CN106556652B - 富马酸二甲酯原料药的质量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分析检测领域，尤其涉及富马酸二甲酯原料药的质量检测方法。本发明提供的方法以HPLC定量检测富马酸二甲酯原料药中有效成分及杂质的方法，该方法准确性高，灵敏度高，重复性好。实验表明，采用本发明提供的方法，连续六针进样，峰面积的RSD值不超过5％，说明重现性较好；对不同物质的加标回收率为89％～98.5％，说明准确度良好；经计算，本发明的方法对富马酸二甲酯原料药中有效成分及杂质的最低检测限皆低于0.01μg/mL，说明本发明提供的方法的灵敏度良好。
Description
技术领域
本发明涉及分析检测领域，尤其涉及富马酸二甲酯原料药的质量检测方法。
背景技术
富马酸二甲酯(DMF)为富马酸酯类药物之一，最早是作为重症银屑病的口服治疗药物，由于具有一定免疫调节作用，逐渐被用于治疗多发性硬化(MS)。另外，富马酸二甲酯也是一种生物杀灭剂，用于防止皮革、鞋类或者家具的霉菌生长。
富马酸、富马酸单甲酯、马来酸和马来酸二甲酯是常出现在富马酸二甲酯原料药中的杂质。
富马酸又称反丁烯二酸，英文名称：Fumaric Acid，分子式：C4H4O4。分子量为116.07，CAS号：110-17-8，为白色颗粒或结晶性粉未。具有轻微刺激性。
马来酸又称顺丁烯二酸、失水苹果酸，英文名称：Maleic acid，分子式：C4H4O4。分子量为116.07，CAS号：110-16-7，为无色单斜棱晶。主要用于制造不饱和聚酯。
富马酸单甲酯(MMF)，英文名：Monomethyl fumarate，分子式：C5H6O4，分子量：130.10，CAS号：2756-87-8，为白色晶体粉末，具升华特性，具有高效抑菌杀菌作用。
马来酸二甲酯(DMM)又称顺丁烯二酸二甲酯，英文名：Dimethyl maleate，分子式：C6H8O4，分子量：144.13，CAS号：624-48-6，为无色油状液体，是一种重要的有机化工原料，用作增塑剂、脂肪油类的防腐剂及有机合成的原料。
富马酸二甲酯的合成工艺中，富马酸为重要的起始原料，富马酸单甲酯为合成副产物和降解物。马来酸和富马酸互为正反异构体，马来酸二甲酯与富马酸二甲酯互为正反异构体。DMF中杂质的质量分数不应高于0.1％，因此，提供DMF原料药中杂质的检测方法十分必要。
在目前公开的检测方法中，仅有同时检测富马酸和马来酸，或仅同时检测富马酸二甲酯和马来酸二甲酯，或仅同时检测富马酸二甲酯和富马酸单甲酯的方法，却没有能够同时检测富马酸二甲酯、富马酸、富马酸单甲酯、马来酸和马来酸二甲酯这五种成分的方法。
因此，开发能同时有效分离并定量检测这五种成分，对富马酸二甲酯原料药的产品质量控制具有重要的实用价值。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供富马酸二甲酯原料药的质量检测方法，本发明提供的方法能够同时检测富马酸二甲酯原料药中富马酸二甲酯、富马酸、富马酸单甲酯、马来酸和/或马来酸二甲酯的含量，该方法准确度、灵敏性、重复性皆较好，能够为富马酸二甲酯原料药的质量监控提供可靠依据。
本发明提供的富马酸二甲酯原料药的质量检测方法，将富马酸二甲酯原料药溶解，以磷酸水溶液为流动相A相，以磷酸-甲醇溶液为流动相B相，以高效液相色谱检测获得色谱图，根据色谱图获得富马酸二甲酯原料药中富马酸二甲酯、富马酸、富马酸单甲酯、马来酸和/或马来酸二甲酯的含量。
利用高效液相色谱(HPLC)对物质进行定量检测是目前常用的检测方法，在面对需要对富马酸二甲酯原料药中有效成分及杂质的含量进行定量分析时，采用高效液相色谱是一种快速有效的方式。但是，现有技术中，并没有任何一种方法能够同时对富马酸二甲酯、富马酸、富马酸单甲酯、马来酸和马来酸二甲酯进行定量。当采用HPLC对一种新的物质进行检测时需要对该方法进行系统适用性、重复性、准确度、灵敏度等多方面的鉴定，具体为：
系统适用性：进样系统适用性溶液和连续进样6针杂质对照品溶液，系统适用性溶液谱图(图1)中，富马酸、马来酸、富马酸单甲酯、马来酸二甲酯和富马酸二甲酯均能有效分离。其中，富马酸峰与马来酸峰之间的分离度为9.09，富马酸单甲酯峰与马来酸二甲酯峰之间的分离度为3.02，富马酸二甲酯峰理论塔板数为37579；杂质对照品溶液谱图中，富马酸峰面积的RSD值为0.28％，富马酸单甲酯峰面积的RSD值为0.29％。证明系统适用性符合要求，本法重复性良好。
