CN106573039A - 与溶酶体酶融合的载有甘露糖‑6‑磷酸的肽 - Google Patents

Abstract

一种靶向治疗剂，其包括溶酶体酶和溶酶体靶向部分，所述溶酶体靶向部分是含有至少一个N‑连接的糖基化位点的肽。产生所述靶向治疗剂的方法可包括编码所述靶向治疗剂的核苷酸和共同表达GNPT的宿主细胞。包含所述靶向治疗剂的药物组合物和使用其治疗溶酶体贮积病的方法。

Description

与溶酶体酶融合的载有甘露糖-6-磷酸的肽

相关申请的交叉引用

本申请要求2014年8月11日提交的美国临时专利申请No.62/036,082的优先权，该临时专利申请的公开内容在此整体并入。

发明背景

超过四十种溶酶体贮积病直接或间接由一种或多种溶酶体酶的缺少或缺乏引起。山菲立普综合症(Sanfilippo syndrome)或粘多糖贮积症III(MPS III)是一种此类疾病。它是一种罕见的遗传病，特征为缺乏参与糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAG)降解的酶。

已经鉴别MPS III的四种不同形式，称为MPS III A、B、C和D。每一者的特征为缺少或缺乏不同溶酶体酶。IIIB型粘多糖贮积症(MPS IIIB；B型山菲立普病)是一种由酶a-N-乙酰基-氨基葡糖苷酶(Naglu)缺乏引起的常染色体隐性遗传病，导致硫酸乙酰肝素积累在特别是脑中神经元和胶质细胞的溶酶体中，以及硫酸乙酰肝素在别处的其它溶酶体积累。MPSIIIB本身主要显现在脑中。

酶替代疗法(ERT)已用于递送酶以治疗各种溶酶体贮积病。通常，溶酶体酶在细胞溶质中合成，然后横越内质网(ER)，在内质网中其经N-连接的高甘露糖型碳水化合物糖基化。在高尔基体中，糖蛋白上的高甘露糖碳水化合物接着经一系列糖基转移酶修饰，变成成熟N-聚糖；修饰之一是添加甘露糖-6-磷酸(M6P)。携带此修饰的蛋白质接着经由M6P部分与非阳离子依赖性甘露糖-6-磷酸受体(CI-MPR)的结合而靶向溶酶体。酶替代疗法的功效关键取决于代替酶的适当溶酶体靶向。然而，重组产生的Naglu蛋白的特征为M6P磷酸化显著缺少，使得此酶的溶酶体靶向和其有效用于ERT的用途很难。

因此，仍然需要研发一种溶酶体靶向的替代方法以保证有效的酶替代疗法。

发明概要

本发明提供一种靶向治疗剂，其包括溶酶体酶和溶酶体靶向部分，其中所述溶酶体靶向部分是含有至少一个N-连接的糖基化位点的肽。

在一些实施方案中，肽含有N-连接的糖基化。在一些实施方案中，肽含有含M6P基团的N-连接的糖基化。

在一些实施方案中，溶酶体酶选自表2。在一些实施方案中，溶酶体酶是N-乙酰葡糖胺糖苷酶(Naglu)蛋白质。在一些实施方案中，Naglu蛋白质包括与SEQ ID NO.：1至少80％、90％或95％一致的氨基酸序列。在一些实施方案中，Naglu蛋白质包括与SEQ ID NO.：1一致的氨基酸序列。

在一些实施方案中，溶酶体靶向部分是选自以下的肽：鞘脂激活蛋白原、白血病抑制因子、E1A刺激基因的细胞阻遏子以及其片段。在一些实施方案中，肽包括与SEQ IDNO.4、6或9至少80％、90％或95％一致的序列。在一些实施方案中，肽包括与SEQ ID NO.4、6或9一致的序列。

在一些实施方案中，靶向治疗剂是融合蛋白。在一些实施方案中，溶酶体靶向部分融合至溶酶体酶的N端。在一些实施方案中，溶酶体靶向部分融合至溶酶体酶的C端。在一些实施方案中，溶酶体靶向部分与溶酶体酶经由连接子融合。在一些实施方案中，连接子包含序列GAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAP(SEQ ID NO.：15)。在一些实施方案中，融合蛋白与SEQ ID NO.18、19或20的氨基酸序列至少80％或95％一致。在一些实施方案中，融合蛋白与SEQ ID NO.18、19或20的氨基酸序列一致。

在一些实施方案中，靶向治疗剂是融合蛋白。在一些实施方案中，溶酶体靶向部分融合至溶酶体酶的N端。在一些实施方案中，溶酶体靶向部分融合至溶酶体酶的C端。在一些实施方案中，溶酶体靶向部分与溶酶体酶经由连接子融合。在一些实施方案中，连接子包含序列GAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAP(SEQ ID NO.：15)。在一些实施方案中，融合蛋白与SEQ ID NO.23、24或25的氨基酸序列至少80％或95％一致。在一些实施方案中，融合蛋白与SEQ ID NO.23、24或25的氨基酸序列一致。

在一方面，本发明提供一种编码本文中公开的任一融合蛋白的核酸。在一方面，本发明提供一种包括本文中公开的任一核酸的载体，和一种包括所述载体的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞选自细菌、酵母、昆虫、哺乳动物或人细胞。在一些实施方案中，细胞是CHO细胞系。

在一些实施方案中，宿主细胞共同表达N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶(GNPT)。在一些实施方案中，宿主细胞包括编码GNPT的外源性核酸。在一些实施方案中，宿主细胞具有活化的内源性GNPT表达。

在一方面，本发明提供一种用于产生靶向治疗融合蛋白的方法，其包括培养包含编码本文中描述的融合蛋白的核酸的细胞，其中所述细胞共同表达N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶(GNPT)，且回收由所述细胞产生的融合蛋白。

在一方面，本发明提供一种药物组合物，其包括本文中描述的任一靶向治疗剂和药学上可接受的载剂。在一方面，本发明提供一种治疗溶酶体贮积病的方法，其通过向需要治疗的受试者施用本文中描述的任一药物组合物。在一些实施方案中，溶酶体贮积病是B型山菲立普综合症。在一些实施方案中，药物组合物经静脉内、皮下、鞘内和/或其组合施用。

图示简单说明

图1展示Naglu-IGFII、Naglu-CREG和Naglu-SapDC融合蛋白的M6P受体体外结合分析。

图2展示Naglu-IGFII和Naglu-LIF融合蛋白的M6P受体体外结合分析。

图3展示监测M6P受体介导的Naglu-CREG、Naglu-SapDC和Naglu-LIF融合蛋白的细胞摄取的体外分析以及与由相同分析测定的Naglu-IGFII的细胞摄取比较的结果。

图4展示使用抗M6P抗体的蛋白质印迹分析，展示野生型HT1080细胞或过度表达N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶(GNPT)的细胞系中产生的酸性α-萄糖苷酶(GAA)、Naglu-LIF融合蛋白(Naglu-LIF)、芳基硫酸酯酶A(ARSA)、艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(I2S)、乙酰肝素-N-硫酸胺酶(HNS)和葡糖脑苷脂酶(GCB)蛋白质的M6P相对含量。蛋白质印迹分析在使用糖苷内切酶H去除M6P前(-)和后(+)进行。

图5证实当在野生型HT1080细胞或过度表达N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶(GNPT)的细胞系中产生时艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(I2S)与M6P受体结合的体外结合。

图6说明在野生型HT1080细胞或过度表达N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶(GNPT)的细胞系中产生的艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(I2S)的体外细胞摄取。

图7展示HT 1080细胞或过度表达GNPT的细胞系(GlcNAc-P-T)中产生的重组Naglu蛋白质的体外M6P受体结合。

图8展示HT1080细胞或过度表达GNPT的细胞系(GlcNAc-P-T)中产生的各种Naglu融合蛋白的体外M6P受体结合。

图9展示通过PAD-HPLC，对来源于Naglu-SapDC和Naglu-LIF的M6P单糖进行定量。I2S的M6P含量用作对照。

图10说明在野生型HT1080细胞或过度表达N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶(GNPT)的细胞系中产生的Naglu-SapDC的体外细胞摄取。Naglu-IGFII的细胞摄取用作对照。

图11说明在野生型HT1080细胞或过度表达N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶(GNPT)的细胞系中产生的Naglu-LIF的体外细胞摄取。Naglu-IGFII的细胞摄取用作对照。

图12A-B证实在鞘内递送媒介物对照或Naglu-SapDC或Naglu-LIF融合蛋白至Naglu敲除小鼠后，小鼠(A)肝和(B)脑组织中的体内Naglu酶活性。

图13A-F展示组织中Naglu蛋白质的免疫组织化学检测。在已经接受每周三次媒介物对照或(A)Naglu-SapDC或(C)Naglu-LIF融合蛋白鞘内注射的Naglu敲除小鼠的大脑皮质和小脑的神经元中可检测到Naglu蛋白质。圈出注射Naglu-SapDC和Naglu-LIF的小鼠的大脑皮质中Naglu⁺染色神经元(分别B和D)。类似地，在每周三次媒介物对照或Naglu-SapDC(E)或Naglu-LIF(F)鞘内注射后Naglu敲除小鼠的肝中检测到Naglu。

图14证实在鞘内递送媒介物对照或Naglu-SapDC和Naglu-LIF融合蛋白至Naglu敲除小鼠后，小鼠肝中的体内葡糖胺聚糖(GAG)水平。

图15证实在每周两次和三次鞘内注射媒介物对照或Naglu-SapDC和Naglu-LIF融合蛋白至Naglu敲除小鼠后，小鼠脑中的体内葡糖胺聚糖(GAG)水平。

图16证实在每周两次和三次鞘内注射媒介物对照或Naglu-SapDC和Naglu-LIF融合蛋白至Naglu敲除小鼠后，小鼠脑中的体内硫酸乙酰肝素(HS)水平。

图17-19证实在鞘内递送媒介物对照(PBS)或Naglu-SapDC融合蛋白至Naglu敲除小鼠后，小鼠脑中的体内三种B型山菲立普生物标记物水平。

图20说明在每周两次或三次鞘内注射媒介物对照或Naglu-SapDC融合蛋白后小鼠大脑皮质组织中的LAMP-1免疫组织化学染色。

图21说明在每周两次或三次鞘内注射媒介物对照或Naglu-SapDC融合蛋白后小鼠小脑组织中的LAMP-1免疫组织化学染色。

图22说明在每周两次或三次鞘内注射媒介物对照或Naglu-SapDC融合蛋白后小鼠丘脑组织中的LAMP-1免疫组织化学染色。

图23说明在每周两次或三次鞘内注射媒介物对照或Naglu-SapDC融合蛋白后小鼠纹状体组织中的LAMP-1免疫组织化学染色。

图24说明在每周两次或三次鞘内注射媒介物对照或Naglu-SapDC融合蛋白后小鼠白质组织中的LAMP-1免疫组织化学染色。

图25说明在每周三次鞘内注射媒介物对照或Naglu-SapDC融合蛋白后小鼠肝组织中的LAMP-1免疫组织化学染色。

图26说明在每周三次鞘内注射媒介物对照或Naglu-SapDC融合蛋白后小鼠大脑和小脑组织中GFAP的免疫组织化学染色。

图27说明在每周三次鞘内注射媒介物对照或Naglu-SapDC融合蛋白后小鼠小脑和大脑组织中Iba-1的免疫组织化学染色。

图28说明在每周两次或三次鞘内注射媒介物对照或Naglu-LIF融合蛋白后小鼠大脑皮质组织中的LAMP-1免疫组织化学染色。

图29说明在每周两次或三次鞘内注射媒介物对照或Naglu-LIF融合蛋白后小鼠小脑组织中的LAMP-1免疫组织化学染色。

图30说明在每周两次或三次鞘内注射媒介物对照或Naglu-LIF融合蛋白后小鼠丘脑组织中的LAMP-1免疫组织化学染色。

图31说明在每周两次或三次鞘内注射媒介物对照或Naglu-LIF融合蛋白后小鼠纹状体组织中的LAMP-1免疫组织化学染色。

图32说明在每周两次或三次鞘内注射媒介物对照或Naglu-LIF融合蛋白后小鼠白质组织中的LAMP-1免疫组织化学染色。

图33说明在每周三次鞘内注射媒介物对照或Naglu-LIF融合蛋白后小鼠肝组织中的LAMP-1免疫组织化学染色。

图34说明在每周三次鞘内注射媒介物对照或Naglu-LIF融合蛋白后小鼠大脑和小脑组织中GFAP的免疫组织化学染色。

图35说明在每周三次鞘内注射媒介物对照或Naglu-LIF融合蛋白后小鼠大脑和小脑组织中Iba-1的免疫组织化学染色。

定义

为使本发明更容易理解，首先在下文定义某些术语。本说明书通篇阐述以下术语和其它术语的其它定义。

α-N-乙酰基-氨基葡糖苷酶：如本文所用，术语“α-N-乙酰基-氨基葡糖苷酶”是指能够将N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷中之末端非还原N-乙酰基-D-葡糖胺残基水解的酶。α-N-乙酰基-氨基葡糖苷酶又名α-乙酰-氨基葡糖苷酶、N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷酶、N-乙酰基-α-氨基葡糖苷酶和α-D-2-乙酸胺基-2-脱氧葡糖苷酶。

大约或约：如本文所用，术语“大约”或“约”在应用于一个或多个相关值时是指类似于所述参考值的值。在某些实施方案中，除非另有说明或者从上下文另外显而易见(除非此类数目将超过可能值的100％)，否则术语“大约”或“约”是指在任一方向上(大于或小于)所述参考值的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少的一系列值。

改善：如本文所用，术语“改善”意指受试者病况的预防、减弱或缓解，或病况的好转。改善包括但无需疾病病状痊愈或完全预防。在一些实施方案中，改善包括增加相关疾病组织中缺乏的相关蛋白质或其活性的水平。

氨基酸：如本文所用，术语“氨基酸”在其最广泛意义上是指可以并入多肽链中的任何化合物和/或物质。在一些实施方案中，氨基酸具有通用结构H₂N-C(H)(R)-COOH。在一些实施方案中，氨基酸是天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，氨基酸是合成氨基酸；在一些实施方案中，氨基酸是d-氨基酸；在一些实施方案中，氨基酸是l-氨基酸。“标准氨基酸”是指通常在天然存在的肽中发现的二十种标准1-氨基酸任一者。“非标准氨基酸”是指除标准氨基酸以外的任何氨基酸，不管其是合成制得还是从天然来源获得。如本文所用，“合成氨基酸”涵盖经化学修饰的氨基酸，包括(但不限于)盐、氨基酸衍生物(例如酰胺)和/或取代。包括肽中羧基和/或氨基端氨基酸在内的氨基酸可以通过甲基化、酰胺化、乙酰化、保护基和/或经可以改变肽的循环半衰期但不会不利地影响其活性的其它化学基团取代来修饰。氨基酸可以参与二硫键。氨基酸可包含一种或多种翻译后修饰，例如与一个或多个化学实体(例如甲基、乙酸酯基、乙酰基、磷酸酯基、甲酰基部分、类异戊二烯基、硫酸酯基、聚乙二醇部分、脂质部分、碳水化合物部分、生物素部分等等)缔合。术语“氨基酸”与“氨基酸残基”可互换使用，且可指游离氨基酸和/或肽的氨基酸残基。从使用该术语的上下文将显而易见其是指游离氨基酸还是肽的残基。

动物：如本文所用，术语“动物”是指动物界的任何成员。在一些实施方案中，“动物”是指处于任何一个发育阶段的人。在一些实施方案中，“动物”是指处于任何一个发育阶段的非人动物。在某些实施方案中，非人动物是哺乳动物(例如啮齿类动物、小鼠、大鼠、兔子、猴子、狗、猫、绵羊、牛、灵长类动物和/或猪)。在一些实施方案中，动物包括(但不限于)哺乳动物、鸟、爬虫动物、两栖动物、鱼、昆虫和/或蠕虫。在一些实施方案中，动物可以是转基因动物、基因工程化的动物和/或克隆。

生物学活性：如本文所用，短语“生物学活性”(或生物活性)是指在生物系统中，特别是在生物体中具有活性的任何药剂的特征。举例来说，当施用于生物体时对该生物体具有生物效应的药剂被认为是生物学活性的。在具体实施方案中，在蛋白质或多肽是生物学活性的情况下，享有蛋白质或多肽的至少一种生物活性的蛋白质或多肽部分典型地称为“生物学活性”部分。

非阳离子依赖性甘露糖-6-磷酸受体(CI-M6PR)：如本文所用，术语“非阳离子依赖性甘露糖-6-磷酸受体(CI-M6PR)”是指结合高尔基体中预定输送至溶酶体的酸性水解酶(例如α-N-乙酰基-氨基葡糖苷酶)前驱物上甘露糖-6-磷酸(M6P)标签的细胞受体。除甘露糖-6-磷酸以外，CI-M6PR还结合某些蛋白质，包括IGF-II。CI-M6PR又名“CI-MPR”、“M6P/IGF-II受体”、“CI-MPR/IGF-II受体”、“CD222”、“MPR300”、“IGF-II受体”或“IGF2受体”。这些术语和其缩写在本文中可互换使用。

