CN106561716A - 一种农用抑菌复合酶制剂和制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种农用抑菌复合酶制剂，该复合酶制剂包括A、B两个部分，A部分，溶菌酶酶活为2×10⁵U/mL、壳聚糖酶酶活为1.5×10⁴U/mL、中性纤维素酶酶活为1×10³U/mL、β‑甘露聚糖酶酶活为5×10²U/mL、CaCl₂浓度为6g/L、MgCl₂浓度为4g/L、山梨醇浓度为100g/L、山梨酸钾浓度为1g/L、苯甲酸钠浓度为1g/L，pH 4.0；B部分，中性蛋白酶固体制剂，酶活为2×10⁵U/g。本发明还公开了对应的制备方法。本发明制备的复合酶制剂对多种微生物具有显著的抑菌效果，与EDTA‑2Na配合使用可获得更广泛的抑菌谱和更好的抑菌效果。

Description

一种农用抑菌复合酶制剂和制备方法

技术领域

本发明涉及酶制剂的技术领域，尤其是一种利用多种常用酶制剂制备的具有抑菌活性的农用复合酶制剂及方法。

背景技术

病原微生物感染是导致种植和养殖业病害的重要原因，据统计，由微生物引起的植物病害每年导致的损失达植物总产量的15％；近30年来全球发生的十余起重大动物疫情导致的经济损失总额近1千亿美元。抗生素和各类化学抗菌药物的发现和发明有效的降低了微生物病害的发生率和其造成的损失，但同时也带来了严重的安全问题和环境问题。目前，对于由微生物所引起的农业病害尚无安全有效的防治措施。

微生物(非细胞结构微生物除外)细胞壁是保护细胞免受外力损伤，保持细胞形态的重要结构，通常由肽聚糖、纤维素、壳聚糖、半纤维素等构成。因此选择对应的水解酶对微生物细胞壁进行处理后，再使用蛋白酶对细胞膜进行破坏即可达到杀菌/抑菌的效果。酶是安全高效的天然产物，但单一的酶制剂通常难以对微生物产生有效的抑制作用，急需开发一种对多种微生物具有杀菌/抑菌作用的复合酶制剂。

发明内容

本发明的目的在于提供一种农用抑菌复合酶制剂及制备方法，该制剂对常见的具有细胞结构的微生物均具有显著的抑菌效果。

为了达成上述目的，本发明的技术方案如下：

一种农用抑菌复合酶制剂，该复合酶制剂包括A、B两个部分，A部分由溶菌酶、壳聚糖酶、中性纤维素酶、β-甘露聚糖酶、CaCl₂、MgCl₂、山梨醇、山梨酸钾、苯甲酸钠复配而成，B部分为中性蛋白酶固体制剂；其中，A部分，溶菌酶酶活为2×10⁵U/mL、壳聚糖酶酶活为1.5×10⁴U/mL、中性纤维素酶酶活为1×10³U/mL、β-甘露聚糖酶酶活为5×10²U/mL、CaCl₂浓度为6g/L、MgCl₂浓度为4g/L、山梨醇浓度为100g/L、山梨酸钾浓度为1g/L、苯甲酸钠浓度为1g/L，pH4.0；B部分，中性蛋白酶固体制剂，酶活为2×10⁵U/g。

一种农用抑菌复合酶制剂的制备方法，

步骤一、取市售溶菌酶、壳聚糖酶、中性纤维素酶、β-甘露聚糖酶检测酶活力，溶菌酶以1g或1mL酶制剂在其产品说明书标示的最适反应条件下，在波长450nm处，每分钟引起溶酶小球菌悬浮液吸收度下降0.001为1个酶活力单位；壳聚糖酶、中性纤维素酶和β-甘露聚糖酶以1g或1mL酶制剂在其产品说明书标示的最适反应条件下每分钟释放1μmol还原糖为1个酶活力单位；

步骤二、按照以下步骤调配A部分，以下标示浓度均为终浓度：

(1)适量无菌水溶解CaCl₂ 6g/L、MgCl₂ 4g/L、山梨酸钾1g/L、苯甲酸钠1g/L；

(2)加入山梨醇液体或固体至山梨醇净含量为100g/L；

(3)按照酶活力加入溶菌酶2×10⁵U/mL、壳聚糖酶1.5×10⁴U/mL、中性纤维素酶1×10³U/mL和β-甘露聚糖酶5×10²U/mL，再加入无菌水至略小于终体积；