准确度：富马酸三个浓度水平的平均回收率分别为93.80％、96.07％和97.45％，9个样品富马酸回收率RSD为3.01％；
富马酸单甲酯三个浓度水平的平均回收率分别为89.82％、90.57％和92.52％，9个样品富马酸单甲酯回收率RSD为3.34％；
富马酸二甲酯的加标回收率分别为98.5％；
马来酸的加标回收率分别为92.4％；
马来酸二甲酯的加标回收率分别为92.1％；
可见此方法可以对样品中富马酸二甲酯、富马酸、富马酸单甲酯、马来酸和/或马来酸二甲酯进行准确测定。
灵敏度：以本发明提供的方法对富马酸二甲酯进行检测，其中，富马酸最低检测限为0.0215μg/ml；马来酸最低检测限为0.0284μg/ml；富马酸单甲酯最低检测限为0.0684μg/ml；马来酸二甲酯最低检测限为0.0085μg/ml；富马酸二甲酯最低检测限为0.0084μg/ml；说明本发明提供的方法的灵敏度良好。
在本发明的实施例中，磷酸水溶液中磷酸的体积分数为0.1％。
在本发明的实施例中，磷酸-甲醇溶液中磷酸的体积分数为0.1％。
液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流动相对样品具有一定的溶解能力且与样品不产生化学反应，其黏度要尽量小，以便得到好的分离效果；且流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用紫外检测器，则应使用对紫外吸收较低的溶剂配制。其沸点不可以太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。对于富马酸二甲酯而言，以本发明提供的流动相进行梯度洗脱能够保证更好的检测效果，优于其他流动相的检测结果。
在本发明的实施例中，高效液相色谱的洗脱程序为：
0min～8min流动相A相体积分数为87％；
8min～8.01min流动相A相体积分数由87％至72％；
8.01min～40min流动相A相体积分数为72％；
40min～41min流动相A相体积分数由72％至87％；
41min～55min流动相A相体积分数为87％。
流动相的流速过高会降低塔板数，而塔板数的降低会导致样品分离度的降低。以本发明提供的方法进行检测，富马酸二甲酯的塔板数为38129；富马酸的塔板数为16339；富马酸单甲酯的塔板数为66400；马来酸的塔板数为14249；马来酸二甲酯的塔板数为79835。
在本发明的实施例中，流动相的流速为0.8mL/min～1.2mL/min。
在一些实施例中，流动相的流速为1.0mL/min。
对本发明提供的方法而言，根据富马酸二甲酯、富马酸、富马酸单甲酯。马来酸和马来酸二甲酯的极性选择C18色谱柱。色谱柱的尺寸会对分离结果产生影响，其内径会对流动相的流速产生影响，长度较短的色谱柱运行时间短，柱压较低；长度较长的色谱柱分辨率稿，但运行时间增长。
在本发明的实施例中，高效液相色谱的色谱柱为Waters SunFire C18色谱柱。
在一些实施例中，色谱柱的规格为4.6mm×250mm，5μm。
对柱温的选择需考虑待分离物质本身的特性，柱温影响流动相对待测物质的溶解度也会影响柱压。一般情况下，提高柱温有利于提高分离度，但温度过高会导致柱压过低，不利于物质的检出。采用本发明提供的方法检测富马酸二甲酯原料药，富马酸单甲酯峰和富马酸二甲酯峰之间的分离度为23.56。
在本发明的实施例中，高效液相色谱的色谱柱的柱温为35℃～45℃。
在一些实施例中，高效液相色谱的色谱柱的柱温为40℃。
高效液相色谱的检测波长需根据待测物的紫外吸收图谱设置。
在本发明的实施例中，高效液相色谱的检测波长为200nm～220nm。
在一些实施例中，高效液相色谱的检测波长为210nm。
采用本发明提供的方法，富马酸的保留时间为5.3min±0.1min；马来酸的保留时间为7.3min±0.1min；富马酸单甲酯的保留时间为13.5min±0.1min；马来酸二甲酯的保留时间为14.1min±0.1min；富马酸二甲酯的保留时间为22.7min±0.1min。
在本发明的实施例中，溶解富马酸二甲酯原料药的溶剂为乙腈。
在本发明的实施例中，溶解后富马酸二甲酯原料药的浓度为0.5mg/mL～1.5mg/mL。
在一些实施例中，高效液相色谱检测的进样量为10μL。
在本发明的实施例中，溶解后富马酸二甲酯原料药的浓度为1mg/mL。
在本发明的实施例中，才采用外标法对富马酸二甲酯、富马酸、富马酸单甲酯。马来酸和马来酸二甲酯进行定量。
