CN106544327A

CN106544327A - 一种利用聚球藻pcc 7942制备漆酶的方法

Info

Publication number: CN106544327A
Application number: CN201610967094.9A
Authority: CN
Inventors: 梁园梅; 江东; 成家杨; 毛睿慈
Original assignee: Peking University Shenzhen Graduate School
Current assignee: Peking University Shenzhen Graduate School
Priority date: 2016-10-28
Filing date: 2016-10-28
Publication date: 2017-03-29
Anticipated expiration: 2036-10-28
Also published as: CN106544327B

Abstract

本发明公开了一种利用聚球藻PCC 7942制备漆酶的方法，包括步骤：将S7942 NSIIRA、S7942 NSIILA、aadA、rep‑origin、SLAC五个片段进行PCR扩增后重组，再扩增收获第一菌体，提取质粒作为重组质粒；聚球藻PCC 7942的自然转化：S1、将聚球藻PCC 7942菌落转移至Bg‑11液体培养基中活化培养7天后用作接种液；S2、将接种液添加至新鲜的Bg‑11液体培养基中培养，直至聚球藻PCC 7942菌落中的第二菌体的OD 730达到2.0～2.5，获得第一培养体系；S3、向第一培养体系中加入重组质粒并培养，直至第二菌体的OD 730稳定，获得第二培养体系；S4、将第二培养体系涂布于含有筛选抗性的Bg‑11固体培养基上并培养，直至出现转化子，获得漆酶。根据本发明的方法所获得的漆酶对染料具有良好的降解作用。

Description

一种利用聚球藻PCC 7942制备漆酶的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地讲，涉及一种利用聚球藻PCC 7942制备漆酶的方法。

背景技术

蓝细菌(也称为蓝藻)是一类特殊的原核微生物，其代表了地球上最古老的一种生命形态，可以直接利用太阳能、二氧化碳和水进行产氧性光合作用，具有生长速度快、光合作用效率高等优点，是一种十分理想的基因工程宿主，因此蓝细菌在生物能源、生物催化剂及高附加值化学品生产等领域具有广泛的应用前景。目前，聚球藻属是蓝细菌门最重要的种属之一，在世界范围内被广泛研究。聚球藻属是水体微藻类最丰富的成员之一(浓度可达105cells/mL～106cells/mL)，也被认为是海洋地域中CO₂固定最重要的参与者，而其中聚球藻PCC 7942是聚球藻属研究中非常重要的模式菌株。

漆酶属于蓝多铜氧化酶家族，可作用底物范围较广，对于多种酚类化合物以及大量含氨基、羟基或羧基等基团的化合物都具有显著的催化能力，如单酚、对苯二酚、邻苯二酚、甲氧基酚、抗坏血酸、二胺化合物等。漆酶的催化机制是以分子氧作为最终电子受体，催化底物发生氧化的同时将氧一步四电子还原成水。因其催化氧化反应只需氧气，副产物只有水，是一种环保型“绿色催化剂”。基于漆酶具有独特的环境友好型催化机理，使得其在造纸业、纺织业、食品加工、生物炼制、环境保护和生物能源等方面都具有广阔的应用前景。

随着世界上服装、纺织、纤维、印染等行业的转移，带动了我国染料工业的迅猛发展。中国染料工业协会提供的数据显示，染料制造业全行业的产量由2000年的25.7万吨上升至2014年的91.72万吨。染料本身的结构导致其具有较高的光稳定性及水洗稳定性，很难处理清除，纺织行业等所排出废水往往含有大量染料残余物，对环境河流危害极大。由于普通的物理化学方法治理成本高、处理效率低、往往带有二次污染等，并没有很好解决这一工业生产污染问题。因此，利用生物方法环保低耗能处理残余染料近年来得到了广泛关注。

发明内容

为解决上述现有技术存在的问题，本发明提供了一种利用聚球藻PCC 7942制备漆酶的方法，该方法主要采用基因工程技术，利用聚球藻PCC 7942作为宿主，以进行漆酶的制备，所获得的漆酶能够应用在染料降解领域，对染料具有良好的降解作用。

为了达到上述发明目的，本发明采用了如下的技术方案：

一种利用聚球藻PCC 7942制备漆酶的方法，包括步骤：

将S7942NSIIRA、S7942NSIILA、aadA、rep-origin、SLAC五个片段进行PCR扩增后重组，再进行扩增收获第一菌体，提取所述第一菌体中的质粒，作为重组质粒；