(4)10％的盐酸/NaOH溶液调节pH至4.0；

(5)无菌水定容至终体积。

以及，选用市售2×10⁵U/g中性蛋白酶粉作为B部分。

本发明A部分为液体，由对微生物细胞壁具有溶解作用的多种酶制剂、稳定剂和盐溶液组成，包括对细菌细胞壁中的肽聚糖具有水解作用的溶菌酶，对真菌、藻类细胞壁中的壳聚糖具有水解作用的壳聚糖酶，对真菌、藻类和感染后的植物细胞壁中的纤维素和半纤维素具有水解作用的纤维素酶和β-甘露聚糖酶。发挥主要破壁作用的溶菌酶和壳聚糖酶活力较高，发挥辅助破壁作用的中性纤维素酶和β-甘露聚糖酶活力较低，防止对植物正常细胞的破坏。A部分中除酶以外，还包括CaCl₂、MgCl₂、山梨醇、山梨酸钾和苯甲酸钠。其中CaCl₂、MgCl₂主要用于保持酶活力，并在本发明所述的复合酶制剂与EDTA-2Na配合使用时与EDTA-2Na结合，避免EDTA-2Na螯合酶结合离子；山梨醇为酶稳定剂和保护剂；山梨酸钾、苯甲酸钠为防腐剂。A部分pH值调节至4.0，以提高酶储存稳定性。

本发明B部分由对微生物原生质体具有破坏作用的蛋白酶组成。B部分的蛋白酶，在A部分破坏细胞壁后对细胞膜上的蛋白进行水解，促进细胞溶解，同时对A部分中的酶进行水解，避免植物正常细胞过长时间暴露在纤维素酶和β-甘露聚糖酶下的破坏。

本发明所使用的酶均为中性酶，原因为溶菌酶最适反应pH为中性，选择中性酶可以使该复合酶制剂在中性pH值下保持较高活力，同时减少调节稀释液pH值的步骤，直接加入纯水、晾晒后的自来水或地下水稀释即可使用。

本发明使用时，用水将A部分稀释100倍喷洒或涂抹在感染区域，1-2小时后将B部分稀释100倍喷洒或涂抹在A部分施用范围内。在疑似革兰氏阴性细菌感染或为了提高抑菌效果时，可在A部分施用30分钟前用0.5g/L的EDTA-2Na(乙二胺四乙酸二钠)喷洒或涂抹感染部分，破坏革兰氏阴性细菌的脂多糖膜层。

本发明通过将对多种微生物细胞壁的主要成分具有水解作用的酶复配为一种稳定的酶制剂，配合对细胞膜具有破坏作用的蛋白酶，组成一种对多种微生物具有抑菌活性的农用复合酶制剂，与EDTA-2Na配合使用可获得更广泛的抑菌谱和更好的抑菌效果。

采用上述方案后，本发明的有益效果是：一、该复合酶制剂生物安全，无毒副作用；二、A、B两个部分配合使用可破坏多数微生物的细胞结构；三、蛋白酶与其他酶分开储存，避免了蛋白酶对其他酶的降解。

具体实施方式

实施例一：复合酶制备试验一

分别取市售溶菌酶、壳聚糖酶、中性纤维素酶、β-甘露聚糖酶各一种检测酶活力，分别为1.9×10⁷U/g，2.5×10⁵U/g，4.7×10⁴U/g，8.3×10⁴U/g。

取600mL无菌水，加入CaCl₂ 6g、MgCl₂ 4g、山梨酸钾1g、苯甲酸钠1g溶解后，加入70％山梨醇溶液143mL，充分搅拌。分别加入上述溶菌酶10.5g、壳聚糖酶60g、中性纤维素酶21.3g、β-甘露聚糖酶6.0g、无菌水150mL。用10％盐酸缓慢调节酶液pH至4.0后定容至1L即为A部分，取市售2×10⁵U/g中性蛋白酶粉作为B部分。A酶液1L与B酶粉1Kg搭配即为农用抑菌复合酶制剂。

实施例二：复合酶制备试验二及其稳定性考察

分别取市售溶菌酶、壳聚糖酶、中性纤维素酶、β-甘露聚糖酶各一种检测酶活力，分别为4.7×10⁶U/g，2.4×10⁵U/g，9.5×10⁴U/g，4×10⁴U/g。