稀释剂：如本文所用，术语“稀释剂”是指可用于制备重组配方的药学上可接受的(例如施用于人安全且无毒)稀释物质。示例性稀释剂包括无菌水、抑菌注射用水(BWFI)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲生理盐水)、无菌盐溶液、林格氏溶液(Ringer′s solution)或右旋糖溶液。

酶替代疗法(ERT)：如本文所用，术语“酶替代疗法(ERT)”是指通过提供缺失的酶来医治酶缺乏症的任何治疗策略。在一些实施方案中，缺失的酶通过鞘内施用来提供。在一些实施方案中，缺失的酶通过输注至血流中来提供。一旦施用，酶即被细胞摄取并输送至溶酶体，其中酶用于除去因酶缺乏症而积累在溶酶体中的物质。典型地，为使溶酶体酶替代疗法有效，治疗酶传递至其中显现贮积缺点的标靶组织中的适当细胞中的溶酶体。

表达：如本文所用，核酸序列的“表达”是指一个或多个以下事件：(1)从DNA序列产生RNA模板(例如通过转录)；(2)加工RNA转录物(例如通过剪接、编辑、5’帽形成和/或3’端形成)；(3)RNA翻译成多肽或蛋白质；和/或(4)多肽或蛋白质的翻译后修饰。在本申请中，术语“表达”和“产生”以及语法上同等物可互换地使用。

聚糖：如本领域中已知且本文中使用，“聚糖”是糖。聚糖可以是糖残基的单体或聚合物，但是典型地含有至少三个糖，且可以是线性或分支的。聚糖可以包括天然糖残基(例如葡萄糖、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰基神经氨糖酸、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、己糖、阿拉伯糖、核糖、木糖等等)和/或经修饰糖(例如2’-氟核糖、2’-脱氧核糖、磷酸甘露糖、6’磺基N-乙酰葡糖胺等等)。术语“聚糖”包括糖残基的均聚物和杂聚物。术语“聚糖”还涵盖糖结合物的聚糖组分(例如糖蛋白、糖脂、蛋白聚糖等等)。术语还涵盖游离聚糖，包括已经从糖结合物裂解或者以其它方式释放的聚糖。

糖结合物：如本文所用，术语“糖结合物”涵盖其中至少一个糖部分共价连接于至少一个其它部分的所有分子。该术语特别涵盖具有包括例如N-连接的糖蛋白、O-连接的糖蛋白、糖脂、蛋白聚糖等等共价附接的糖部分的所有生物分子。

糖蛋白：如本文所用，术语“糖蛋白”是指含有共价连接于一个或多个糖部分(即聚糖)的肽主链的蛋白质。如本领域技术人员所了解，肽主链典型地包含氨基酸残基的线性链。在某些实施方案中，肽主链跨越细胞膜，使得其包含跨膜部分，以及细胞外部分和/或细胞内部分。在某些实施方案中，跨越细胞膜的糖蛋白的肽主链包含细胞内部分、跨膜部分和细胞外部分。糖部分可以呈单糖、二糖、寡糖和/或聚糖形式。糖部分可以包含糖残基的单个非分支链，或可以包含一个或多个分支链。在某些实施方案中，糖部分可以包括硫酸酯基和/或磷酸酯基。或者或另外，糖部分可以包括乙酰基、乙醇酰基、丙基或其它烷基修饰。或者或另外，糖部分可以通过二乙酰基化来修饰。在某些实施方案中，糖蛋白含有O连接的糖部分；在某些实施方案中，糖蛋白含有N-连接的糖部分。在某些实施方案中，糖部分特别为含有甘露糖-6-磷酸残基的N-连接的聚糖。在某些实施方案中，本文中公开的方法包含针对糖基化模式和/或M6P磷酸化水平，分析治疗糖蛋白、细胞表面糖蛋白的释放片段(例如糖肽)、附接于细胞表面糖蛋白的细胞表面聚糖、细胞表面糖蛋白的肽主链、此类糖蛋白的片段、聚糖和/或肽主链以及其组合的步骤。

高甘露糖：如本文所用，术语“高甘露糖”在本文中用以描述含有一个或多个Man9(GlcNAc)2、Man8(GlcNAc)2、Man7(GlcNAc)2、Man6(GlcNAc)2和/或Man5(GlcNAc)2N-连接的寡糖或其组合的蛋白质(例如Naglu)。

同源性：如本文所用，术语“同源性”(或对应形容词“同源”)是指聚合物分子，例如核酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)和/或多肽分子之间的整体相关性。在一些实施方案中，如果聚合物分子的序列至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％一致，那么其被认为彼此是“同源”。在一些实施方案中，如果聚合物分子的序列至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％相似，那么其被认为彼此是“同源”。

一致性：如本文所用，术语“一致性”是指聚合物分子，例如核酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)和/或多肽分子之间的整体相关性。两个核酸序列的一致性百分比的计算例如可以通过将两个序列比对以达成最佳比较的目的来进行(例如间隙可以引入用于最佳比对的第一和第二核酸序列中的一者或两者中，且为了比较，可以忽略非一致序列)。在某些实施方案中，为了比较而比对的序列的长度是参考序列长度的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或基本上100％。接着比较对应核苷酸位置的核苷酸。当第一序列中的一个位置被与第二序列中对应位置相同的核苷酸占据时，分子在该位置一致。两个序列之间的一致性百分比是所述序列共享的一致位置数目的函数，考虑为最佳比对两个序列需要引入的间隙数目和每个间隙的长度。两个序列之间的序列比较和一致性百分比的测定可以使用数学算法完成。举例来说，两个核苷酸序列之间的一致性百分比可以使用Meyers和Miller(CABIOS，1989，4：11-17)的算法测定，该算法已经并入ALIGN程序(2.0版)中，使用PAM 120权重残基表、间隙长度罚分12和间隙罚分4。或者，两个核苷酸序列之间的一致性百分比可以使用GCG软件包中的GAP程序使用NWSgapdna.CMP矩阵测定。

提高、增加或减少：如本文所用，术语“提高”、“增加”或“减少”或语法上同等物指示相对于基线测量值，例如在开始本文中描述的治疗前相同个体中的测量值，或对照受试者(或多个对照受试者)中在缺乏本文中描述的治疗下的测量值的值。“对照受试者”是罹患与所治疗的受试者相同形式疾病的受试者，年龄几乎与所治疗的受试者相同。

体外：如本文所用，术语“体外”是指发生在人造环境中，例如在试管或反应容器中，在细胞培养物中等等，而非多细胞生物体内的事件。

体内：如本文所用，术语“体内”是指发生在例如人和非人动物等多细胞生物体内的事件。在基于细胞的系统的上下文中，该术语可用于指发生在活细胞内(与例如体外系统相反)的事件。

鞘内施用：如本文所用，术语“鞘内施用”或“鞘内注射”是指注射至脊椎管(围绕脊髓的鞘内空间)。可以使用各种技术，包括(但不限于)通过头颅穿洞或小脑延髓池穿刺或腰椎穿刺等进行侧脑室注射。在一些实施方案中，根据本发明的“鞘内施用”或“鞘内递送”是指经由腰椎区域或腰部的鞘内施用或递送，即腰椎鞘内施用或递送。如本文所用，术语“腰部”或“腰椎区域”是指第三根与第四根腰(下背)椎骨且更包括脊柱的L2-S1区域在内的区域。

连接子：如本文所用，术语“连接子”是指融合蛋白中除出现在天然蛋白质中特定位置处的氨基酸序列以外的氨基酸序列，且一般设计成在两个蛋白质部分之间可弯曲或插入例如a-螺旋等结构。连接子也称为间隔子。

溶酶体酶：如本文所用，术语“溶酶体酶”是指能够减少哺乳动物溶酶体中积累的物质或可以救助或改善一种或多种溶酶体贮积病症状的任何酶。适于本发明的溶酶体酶包括野生型或经修饰的溶酶体酶，且可以使用重组和合成方法产生或从自然来源纯化。示例性溶酶体酶列于表1中。

溶酶体酶缺乏：如本文所用，“溶酶体酶缺乏”是指由溶酶体中使大分子(例如酶底物)分解成肽、氨基酸、单糖、核酸和脂肪酸所需的至少一种酶缺乏引起的一组遗传性病症。结果，罹患溶酶体酶缺乏的个体具有在各种组织(例如CNS、肝、脾、肠、血管壁和其它器官)中积累的物质。

溶酶体贮积病：如本文所用，术语“溶酶体贮积病”是指由天然大分子代谢所需的一种或多种溶酶体酶缺乏所引起的任何疾病。这些疾病典型地导致未降解分子积累在溶酶体中，使得贮积粒(又名贮积囊泡)数目增加。

信使RNA(mRNA)：如本文所用，术语“信使RNA(mRNA)”是指编码至少一种多肽的聚核苷酸。如本文所用的mRNA涵盖经修饰与未经修饰的RNA。mRNA可以含有一个或多个编码区和非编码区。

部分：如本文所用，术语“部分”是指分子(例如聚糖或蛋白质)的一部分或官能团。“部分”与本文中术语“残基”可互换使用。

N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶(GNPT)蛋白质：如本文所用，术语N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶(GNPT)蛋白质是指能够在溶酶体水解酶(例如α-N-乙酰基-氨基葡糖苷酶)上催化N-乙酰葡糖胺-1-磷酸从UDP-GlcNAc转变成甘露糖残基的酶。

核酸：如本文所用，术语“核酸”在其最广泛意义上是指并入或可以并入聚核苷酸链中的任何化合物和/或物质。在一些实施方案中，核酸是经由磷酸二脂键并入或可以并入聚核苷酸链中的化合物和/或物质。在一些实施方案中，“核酸”是指个别核酸残基(例如核苷酸和/或核苷)。在一些实施方案中，“核酸”是指包含个别核酸残基的聚核苷酸链。在一些实施方案中，“核酸”涵盖RNA以及单链和/或双链DNA和/或cDNA。此外，术语“核酸”、“DNA”、“RNA”和/或类似术语包括核酸类似物，即不具有磷酸二脂主链的类似物。举例来说，在本领域中已知且具有肽键代替主链中的磷酸二酯键的所谓“肽核酸”被认为是在本发明的范围内。术语“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此的变体简并和/或编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和/或RNA的核苷酸序列可以包括内含子。核酸可以从天然来源纯化，使用重组表达系统产生且任选纯化、化学合成等等。适当时，例如在化学合成分子的情况下，核酸可以包含核苷类似物，例如具有化学修饰的碱基或糖、主链修饰等等的类似物。除非另有指示，否则核酸序列以5’至3’方向呈现。在一些实施方案中，核酸是或包含天然核苷(例如腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)；核苷类似物(例如2-氨基腺苷、2-硫基胸苷、次黄嘌呤核苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代基腺苷、8-氧代基鸟苷、O(6)-甲基鸟嘌呤和2-巯基胞苷)；经化学修饰的碱基；经生物修饰的碱基(例如甲基化碱基)；插入碱基；经修饰糖(例如2’-氟核糖、核糖、2’-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)；和/或经修饰磷酸酯基(例如硫代磷酸酯和5’-N-亚磷酰胺键)。在一些实施方案中，本发明特别针对“未修饰的核酸”，意指未经化学修饰以促进或实现递送的核酸(例如聚核苷酸和残基，包括核苷酸和/或核苷)。

患者：如本文所用，术语“患者”或“受试者”是指所提供的组合物可以施用，例如以达成实验、诊断、预防、美容和/或治疗的目的的任何生物体。典型患者包括动物(例如哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物和/或人)。在一些实施方案中，患者是人。人包括出生前和出生后形式。

药学上可接受：如本文所用，术语“药学上可接受”是指在合理医学判断范围内，适于与人和动物的组织接触使用而无过度毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症，与合理的收益/风险比相称的物质。

多肽：如本文所用，一般来说，“多肽”是一串至少两个彼此通过肽键附接的氨基酸。在一些实施方案中，多肽可以包括至少3-5个氨基酸，每个氨基酸借助于至少一个肽键附接于其它氨基酸。本领域技术人员将了解多肽有时包括仍能够任选整合至多肽链中的“非天然”氨基酸或其它实体。

蛋白质：如本文所用，“治疗蛋白质”的术语“蛋白质”是指多肽(即一串至少两个彼此通过肽键连接的氨基酸)。蛋白质可以包括除氨基酸以外的部分(例如可以是糖蛋白、蛋白聚糖等等)和/或可以另外加工或修饰。本领域技术人员将了解，“蛋白质”可以是如由细胞产生的完整多肽链(有或者没有信号序列)，或可以是其特征性部分。本领域技术人员将了解蛋白质有时可以包括超过一个例如通过一个或多个二硫键连接或通过其它方式缔合的多肽链。多肽可以含有1-氨基酸、d-氨基酸或两者，且可以含有本领域中已知的多种氨基酸修饰或类似物中的任一者。适用修饰包括例如末端乙酰化、酰胺化、甲基化等等。在一些实施方案中，蛋白质可以包含天然氨基酸、非天然氨基酸、合成氨基酸和其组合。术语“肽”一般用于指长度小于约100个氨基酸、小于约50个氨基酸、小于20个氨基酸或者小于10个氨基酸的多肽。在一些实施方案中，蛋白质是抗体、抗体片段、其生物学活性部分和/或其特征性部分。

重组.如本文所用，术语“重组”是指使用重组DNA技术产生的DNA分子、肽、蛋白质或细胞，如该术语为本领域技术人员通常所理解。

受试者：如本文所用，术语“受试者”是指人或任何非人动物(例如小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类动物)。人包括出生前和出生后形式。在许多实施方案中，受试者是人。受试者可以是患者，其是指引见给医疗服务提供方进行疾病诊断或治疗的人。术语“受试者”在本文中与“个体”或“患者”可互换使用。受试者可以罹患或易患疾病或病症，但是可能显示或可能不显示该疾病或病症的症状。

基本上：如本文所用，术语“基本上”是指大于总数80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的量。

标靶组织：如本文所用，术语“标靶组织”是指受待治疗的溶酶体贮积病影响的任何组织或所缺乏的溶酶体酶正常表达的任何组织。在一些实施方案中，标靶组织包括罹患或易患溶酶体贮积病的患者中其中存在可检测或异常高量的酶底物例如贮积在组织的细胞溶酶体中的组织。在一些实施方案中，标靶组织包括显示疾病相关病变、症状或特征的组织。在一些实施方案中，标靶组织包括其中所缺乏的溶酶体酶以升高水平正常表达的组织。如本文所用，标靶组织可以是脑标靶组织、脊髓标靶组织和/或周围标靶组织。示例性标靶组织详细描述于下文中。

治疗糖蛋白：如本文所用，术语“治疗糖蛋白”是指可以用于至少部分代替待治疗的疾病中缺乏或缺失的酶的任何糖蛋白。在一些实施方案中，术语治疗糖蛋白是指可以定位、输送、加工和/或存在于细胞溶酶体中的溶酶体蛋白质(例如酸性水解酶)。在一些实施方案中，治疗糖蛋白是指具有酶活性(例如溶酶体酶)的糖蛋白，其可以用于至少部分代替待治疗的溶酶体贮积病中缺乏或缺失的溶酶体酶。在一些实施方案中，治疗糖蛋白能够减少哺乳动物溶酶体中积累的物质或可以救助或改善一种或多种溶酶体贮积病症状。适于本发明的治疗糖蛋白包括野生型、经修饰的溶酶体酶或溶酶体酶的蛋白质融合物，且可以使用重组方法产生。

治疗有效室：如本文所用，术语治疗剂的“治疗有效量”意指当施用于罹患或易患疾病、病症和/或病状的受试者时足够治疗、诊断、预防疾病、病症和/或病状和/或延迟症状发作的量。本领域技术人员将了解，治疗有效量典型地经由包含至少一个单位剂量的给药方案施用。

治疗：如本文所用，术语“治疗(treatment)”(以及“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指部分或完全缓解、改善、减轻、抑制特定疾病、病症和/或病状(例如猎人综合症、B型山菲立普综合症)、延迟发作、减轻严重性和/或减少一种或多种症状或特征发生的治疗剂(例如溶酶体酶)的任何施用。此类治疗可以是未展现相关疾病、病症和/或病状的征象的受试者和/或仅展现疾病、病症和/或病状的早期征象的受试者。或者或另外，此类治疗可以是展现相关疾病、病症和/或病状的一种或多种确定的征象的受试者。

发明详述

本发明提供含有溶酶体酶和含N-连接的糖基化位点的溶酶体靶向部分的靶向治疗剂，以及其制造方法和使用其用于溶酶体贮积病的有效酶替代疗法的方法。

在一些实施方案中，本发明提供一种溶酶体靶向部分，其为含有含M6P基团的N-连接的糖基化的肽。在一些实施方案中，本发明提供一种靶向治疗剂，其中溶酶体酶与溶酶体靶向部分经由连接子融合。在一些实施方案中，本发明提供包括编码靶向治疗剂的核酸的载体，以及含有所述核酸且共同表达GNPT的宿主细胞。在一些实施方案中，溶酶体酶是Naglu。