聚球藻PCC 7942的自然转化：S1、将聚球藻PCC 7942菌落转移至第一份Bg-11液体培养基中活化培养7天后用作接种液；S2、将所述接种液添加至第二份Bg-11液体培养基中培养，直至所述聚球藻PCC 7942菌落中的第二菌体的OD 730达到2.0～2.5，获得第一培养体系；S3、向所述第一培养体系中加入所述重组质粒，在800lux～1000lux的光照条件下培养，直至所述第二菌体的OD 730稳定，获得第二培养体系；S4、将所述第二培养体系涂布于具有第一筛选抗性的Bg-11固体培养基上，在1500lux～2000lux的光照条件下培养，直至出现转化子，获得所述漆酶。

进一步地，所述S7942NSIIRA片段包括序列号为SEQ NO:1的上游引物和序列号为SEQ NO:2的下游引物；所述S7942NSIILA片段包括序列号为SEQ NO:3的上游引物和序列号为SEQ NO:4的下游引物；所述aadA片段包括序列号为SEQ NO:5的上游引物和序列号为SEQNO:6的下游引物；所述rep-origin片段包括序列号为SEQ NO:7的上游引物和序列号为SEQNO:8的下游引物；所述SLAC片段包括序列号为SEQ NO:9的上游引物和序列号为SEQ NO:10的下游引物。

进一步地，在S4中，所述具有第一筛选抗性的Bg-11固体培养基中的第一筛选抗性浓度为2μL/mL～5μL/mL。

进一步地，所述第一筛选抗性为大观霉素和链霉素双抗性。

进一步地，在S4后，还包括S5：对所述转化子进行PCR验证，分离阳性克隆并以具有第二筛选抗性的Bg-11固体培养基作为培养基进行平板培养和/或以具有第二筛选抗性的Bg-11液体培养基作为培养基进行液体培养。

进一步地，在S5中，所述具有第二筛选抗性的Bg-11固体培养基和所述具有第二筛选抗性的Bg-11液体培养基中的第二筛选抗性浓度均为20μL/mL～50μL/mL。

进一步地，所述第二筛选抗性为大观霉素和链霉素双抗性。

进一步地，S2具体包括：将所述接种液添加至所述第二份Bg-11液体培养基中培养，直至所述第二菌体的OD 730达到0.4～0.5；使用第三份Bg-11液体培养基清洗OD 730为0.4～0.5的第二菌体一次并离心收集；

使用第四份Bg-11液体培养基悬浮经过清洗的所述OD 730为0.4～0.5的第二菌体，直至所述第二菌体的OD730达到2.0～2.5，获得所述第一培养体系；其中，所述第四份Bg-11液体培养基的体积为所述第二份Bg-11液体培养基的体积的1/5。

进一步地，在S2中，所述接种液与所述第二份Bg-11液体培养基的体积比大于5％。

进一步地，所述重组质粒在-20℃下冷藏保存备用。

本发明以聚球藻PCC 7942作为宿主，使得外源漆酶的重组质粒与聚球藻PCC 7942成功发生了同源交换，该重组质粒的基因进入聚球藻PCC 7942的基因中，并成功出现了同源交换的转化子；而后分别利用含有高浓度筛选抗性的Bg-11固体培养基和含有高浓度筛选抗性的Bg-11液体培养基进行保种和扩增，实现了以聚球藻PCC 7942作为宿主对漆酶的大量生产过程。根据本发明的利用聚球藻PCC 7942制备漆酶的方法能够保证转化子稳定遗传插入片段的抗性达到20μg/mL，获得了稳定有效地遗传。根据本发明的利用聚球藻PCC7942制备漆酶的方法采用了完全不同的宿主以及方法，提供了一种全新的利用基因工程制备漆酶的方法，且该制备方法操作简单。

附图说明

通过结合附图进行的以下描述，本发明的实施例的上述和其它方面、特点和优点将变得更加清楚，附图中：

图1是根据本发明的实施例的重组质粒的结构图。

图2-图4是根据本发明的实施例的染料溶液被培养基上清液降解前后的光谱扫描图。

图5-图7是根据本发明的实施例的染料溶液被培养基沉淀物降解前后的光谱扫描图。

具体实施方式

以下，将参照附图来详细描述本发明的实施例。然而，可以以许多不同的形式来实施本发明，并且本发明不应该被解释为限制于这里阐述的具体实施例。相反，提供这些实施例是为了解释本发明的原理及其实际应用，从而使本领域的其他技术人员能够理解本发明的各种实施例和适合于特定预期应用的各种修改。