在一些实施例中，获得富马酸二甲酯含量的方法为：根据富马酸二甲酯标准品浓度与高效液相色谱检测所得峰面积绘制标准曲线，根据标准曲线获得富马酸二甲酯的含量。
在一些实施例中，富马酸二甲酯标准曲线的绘制方法为：以富马酸二甲酯的浓度为横坐标，以HPLC检测色谱图中富马酸二甲酯的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。
以本发明提供的方法获得的富马酸二甲酯线性方程为：Y＝4×10-7X+0.0141，R2＝0.9990。
在一些实施例中，获得富马酸含量的方法为：根据富马酸标准品浓度与高效液相色谱检测所得峰面积绘制标准曲线，根据标准曲线获得富马酸的含量。
在一些实施例中，富马酸标准曲线的绘制方法为：以富马酸的浓度为横坐标，以HPLC检测色谱图中富马酸的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。
以本发明提供的方法获得的富马酸线性方程为：Y＝4×10-7X－0.0058，R2＝0.9997。
在一些实施例中，获得富马酸单甲酯含量的方法为：根据富马酸单甲酯标准品浓度与高效液相色谱检测所得峰面积绘制标准曲线，根据标准曲线获得富马酸单甲酯的含量。
在一些实施例中，富马酸单甲酯标准曲线的绘制方法为：以富马酸单甲酯的浓度为横坐标，以HPLC检测色谱图中富马酸单甲酯的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。
以本发明提供的方法获得的富马酸单甲酯的线性方程为：Y＝4×10-7X+0.0005，R2＝0.9998。
在一些实施例中，获得马来酸二甲酯含量的方法为：根据马来酸二甲酯标准品浓度与高效液相色谱检测所得峰面积绘制标准曲线，根据标准曲线获得马来酸二甲酯的含量。
在一些实施例中，马来酸二甲酯标准曲线的绘制方法为：以马来酸二甲酯的浓度为横坐标，以HPLC检测色谱图中马来酸二甲酯的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。
以本发明提供的方法获得的马来酸二甲酯的线性方程为：Y＝4×10-7X+0.0415，R2＝0.9960。
在一些实施例中，获得马来酸含量的方法为：根据马来酸标准品浓度与高效液相色谱检测所得峰面积绘制标准曲线，根据标准曲线获得马来酸的含量。
在一些实施例中，马来酸标准曲线的绘制方法为：以马来酸的浓度为横坐标，以HPLC检测色谱图中马来酸的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。
以本发明提供的方法获得的马来酸的线性方程为：Y＝4×10-7X－0.0138，R2＝0.998。
本发明提供了以HPLC定量检测富马酸二甲酯原料药中有效成分及杂质的方法，本发明提供的方法准确性高，灵敏度高，重复性好。实验表明，采用本发明提供的方法，连续六针进样，峰面积的RSD值不超过5％，说明重现性较好；对不同物质的加标回收率为89％～98.5％，说明准确度良好；经计算，本发明的方法对富马酸二甲酯原料药中有效成分及杂质的最低检测限皆低于0.01μg/mL，说明本发明提供的方法的灵敏度良好。
附图说明
图1示系统适用性溶液HPLC检测图谱；
图2示杂质对照品溶液HPLC检测图谱；
图3示DMF原料药HPLC检测图谱；
图4示DMF原料药加杂质对照品的HPLC检测图谱。
具体实施方式
本发明提供了富马酸二甲酯原料药的质量检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试剂、仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。
其中富马酸二甲酯原料药(供试品)来自深圳翰宇药业股份有限公司；
富马酸二甲酯对照品(标准品)来自深圳翰宇药业股份有限公司；
杂质对照品(富马酸、富马酸单甲酯、马来酸、马来酸二甲酯)购自中检所和阿拉丁(aladdin)。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1系统适用性
配制系统适用性溶液：取富马酸对照品约10mg、马来酸对照品约10mg、富马酸单甲酯对照品约10mg、马来酸二甲酯对照品约10mg、富马酸二甲酯对照品约50mg，精密称定，置50ml量瓶中，加乙腈5ml溶解，再加水至刻度，摇匀，精密量取1ml置100ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，制成每1ml中约含富马酸2μg、马来酸2μg、富马酸单甲酯2μg、马来酸二甲酯2μg、富马酸二甲酯10μg的混合溶液。