本发明的各方面在以下分部中进一步详细描述。分部的使用不意味着限制本发明。每个分部可以应用于本发明的任何方面。在本申请中，除非另有说明，使用“或”意指“和/或”。

治疗溶酶体酶-Naglu蛋白质

本发明人意外发现溶酶体酶可以通过将其连接至含有N-连接的糖基化位点的靶向部分来靶向溶酶体。本发明提供含有溶酶体酶和含N-连接的糖基化位点的溶酶体靶向部分的靶向治疗剂。在一些实施方案中，在本发明的上下文中适合的治疗溶酶体酶是重组人Naglu蛋白质。α-N-乙酰基-氨基葡糖苷酶(Naglu)通过从此糖胺聚糖的非还原端去除GlcNAc(N-乙酰基-葡糖胺)，帮助逐步降解溶酶体中的硫酸乙酰肝素。缺少Naglu导致硫酸乙酰肝素不完全分解，且随后未完全分解的产物积累在溶酶体中。缺少Naglu引起致命的神经变性疾病III B型山菲立普病。

根据本发明的适合Naglu蛋白质可以是可以取代天然存在的Naglu蛋白质活性或救助与Naglu缺乏有关的一种或多种表现型或症状的任何分子。在一些实施方案中，适于本发明的Naglu蛋白质是具有N端和C端且氨基酸序列基本上与成熟人Naglu蛋白质相似或一致的多肽。

典型地，人Naglu呈加工成成熟形式的前驱分子产生。此过程一般在蛋白质进入内质网时通过去除23个氨基酸的信号肽进行。典型地，前驱形式也称为全长前驱物或全长Naglu蛋白质，其含有743个氨基酸。当前驱蛋白进入内质网时，N端23个氨基酸裂解，产生成熟形式。因此，预期N端23个氨基酸一般并非Naglu蛋白质活性所需。然而，Naglu蛋白质的全长前驱物的使用也涵盖在本发明的范围内。典型野生型或天然存在的人Naglu蛋白质的成熟形式(SEQ ID NO：1)和全长前驱物(SEQ ID NO：2)的氨基酸序列展示于下表1中。

表1.成熟和全长前驱Naglu蛋白质

因此，在一些实施方案中，适于本发明的Naglu蛋白质是成熟人Naglu蛋白质(SEQID NO：1)。在一些实施方案中，适合的Naglu蛋白质可以是来自不同物种(例如小鼠、大鼠、绵羊、猪、狗等)的成熟人Naglu蛋白质的同源物或直系同源物。在其它实施方案中，适合的Naglu蛋白质可以是成熟人Naglu蛋白质的功能变异体。成熟人Naglu蛋白质的功能变异体可以是与野生型或天然存在的Naglu蛋白质(例如SEQ ID NO：1)相比，含有一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入，同时基本上维持Naglu蛋白质的生物活性的经修饰的成熟人Naglu蛋白质。因此，在一些实施方案中，适于本发明的Naglu蛋白质基本上与成熟人Naglu蛋白质(SEQ ID NO：1)同源。在一些实施方案中，适于本发明的Naglu蛋白质具有与SEQ ID NO：1至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高程度同源的氨基酸序列。在一些实施方案中，适于本发明的Naglu蛋白质基本上与成熟人Naglu蛋白质(SEQ ID NO：1)一致。在一些实施方案中，适于本发明的Naglu蛋白质具有与SEQ ID NO：1至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高程度一致的氨基酸序列。在一些实施方案中，适于本发明的Naglu蛋白质含有成熟人Naglu蛋白质的片段或一部分。

或者，适于本发明的Naglu蛋白质为全长Naglu蛋白质。在一些实施方案中，适合的Naglu蛋白质可以是来自不同物种(例如小鼠、大鼠、绵羊、猪、狗等)的全长人Naglu蛋白质的同源物或直系同源物。在一些实施方案中，适合的Naglu蛋白质可以是与野生型或天然存在的全长Naglu蛋白质(例如SEQ ID NO：2)相比，含有一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入，同时维持基本Naglu蛋白质活性的全长人Naglu蛋白质的功能变异体。因此，在一些实施方案中，适于本发明的Naglu蛋白质基本上与全长人Naglu蛋白质(SEQ ID NO：2)同源。在一些实施方案中，适于本发明的Naglu蛋白质具有与SEQ ID NO：2至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高程度同源的氨基酸序列。在一些实施方案中，适于本发明的Naglu蛋白质基本上与SEQ ID NO：2一致。在一些实施方案中，适于本发明的Naglu蛋白质具有与SEQ ID NO：2至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高程度一致的氨基酸序列。在一些实施方案中，适于本发明的Naglu蛋白质含有全长人Naglu蛋白质的片段或一部分。如本文所用，全长Naglu蛋白质典型地含有信号肽序列。

如本领域中众所周知，氨基酸或核酸序列可以使用多种算法中的任一者比较，所述算法包括可用于商用计算机程序的算法，例如用于核苷酸序列的BLASTN和用于氨基酸序列的BLASTP、间隙BLAST和PSI-BLAST。示例性此类程序描述于Altschul等人，Basic localalignment search tool，J.Mol.Biol.，215(3)：403-410，1990；Altschul等人，Methods inEnzymology；Altschul等人，″Gapped BLAST and PSI-BLAST：a new generation ofprotein database search programs″，Nucleic Acids Res.25：3389-3402，1997；Baxevanis等人，Bioinformatics：A Practical Guide to the Analysis of Genes andProteins，Wiley，1998；以及Misener等人，(编辑)，Bioinformatics Methods andProtocols (Methods in Molecular Biology，第132卷)，Humana Press，1999；所有上述都以引用的方式并入本文中。除鉴别同源序列以外，以上提及的程序典型地指示同源性程度。在一些实施方案中，如果至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更多的两个序列的对应残基在残基的相关延伸上同源，那么其被认为是基本上同源的。在一些实施方案中，相关延伸是完整序列。在一些实施方案中，相关延伸是至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少125、至少150、至少175、至少200、至少225、至少250、至少275、至少300、至少325、至少350、至少375、至少400、至少425、至少450、至少475、至少500个或更多个残基。

短语“基本上一致”在本文中用以提及氨基酸或核酸序列之间的比较。如本领域技术人员所了解，如果两个序列在对应位置含有一致残基，那么一般视为“基本上一致”。如本领域中众所周知，氨基酸或核酸序列可以使用多种算法中的任一者比较，所述算法包括可用于商用计算机程序的算法，例如用于核苷酸序列的BLASTN和用于氨基酸序列的BLASTP、间隙BLAST和PSI-BLAST。示例性此类程序描述于Altschul等人，Basic local alignmentsearch tool，J.Mol.Biol.，215(3)：403-410，1990；Altschul等人，Methods inEnzymology；Altschul等人，Nucleic Acids Res.25：3389-3402，1997；Baxevanis等入，Bioinformatics：A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins，Wiley，1998；以及Misener等人，(编辑)，Bioinformatics Methods and Protocols(Methods inMolecular Biology，第132卷)，Humana Press，1999。除鉴别一致序列以外，以上提及的程序典型地指示一致性程度。在一些实施方案中，如果至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的两个序列的对应残基在残基的相关延伸上一致，那么其被认为是基本上一致的。在一些实施方案中，相关延伸是完整序列。在一些实施方案中，相关延伸是至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500个或更多个残基。

替代治疗溶酶体酶

本发明人意外发现溶酶体酶可以通过将其连接至含有N-连接的糖基化位点的靶向部分来靶向溶酶体。因此，本发明提供含有溶酶体酶和含N-连接的糖基化位点的溶酶体靶向部分的靶向治疗剂。在本发明的上下文中适合治疗溶酶体酶是已经展示在溶酶体贮积病的出现或治疗中起作用的任何蛋白质，溶酶体贮积病尤其是具有CNS病因和/或症状的那些溶酶体贮积病，包括(但不限于)天冬氨酰葡糖胺尿症、胆固醇脂贮积病、沃尔曼病(Wolman disease)、胱氨酸病、达农病(Danon disease)、法夫里病(Fabry disease)、法尔布脂肪肉芽肿病(Farber lipogranulomatosis)、法尔布病、岩藻糖苷病、I/II型半乳糖涎酸沉积症、I/II/III型戈谢病(Gaucher disease type I/II/III)、球样细胞性脑白质营养不良、克拉贝病(Krabbe disease)、II型糖原贮积病、蓬佩病(Pompe disease)、I/II/III型GM1-神经节苷脂沉积症、I型GM2-神经节苷脂沉积症、塔伊塞奇病(Tay Sachs disease)、II型GM2-神经节苷脂沉积症、桑德霍夫病(Sandhoff disease)、GM2-神经节苷脂沉积症、I/II型α-甘露糖苷过多症、.β.-甘露糖苷过多症、异染性脑白质营养不良、I型粘脂质贮积病、I/II型涎酸贮积症、II/III型粘脂质贮积病、I-细胞疾病、IIIC型粘脂质贮积病假赫勒多营养障碍(mucolipidosis type IIIC pseudo-Hurler polydystrophy)、I型粘多糖贮积症、II型粘多糖贮积症、IIIA型粘多糖贮积症、山菲立普综合症、IIIB型粘多糖贮积症、IIIC型粘多糖贮积症、IIID型粘多糖贮积症、IVA型粘多糖贮积症、莫基奥综合症(Morquiosyndrome)、IVB型粘多糖贮积症、VI型粘多糖贮积症、VII型粘多糖贮积症、斯莱综合症(Slysyndrome)、IX型粘多糖贮积症、多发性硫酸脂酶缺乏症、神经元蜡样脂褐质沉积症、CLN 1巴藤病(CLN 1 Batten disease)、CLN 2巴藤病、A/B型尼曼-皮克疾病(Niemann-Pickdisease types A/B)、C1型尼曼-皮克疾病、C2型尼曼-皮克疾病、致密性成骨不全症、I/II型申德勒病(Schindler disease types I/II)、戈谢病和涎酸贮积病。

溶酶体贮积病的遗传原因、临床表现和分子生物学的详细评述详述于Scriver等人编辑，The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Disease，第7版，第II卷，McGraw Hill，(1995)。本领域技术人员一般已知以上疾病中缺乏的酶；一些例示于下表2中：

表2.与溶酶体贮积病有关的蛋白质

在一些实施方案中，适于本发明的治疗溶酶体酶是人野生型蛋白质。在一些实施方案中，治疗溶酶体酶可以是来自不同物种(例如小鼠、大鼠、绵羊、猪、狗等)的人野生型蛋白质的同源物或直系同源物。在其它实施方案中，适于本发明的治疗溶酶体酶可以是人野生型蛋白质的功能变异体。人野生型蛋白质的功能变异体可以是与野生型或天然存在的蛋白质相比，含有一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入，同时基本上维持人野生型蛋白质的生物活性的经修饰的人野生型蛋白质。因此，在一些实施方案中，适于本发明的治疗溶酶体酶基本上与人野生型蛋白质相同。在一些实施方案中，适于本发明的治疗溶酶体酶具有与人野生型蛋白质至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高程度同源的氨基酸序列。在一些实施方案中，适于本发明的治疗溶酶体酶基本上与人野生型蛋白质一致。在一些实施方案中，适于本发明的治疗溶酶体酶具有与人野生型蛋白质至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高程度一致的氨基酸序列。在一些实施方案中，适于本发明的治疗溶酶体酶具有人野生型蛋白质的片段或一部分。

溶酶体靶向部分

本发明人意外发现溶酶体酶可以通过将其连接至含有N-连接的糖基化位点的靶向部分来靶向溶酶体。因此，本发明提供含有溶酶体酶和含N-连接的糖基化位点的溶酶体靶向部分的靶向治疗剂。

本发明预期在本发明范围内可以使用任何肽，只要其具有N-连接的糖基化位点。N-连接的糖基化位点可以通过计算机算法和软件预测，许多计算机算法和软件为本领域中普遍已知。或者，N-连接的糖基化可以通过实验，使用本领域中普遍已知的许多分析中的任一者确定。此类分析的非限制性实例提供于本文中的实施例部分中。

适合的靶向部分可以来源于蛋白质或肽，包括(但不限于)IGF-I、Kif、ApoE、TAT、RAP、p97、纤溶酶原、白血病抑制因子肽(LIF)、E1A刺激基因的细胞阻遏子肽(CREG)、人Sortlin-1前肽(SPP)、人鞘脂激活蛋白原肽(SapDC)和颗粒蛋白前体。在一些实施方案中，溶酶体靶向部分是以甘露糖-6-磷酸依赖性方式结合CI-M6PR的任何蛋白质、肽或其片段。在一些实施方案中，溶酶体靶向部分是直接结合CI-M6PR的区域、结构域和/或细胞外部分的任何蛋白质、肽或其片段。在一些实施方案中，溶酶体靶向部分是经由M6P残基直接结合CI-M6PR的区域、结构域和/或细胞外部分的任何蛋白质、肽或其片段。

在一些实施方案中，溶酶体靶向部分来源于人鞘脂激活蛋白原(SEQ ID NO：3)。在一些实施方案中，溶酶体靶向部分是野生型或天然存在的人鞘脂激活蛋白原蛋白质的鞘脂激活蛋白原序列。在一些实施方案中，使用包含鞘脂激活蛋白原的C端区域和D功能域的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。

表3.人鞘脂激活蛋白原

在一些实施方案中，溶酶体靶向部分是含有氨基酸取代、插入或缺失的经修饰的人鞘脂激活蛋白原序列。在一些实施方案中，溶酶体靶向部分具有与人鞘脂激活蛋白原的序列(SEQ ID NO：3)至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致的序列。在一些实施方案中，溶酶体靶向部分是人鞘脂激活蛋白原的片段。在一些实施方案中，溶酶体靶向部分是含有氨基酸取代、插入或缺失的经修饰的人鞘脂激活蛋白原DC肽(SapDC)序列。在一些实施方案中，溶酶体靶向部分具有与SapDC(SEQ ID NO：4)至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致的序列。在一些实施方案中，溶酶体靶向部分是SapDC的片段。在一些实施方案中，溶酶体靶向部分含有具有一个或多个N端、C端或内部缺失的人鞘脂激活蛋白原(SEQ ID NO：3)或SapDC(SEQ IDNO：4)。在一些实施方案中，溶酶体靶向部分是对受体的结合亲和力降低的经修饰的人鞘脂激活蛋白原或SapDC肽。

在一些实施方案中，溶酶体靶向部分来源于人白血病抑制因子(SEQ ID NO：5)。在一些实施方案中，溶酶体靶向部分是野生型或天然存在的人白血病抑制因子蛋白质的白血病抑制因子序列。在一些实施方案中，氨基酸序列包含白血病抑制因子的信号肽、糖基化位点、4个螺旋束的螺旋A、B、C和/或D和其组合。在一些实施方案中，使用包含信号肽、糖基化位点、4个螺旋束的螺旋A、B、C和D和各种突变(LIF)的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)。

表4.人白血病抑制因子

LIF序列内之位点

(N)-表示糖基化位点

{}-表示为改变受体gp 130的识别而进行的突变；[[]]-表示为改变白血病抑制因子的受体的识别而进行的突变

在一些实施方案中，溶酶体靶向部分是含有氨基酸取代、插入或缺失的经修饰的人白血病抑制因子序列。在一些实施方案中，溶酶体靶向部分具有与白血病抑制因子的序列(SEQ ID NO：5)至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致的序列。在一些实施方案中，溶酶体靶向部分是人白血病抑制因子的片段。在一些实施方案中，溶酶体靶向部分是含有氨基酸取代、插入或缺失的经修饰的人LIF序列(SEQID NO：6)。在一些实施方案中，溶酶体靶向部分具有与LIF(SEQ ID NO：6)至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致的序列。在一些实施方案中，溶酶体靶向部分是LIF的片段。在一些实施方案中，溶酶体靶向部分含有具有一个或多个N端、C端或内部缺失的人白血病抑制因子(SEQ ID NO：5)或LIF(SEQ ID NO：6)。在一些实施方案中，溶酶体靶向部分是对LIF受体和/或替代结合蛋白，例如(但不限于)pg 130的结合亲和力减少的经修饰的人白血病抑制因子或LIF肽。

在一些实施方案中，溶酶体靶向部分来源于人E1A刺激基因的细胞阻遏子蛋白(SEQ ID NO：7)。在一些实施方案中，溶酶体靶向部分是野生型或天然存在的人E1A刺激基因的细胞阻遏子蛋白的E1A刺激基因的细胞阻遏子序列。

在一些实施方案中，使用不包含E1A刺激基因的细胞阻遏子的信号肽的序列，且不包含E1A刺激基因的细胞阻遏子的序列DPQS(SEQ ID NO：8)的内部肽的氨基酸序列，得到人E1刺激基因的阻遏子肽(CREG)(SEQ ID NO：9)。

表5.人E1刺激基因的阻遏子

在一些实施方案中，溶酶体靶向部分是含有氨基酸取代、插入或缺失的经修饰的人E1A刺激基因的细胞阻遏子序列。在一些实施方案中，溶酶体靶向部分具有与人E1A刺激基因的细胞阻遏子(SEQ ID NO：7)的序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致的序列。在一些实施方案中，溶酶体靶向部分是人E1A刺激基因的细胞阻遏子的片段。在一些实施方案中，溶酶体靶向部分是含有氨基酸取代、插入或缺失的经修饰的人E1A刺激基因的细胞阻遏子序列。在一些实施方案中，溶酶体靶向部分具有与人E1A刺激基因的细胞阻遏子肽(CREG)的序列(SEQ ID NO：9)至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致的序列。在一些实施方案中，溶酶体靶向部分是CREG的片段。在一些实施方案中，溶酶体靶向部分含有具有一个或多个N端、C端或内部缺失的人E1A刺激基因的细胞阻遏子(SEQ ID NO：7)或CREG(SEQ ID NO：9)。在一些实施方案中，溶酶体靶向部分是对受体的结合亲和力减少的经修饰的人E1A刺激基因的细胞阻遏子或CREG。

