,其特征在于,是将纤维素和半纤维素的至少一方进行糖化的糖化组合物,其中,以分散状态含有糖化酶、和平均一次粒径为1nm~400nm且利用动态光散射法的测定粒径大于等于5nm且小于500nm的胶态二氧化硅,且未固定化于胶态二氧化硅的糖化酶相对于全部糖化酶的比例为25%~100%。
9.糖的制造方法,其特征在于,使用权利要求1~7的任一项所述的糖化反应液来制造糖。
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Citations (2)
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---|---|---|---|---|
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KR20140076140A (ko) * | 2012-12-12 | 2014-06-20 | 주식회사 젠닥스 | 실리카 나노입자에 고정화된 정제되지 않은 셀룰라아제를 이용한 바이오매스의 당화율을 증진시키는 방법 |
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---|---|---|---|---|
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Patent Citations (2)
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---|---|---|---|---|
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KR20140076140A (ko) * | 2012-12-12 | 2014-06-20 | 주식회사 젠닥스 | 실리카 나노입자에 고정화된 정제되지 않은 셀룰라아제를 이용한 바이오매스의 당화율을 증진시키는 방법 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
JASON S. LUPOI等: "Evaluation of Nanoparticle-Immobilized Cellulase for Improved Ethanol Yield in Simultaneous Saccharification and Fermentation Reactions", 《BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING》 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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CN111373037B (zh) * | 2017-11-22 | 2023-04-18 | 国立大学法人东京大学 | 壳多糖分解酶组合物、壳多糖分解反应液及糖的制造方法 |
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