本发明公开了一种利用聚球藻PCC 7942制备漆酶的方法，该方法采用基因工程，利用聚球藻PCC 7942作为宿主，以进行漆酶的制备。

根据本发明的利用聚球藻PCC 7942制备漆酶的方法包括下述步骤：

Q1、将S7942NSIIRA、S7942NSIILA、aadA、rep-origin、SLAC五个片段进行PCR扩增后重组，再进行扩增收获第一菌体，提取第一菌体中的质粒，作为重组质粒，-20℃下冷藏保存备用。

具体来讲，上述五个片段的序列对应如表1所示。

表1五个片段的序列表

利用碱基互补原则，重组后在大肠杆菌中进行扩增，获得的重组质粒的结构如图1所示，从图1中可以看出，上述五个片段是按照SLAC、S7942NSIILA、rep-origin、S7942NSIIRA、aadA的顺序首位相连形成重组质粒的，该重组质粒的名称为pATEWMCS-SLAC，其大小为4143bp。

值得说明的是，在上述S7942NSIILA和S7942NSIIRA两个片段中，S7942即为聚球藻(Synechococcus)PCC 7942的简称。

Q2、对聚球藻PCC 7942进行自然转化。

具体参照如下步骤：

S1、将聚球藻PCC 7942菌落转移至第一份Bg-11液体培养基中活化培养7天后用作接种液。

所述第一份Bg-11液体培养基的组成如表2所示。

表2第一份Bg-11液体培养基的成分表

其中，微量元素A5溶液的组成如表3所示。

表3微量元素A5溶液的成分表

值得说明的是，后续所使用的第二份Bg-11液体培养基、第三份Bg-11液体培养基、第四份Bg-11液体培养基的组成均与本步骤中的第一份Bg-11液体培养基的组成相同，第一份、第二份、第三份、第四份的表述仅用于区分不同份的Bg-11液体培养基；也就是说，第二份、第三份、第四份其实质是另一份组成相同的新鲜的Bg-11液体培养基。

S2、将接种液添加至第二份Bg-11液体培养基中培养，直至聚球藻PCC 7942菌落中的第二菌体的OD 730达到2.0～2.5，获得第一培养体系。

在本步骤中，控制接种液与该新鲜的第二份Bg-11液体培养基的体积之比大于5％；也就是说，接种比例大于5％。

其中，OD 730是指在730nm下的吸光度。

具体来讲，首先按照上述接种比例，将接种液添加至第二份Bg-11液体培养基中培养，直至第二菌体的OD 730由初始的0.1左右达到0.4～0.5；然后使用第三份Bg-11液体培养基清洗OD 730为0.4～0.5的第二菌体一次，并在4000r/min下离心10min，收集100mLOD730为0.4～0.5的第二菌体；最后向该100mL的第二菌体中加入20mL～25mL第四份Bg-11液体培养基进行培养，直至第二菌体的OD 730达到2.0～2.5，获得第一培养体系。

值得说明的是，为了合理控制培养周期，以保证其中第二菌体的生命活力，控制第四份Bg-11液体培养基的体积为第二份Bg-11液体培养基的体积的1/5左右。

S3、向第一培养体系中加入重组质粒，在800lux～1000ux的光照条件下培养，直至第二菌体的OD 730达到稳定状态，获得第二培养体系。

优选地，重组质粒的加入量至少为10μg。

一般地，本步骤中培养时间为24h左右即可使其中的第二菌体的OD 730达到稳定状态；也就是说，其中的第二菌体的OD 730无明显变化。

值得说明的是，在上述培养的过程中，每隔一段时间需轻轻晃动盛装有培养体系的管子，以防止其中的第二菌体沉淀而影响转化效率。

S4、将第二培养体系涂布于具有第一筛选抗性的Bg-11固体培养基上，在1500lux～2000lux的光照条件下培养，直至出现转化子，获得漆酶。

第一筛选抗性为大观霉素和链霉素双抗性，且第一筛选抗性浓度为2μL/mL～5μL/mL。

此处所用的Bg-11固体培养基是指在上述Bg-11液体培养基中加入琼脂粉至琼脂粉在其中的浓度达到12g/L，并在121℃下进行高压灭菌20min后获得的固体培养基。