本领域中已知各种其它溶酶体靶向部分且可用于实践本发明。举例来说，某些基于肽的溶酶体靶向部分描述于美国专利No.7,396,811、7,560,424和7,629,309；美国申请公布No.2003-0082176、2004-0006008、2003-0072761、20040005309、2005-0281805、2005-0244400和国际公布WO 03/032913、WO 03/032727、WO 02/087510、WO 03/102583、WO 2005/078077、WO/2009/137721，其整个公开以引用的方式并入本文中。

在一些实施方案中，溶酶体靶向部分是呈被细胞磷酸化的M6P的任何多肽。在一些实施方案中，多肽能够结合于CI-M6PR。在一些实施方案中，多肽是在选自以下的蛋白质内发现的氨基酸序列：组织蛋白酶B、组织蛋白酶D、组织蛋白酶L、β-葡糖苷酸酶、β-甘露糖苷酶、α-岩藻糖苷酶、β-己糖胺酶、芳基硫酸酯酶、β-半乳糖苷酶、磷酸甘露聚糖、潜在TGFβ、白血病抑制因子、增殖蛋白、前肾素、单纯疱疹病毒、PI-LLC裂解的GPI锚、视黄酸、IGFII、纤溶酶原、甲状腺球蛋白、TGFβR-V、CD87、GTP-结合蛋白(Gi-1、Gi-2和Gi-3)、HA-I衔接蛋白、HA-II衔接蛋白和其组合。在一些实施方案中，氨基酸序列包括选自以下的一种或多种蛋白质的结构域、片段、区域或区段：组织蛋白酶B、组织蛋白酶D、组织蛋白酶L、β-葡糖苷酸酶、β-甘露糖苷酶、α-岩藻糖苷酶、β-己糖胺酶、芳基硫酸酯酶、β-半乳糖苷酶、磷酸甘露聚糖、潜在TGFβ、白血病抑制因子、增殖蛋白、前肾素、单纯疱疹病毒、PI-LLC裂解的GPI锚、视黄酸、IGFII、纤溶酶原、甲状腺球蛋白、TGFβR-V、CD87、GTP-结合蛋白(Gi-1、Gi-2和Gi-3)、HA-I衔接蛋白、HA-II衔接蛋白和其组合。在一些实施方案中，多肽以合成方式产生。在一些实施方案中，多肽以重组方式产生。两种方法广泛用于本领域中且描述于例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)。

溶酶体靶向部分与溶酶体酶连接-融合蛋白

溶酶体靶向部分可以用本领域中普遍已知的任一方式偶合于溶酶体酶。非限制性实例包括通过遗传方式或通过化学偶合产生融合蛋白。在一些实施方案中，溶酶体靶向部分融合至溶酶体酶的N端，且在其它实施方案中，溶酶体靶向部分融合至溶酶体酶的C端。在一些实施方案中，溶酶体靶向部分位于内部，即溶酶体酶多肽内。产生融合蛋白在本领域中是标准的，详细地描述于Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press(2001)。预期在本发明的范围内，超过一个溶酶体靶向部分可与适合溶酶体酶偶合。

在本发明的一些实施方案中，靶向治疗剂是融合蛋白。融合蛋白是从两个或更多个更小的多肽产生的多肽。融合蛋白可以通过本领域中标准且详细地描述于Sambrook等人中的重组DNA技术制成。

在本发明的范围内的融合蛋白的非限制性实例在本文中的实施例部分中公开。在一些实施方案中，融合蛋白具有以下氨基酸序列之一：SEQ ID NO：23、24、25或26。在一些实施方案中，融合蛋白与这些序列中的任一者至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％一致。

连接子或间隔子

溶酶体靶向部分可以融合至适合溶酶体酶多肽的N端或C端，或插入内部。溶酶体靶向部分可以直接融合至溶酶体酶多肽或可以通过连接子或间隔子与溶酶体酶多肽分隔。氨基酸连接子或间隔子一般设计成在两个蛋白质部分之间可弯曲或插入例如α-螺旋等结构。连接子或间隔子可以相对较短，例如聚“GAG”序列GGGGGAAAAGGGG(SEQ ID NO：10)、GAP的“GAP”序列(SEQ ID NO：11)、GGGGGP的“聚GP”序列(SEQ ID NO：12)，或可以是更长的，例如10-50(例如10-20、10-25、10-30、10-35、10-40、10-45、10-50)个氨基酸长。在一些实施方案中，各种短连接子序列可以串联重复存在。举例来说，适合的连接子可以含有串联重复存在的GGGGGAAAAGGGG的“GAG”氨基酸序列(SEQ ID NO：10)。在一些实施方案中，例如连接子可以进一步含有一个或多个“GAP”序列，其框住GGGGGAAAAGGGG的“GAG”序列(SEQ ID NO：10)。举例来说，在一些实施方案中，可以使用GAG2连接子，其含有两个串联“GAG”重复序列，每个由“GAP”序列框住，例如GAPGGGGGAAAAGGGGGAPGGGGGAAAAGGGGGAP(SEQ ID NO：13)。在一些实施方案中，可以使用GAG3连接子，其含有三个串联“GAG”重复序列，每个由两个“GAP”序列框住，例如GAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAP(SEQ IDNO：14)。在一些实施方案中，适合的连接子或间隔子可以含有与SEQ ID NO：14的序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致的序列。

在一些实施方案中，适合的连接子或间隔子可以含有以下序列：GAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAP(SEQ ID NO.：15)。在一些实施方案中，适合的连接子或间隔子可以含有与SEQ ID NO：15的序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％一致的序列。

载体

在一方面，本发明提供编码本文中公开的任一融合蛋白的核酸。在一方面，本发明提供包括所述核酸的载体。术语核酸详细地描述于本文中的定义部分中。用于表达本文中描述的蛋白质和/或本发明的其它组分的载体包括质粒载体，以及双链或单链RNA或DNA病毒性载体。载体可以作为DNA直接引入细胞中或通过间接使用噬菌体和病毒引入细胞中。载体是本领域中通常已知的且详细地描述于Sambrook等人，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)。

宿主细胞

在一方面，本发明提供包括载体的宿主细胞。适合的宿主细胞可以来源于多种生物体，包括(但不限于)哺乳动物、植物、鸟类(例如禽类系统)、昆虫、酵母和细菌。在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞。根据本发明，可以利用对细胞培养和多肽表达敏感的任何哺乳动物细胞作为宿主细胞。根据本发明可以使用的哺乳动物细胞的非限制性实例包括人胚肾293细胞(HEK293)、HeLa细胞；BALB/c小鼠骨髓瘤细胞系(NSO/l，ECACC No：85110503)；人成视网膜细胞(PER.C6(CruCell，Leiden，The Netherlands))，经SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人纤维肉瘤细胞系(例如HT-1080)；人胚肾细胞系(亚克隆用于在悬浮培养物中生长的293或293细胞，Graham等人，J.Gen Virol.，36：59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞+/-DHFR(CHO，Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：4216(1980))；小鼠足细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.，23：243-251(1980))；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HeLa，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；水牛大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(HepG2，HB 8065)；小鼠乳房肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人，AnnalsN.Y.Acad.Sci.，383：44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；人肝细胞瘤细胞系(Hep G2)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、人细胞系CAP和AGE1.HN和Glycotope组。

在一些实施方案中，宿主细胞是非哺乳动物细胞。适合的非哺乳动物细胞包括原核生物、古细菌、酵母和其它真核细胞。适于本发明的非哺乳动物宿主细胞的非限制性实例包括来源于巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)、甲醇毕赤氏酵母(Pichiamethanolica)、安格斯毕赤氏酵母(Pichia angusta)、粟酒裂殖酵母(Schizosacccharomyces pombe)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)的酵母细胞和细胞系；来源于草地贪夜蛾(Sodopterafrugiperda)、粉纹夜蛾(Trichoplusis ni)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)和烟草天蛾(Manduca sexta)的昆虫细胞和细胞系；以及来源于大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus lichenifonnis)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、产气荚膜梭状芽胞杆菌(Clostridia perfringens)、脆弱拟杆菌(Clostridia difficile)的细胞和细胞系；以及来源于爪蟾(Xenopus Laevis)的两栖动物细胞和细胞系。

GNPT

在本发明的一些实施方案中，宿主细胞共同表达GNPT。典型地，通过翻译后修饰大大地影响例如溶酶体酶等治疗糖蛋白以保证适当功能。如本说明书通篇所述，溶酶体蛋白质属于称为酸性水解酶的酶类别且在粗糙型内质网合成为可溶解或膜结合糖蛋白。可溶解溶酶体酶的N-连接的寡糖沿着至高尔基体和穿过高尔基体的运行线修饰以暴露甘露糖-6-磷酸(M6P)识别标记物。这些M6P识别标记物在反面高尔基网(TGN)被阳离子甘露糖-6-磷酸受体(CI-M6PR)识别，由此群集和包装成AP1-内涵素包膜小泡。在与内涵体融合后，受体释放其配体，将溶酶体酶递送至新形成的溶酶体。如果溶酶体蛋白质没能在反面高尔基网中结合M6P受体，例如在其中缺乏磷酸转移酶的I-细胞疾病的情况下，从细胞分泌蛋白质，导致例如血浆、脑脊髓液、泪液和尿等体液内溶酶体酶过量。因为阳离子甘露糖-6-磷酸受体对于溶酶体酶往返于细胞表面的再循环和后退运动来说是重要的，所以CI-M6PR可以充当酶替代疗法中溶酶体介导的治疗糖蛋白的细胞递送的重要标靶。

假定蛋白质靶向的细胞重要性，紧密调节N-连接的寡糖的修饰以暴露甘露糖-6-磷酸识别标签，如同溶酶体酶的情况下。在两步骤过程中产生M6P残基。首先，N-乙酰葡糖胺1-磷酸附接于甘露糖的C6-羟基，接着去除N-乙酰葡糖胺。第一个反应由UDP-GlcNAc：溶酶体酶N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶(GNPT)催化，而第二个反应由α-N-乙酰葡糖胺糖苷酶催化。GNPT酶是含有三个不同亚单位(α、β、γ)的六聚体复合物。溶酶体蛋白质结合在该分子的活性裂口内，其中酶催化N-乙酰葡糖胺1-磷酸加成至蛋白质；利用二磷酸尿苷N-乙酰葡糖胺(UDP-GlcNAc)作为分子底物。

治疗糖蛋白(即溶酶体酶)输入和输出细胞的能力典型地与其M6P磷酸化水平正相关。举例来说，一种或多种治疗糖蛋白(即溶酶体酶)的糖基化水平和其输送能力可以基于其M6P磷酸化水平(单磷酸化或二磷酸化)而改变。

在一些实施方案中，适于本发明的GNPT酶是人GNPT蛋白质(SEQ ID NO：16和/或17)。在一些实施方案中，适合的GNPT酶可以是成熟人GNPT蛋白质的同源物或直系同源。举例来说，成熟人GNPT蛋白质的同源物或直系同源物可以是与野生型或天然存在的GNPT蛋白质(例如SEQ ID NO：16和/或17)相比，含有一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入，同时维持基本GNPT蛋白质活性的经修饰的成熟人GNPT蛋白质。因此，在一些实施方案中，适于本发明的GNPT酶基本上与人GNPT蛋白质(SEQ ID NO：16和/或17)相同。在一些实施方案中，适于本发明的GNPT酶具有与SEQ ID NO：16和/或17至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高程度同源的氨基酸序列。在一些实施方案中，适于本发明的GNPT酶基本上与成熟人GNPT蛋白质(SEQ IDNO：16和/或17)一致。在一些实施方案中，适于本发明的GNPT酶具有与SEQ ID NO：16和/或17至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高程度一致的氨基酸序列。在一些实施方案中，适于本发明的GNPT酶含有成熟人GNPT蛋白质的片段或一部分。

表6.人GNPT蛋白质

包括GNPT在内的酶在宿主细胞和组织培养物中的过度表达是常规的且详细地描述于Sambrook等人中。

培养条件

本发明提供一种使用GNPT细胞培养系统产生重组靶向治疗糖蛋白的方法。在一些实施方案中，细胞培养系统用于小规模产生治疗糖蛋白。在一些实施方案中，细胞培养系统用于大规模产生。在一些实施方案中，所产生的治疗糖蛋白是重组溶酶体酶。用于产生相关重组多肽的典型大规模程序包括分批培养和补料分批培养。分批培养法传统上包含用特定细胞密度的种子培养物接种大规模生产培养物，细胞在有助于细胞生长、存活力和/或生产率的条件(例如适合的培养基、pH值和温度)下生长，当细胞达到指定细胞密度时收获培养物，以及纯化所表达的多肽。补料分批培养程序包括分批培养物补充营养素和在细胞生长期间消耗的其它组分的额外步骤。在一些实施方案中，根据本发明的大规模生产方法使用补料分批培养系统。

生物反应器

本发明还提供了可用于产生重组治疗糖蛋白的生物反应器。生物反应器可以是例如灌注、分批、补料分批、反复分批或连续(例如连续搅动釜式反应器模型)。典型地，生物反应器包含至少一个被设计且配置成容纳培养基(例如化学成分确定的营养培养基)的容器。容器还典型地包含至少一个被设计和配置成使新鲜培养基流入容器的入口。容器还典型地包含至少一个被设计和配置成使废培养基从容器流出的出口。在一些实施方案中，容器可以进一步包含至少一个被设计和配置成使容器中分离的细胞被分配与废培养基一起穿过至少一个出口的程度最小化的过滤器。生物反应器还可以装备有一个或多个设计成能维持适于细胞生长的条件的其它组件。举例来说，生物反应器可以装备有一个或多个被设计和配置成将容器内的培养基循环或混合的循环或混合装置。典型地，经工程化以表达重组治疗糖蛋白的分离的细胞悬浮在培养基中。因此，有时，循环装置确保分离的细胞保持悬浮在培养基中。在一些情况下，细胞附接于基质。在一些情况下，细胞附接于一个或多个悬浮在培养基中的基质(例如微珠)。生物反应器可以包含一个或多个用于从容器获得细胞悬浮液样品的端口。生物反应器可以配置有一个或多个用于监测和/或控制培养物的条件的组件，包括例如气体含量(例如空气、氧、氮、二氧化碳)、流速、温度、pH值和溶解氧水平以及搅动速率/循环速率等条件。

任何适当尺寸的容器都可以用于生物反应器。典型地，容器尺寸适于满足制造重组I2S的生产需要。在一些实施方案中，容器被设计和配置成含有多达1L、多达10L、多达100L、多达500L、多达1000L、多达1500L、多达2000L或更多培养基。在一些实施方案中，生产生物反应器的体积为至少10L、至少50L、100L、至少200L、至少250L、至少500L、至少1000L、至少1500L、至少2000L、至少2500L、至少5000L、至少8000L、至少10,000L或至少12,000L或更多或之间的任何体积。生产生物反应器可以由有助于细胞生长和存活力的不干扰所产生的治疗糖蛋白的表达或稳定性或活性的任何材料建造。示例性材料可以包括(但不限于)玻璃、塑胶或金属。

在一些实施方案中，细胞可以在生物反应器的容器中所容纳的化学成分确定的培养基中培养。培养法通常包括将新鲜培养基通过至少一个入口灌注至容器中且通过至少一个出口从容器放出废培养基。在每天至多约0.1容器体积、每天约0.2容器体积、每天约0.3容器体积、每天约0.4容器体积、每天约0.5容器体积、每天约1容器体积、每天约1.5容器体积或更多的速率下放出。所述方法还包括收获包含重组糖蛋白的培养基。在一些实施方案中，治疗糖蛋白可以是溶酶体酶。在一些实施方案中，治疗糖蛋白可以是融合蛋白。可以在每天至多约0.1容器体积、每天约0.2容器体积、每天约0.3容器体积、每天约0.4容器体积、每天约0.5容器体积、每天约1容器体积、每天约1.5容器体积或更多的速率下收获。灌注也典型地在等于放出速率与收获速率之和的速率下进行。举例来说，灌注速率可以超过每天约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0容器体积。在一些实施方案中，灌注速率少于每天5.0、4.5、4.0、3.5、3.0、2.5、2.0、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5容器体积。

监测培养条件

在本发明的某些实施方案中，从业者可以发现定期监测生长细胞培养物的特定条件是有益的或必需的。监测细胞培养条件容许从业者确定细胞培养物是否正在次最优水平下产生重组多肽或蛋白质或是否培养物即将进入次最优生产阶段。为了监测某些细胞培养条件，需要移出培养物的少量等分试样用于分析。