检测方法为：
仪器：安捷伦高效液相色谱仪配备紫外检测器；
色谱柱：Waters SunFire C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；
流动相A：0.1％(v/v)磷酸溶液；
流动相B：0.1％(v/v)磷酸甲醇溶液；
检测波长：210nm
流速：1.0mL/min
进样量：10μL
柱温：40℃
洗脱梯度：0min～8min流动相A相体积分数为87％；
8min～8.01min流动相A相体积分数由87％至72％；
8.01min～40min流动相A相体积分数为72％；
40min～41min流动相A相体积分数由72％至87％；
41min～55min流动相A相体积分数为87％。
将系统适用性溶液进样，色谱图如图1，结果如表1：
表1：系统适用性溶液测定结果
系统适用性溶液的检测谱图中，富马酸峰与马来酸峰之间的分离度为9.09，富马酸单甲酯峰与马来酸二甲酯峰之间的分离度为3.02，富马酸、马来酸、富马酸单甲酯、马来酸二甲酯和富马酸二甲酯均能有效分离。
实施例2稳定性
杂质对照品储备溶液：取富马酸对照品约20mg及富马酸单甲酯对照品约30mg,精密称定，置200ml容量瓶中，加适量乙腈溶解，再加水至刻度，摇匀，即得。
杂质对照品溶液：精密量取杂质对照储备液1ml置100ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得。
检测方法为：
仪器：安捷伦高效液相色谱仪配备紫外检测器；
色谱柱：Waters SunFire C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；
流动相A：0.1％(v/v)磷酸溶液；
流动相B：0.1％(v/v)磷酸甲醇溶液；
检测波长：210nm
流速：1.0mL/min
进样量：10μL
柱温：40℃
洗脱梯度：0min～8min流动相A相体积分数为87％；
8min～8.01min流动相A相体积分数由87％至72％；
8.01min～40min流动相A相体积分数为72％；
40min～41min流动相A相体积分数由72％至87％；
41min～55min流动相A相体积分数为87％。
将杂质对照品溶液连续进样6针，其中一次的进样图谱如图2，结果如表2：
表2：杂质对照品储备溶液测定结果
| 进样序列 | 富马酸峰面积 | 富马酸单甲酯峰面积 |
| 1 | 2428678 | 3389454 |
| 2 | 2440461 | 3406957 |
| 3 | 2441433 | 3414641 |
| 4 | 2448696 | 3407254 |
| 5 | 2441100 | 3396456 |
| 6 | 2445962 | 3412791 |
| 对照品称样量/mg | 20.54 | 30.47 |
| 浓度C<sub>S</sub>/mg/ml | 0.001021 | 0.001505 |
| 平均峰面积A<sub>S</sub> | 2441055 | 3404592 |
| RSD(％) | 0.282 | 0.287 |
6次进样中，富马酸峰面积的RSD值为0.28％，富马酸单甲酯峰面积的RSD值为0.29％。证明系统适用性符合要求，本法重复性良好。
实施例3准确性
杂质对照品储备溶液：取富马酸对照品约20mg及富马酸单甲酯对照品约30mg,精密称定，置200ml容量瓶中，加适量乙腈溶解，再加水至刻度，摇匀，即得。
杂质对照品溶液：精密量取杂质对照储备液1ml置100ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得。
供试品溶液：取供富马酸二甲酯原料药50mg，精密称定，置50mL量瓶中，加5ml乙腈溶解，再用水稀释至刻度，摇匀，即得(配完后立即进样)。
供试品加标溶液：取富马酸二甲酯原料药50mg，精密称定，置50ml量瓶中，加乙腈5ml溶解后，再精密加入杂质对照品储备液0.5ml，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
分别进样实施例1中的杂质对照品溶液、供试品溶液和供试品加标溶液：
检测方法为：
仪器：安捷伦高效液相色谱仪配备紫外检测器；
色谱柱：Waters SunFire C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；