取6L无菌水，加入CaCl₂ 60g、MgCl₂ 40g、山梨酸钾10g、苯甲酸钠10g溶解后，加入70％山梨醇溶液1.43L，充分搅拌。分别加入上述溶菌酶426g、壳聚糖酶625g、中性纤维素酶105g、β-甘露聚糖酶125g、无菌水1.5L。用10％盐酸缓慢调节酶液pH至4.0后定容至10L即为A部分，取市售2×10⁵U/g中性蛋白酶粉作为B部分。A酶液10L与B酶粉10Kg搭配即为农用抑菌复合酶制剂。

检测A酶液中溶菌酶、壳聚糖酶、中性纤维素酶、β-甘露聚糖酶酶活力分别为1.9×10⁵U/mL，1.6×10⁴U/mL，1.1×10³U/mL，5.0×10²U/mL。取A酶液9L分为3组，每组3个平行样，每个样品1L。组1于4℃储存，组2于室温储存，组3于37℃储存，3个月后检测酶活力，检测结果如表1所示。

表1A酶液3个月稳定性实验

从表1中可以看出，A酶液具有较好的稳定性，室温条件下，3个月酶活保持率均高于90％；37℃下，3个月酶活保持率均高于70％。B部分酶活力稳定性参考品牌标示。

实施例三：抑菌活性试验

取600mL土壤浸出液分为4组，每组3个平行样，每个样品50mL。组1为阴性对照，即不作处理；组2为阳性对照，121℃灭菌30分钟；组3加入实施例二中的复合酶制剂A 0.5mL，25℃静置1小时后加入0.5g酶制剂B，充分溶解后静置1小时；组4加入5％EDTA-2Na溶液0.5mL，静置30分钟后重复组3操作。用市售营养琼脂培养基、高氏1号琼脂培养基、马丁-孟加拉红琼脂培养基检测各组微生物总数，检测结果如表2所示。

表2复合酶制剂处理土壤浸出液实验

从表中可以看出，该复合酶制剂对土壤中的微生物菌群具有显著的抑制作用，与EDTA-2Na配合使用时，对复合微生物菌群抑制效果更显著。

Claims (2)

1.一种农用抑菌复合酶制剂，其特征在于：该复合酶制剂包括A、B两个部分，A部分由溶菌酶、壳聚糖酶、中性纤维素酶、β-甘露聚糖酶、CaCl₂、MgCl₂、山梨醇、山梨酸钾、苯甲酸钠复配而成，B部分为中性蛋白酶固体制剂；其中，A部分，溶菌酶酶活为2×10⁵U/mL、壳聚糖酶酶活为1.5×10⁴U/mL、中性纤维素酶酶活为1×10³U/mL、β-甘露聚糖酶酶活为5×10²U/mL、CaCl₂浓度为6g/L、MgCl₂浓度为4g/L、山梨醇浓度为100g/L、山梨酸钾浓度为1g/L、苯甲酸钠浓度为1g/L，pH 4.0；B部分，中性蛋白酶固体制剂，酶活为2×10⁵U/g。

2.根据权利要求1所述的一种农用抑菌复合酶制剂，其特征在于制备方法是：

步骤一、取市售溶菌酶、壳聚糖酶、中性纤维素酶、β-甘露聚糖酶检测酶活力，溶菌酶以1g或1mL酶制剂在其产品说明书标示的最适反应条件下，在波长450nm处，每分钟引起溶酶小球菌悬浮液吸收度下降0.001为1个酶活力单位；壳聚糖酶、中性纤维素酶和β-甘露聚糖酶以1g或1mL酶制剂在其产品说明书标示的最适反应条件下每分钟释放1μmol还原糖为1个酶活力单位；

步骤二、按照以下步骤调配A部分，以下标示浓度均为终浓度：

(1)适量无菌水溶解CaCl₂ 6g/L、MgCl₂ 4g/L、山梨酸钾1g/L、苯甲酸钠1g/L；

(2)加入山梨醇液体或固体至山梨醇净含量为100g/L；

(3)按照酶活力加入溶菌酶2×10⁵U/mL、壳聚糖酶1.5×10⁴U/mL、中性纤维素酶1×10³U/mL和β-甘露聚糖酶5×10²U/mL，再加入无菌水至略小于终体积；

(4)10％的盐酸/NaOH溶液调节pH至4.0；

(5)无菌水定容至终体积；

选用市售2×10⁵U/g中性蛋白酶粉作为B部分。