作为非限制性实例，监测所表达的治疗糖蛋白的温度、pH值、细胞密度、细胞存活力、综合活细胞密度、渗透性或滴度或活性可能是有益的或必需的。本领域中众所周知将容许本领域技术人员测量这些条件的许多技术。举例来说，细胞密度可以使用血球计、库尔特计数器(Coulter counter)或细胞密度检查(CEDEX)测量。活细胞密度可以通过用锥虫蓝染色培养样品来测定。因为仅仅死细胞摄取锥虫蓝，所以活细胞密度可以通过计数细胞总数，将吸收染料的细胞数目除以细胞总数并取倒数来确定。或者，所表达的治疗糖蛋白的水平可以通过例如SDS-PAGE凝胶的考马斯染色(coomassie staining)、蛋白质印迹、布拉德福德分析(Bradford assay)、劳里分析(Lowry assay)、缩二脲分析(Biuret assay)和UV吸光度等标准的分子生物学技术来测定。

监测M6P磷酸化水平和/或产生糖基化概况的聚糖模式也可能是有益的或必需的，如申请的图9-10中所证实。举例来说，在一些实施方案中，可以进行分析以监测聚糖的关键质量属性，例如触角岩藻糖基化、半乳糖苷化、涎酸化、高甘露糖结构和磷酸化结构。在一些实施方案中，可以进行分析以相对于参考样品表征重组产生的糖蛋白。在一些实施方案中，可以进行分析以相对于在相同条件下产生的先前一批或批次的样品蛋白质表征重组产生的糖蛋白。在一些实施方案中，可以进行分析以相对于在不同条件下产生的先前一批或批次的样品蛋白质表征重组产生的糖蛋白。在一些实施方案中，可以进行分析以相对于在不同生产阶段产生的先前一批或批次的样品蛋白质表征重组产生的糖蛋白。

GNPT细胞系可用于重组产生M6P磷酸化水平增加的治疗糖蛋白。在一些实施方案中，使用GNPT细胞系产生的重组治疗糖蛋白的M6P水平高于天然存在的治疗糖蛋白。在一些实施方案中，重组治疗糖蛋白的M6P磷酸化水平高于在未过度表达GNPT的细胞系中重组产生的相同治疗糖蛋白。在一些实施方案中，与未过度表达GNPT的细胞系中的产生相比M6P磷酸化增加至少1倍。在一些实施方案中，M6P磷酸化增加为增加至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80或90倍。在一些实施方案中，M6P磷酸化增加为增加至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在一些实施方案中，使用GNPT细胞系产生的重组治疗糖蛋白的M6P水平比野生型治疗糖蛋白高至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。

在一些实施方案中，使用GNPT细胞系产生的重组治疗糖蛋白可以含有至少一个M6P残基。在一些实施方案中，重组治疗糖蛋白可以含有多个M6P残基。在一些实施方案中，重组治疗糖蛋白可以是具有两个M6P残基的二磷酸化糖蛋白。在一些实施方案中，与野生型蛋白质相比，使用GNPT细胞系产生的重组治疗糖蛋白可以含有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个M6P残基。

在一些实施方案中，与野生型蛋白质相比，重组治疗糖蛋白可以含有例如M3、M4、M5、M6、M7或M8结构等高甘露糖结构的数目和/或水平的增加。在一些实施方案中，与野生型蛋白质相比，M3结构增加1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％。在一些实施方案中，与野生型蛋白质相比，M4结构增加1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％。在一些实施方案中，与野生型蛋白质相比，M5结构增加1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％。在一些实施方案中，与野生型蛋白质相比，M6结构增加1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％。在一些实施方案中，与野生型蛋白质相比，M7结构增加1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％。在一些实施方案中，与野生型蛋白质相比，M8结构增加1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％。

在一些实施方案中，与野生型蛋白质相比，重组治疗糖蛋白可以含有总磷酸化结构的数目和/或水平的增加。在一些实施方案中，与野生型蛋白质相比，总磷酸化结构增加1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％。

在一些实施方案中，与野生型蛋白质相比，使用GNPT细胞系产生的重组治疗糖蛋白可以含有高水平的触角结构。具体地说，用GNPT细胞系产生的治疗糖蛋白可具有高水平的表明M6P磷酸化的A0触角。在一些实施方案中，与野生型蛋白质相比，A0水平增加1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％。

在一些实施方案中，适于本发明的治疗蛋白质可以含有对CI-M6PR具有更高结合亲和力的二磷酸化寡糖。在一些实施方案中，适合的酶含有多达约每种酶约至少20％二磷酸化寡糖的平均值。在其它实施方案中，适合的酶可以含有每种酶约10％、15％、18％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％二磷酸化寡糖。

在一些实施方案中，可以使用多种众所周知的评估CI-M6PR结合水平的结合分析中的任一者，测试由使用GNPT细胞系产生所引起的治疗糖蛋白的M6P磷酸化水平的增加。在一些实施方案中，与天然蛋白质相比，使用GNPT细胞系产生的治疗糖蛋白的CI-M6PR增加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80或90倍。

在一些实施方案中，可以通过使用多种众所周知的体外结合分析中的任一者，例如(但不限于)放射性标记运行分析、放射性标记结合分析、ELISA、表面等离子共振和等温滴定量热法，监测治疗糖蛋白与CI-M6PR的结合，来测试M6P磷酸化水平。在一些实施方案中，可以通过使用例如(但不限于)免疫组织化学染色、荧光免疫组织化学染色和共焦显微术等方法评估细胞摄取，监测治疗糖蛋白与CI-M6PR的结合，来测试M6P磷酸化水平。在一些实施方案中，可以使用例如(但不限于)糖苷酶处理、质谱分析和HPLC等分析技术，分析M6P磷酸化水平。

治疗糖蛋白的纯化

多种方法可以用于纯化或分离根据本文中描述的各种方法产生的治疗糖蛋白。在一些实施方案中，所表达的治疗糖蛋白(例如溶酶体酶)可以分泌到培养基中，因此可以通过离心或过滤作为纯化过程中的第一步骤来去除细胞和其它固体。或者或另外，使表达的治疗糖蛋白可以与宿主细胞表面结合。在此实施方案中，使表达多肽或蛋白质的宿主细胞(例如酵母细胞)进行细胞溶解以用于纯化。宿主细胞(例如酵母细胞)的溶解可以通过本领域技术人员众所周知的大量方式来实现，包括通过玻璃珠进行物理破坏和暴露于高pH值条件。

治疗糖蛋白可以通过标准方法，包括(但不限于)色谱法(例如离子交换、亲和力、尺寸排阻和羟磷灰石色谱法)、凝胶过滤、离心或差别溶解法、乙醇沉淀法或通过任何其它可用于纯化蛋白质的技术来分离和纯化(参见例如Scopes，Protein PurificationPrinciples and Practice 第2版，Springer-Verlag，New York，1987；Higgins，S.J.和Hames，B.D.(编辑)，Protein Expression：A Practical Approach，Oxford Univ Press，1999；以及Deutscher，M.P.，Simon，M.I.，Abelson，J.N.(编辑)，Guide to ProteinPurification：Methods in Enzymology(Methods in Enzymology Series，第182卷)，Academic Press，1997，都以引用的方式并入本文中)。对于免疫亲和色谱法，具体地说，蛋白质可以通过使其与包含针对该蛋白质培育且附着固定支撑物的抗体的亲和柱结合来分离。或者，例如流感包衣序列、聚组氨酸或谷胱甘肽-S-转移酶等亲和标签可以通过标准重组技术来附接于蛋白质，以容易通过穿过适当亲和柱而纯化。例如苯基甲基磺酰氟(PMSF)、亮抑酶肽、胃酶抑素或抑肽酶等蛋白酶抑制剂可以在任何阶段或所有阶段加入，以减少或消除在纯化过程期间多肽或蛋白质的降解。当为分离和纯化所表达的多肽或蛋白质而必须溶解细胞时蛋白酶抑制剂是特别需要的。示例性纯化方法描述于以下实施例部分中。

药物组合物和投药

本发明进一步提供含有根据本发明的靶向治疗剂的药物组合物。典型地，适合的药物组合物含有至少一种药学上可接受的赋形剂并调配用于施用于人。

举例来说，本文中提供的药物组合物可以呈无菌可注射形式(例如适于皮下、静脉或鞘内注射的形式)提供。举例来说，在一些实施方案中，药物组合物呈适于注射的液体剂型提供。在一些实施方案中，药物组合物呈粉剂(例如冻干和/或杀菌)提供，任选地，在真空下，在注射前其用水性稀释剂(例如水、缓冲液、盐溶液等)复原。在一些实施方案中，药物组合物在水、氯化钠溶液、乙酸钠溶液、苯甲醇溶液、磷酸盐缓冲盐水等中稀释和/或复原。在一些实施方案中，粉剂应与水性稀释剂轻轻混合(例如不震荡)。

在一些实施方案中，所提供的药物组合物包含一种或多种药学上可接受的赋形剂(例如防腐剂、惰性稀释剂、分散剂、表面活性剂和/或乳化剂、缓冲剂等)。在一些实施方案中，药物组合物包含一种或多种防腐剂。在一些实施方案中，药物组合物不含防腐剂。

本文中描述的药物组合物的组合物可以通过药学领域中已知或此后研发的任何方法制备。在一些实施方案中，此类制备方法包括以下步骤：使活性成分与一种或多种赋形剂和/或一种或多种其它辅助成分缔合，然后必要和/或需要时，成形和/或将产物包装成所需单剂或多剂单元。

根据本发明的药物组合物可以散装、呈单个单位剂量和/或多个单一单位剂量制备、包装和/或出售。如本文所用，“单位剂量”为包含预定量的活性成分的药物组合物的离散量。活性成分的量一般等于将施用于受试者的剂量和/或此类剂量的适合分数量，例如此类剂量的一半或三分之一。

根据本发明的药物组合物中活性成分、药学上可接受的赋形剂和/或任何其它成分的相对量可以改变，取决于所治疗的受试者的身份、体形和/或条件和/或取决于组合物施用的途径。举例来说，组合物可以包含0.1％与100％(w/w)之间的活性成分。

本发明的药物组合物可以另外包含药学上可接受的赋形剂，如本文所用，所述赋形剂可以是或包含溶剂、分散介质、稀释剂或其它液体媒介物、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等张剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等，如适于所需特定剂型。Remington’s The Science and Practice of Pharmacy，第21版，A.R.Gennaro，(Lippincott，Williams&Wilkins，Baltimore，MD，2006)公开在调配药物组合物时所用的各种赋形剂和已知的其制备技术。除非例如通过产生任何不良生物作用或以有害的方式与药物组合物的任何其它组分另外相互作用，任何常规赋形剂介质与物质或其衍生物不相容，否则其使用涵盖在本发明的范围内。

在一些实施方案中，根据本发明的药物组合物可以经由包括(但不限于)实质内、脑内、脑室内(ICV)、鞘内(例如腰椎内、大池内)施用和直接或间接注射至CNS和/或CSF的任何其它技术和途径在内的各种技术和途径，进行CNS递送。

鞘内递送

在一些实施方案中，根据本发明的药物组合物可以用于鞘内施用。如本文所用，鞘内施用(也称为鞘内注射或鞘内递送)是指注射至脊椎管(围绕脊髓的鞘内空间)。用于鞘内施用的各种配方描述于WO/2011/163652中，其内容以引用的方式并入本文中。

根据本发明，含有靶向治疗剂的药物组合物可以注射在包围脊椎管的任何区域。在一些实施方案中，含有靶向治疗剂的药物组合物注射至腰椎区或小脑延髓池或经脑室内注射至脑室空间。如本文所用，术语“腰部”或“腰椎区域”是指第三根与第四根腰(下背)椎骨且更包括脊柱的L2-S1区域在内的区域。典型地，经由腰椎区域或腰部的鞘内鞘内注射也称为“腰椎鞘内递送”或“腰椎鞘内施用”。

各种装置可以用于根据本发明进行鞘内递送。在一些实施方案中，用于鞘内施用的装置含有流体入口(例如可注射的端口)；具有与流体入口呈流体连通的第一流量孔板和被配置成插入脊髓中的第二流量孔板的中空主体(例如导管)；以及用于将中空主体插入脊髓中固定的固定机构。作为非限制性实例，适合的固定机构含有一个或多个安装在中空主体表面上的头以及在一个或多个头上可调节以防止中空主体(例如导管)从脊髓滑落的缝合环。在多个实施方案中，流体入口包含储存槽。在一些实施方案中，流体入口包含机械泵(例如输注泵)。在一些实施方案中，植入导管连接至储存槽(例如用于推送)或输注泵。流体入口可以植入或在外部。

在一些实施方案中，鞘内施用可以通过腰椎穿刺(即缓慢推注)或经由端口-导管递送系统(即输注或推注)进行。在一些实施方案中，导管插入腰椎薄层之间，且尖端向上朝腱鞘空间旋至所需水平(一般L3-L4)。

为进行注射，本发明的配方可以在液体溶液中调配。另外，酶可以呈固体形式调配且在即将使用时再溶解或悬浮。还包括冻干形式。注射可以例如呈酶的推注或连续输注(例如使用输注泵)形式。

B型山菲立普和其它溶酶体贮积病的治疗

本发明可以用于有效地治疗B型山菲立普综合症和其它溶酶体贮积病。B型山菲立普综合症或III B粘多糖贮积症(MPS III B)为一种由酶Naglu缺乏引起的遗传性代谢病症。Naglu定位至溶酶体且在糖胺聚糖(GAG)乙酰肝素以及硫酸皮肤素的分解代谢中起重要作用。在酶缺乏下，这些底物积累在细胞内，最终引起充血，接着细胞死亡以及组织破坏。由于酶普遍表达，所以在MPS III B患者中影响多个细胞类型以及器官系统。

此病症的界定临床特征为中枢神经系统(CNS)退化，其引起认知损害(例如IQ降低)。另外，患病个体的MRI扫描显示白质病变、脑实质、神经中枢、胼胝体以及脑干中膨胀的血管周围间隙；萎缩；以及巨脑室(Wang等人Molecular Genetics and Metabolism，2009)。疾病典型地在一岁时显现，具有器官巨大症以及骨骼畸形。一些患病个体经历认知功能逐渐丧失，其中大多数患病个体在其十岁或二十岁内死于疾病相关并发症。

本发明的组合物和方法可以用于有效地治疗罹患或易患B型山菲立普综合症的个体。如本文所用，术语“治疗(treat或treatment)”是指一种或多种与疾病有关的症状改善、预防疾病的一种或多种症状或延迟其发作和/或减轻疾病的一种或多种症状的严重程度或频率。

在一些实施方案中，治疗是指部分或完全减轻、改善、减缓、抑制B型山菲立普综合症患者中神经损害、延迟其发作、降低其严重程度和/或发病率。如本文所用，术语“神经损害”包括与中枢神经系统(例如脑和脊髓)损害有关的各种症状。神经损害的症状可以尤其包括例如认知损害；白质损害；脑实质、神经中枢、胼胝体和/或脑干中膨胀的血管周围间隙；和/或巨脑室。

如本文所用，术语“提高”、“增加”或“减少”指示相对于对照的值。在一些实施方案中，适合的对照为基线测量值，例如在相同个体中在开始本文中描述的治疗前的测量值，或在缺乏本文中描述的治疗下对照个体(或多个对照个体)中的测量值。“对照个体”为罹患溶酶体贮积病(例如B型山菲立普综合症)的个体，与罹患相同溶酶体贮积病的个体几乎同岁和/或性别相同，正在进行治疗(以确保所治疗个体和对照个体中疾病的阶段可比较)。

所治疗的个体(还称为“患者”或“受试者”)为患有溶酶体贮积病或可能发展溶酶体贮积病的个体(胎儿、婴儿、儿童、青少年或成年人)。在一些实施方案中，溶酶体贮积病是山菲立普综合症。在一些特定实施方案中，溶酶体贮积病为B型山菲立普综合症。个体可以具有残余的内源性Naglu表达和/或活性，或活性不可测量。举例来说，患有B型山菲立普综合症的个体可具有比正常Naglu表达水平少约30-50％、少约25-30％、少约20-25％、少约15-20％、少约10-15％、少约5-10％、少约0.1-5％的Naglu表达水平。

在一些实施方案中，个体为最近被诊断患有疾病的个体。典型地，早期治疗(在诊断后尽快开始治疗)对最小化疾病作用和最大化治疗益处来说是重要的。

通过提及以下实施例将更充分地理解本发明。然而，其不应解释为限制本发明的范围。本文中引用的所有参考文献都以引用的方式整体并入本文中。

实施例

实施例1：Naglu融合蛋白的产生

若干蛋白质已经经由M6P依赖性方式参与结合CI-M6P受体内的不同胞外区/结构域，例如白血病抑制因子、E1A刺激基因的细胞阻遏子和皂角素，或经由非M6P依赖性方式参与结合，例如胰岛素样生长因子II。因此，设计一系列Naglu-融合蛋白，其可结合CI-M6PR，因此可促进CI-M6PR介导的rhNaglu至溶酶体的递送，如下所述。

Naglu-SapDC

Naglu-SapDC蛋白质是如下所述，Naglu与皂角素蛋白部分的融合物。为了产生Naglu-SapDC融合蛋白，通过使人Naglu基因与编码皂角素的保守C端区域和D功能域(SapDC)的序列偶合来产生核酸构筑体。GAG3连接子插入两个序列之间以允许在翻译后两个肽之间旋转。在所得全长Naglu-SapDC融合蛋白(SEQ ID NO：18)中，全长Naglu构成N端，且SapDC肽序列构成C端。