流动相A：0.1％(v/v)磷酸溶液；
流动相B：0.1％(v/v)磷酸甲醇溶液；
检测波长：210nm
流速：1.0mL/min
进样量：10μL
柱温：40℃
洗脱梯度：0min～8min流动相A相体积分数为87％；
8min～8.01min流动相A相体积分数由87％至72％；
8.01min～40min流动相A相体积分数为72％；
40min～41min流动相A相体积分数由72％至87％；
41min～55min流动相A相体积分数为87％。
结果见图2、图3、图4。可以看出，杂质峰均能达到有效分离，且样品主峰中无杂峰干扰。
图2中富马酸和MMF的分离度为42.88。拖尾因子分别为1.08和1.09。
图3中MMF和DMF的分离度为23.56。拖尾因子为1.19和1.16。
图4中富马酸与MMF的分离度为41.32，富马酸与DMF的分离度为41.32和21.36。富马酸，MMF和DMF的拖尾因子依次为1.06、1.07和1.19。
实施例4
配制系统适用性溶液：取富马酸对照品约10mg、马来酸对照品约10mg、富马酸单甲酯对照品约10mg、马来酸二甲酯对照品约10mg、富马酸二甲酯对照品约50mg，精密称定，置50ml量瓶中，加乙腈5ml溶解，再加水至刻度，摇匀，作为系统适用性贮备液，精密量取系统适用性贮备液1ml置100ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，制成每1ml中约含富马酸2μg、马来酸2μg、富马酸单甲酯2μg、马来酸二甲酯2μg、富马酸二甲酯10μg的混合溶液。
分别量取系统适用性贮备液0.25ml、0.50ml、0.75ml、1.0ml、1.25ml、1.5ml置于置于100ml量瓶中，加水稀释至刻度，作为25％、50％、75％、100％、125％、150％水平线性溶液，进样分析，
检测方法为：
仪器：安捷伦高效液相色谱仪配备紫外检测器；
色谱柱：Waters SunFire C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；
流动相A：0.1％(v/v)磷酸溶液；
流动相B：0.1％(v/v)磷酸甲醇溶液；
检测波长：210nm
流速：1.0mL/min
进样量：10μL
柱温：40℃
洗脱梯度：0min～8min流动相A相体积分数为87％；
8min～8.01min流动相A相体积分数由87％至72％；
8.01min～40min流动相A相体积分数为72％；
40min～41min流动相A相体积分数由72％至87％；
41min～55min流动相A相体积分数为87％。
以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线：
富马酸线性方程为Y＝4×10-7X－0.0058，R2＝0.9997；
富马酸单甲酯线性方程为Y＝4×10-7X+0.0005，R2＝0.9998；
富马酸二甲酯线性方程为Y＝4×10-7X+0.0141，R2＝0.9990；
马来酸的线性为Y＝4×10-7X－0.0138，R2＝0.998；
马来酸二甲酯线性为Y＝4×10-7X+0.0415，R2＝0.9960。
各物质最低检测限为信噪比为3时成分的浓度。
信噪比计算公式为s/n＝2h/hn
其中
h＝与组分对应的峰高
hn＝在等于半高处峰宽的五倍
因此：
富马酸最低检测限为：0.0215μg/ml；
马来酸最低检测限为：0.0284μg/ml；
富马酸单甲酯最低检测限为：0.0684μg/ml；
马来酸二甲酯最低检测限为：0.0085μg/ml；
富马酸二甲酯最低检测限为：0.0084μg/ml。
实施例5
配制：
杂质对照品储备溶液：取富马酸对照品约20mg及富马酸单甲酯对照品约30mg,精密称定，置200ml容量瓶中，加适量乙腈溶解，再加水至刻度，摇匀，即得。
杂质对照品溶液：精密量取杂质对照储备液1ml置100ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得。
50％准确度溶液：取DMF原料药50mg，精密称定，置50ml量瓶中，加5ml乙腈溶解，再加杂质对照品储备液0.25ml，加水稀释至刻度，摇匀，即得。平行配制3份。
100％准确度溶液：取DMF原料药50mg，精密称定，置50ml量瓶中，加5ml乙腈溶解，再加杂质对照品储备液0.5ml，加水稀释至刻度，摇匀，即得。平行配制3份。