人全长Naglu-斜体

GAG3连接子-粗体

SapDC-下划线

SapDC序列内的位点

(N)-表示糖基化位点

Naglu-LIF

Naglu-LIF蛋白质是如下所述，Naglu与白血病抑制因子蛋白质的部分的融合物。为了产生Naglu-LIF融合蛋白，通过使人Naglu基因与编码包含糖基化位点和白血病抑制因子(LIF)的4个螺旋束的螺旋A、B、C和D的102个氨基酸序列的序列偶合来产生核酸构筑体。GAG3连接子插入两个序列之间以允许在翻译后两个肽之间旋转。在所得全长Naglu-LIF融合蛋白(SEQ ID NO：19)中，全长Naglu构成N端，且LIF肽序列构成C端。

人全长Naglu-斜体

GAG3连接子-粗体

LIF-下划线

LIF序列内的位点

(N)-表示糖基化位点

{}-表示为改变受体gp 130的识别而进行的突变；[[]]-表示为改变LIF受体的识别而进行的突变

Naglu-CREG

Naglu-CREG蛋白质是如下所述，Naglu与E1A刺激基因的细胞阻遏子蛋白的部分的融合物。为了产生Naglu-CREG融合蛋白，通过使人Naglu基因与编码CREG氨基酸序列的序列偶合来产生核酸构筑体。GAG3连接子插入两个序列之间以允许在翻译后两个肽之间旋转。在所得全长Naglu-CREG融合蛋白(SEQ ID NO：20)中，全长Naglu构成N端，且CREG肽序列构成C端。

人全长Naglu-斜体

GAG3连接子-粗体

CREG-下划线

CREG序列内的位点

(N)-表示糖基化位点

Naglu-IGFII

Naglu-IGFII蛋白质是如下所述，Naglu与胰岛素样生长因子II肽的部分的融合物。为了产生Naglu-IGFII融合蛋白，通过使人Naglu基因与编码胰岛素样生长因子II肽IGFII的氨基酸残基8-67(SEQ ID NO：22)的序列偶合来产生核酸构筑体。GAG3连接子插入两个序列之间以允许在翻译后两个肽之间旋转。在所得全长Naglu-IGFII融合蛋白(SEQ IDNO：21)中，全长Naglu构成N端，且IGFII肽序列构成C端。与全长IGFII分子相比，报道8-67IGFII以高2-10倍的亲和力结合M6P/IGF II受体，而其结合IGF I受体的能力减少30倍(Hashimoto R，JBC 1995 270(30)：18013-18018)。

人全长Naglu-斜体

GAG3连接子-粗体

IGFII-下划线

SEQ ID NO：18-21是全长Naglu融合蛋白的氨基酸序列，其还含有在细胞内加工期间去除的全长Naglu蛋白质的那些23个N端氨基酸。以下提供的氨基酸序列(SEQ ID NO：23-26)是不包括这些23个N端氨基酸的对应序列。

Naglu-SapDC：

人全长Naglu-斜体

GAG3连接子-粗体

SapDC-下划线

SapDC序列内的位点

(N)-表示糖基化位点

Naglu-LIF：

人全长Naglu-斜体

GAG3连接子-粗体

LIF-下划线

LIF序列内的位点

(N)-表示糖基化位点

{}-表示为改变受体gp 130的识别而进行的突变；[[]]-表示为改变LIF受体的识别而进行的突变

Naglu-CREG：

人全长Naglu-斜体

GAG3连接子-粗体

CREG-下划线

CREG序列内的位点

(N)-表示糖基化位点

Naglu-IGFII：

人全长Naglu-斜体

GAG3连接子-粗体

IGFII-下划线

实施例2：Naglu-融合蛋白的体外M6P受体结合和细胞摄取

使用标准技术，将编码不同Naglu融合蛋白中之每一者的核酸亚克隆至哺乳动物表达载体中并转染至HT-1080细胞中。接着使用本领域中一般已知的技术，筛选转染子以产生过度表达HT-1080的细胞系。对于所有体外基于蛋白质的分析和受体结合实验，在波浪式生物反应器中，使用哺乳动物细胞培养表达系统产生重组蛋白质。在表达后，每个融合蛋白进行三步纯化过程。首先，使用超过滤(UF)装置(Pall Corporation，Port Washington，NY11050)浓缩条件培养基。接着浓缩的培养基施加至丁基琼脂糖色谱柱(丁基)，且接着此纯化步骤的洗脱物使用Q琼脂糖色谱柱(Q)进一步纯化。经纯化的蛋白质经缓冲液更换成PBS(11.9mM磷酸钠、2.7mM磷酸钾、137mM氯化钠，pH 7.4)用于存储。所得融合蛋白纯化至纯度大于90％。

在纯化后，用各种浓度的融合蛋白和针对人Naglu的抗体进行ELISA，以评估Naglu-融合蛋白与CI-M6PR的结合。数据表明Naglu-IGFII、Naglu-CREG、Naglu-SapDC和Naglu-LIF融合蛋白能够结合于CI-M6PR(图1和2)。在四种融合蛋白中，Naglu-IGFII展示以大约0.21nM的K_D最强结合。Naglu-CREG、Naglu-SapDC和Naglu LIF还展示与CI-M6PR的强结合(K_D分别为1.25、5.5和32.4nM)，然而，其不如Naglu-IGFII的结合强(图1和2)。

还评估体外CI-M6PR介导的每种Naglu-融合蛋白的靶向和细胞摄取。简单地说，过度表达CI-M6PR的细胞生长至汇合，并用各种浓度的重组Naglu-IGFII、Naglu-CREG、Naglu-SapDC或Naglu-LIF的溶液(其含有其它甘露糖-6-磷酸或不含)处理(图3)。指定时间段后，去除上清液且重复洗涤细胞。在细胞溶解后，分析每个样品的细胞内Naglu酶活性。数据表明在用每种融合蛋白处理后，细胞内Naglu活性的水平增加，表明所有四种融合蛋白都有效地被细胞内在化(图3)。此与甘露糖-6-磷酸存在下Naglu-融合蛋白的培育形成鲜明对比，甘露糖-6-磷酸盐存在下完全阻断细胞内在化(图3)。甘露糖-6-磷酸阻止每种Naglu-融合蛋白(Naglu-CREG、Naglu-SapDC和Naglu-LIF)的CI-M6PR靶向和溶酶体进入的能力表明甘露糖-6-磷酸能够有效胜过Naglu-融合蛋白与CI-M6PR的结合。此表明观测到的每种Naglu-融合蛋白的细胞内在化和溶酶体进入是CI-M6PR的结果。数据还表明Naglu-融合蛋白的细胞摄取以剂量依赖性方式发生，因为细胞内Naglu活性随着添加到分析中的Naglu-融合蛋白的浓度递增成比例增加(图3)。Naglu-IGFII与CI-M6PR的结合通过IGF-II结构域与CI-M6PR之间的蛋白质-蛋白质相互作用介导。因此，Naglu-IGFII的细胞摄取不取决于甘露糖-6-磷酸，且不被其击败。

实施例3：GNPT细胞系的产生

假定GNPT在N-连接的聚糖的翻译后修饰，特别是可溶解的溶酶体酶的M6P-磷酸化中起关键作用，进行实验以评估GNPT酶的过度表达是否会导致溶酶体酶上M6P-磷酸化水平增加。

N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶(GNTP)蛋白质为含有三个不同亚单位(α、β、γ)每一者的两个拷贝的六聚体复合物。编码GNTP蛋白质的α/β亚单位和γ亚单位的核酸克隆至含有α/β亚单位的表达盒和γ亚单位的一个表达暗盒的一种哺乳动物表达载体中。将载体转染至人HT-1080细胞中，接着在选择压力下生长以建立过度表达重组GNTP的细胞系。选择过度表达GNPT的细胞系且用于用表达Naglu-LIF、Naglu-CREG、Naglu-SapDC或Naglu-IGFII或各种溶酶体贮积病酶(ARSA、I2S、HNS、GAA、GCB)之一的天然形式的哺乳动物表达载体进行二次转染。GNTP和每种共同表达产物的过度表达通过qPCR、ELISA、溶酶体酶活性分析和/或蛋白质印迹分析来证实。

GNPT酶呈含有三个不同亚单位(α、β、γ)每一者的两个拷贝的六聚体蛋白复合物存在。产生一种构筑体，其含有两个表达盒，一个编码α/β亚单位且第二个编码γ亚单位。

GNTPα/β

为促进GNPT的α和β亚单位的表达，使用SEQ ID ID：27的核酸序列产生核酸构筑体。

ATGCTGTTCAAGCTCCTGCAGAGACAGACCTATACCTGCCTGTCCCACAGGTATGGGCTCTACGTGTGCTTCTTGGGCGTCGTTGTCACCATCGTCTCCGCCTTCCAGTTCGGAGAGGTGGTTCTGGAATGGAGCCGAGATCAATACCATGTTTTGTTTGATTCCTATAGAGACAATATTGCTGGAAAGTCCTTTCAGAATCGGCTTTGTCTGCCCATGCCGATTGACGTTGTTTACACCTGGGTGAATGGCACAGATCTTGAACTACTGAAGGAACTACAGCAGGTCAGAGAACAGATGGAGGAGGAGCAGAAAGCAATGAGAGAAATCCTTGGGAAAAACACAACGGAACCTACTAAGAAGAGTGAGAAGCAGTTAGAGTGTTTGCTAACACACTGCATTAAGGTGCCAATGCTTGTCCTGGACCCAGCCCTGCCAGCCAACATCACCCTGAAGGACCTGCCATCTCTTTATCCTTCTTTTCATTCTGCCAGTGACATTTTCAATGTTGCAAAACCAAAAAACCCTTCTACCAATGTCTCAGTTGTTGTTTTTGACAGTACTAAGGATGTTGAAGATGCCCACTCTGGACTGCTTAAAGGAAATAGCAGACAGACAGTATGGAGGGGCTACTTGACAACAGATAAAGAAGTCCCTGGATTAGTGCTAATGCAAGATTTGGCTTTCCTGAGTGGATTTCCACCAACATTCAAGGAAACAAATCAACTAAAAACAAAATTGCCAGAAAATCTTTCCTCTAAAGTCAAACTGTTGCAGTTGTATTCAGAGGCCAGTGTAGCGCTTCTAAAACTGAATAACCCCAAGGATTTTCAAGAATTGAATAAGCAAACTAAGAAGAACATGACCATTGATGGAAAAGAACTGACCATAAGTCCTGCATATTTATTATGGGATCTGAGCGCCATCAGCCAGTCTAAGCAGGATGAAGACATCTCTGCCAGTCGTTTTGAAGATAACGAAGAACTGAGGTACTCATTGCGATCTATCGAGAGGCATGCACCATGGGTTCGGAATATTTTCATTGTCACCAACGGGCAGATTCCATCCTGGCTGAACCTTGACAATCCTCGAGTGACAATAGTAACACACCAGGATGTTTTTCGAAATTTGAGCCACTTGCCTACCTTTAGTTCACCTGCTATTGAAAGTCACATTCATCGCATCGAAGGGCTGTCCCAGAAGTTTATTTACCTAAATGATGATGTCATGTTTGGGAAGGATGTCTGGCCAGATGATTTTTACAGTCACTCCAAAGGCCAGAAGGTTTATTTGACATGGCCTGTGCCAAACTGTGCCGAGGGCTGCCCAGGTTCCTGGATTAAGGATGGCTATTGTGACAAGGCTTGTAATAATTCAGCCTGCGATTGGGATGGTGGGGATTGCTCTGGAAACAGTGGAGGGAGTCGCTATATTGCAGGAGGTGGAGGTACTGGGAGTATTGGAGTTGGACAGCCCTGGCAGTTTGGTGGAGGAATAAACAGTGTCTCTTACTGTAATCAGGGATGTGCGAATTCCTGGCTCGCTGATAAGTTCTGTGACCAAGCATGCAATGTCTTGTCCTGTGGGTTTGATGCTGGCGACTGTGGGCAAGATCATTTTCATGAATTGTATAAAGTGATCCTTCTCCCAAACCAGACTCACTATATTATTCCAAAAGGTGAATGCCTGCCTTATTTCAGCTTTGCAGAAGTAGCCAAAAGAGGAGTTGAAGGTGCCTATAGTGACAATCCAATAATTCGACATGCTTCTATTGCCAACAAGTGGAAAACCATCCACCTCATAATGCACAGTGGAATGAATGCCACCACAATACATTTTAATCTCACGTTTCAAAATACAAACGATGAAGAGTTCAAAATGCAGATAACAGTGGAGGTGGACACAAGGGAGGGACCAAAACTGAATTCTACAGCCCAGAAGGGTTACGAAAATTTAGTTAGTCCCATAACACTTCTTCCAGAGGCGGAAATCCTTTTTGAGGATATTCCCAAAGAAAAACGCTTCCCGAAGTTTAAGAGACATGATGTTAACTCAACAAGGAGAGCCCAGGAAGAGGTGAAAATTCCCCTGGTAAATATTTCACTCCTTCCAAAAGACGCCCAGTTGAGTCTCAATACCTTGGATTTGCAACTGGAACATGGAGACATCACTTTGAAAGGATACAATTTGTCCAAGTCAGCCTTGCTGAGATCATTTCTGATGAACTCACAGCATGCTAAAATAAAAAATCAAGCTATAATAACAGATGAAACAAATGACAGTTTGGTGGCTCCACAGGAAAAACAGGTTCATAAAAGCATCTTGCCAAACAGCTTAGGAGTGTCTGAAAGATTGCAGAGGTTGACTTTTCCTGCAGTGAGTGTAAAAGTGAATGGTCATGACCAGGGTCAGAATCCACCCCTGGACTTGGAGACCACAGCAAGATTTAGAGTGGAAACTCACACCCAAAAAACCATAGGCGGAAATGTGACAAAAGAAAAGCCCCCATCTCTGATTGTTCCACTGGAAAGCCAGATGACAAAAGAAAAGAAAATCACAGGGAAAGAAAAAGAGAACAGTAGAATGGAGGAAAATGCTGAAAATCACATAGGCGTTACTGAAGTGTTACTTGGAAGAAAGCTGCAGCATTACACAGATAGTTACTTGGGCTTTTTGCCATGGGAGAAAAAAAAGTATTTCCAAGATCTTCTCGACGAAGAAGAGTCATTGAAGACACAATTGGCATACTTCACTGATAGCAAAAATACTGGGAGGCAACTAAAAGATACATTTGCAGATTCCCTCAGATATGTAAATAAAATTCTAAATAGCAAGTTTGGATTCACATCGCGGAAAGTCCCTGCTCACATGCCTCACATGATTGACCGGATTGTTATGCAAGAACTGCAAGATATGTTCCCTGAAGAATTTGACAAGACGTCATTTCACAAAGTGCGCCATTCTGAGGATATGCAGTTTGCCTTCTCTTATTTTTATTATCTCATGAGTGCAGTGCAGCCACTGAATATATCTCAAGTCTTTGATGAAGTTGATACAGATCAATCTGGTGTCTTGTCTGACAGAGAAATCCGAACACTGGCTACCAGAATTCACGAACTGCCGTTAAGTTTGCAGGATTTGACAGGTCTGGAACACATGCTAATAAATTGCTCAAAAATGCTTCCTGCTGATATCACGCAGCTAAATAATATTCCACCAACTCAGGAATCCTACTATGATCCCAACCTGCCACCGGTCACTAAAAGTCTAGTAACAAACTGTAAACCAGTAACTGACAAAATCCACAAAGCATATAAGGACAAAAACAAATATAGGTTTGAAATCATGGGAGAAGAAGAAATCGCTTTTAAAATGATTCGTACCAACGTTTCTCATGTGGTTGGCCAGTTGGATGACATAAGAAAAAACCCTAGGAAGTTTGTTTGCCTGAATGACAACATTGACCACAATCATAAAGATGCTCAGACAGTGAAGGCTGTTCTCAGGGACTTCTATGAATCCATGTTCCCCATACCTTCCCAATTTGAACTGCCAAGAGAGTATCGAAACCGTTTCCTTCATATGCATGAGCTGCAGGAATGGAGGGCTTATCGAGACAAATTGAAGTTTTGGACCCATTGTGTACTAGCAACATTGATTATGTTTACTATATTCTCATTTTTTGCTGAGCAGTTAATTGCACTTAAGCGGAAGATATTTCCCAGAAGGAGGATACACAAAGAAGCTAGTCCCAATCGAATCAGAGTATAG(SEQ ID NO：27)

所得氨基酸序列(SEQ ID NO：28)包括GNPT的α和β亚单位以及所需裂解识别位点。

MLFKLLQRQTYTCLSHRYGLYVCFLGVVVTIVSAFQFGEVVLEWSRDQYHVLFDSYRDNIAGKSFQNRLCLPMPIDVVYTWVNGTDLELLKELQQVREQMEEEQKAMREILGKNTTEPTKKSEKQLECLLTHCIKVPMLVLDPALPANITLKDLPSLYPSFHSASDIFNVAKPKNPSTNVSVVVFDSTKDVEDAHSGLLKGNSRQTVWRGYLTTDKEVPGLVLMQDLAFLSGFPPTFKETNQLKTKLPENLSSKVKLLQLYSEASVALLKLNNPKDFQELNKQTKKNMTIDGKELTISPAYLLWDLSAISQSKQDEDISASRFEDNEELRYSLRSIERHAPWVRNIFIVTNGQIPSWLNLDNPRVTIVTHQDVFRNLSHLPTFSSPAIESHIHRIEGLSQKFIYLNDDVMFGKDVWPDDFYSHSKGQKVYLTWPVPNCAEGCPGSWIKDGYCDKACNNSACDWDGGDCSGNSGGSRYIAGGGGTGSIGVGQPWQFGGGINSVSYCNQGCANSWLADKFCDQACNVLSCGFDAGDCGQDHFHELYKVILLPNQTHYIIPKGECLPYFSFAEVAKRGVEGAYSDNPIIRHASIANKWKTIHLIMHSGMNATTIHFNLTFQNTNDEEFKMQITVEVDTREGPKLNSTAQKGYENLVSPITLLPEAEILFEDIPKEKRFPKFKRHDVNSTRRAQEEVKIPLVNISLLPKDAQLSLNTLDLQLEHGDITLKGYNLSKSALLRSFLMNSQHAKIKNQAIITDETNDSLVAPQEKQVHKSILPNSLGVSERLQRLTFPAVSVKVNGHDQGQNPPLDLETTARFRVETHTQKTIGGNVTKEKPPSLIVPLESQMTKEKKITGKEKENSRMEENAENHIGVTEVLLGRKLQHYTDSYLGFLPWEKKKYFQDLLDEEESLKTQLAYFTDSKNDTFADSLRYVNKILNSKFGFTSRKVPAHMPHMIDRIVMQELQDMFPEEFDKTSFHKVRHSEDMQFAFSYFYYLMSAVQPLNISQVFDEVDTDQSGVLSDREIRTLATRIHELPLSLQDLTGLEHMLINCSKMLPADITQLNNIPPTQESYYDPNLPPVTKSLVTNCKPVTDKIHKAYKDKNKYRFEIMGEEEIAFKMIRTNVSHVVGQLDDIRKNPRKFVCLNDNIDHNHKDAQTVKAVLRDFYESMFPIPSQFELREYRNRFLHMHELQEWRAYRDKLKFWTHCVLATLIMFTIFSFFAEQLIALKRKIFPRRRIHKEASPNRIRV(SEQ ID NO：28)

*α/β裂解识别位点-粗体和下划线

GNPTγ

为促进GNPT的γ亚单位的表达，使用SEQ ID ID：29的核酸序列产生核酸构筑体。

ATGGCGGCGGGGCTGGCGCGGCTCCTGTTGCTCCTCGGGCTCTCGGCCGGCGGGCCCGCGCCGGCAGGTGCAGCGAAGATGAAGGTGGTGGAGGAGCCCAACGCGTTTGGGGTGAACAACCCGTTCTTGCCTCAGGCCAGTCGCCTCCAGGCCAAGAGGGATCCTTCACCCGTGTCTGGACCCGTGCATCTCTTCCGACTCTCGGGCAAGTGCTTCAGCCTGGTGGAGTCCACGTACAAGTATGAGTTCTGCCCGTTCCACAACGTGACCCAGCACGAGCAGACCTTCCGCTGGAACGCCTACAGTGGGATCCTCGGCATCTGGCACGAGTGGGAGATCGCCAACAACACCTTCACGGGCATGTGGATGAGGGACGGTGACGCCTGCCGTTCCCGGAGCCGGCAGAGCAAGGTGGAGCTGGCGTGTGGAAAAAGCAACCGGCTGGCCCATGTGTCCGAGCCGAGCACCTGCGTCTACGCGCTGACGTTCGAGACCCCCCTCGTCTGCCACCCCCACGCCTTGCTAGTGTACCCAACCCTGCCAGAGGCCCTGCAGCGGCAGTGGGACCAGGTAGAGCAGGACCTGGCCGATGAGCTGATCACCCCCCAGGGCCATGAGAAGTTGCTGAGGACACTTTTTGAGGATGCTGGCTACTTAAAGACCCCAGAAGAAAATGAACCCACCCAGCTGGAGGGAGGTCCTGACAGCTTGGGGTTTGAGACCCTGGAAAACTGCAGGAAGGCTCATAAAGAACTCTCAAAGGAGATCAAAAGGCTGAAAGGTTTGCTCACCCAGCACGGCATCCCCTACACGAGGCCCACAGAAACTTCCAACTTGGAGCACTTGGGCCACGAGACGCCCAGAGCCAAGTCTCCAGAGCAGCTGCGGGGTGACCCAGGACTGCGTGGGAGTTTGTGA(SEQID NO：29)

所得氨基酸序列(SEQ ID NO：30)包括GNPT的γ亚单位。

MAAGLARLLLLLGLSAGGPAPAGAAKMKVVEEPNAFGVNNPFLPQASRLQAKRDPSPVSGPVHLFRLSGKCFSLVESTYKYEFCPFHNVTQHEQTFRWNAYSGILGIWHEWEIANNTFTGMWMRDGDACRSRSRQSKVELACGKSNRLAHVSEPSTCVYALTFETPLVCHPHALLVYPTLPEALQRQWDQVEQDLADELITPQGHEKLLRTLFEDAGYLKTPEENEPTQLEGGPDSLGFETLENCRKAHKELSKEIKRLKGLLTQHGIPYTRPTETSNLEHLGHETPRAKSPEQLRGDPGLRGSL(SEQ ID NO：30)

实施例4：评估在GNPT细胞系中产生的溶酶体酶

假定GNPT在N-连接的聚糖的翻译后修饰，特别是可溶解的溶酶体酶的M6P-磷酸化中起关键作用，进行实验以评估GNPT酶的过度表达是否会导致溶酶体酶上M6P-磷酸化水平增加。简单地说，使用标准方法产生过度表达单个溶酶体酶(GAA、LAL、ARSA、I2S、HNS或GCB)或共同过度表达溶酶体酶和GNPT(GAA-GNPT、ARSA-GNPT、I2S-GNPT、HNS-GNPT或GCB-GNPT)的重组HT-1080细胞系。产生仅过度表达Naglu-LIF(Naglu-LIF)或Naglu-LIF和GNPT(Naglu-LIF-GNPT)的类似细胞系。每种细胞系生长至汇合，且收集条件细胞培养基并如所述浓缩。为了对照，接着将浓缩样品的部分用糖苷内切酶H处理，且处理和未处理的样品通过SDS-PAGE(蛋白质通过ELISA或酶活性分析来定量且负载250ng每种溶酶体酶)分离，且通过蛋白质印迹，使用抗M6P抗体进行分析。如图4所示，与单独溶酶体酶的表达相比，每种溶酶体酶与GNPT共同表达引起M6P磷酸化信号显著增加。意外地，虽然单独的过度表达的Naglu-LIF蛋白质未以任何可检测方式进行M6P磷酸化，但Naglu-LIF与GNPT的共同表达引起M6P-磷酸化增加(图4)。

这些数据表明可使用融合蛋白和/或GNPT的共同表达增加溶酶体酶(例如Naglu)的M6P-磷酸化。

实施例5：使用GNPT细胞系产生的重组I2S增加的M6P受体结合和细胞摄取

为进一步评估过度表达GNPT的细胞系中重组溶酶体蛋白质的表达是否引起M6P-磷酸化增加，进行关于溶酶体酶I2S的其它研究。使用标准方法产生单独过度表达I2S或共同过度表达I2S和GNPT的重组HT-1080细胞系。每种细胞系生长至汇合，且收集条件细胞培养基并如所述浓缩。使用实施例4中描述的CI-M6PR结合分析，测试每种蛋白质在受体亲和力方面的任何变化。此分析揭露来自单独过度表达此蛋白质的细胞的I2S比来自还过度表达GNPT的细胞的I2S结合CI-M6PR弱(图5)。

还评估重组产生的I2S蛋白的体外M6P受体介导的靶向和细胞摄取。简单地说，过度表达CI-M6PR的细胞生长至汇合，且用在仅过度表达此蛋白质的HT-1080细胞中产生的重组I2S或在还过度表达GNPT的HT-1080细胞中产生的重组I2S的溶液处理。指定时间段后，去除上清液且重复洗涤细胞。在溶解后，分析每个细胞样品的细胞内I2S酶活性。数据表明与在单独过度表达I2S的细胞中产生的I2S(K_D＝27.89nM)相比，在过度表达GNPT的细胞系中产生的I2S更迅速地内在化，且对CI-M6PR的亲和力展示更高亲和力(K_D＝1.65nM)(图6)。综合来说，此细胞摄取增加与观测到的增加的M6P-磷酸化(图4)和更紧的受体结合(图5)相符，表明细胞增强的CI-M6PR介导的细胞摄取是增加的M6P-磷酸化和CI-M6PR结合亲和力的结果。

实施例6：天然和使用GNPT细胞系产生的Naglu-融合蛋白增加的M6P受体结合

如上所述，重组产生的治疗糖蛋白的M6P-磷酸化的水平可以通过使用过度表达GNPT的细胞系增加(图4)。具体地说，观测到治疗融合糖蛋白Naglu-LIF的M6P磷酸化增加(图4)。意外地，当与LIF融合时Naglu蛋白质的此M6P-磷酸化增加产生对天然Naglu蛋白质或关于在未过度表达GNPT的细胞中产生的非融合rhNaglu未观测到的M6P-磷酸化水平。为进一步评估此现象，进行其它研究来评估rhNaglu和使用过度表达GNPT的细胞系重组产生的各种融合蛋白的M6P-磷酸化水平。简单地说，使用标准程序产生表达单个重组蛋白质(Naglu-IGFII、rhNaglu、Naglu-CREG或Naglu-SapDC)或共同表达溶酶体酶和GNPT(GNPT/Naglu-SapDC、GNPT/Naglu-CREG、GNPT/rhNaglu)的克隆HT-1080细胞系。每个细胞系生长至汇合，收集条件培养基且各别溶酶体蛋白质和/或融合蛋白纯化至纯度大于90％。

对于初步研究，体外分析用于评估CI-M6PR结合。此分析揭露单独rhNaglu的过度表达引起对CI-M6PR的结合亲和力极其低，K_d低于分析的检测极限(图7)。此结果是根据先前的发现，证明当通过在HT-1080细胞中过度表达而产生时rhNaglu酶几乎无M6P-磷酸化。相比之下，使用过度表达GNPT的细胞系产生的rhNaglu第一次证明对CI-M6PR的结合亲和力弱，K_d值为大约65nM(图7)。虽然此结合亲和力比Naglu-IGFII(用作阳性对照)的结合亲和力低得多(图7)，但后者的结合通过IGF-II结构域与CI-M6PR之间的蛋白质-蛋白质相互作用介导。因此，数据表明例如Naglu等某些治疗糖蛋白的低M6P-磷酸化水平可以通过在过度表达GNPT的细胞系中制造这些蛋白质来提高。此外，数据表明通过产生其中融合区能够进行N-连接的糖基化和M6P-磷酸化的融合蛋白，M6P-磷酸化水平降低的治疗糖蛋白可以用于CI-M6PR介导的溶酶体递送。

在研究第二期中，使用如上所述的相同体外结合分析，评估剩余Naglu融合蛋白的CI-M6PR结合。与先前的发现一致，数据表明Naglu-CREG与Naglu-SapDC融合蛋白都能够结合CI-M6PR。此证明治疗糖蛋白可以用溶酶体靶向部分工程化为融合蛋白，以促进与CI-M6PR的结合。Naglu-SapDC和Naglu-CREG融合蛋白对CI-M6PR的结合亲和力分别为2.90nM和2.50nM(图8)，大于rhNaglu(未检出)和在过度表达GNPT的细胞中产生的rhNaglu(65nM)(图7)。从类似于针对Naglu-IGF-II观测到的结合亲和力(0.24nM)，对CI-M6PR的结合亲和力显著增加(对GNPT/Naglu-SapDC，为0.23nM，以及对GNPT/Naglu-CREG，为0.41nM)显而易见，过度表达GNPT的细胞中融合蛋白的产生引起其M6P-磷酸化进一步增加(图8)。

实施例7：使用GNPT细胞系产生的Naglu-融合蛋白增加的M6P-修饰

为进一步证实与GNPT共同表达后Naglu-LIF和Naglu-SapDC上M6P的增加，进行单糖M6P定量分析。此方法使用酸解来分解所分析的糖蛋白上的所有聚糖；接着检测所释放的单糖，例如M6P，并用PAD-HPLC(脉冲安培法检测高效液相色谱)定量。简单地说，M6P二钠盐用来鉴别从分析样品释放的M6P的峰。M6P标准的曲线下面积用来产生标准曲线，允许定量从样品释放的M6P。在与GNPT共同表达后，Naglu-SapDC的M6P含量从0.75增加至1.84mol/mol(M6P/蛋白质)，且在与GNPT共同表达后，Naglu-LIF的M6P含量增加至1.07(图9)。共同表达GNPT的Naglu-SapDC与共同表达GNPT的Naglu-LIF的M6P含量都非常类似于对照蛋白质I2S的M6P含量(图9)。此结果表明GNPT共同表达增加Naglu融合蛋白的M6P含量至治疗上有意义的水平。下面更详细地阐述用于定量Naglu-LIF和Naglu-SapDC上的M6P的方法。

通过PAD-HPLC定量甘露糖-6-磷酸的程序是从Zhou等人2002，Anal Biochem.15；306(2)：163-170改编。将蛋白质样品与13M三氟乙酸(TFA)混合至6.75M TFA的最终浓度。接着混合物转移至具有螺帽的0.5ml玻璃小瓶中。使用从Sigma-Aldrich Corporation(St.Louis.MO)购买的甘露糖-6-磷酸二钠制备标准品。标准品在H₂O/TFA中制备，浓度在50至1000pM范围内，且接着转移至具有螺帽的玻璃小瓶。所有样品在加热区块中在100℃下加热1.5小时。加热后，玻璃小瓶放在冰上5分钟，且样品转移至埃氏管(Eppendorf tube)。样品在14,000rpm下离心2分钟，然后在浓缩器中干燥约1.5小时。接着200μl水添加至每个样品中且样品再如前干燥。接着100μl水添加至每个样品中且样品通过0.45μm离心过滤单元(Millipore，Billerica，MA)以14,000rpm过滤5分钟。20微升的每个样品和标准品注射在硼酸盐捕捉柱与CarboPac PA 10分析柱成直线的色谱系统(Dionex ICS-3000离子色谱系统(Thermo Fisher Scientific，Inc.，Sunnyvale，CA))中。等度梯度如下进行：80％洗脱液A(100mM NaOH)和20％洗脱液B(1MNaAc于100mM NaOH中)15分钟，逐步至70％洗脱液B 5分钟，接着回至20％洗脱液B。

实施例8：使用GNPT细胞系产生的Naglu-融合蛋白增加的细胞摄取

还评估在过度表达GNPT的细胞系中产生的Naglu-SapDC和Naglu-LIF的体外CI-M6PR介导的靶向和细胞摄取(图10-11)。测定Naglu-IGFII的细胞摄取用于比较。所有样品在一致条件下并行运行，以使得所得数据可比较。

简单地说，过度表达CI-M6PR的细胞生长至汇合，且用在单独HT-1080细胞中产生的重组Naglu-SapDC和Naglu-Lif或在还过度表达GNPT的HT-1080细胞中产生的重组Naglu-SapDC和Naglu-Lif的溶液处理。指定时间段后，去除上清液且重复洗涤细胞。溶解后，分析每个细胞样品的细胞内Naglu酶活性，且总蛋白质通过BCA蛋白质分析来测量。图10-11中图的x轴表示施加于细胞的Naglu-SapDC或Naglu-LIF的量。y轴表示细胞内Naglu活性，或通过总蛋白质量标准化的Naglu酶的当量数，单位为纳克(ng)(参见图10上图)。

数据展示在过度表达GNPT的细胞中产生的Naglu-SapDC对CI-M6PR的亲和力比在单独表达Naglu-SapDC的细胞中产生的Naglu-SapDC的亲和力高14倍(分别K_D＝14.88对比K_D＝208.78nM)(图10)。Naglu-IGFII对CI-M6PR的亲和力仅仅比在过度表达GNPT的细胞中产生的Naglu-SapDC高3.6倍(分别K_D 4.07对比14.88nM)(图10)。当外源性M6P添加至Naglu-SapDC样品时，未观测到Naglu-SapDC的细胞摄取，进一步证实Naglu-SapDC的细胞摄取通过CI-M6PR经由M6P结合域介导(图10)。

类似地，数据展示在过度表达GNPT的细胞中产生的Naglu-LIF对CI-M6PR的亲和力比在单独表达Naglu-LIF的细胞中产生的Naglu-LIF的亲和力高(图11)。Naglu-IGFII对CI-M6PR的亲和力类似于在过度表达GNPT的细胞中产生的Naglu-LIF的亲和力(分别K_D 18对比15nM)，而在单独HT1080细胞中表达的Naglu-LIF的亲和力比Naglu-IGFII的亲和力显著低(分别K_D 178nM对比2nM)。当外源性M6P添加至Naglu-LIF样品时，未观测到Naglu-LIF的细胞摄取，进一步证实Naglu-LIF的细胞摄取通过CI-M6PR经由M6P结合域介导。