150％准确度溶液：取DMF原料药50mg，精密称定，置50ml量瓶中，加5ml乙腈溶解，再加杂质对照品储备液0.75ml，加水稀释至刻度，摇匀，即得。平行配制3份。
将以上各准确度溶液进样分析，以杂质对照品溶液，作为对照进行测定，按外标法计算回收率。
检测方法为：
仪器：安捷伦高效液相色谱仪配备紫外检测器；
色谱柱：Waters SunFire C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；
流动相A：0.1％(v/v)磷酸溶液；
流动相B：0.1％(v/v)磷酸甲醇溶液；
检测波长：210nm
流速：1.0mL/min
进样量：10μL
柱温：40℃
洗脱梯度：0min～8min流动相A相体积分数为87％；
8min～8.01min流动相A相体积分数由87％至72％；
8.01min～40min流动相A相体积分数为72％；
40min～41min流动相A相体积分数由72％至87％；
41min～55min流动相A相体积分数为87％。
富马酸三个浓度水平的平均回收率分别为93.80％、96.07和97.45，9个样品富马酸回收率RSD为3.01％；
富马酸单甲酯三个浓度水平的平均回收率分别为89.82％、90.57和92.52，9个样品富马酸单甲酯回收率RSD为3.34％；
富马酸二甲酯三个浓度水平的平均回收率分别为95.2％、96.3％、94.8％，9个样品富马酸双甲酯回收率RSD为0.81％。
马来酸三个浓度水平的平均回收率分别为90.5％、92.4％、93.5％，9个样品马来酸回收率RSD为1.65％。
马来酸二甲酯三个浓度水平的平均回收率分别为90.8％、91.5％、93.2％，9个样品马来酸双甲酯回收率RSD为1.34％。
实施例6
分别称取DMF原料药49.96mg、50.28mg，精密称定，分别置100ml量瓶中，加乙腈适量溶解，用水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；
分别进样10μL入液相色谱，按实施例4中绘得的标准曲线计算，两份DMF原料药中富马酸、富马酸单甲酯和富马酸二甲酯、马来酸、马来酸二甲酯的含量。结果显示，两份DMF原料药中，主成分富马酸二甲酯的平均含量为99.2％，不含富马酸、马来酸和马来酸二甲酯，富马酸单甲酯平均含量为0.002％。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (5)
1.富马酸二甲酯原料药的质量检测方法，其特征在于，将富马酸二甲酯原料药溶解，以磷酸水溶液为流动相A相，以磷酸-甲醇溶液为流动相B相，以高效液相色谱检测获得色谱图，根据所述色谱图获得富马酸二甲酯原料药中富马酸二甲酯、富马酸、富马酸单甲酯、马来酸和马来酸二甲酯的含量；
所述高效液相色谱的色谱柱为Waters SunFire C18色谱柱；
所述高效液相色谱的检测波长为200nm～220nm；
所述磷酸水溶液中磷酸的体积分数为0.1％；
所述磷酸-甲醇溶液中磷酸的体积分数为0.1％；
所述高效液相色谱的洗脱程序为：
0min～8min流动相A相体积分数为87％；
8min～8.01min流动相A相体积分数由87％至72％；
8.01min～40min流动相A相体积分数为72％；
40min～41min流动相A相体积分数由72％至87％；
41min～55min流动相A相体积分数为87％。
2.根据权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于，所述流动相的流速为0.8mL/min～1.2mL/min。
3.根据权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱的色谱柱的柱温为35℃～45℃。
4.根据权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于，所述富马酸的保留时间为5.3min±0.1min；所述马来酸的保留时间为7.3min±0.1min；所述富马酸单甲酯的保留时间为13.5min±0.1min；所述马来酸二甲酯的保留时间为14.1min±0.1min；所述富马酸二甲酯的保留时间为22.7min±0.1min。
5.根据权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于，溶解所述富马酸二甲酯原料药的溶剂为乙腈。
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