实施例9：Naglu-SapDC融合蛋白的体内递送

Naglu-SapDC的细胞内积累

对于本文中描述的体内实验，利用在过度表达GNPT的细胞中制备的Naglu-SapDC。

为进一步评估Naglu-SapDC融合蛋白的细胞内积累，使用鞘内施用媒介物对照(PBS)或Naglu-SapDC的Naglu KO小鼠进行体内研究；根据表7中描述的实验条件。

表7.分析Naglu-SapDC的功效的实验设计

在每个各别处理后，最后注射后24小时处死Naglu KO小鼠，并分析各种组织中的Naglu酶活性。使用公认的酶活性分析，分析总Naglu活性。简单地说，组织匀浆在Naglu特异性底物甲基伞基-N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷存在下培育指定时间段，然后通过在360/460(激发/发射)下使用荧光板式读数器检查荧光强度来测量裂解产物的积累。数据证明用Naglu-SapDC处理引起与媒介物对照相比，肝(图12A)与脑(图12B)组织中Naglu活性显著增加。在3周处理期的持续时间内观测到此酶活性增加。

Naglu-SapDC融合蛋白的生物分布

还从处理小鼠收集组织样品，固定在10％NBF中并加工用于石蜡包埋。对于每个分析的组织，使用人Naglu特异性抗体，将5μm石蜡切片进行免疫染色。数据清楚证明Naglu-SapDC至大脑皮质的神经元的溶酶体递送(图13A、13B)。最惊人地，数据还证明Naglu-SapDC在肝的肝细胞中的溶酶体递送(图13E)。在Naglu-SapDC经由鞘内递送施用的程度上此为意外的，表明Naglu-SapDC可以远离其施用部位，达到标靶并进入细胞。

Naglu-SapDC融合蛋白的功效

通过鞘内施用Naglu-SapDC进行处理的Naglu敲除小鼠中Naglu酶的体内活性通过检查不同糖蛋白和其各别裂解产物的细胞内积累来评估。一种此类分析设计成能评估肝(图14)和脑组织(图15)中糖胺聚糖(GAG)的量。

简单地说，将肝组织均质化，并根据Jong等人(Clin Chem 38(6)：803-807，1992)针对GAG进行分析。在脑组织的情况下，均质化样品使用链霉蛋白酶和全能核酸酶来消化，以分解蛋白质和核酸。接着通过使样品通过DEAE柱来提取GAG。接着借助于脱盐柱，更换洗脱物的缓冲液，且使用二甲基亚甲基蓝染色测定GAG总数(Lawrence等人，Nat ChemBiol.2012年1月8日；8(2)：197-204)。如图14和15所示，Naglu-SapDC的鞘内递送引起与媒介物对照相比，Naglu敲除小鼠的肝和脑内总GAG浓度明显减少。在整个3周处理期内维持脑内总GAG水平的降低(图15)。

进行第二个分析以评估在鞘内递送Naglu-SapDC融合蛋白后脑组织中硫酸乙酰肝素的量。硫酸肝素是GAG的一种特定类型，其已展示积累在B型山菲立普患者的脑中。为了测量脑组织中的硫酸乙酰肝素，如Lawrence等人(Nat Chem Biol.2012年1月8日；8(2)：197-204)所述，使用高灵敏度LC/MS法。简单地说，使用DEAE柱和脱盐柱从脑组织提取总GAG，接着干燥和称重。接着用从硫酸乙酰肝素特异性释放独特的单糖、二糖和三糖的肝素裂解酶处理称重的GAG。接着分析所释放的二糖，鉴别并通过LC/MS定量，并与市售二糖标准品比较。如在上述GAG研究的情况下，数据说明当与媒介物对照相比时，在三周处理期的持续时间内用Naglu-SapDC处理引起脑中硫酸乙酰肝素积累的总量强烈减少(图16)。

最后，Naglu-SapDC的细胞内递送通过使用上述用于测定硫酸肝素组织含量的相同LC/MS法分析B型山菲立普的不同生物标记物的存在来评估。Naglu的缺乏引起异常硫酸乙酰肝素裂解产物积累在组织中作为Naglu的天然底物(图17-19中呈现)。数据展示鞘内递送Naglu-SapDC至Naglu敲除小鼠引起脑中所分析的所有三种异常硫酸乙酰肝素裂解产物的积累显著减少(图17-19)。综合来说，所有这三种实验方法证明GAG水平和裂解产物整体下降，表明Naglu-SapDC有效地内在化至细胞溶酶体内，在溶酶体内Naglu-SapDC维持酶活性。

为进一步阐明和证实Naglu-SapDC至溶酶体的细胞内递送，本发明人在每个实验处理组中检查溶酶体标记物Lamp-1的分配。与Naglu-SapDC处理小鼠相比，媒介物对照小鼠展示在整个3周时期内在大脑皮质(图20)、小脑(图21)、丘脑(图22)、纹状体(图23)、白质(图24)和肝(图25)的神经元和胶质细胞的明显扩大溶酶体中Lamp-1的免疫组织化学染色增加。

除Lamp-1外，两个其它细胞生物标记物用于进一步评估Naglu-SapDC的溶酶体靶向和细胞内递送。对于此研究，离子钙结合衔接分子1(Iba-1)和胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)选用作标记物。每种蛋白质是公认的细胞发炎反应的指标，且可用于估计特定细胞类型中发炎的水平和强度。具体地说，GFAP染色已经广泛用于证明星形细胞中过程的尺寸和数目，而Iba-1染色主要用于评估小神经胶质细胞。如图26中证明，鞘内递送Naglu-SapDC的小鼠在所检查的每个神经元组织中具有减少量的GFAP染色，表明溶酶体尺寸减小以及过程数目低。还针对所分析的每个神经元样品，观测到Iba-1染色类似的倾向(图27)。

这些数据有力地证明了在体内Naglu-SapDC能够结合CI-M6P受体，此促进各种组织类型中溶酶体靶向和进入。意外地，Naglu-SapDC的鞘内递送引起全身广泛的生物可用性，证明位于神经元组织以及身体各种器官系统，例如肝。数据进一步表明，在进入细胞时，Naglu-SapDC融合蛋白维持酶活性和适当功能，如Naglu敲除小鼠中葡糖胺聚糖、硫酸肝素和B型山菲立普特异性生物标记物过度积累(B型山菲立普病的标志)的整体下降所证明。假定融合蛋白优良的功效、生物分布以及能够使用CI-M6P受体介导的通路靶向溶酶体递送，数据有力地表明此类方法可以非常有效地用于酶替代疗法。尽管rhNaglu几乎无M6P-磷酸化，但Naglu-SapDC融合蛋白可以进行M6P-磷酸化，因此靶向用于CI-M6P受体介导的溶酶体递送。数据清楚表明所述溶酶体靶向方法不仅可用于治疗B型山菲立普综合症，而且也可应用于治疗其中例如天然蛋白质缺乏适当M6P-磷酸化位点或由于GNPT酶袋的竞争性抑制或位阻而使得M6P-磷酸化较差的任何其它溶酶体贮积病。

实施例10：Naglu-LIF融合蛋白的体内递送

Naglu-LIF的细胞内积累

对于本文中描述的体内实验，利用在过度表达GNPT的细胞中制备的Naglu-LIF。

为进一步评估Naglu-LIF融合蛋白的细胞内积累，使用鞘内施用媒介物对照(PBS)或Naglu-LIF的Naglu KO小鼠进行体内研究；根据表8中描述的实验条件。

表8.分析Naglu-LIF的功效的实验设计

每个各别处理后，最后注射后24小时处死Naglu KO小鼠，并分析各种组织中的Naglu酶活性。使用公认的酶活性分析，分析总Naglu活性。简单地说，总细胞溶解产物在Naglu特异性底物甲基伞基-N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷存在下培育指定时间段，然后通过在360/460(激发/发射)下使用荧光板式读数器检查荧光强度来测量裂解产物的积累。数据证明用Naglu-LIF处理引起与媒介物对照相比，肝与脑组织中Naglu活性显著增加。在3周处理期的持续时间内观测到此酶活性增加。

Naglu-LIF融合蛋白的生物分布

还从处理小鼠收集组织样品，固定在10％NBF中并加工用于石蜡包埋。对于每个分析的组织，使用人Naglu特异性抗体，将5μm石蜡切片进行免疫染色。数据清楚证明Naglu-LIF至脊髓、小脑脑脊膜、大脑皮质脑脊膜的神经元和胶质细胞以及大脑皮质中有限区域的神经元和胶质细胞的溶酶体递送(图13C和13D)。最惊人地，数据还证明Naglu-LIF在肝的肝细胞中的溶酶体递送(图13F)。在Naglu-LIF经由鞘内递送施用的程度上此为意外的，表明Naglu-LIF可以远离其施用部位，达到标靶并进入细胞。

Naglu-LIF融合蛋白的功效

通过如上所述，检查GAG和硫酸肝素的细胞内积累，以及分析Naglu-SapDC处理的敲除小鼠的分析，来评估Naglu的体内活性。如图14和15所示，Naglu-LIF的鞘内递送引起与媒介物对照相比，Naglu敲除小鼠的肝和脑内总GAG浓度明显减少。在整个3周处理期内维持脑内总GAG水平的降低(图15)。

数据还说明当与媒介物对照相比时，在三周处理期的持续时间内用Naglu-LIF处理引起脑中硫酸乙酰肝素积累的总量强烈减少(图16)。综合来说，所有数据证明GAG水平整体下降，表明Naglu-LIF能够有效地内在化至细胞溶酶体内，在溶酶体内Naglu-LIF维持酶活性。

为进一步阐明和证实Naglu-LIF至溶酶体的细胞内递送，本发明人在每个实验处理组中检查溶酶体标记物Lamp-1的分配。与Naglu-LIF处理小鼠相比，媒介物对照小鼠展示在整个3周时期内在大脑皮质(图28)、小脑(图29)、丘脑(图30)、纹状体(图31)、白质(32)和肝(图33)的神经元和胶质细胞的明显扩大溶酶体中Lamp-1的免疫组织化学染色增加。

除Lamp-1外，两个其它细胞生物标记物用于进一步评估Naglu-LIF的溶酶体靶向和细胞内递送。对于此研究，离子钙结合衔接分子1(Iba-1)和胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)选用作标记物。每种蛋白质是公认的细胞发炎反应的指标，且可用于估计特定细胞类型中发炎的水平和强度。具体地说，GFAP染色已经广泛用于证明星形细胞中过程的尺寸和数目，而Iba-1染色主要用于评估小神经胶质细胞。如图34中证明，鞘内递送Naglu-LIF的小鼠在所检查的每个神经元组织中具有减少量的GFAP染色，表明溶酶体尺寸减小以及过程数目低。还针对所分析的每个神经元样品，观测到Iba-1染色类似的倾向(图35)。

这些数据有力地证明了在体内Naglu-LIF能够结合CI-M6P受体，此促进各种组织类型中溶酶体靶向和进入。意外地，Naglu-LIF的鞘内递送引起全身广泛的生物可用性，证明位于神经元组织以及身体各种器官系统，例如肝。数据进一步表明，在进入细胞时，Naglu-LIF融合蛋白维持酶活性和适当功能，如Naglu敲除小鼠中葡糖胺聚糖和硫酸乙酰肝素过度积累(B型山菲立普病的标志)的整体下降所证明。假定融合蛋白优良的功效、生物分布以及能够使用CI-M6P受体介导的通路靶向溶酶体递送，数据有力地表明此类方法可以非常有效地用于酶替代疗法。尽管天然Naglu的M6P-磷酸化很差且rhNaglu几乎无M6P磷酸化，但Naglu-LIF融合蛋白可以进行M6P-磷酸化，因此靶向用于CI-M6P受体介导的溶酶体递送。数据清楚表明所述溶酶体靶向方法不仅可应用于B型山菲立普综合症的治疗，而且也可应用于其中例如天然蛋白质缺乏适当M6P-磷酸化位点或由于GNPT酶袋的竞争性抑制或位阻而使得M6P-磷酸化不良的任何其它溶酶体贮积病的治疗。

Claims (41)

1.一种靶向治疗剂，其包含：

溶酶体酶；和

溶酶体靶向部分，其中所述溶酶体靶向部分是含有至少一个N-连接的糖基化位点的肽。

2.如权利要求1所述的靶向治疗剂，其中所述肽含有N-连接的糖基化。

3.如权利要求1所述的靶向治疗剂，其中所述肽含有含M6P基团的N-连接的糖基化。

4.如前述权利要求中任一项所述的靶向治疗剂，其中所述溶酶体酶选自表2。

5.如权利要求1至3中任一项所述的靶向治疗剂，其中所述溶酶体酶是N-乙酰葡糖胺糖苷酶(Naglu)蛋白质。

6.如前述权利要求中任一项所述的靶向治疗剂，其中所述Naglu蛋白质包含与SEQ IDNO.：1至少80％一致的氨基酸序列。

7.如前述权利要求中任一项所述的靶向治疗剂，其中所述Naglu蛋白质包含与SEQ IDNO.：1至少90％一致的氨基酸序列。

8.如前述权利要求中任一项所述的靶向治疗剂，其中所述Naglu蛋白质包含与SEQ IDNO.：1至少95％一致的氨基酸序列。

9.如前述权利要求中任一项所述的靶向治疗剂，其中所述Naglu蛋白质包含与SEQ IDNO.：1一致的氨基酸序列。

10.如前述权利要求中任一项所述的靶向治疗剂，其中所述溶酶体靶向部分是选自以下的肽：鞘脂激活蛋白原、E1A刺激基因的细胞阻遏子、白血病抑制因子以及其片段。

11.如权利要求10所述的靶向治疗剂，其中所述肽包含与SEQ ID NO.4、6或9至少80％一致的序列。

12.如权利要求10所述的靶向治疗剂，其中所述肽包含与SEQ ID NO.4、6或9至少90％一致的序列。

13.如权利要求10所述的靶向治疗剂，其中所述肽包含与SEQ ID NO.4、6或9至少95％一致的序列。

14.如权利要求10所述的靶向治疗剂，其中所述肽包含与SEQ ID NO.4、6或9一致的序列。

15.如前述权利要求中任一项所述的靶向治疗剂，其中所述靶向治疗剂是融合蛋白。

16.如权利要求15所述的靶向治疗剂，其中所述溶酶体靶向部分融合至所述溶酶体酶的N端。

17.如权利要求15所述的靶向治疗剂，其中所述溶酶体靶向部分融合至所述溶酶体酶的C端。

18.如权利要求15至17中任一项所述的靶向治疗剂，其中所述溶酶体靶向部分与所述溶酶体酶经由连接子融合。

19.如权利要求17所述的靶向治疗剂，其中所述连接子包含序列GAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAP(SEQ ID NO.：15)。

20.如权利要求15至19中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白与SEQ ID NO.18、19或20的氨基酸序列至少80％一致。

21.如权利要求15至19中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白与SEQ ID NO.18、19或20的氨基酸序列至少95％一致。

22.如权利要求15至19中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白与SEQ ID NO.18、19或20的氨基酸序列一致。

23.如权利要求15至19中任一项所述的靶向治疗剂，其中所述融合蛋白包含与SEQ IDNO.23、24或25的氨基酸序列至少80％一致的序列。

24.如权利要求15至19中任一项所述的靶向治疗剂，其中所述融合蛋白包含与SEQ IDNO.23、24或25的氨基酸序列至少90％一致的序列。

25.如权利要求15至19中任一项所述的靶向治疗剂，其中所述融合蛋白包含与SEQ IDNO.23、24或25的氨基酸序列至少95％一致的序列。

26.如权利要求15至19中任一项所述的靶向治疗剂，其中所述融合蛋白包含与SEQ IDNO.23、24或25的氨基酸序列一致的序列。

27.一种核酸，其编码如权利要求15至26中任一项所述的融合蛋白。

28.一种载体，其包含如权利要求27所述的核酸序列。

29.一种宿主细胞，其包含如权利要求28所述的载体。

30.如权利要求29所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自细菌、酵母、昆虫或哺乳动物细胞。

31.如权利要求30所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。

32.如权利要求31所述的宿主细胞，其中所述哺乳动物细胞是人细胞。

33.如权利要求31所述的宿主细胞，其中所述哺乳动物细胞是CHO细胞系。

34.如权利要求29至33中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞共同表达N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶(GNPT)。

35.如权利要求34所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含编码GNPT的外源性核酸。

36.如权利要求34所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞具有活化的内源性GNPT表达。

37.一种用于产生靶向治疗融合蛋白的方法，其包括：

a)培养包含编码如权利要求15至19中任一项所述的融合蛋白的核酸的细胞，其中所述细胞共同表达N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶(GNPT)；以及

b)回收由所述细胞产生的所述融合蛋白。

38.一种药物组合物，其包含如权利要求1至26中任一项所述的靶向治疗剂和药学上可接受的载剂。

39.一种治疗溶酶体贮积病的方法，其包括向需要治疗的受试者施用如权利要求38所述的药物组合物。

40.如权利要求39所述的方法，其中所述溶酶体贮积病是B型山菲立普综合症。

41.如权利要求39或40所述的方法，其中所述药物组合物经静脉内、皮下、鞘内和/或其组合施用。