在本实施例中，转化子出现后的体系可认为是藻株培养液，该藻株培养液是一个固液共存的混合体系，而漆酶即存在于固液两相中。

值得说明的是，上述漆酶的制备过程并不能够实现100％的阳性克隆，因此有必要通过下述步骤对上述获得的转化子进行筛选，以获得阳性克隆的转化子，并进行保种和扩增。

S5、对转化子进行PCR验证，分离阳性克隆，以具有第二筛选抗性的Bg-11固体培养基作为培养基进行平板培养并以具有第二筛选抗性的Bg-11液体培养基作为培养基进行液体培养。

在本步骤中，第二筛选抗性也为大观霉素和链霉素双抗性，且第二筛选抗性浓度均为20μL/mL～50μL/mL。

也就是说，步骤S4-S5的过程，其实质为：首先在具有低浓度筛选抗性(第一筛选抗性)的Bg-11固体培养基中培养，直至出现转化子，完成漆酶的制备；然后将经过PCR验证并分离阳性克隆的部分转化子，再在具有高浓度筛选抗性(第二筛选抗性)的Bg-11固体培养基中培养完成保种过程、且在具有高浓度筛选抗性(第二筛选抗性)的Bg-11液体培养基中培养完成扩增，获得大量的漆酶，实现了以聚球藻PCC 7942作为宿主对漆酶的大量生产过程。

为了验证上述漆酶的制备方法获得的漆酶在染料降解领域对染料液体具有良好的降解作用，设计了如下的降解实验。

首先将上述漆酶制备过程中的培养到对数生长期(约10d左右)的藻株培养液在4000r/min下离心10min，分别获得培养基上清液和培养基沉淀物。考虑到降解效果的稳定性，分别选取三组培养基上清液及与之各自对应的三组培养基沉淀物进行实验，三组培养基上清液分别记作S1、S2、S3，而与之相对应的三组培养基沉淀物分别记作G1、G2、G3；以上六组均记为实验组。

本实施例中选取的染料为靛蓝二磺酸钠；具体来讲，以pH为6.5的磷酸缓冲液作为溶剂，将靛蓝二磺酸钠溶解于其中，获得初始OD 610为1的染料溶液。

然后分别将上述S1、S2、S3、G1、G2、G3与200μL染料溶液混合，并置于25℃、1000lux的光照下反应10d，以观察对染料溶液的降解效果。

值得说明的是，鉴于G1、G2、G3均为固体沉淀物，因此在这三组实验中，分别加入100μL新鲜的Bg-11液体培养基；同时，上述S1、S2、S3三组培养基上清液的用量也均为100μL。

为了更好地验证上述培养基上清液及培养基沉淀物对染料溶液的降解作用，设置了三组对照组。在三组对照组中，均将100μL Bg-11液体培养基与200μL染料溶液混合，并置于相同温度及光照下，自然降解10d。

通过对比降解前后各实验组及对照组中染料溶液的颜色变化，可以看出，10d后，对照组中的染料溶液由初始的靛蓝色变为浅蓝色，略有褪色；而使用培养基上清液及培养基沉淀物的实验组中的染料溶液由初始的靛蓝色已完全变为透明溶液，说明无论是培养基上清液或培养基沉淀物中均含有漆酶，而这部分漆酶即对染料溶液产生了良好的降解作用，从而使得染料溶液得以褪色。

与此同时，对上述各实验组在降解前后的光谱进行了扫描，使用了S1、S2、S3三组培养基上清液的实验组的光谱扫描图分别如图2-图4所示，使用了G1、G2、G3三组培养基沉淀物的实验组的光谱扫描图分别如图5-图7所示。从图2-图7中可以看出，在300nm～700nm的光谱扫描范围内，在610nm附近呈现波峰，即代表该染料溶液的最大吸收值；当降解10d后，在该位置处的最大吸收值均非常低，这也印证了10d后染料溶液获得了良好的降解；也说明了培养基上清液及培养基沉淀物中均含有漆酶，而上述漆酶的制备方法也实现了以聚球藻PCC 7942作为宿主，重组质粒与聚球藻PCC 7942的基因组发生了同源交换，使得漆酶的基因进入了聚球藻PCC 7942的基因中，从而成功出现了同源交换的转化子，完成了利用聚球藻PCC 7942生产漆酶的过程。

虽然已经参照特定实施例示出并描述了本发明，但是本领域的技术人员将理解：在不脱离由权利要求及其等同物限定的本发明的精神和范围的情况下，可在此进行形式和细节上的各种变化。

<110> 北京大学深圳研究生院

<120> 一种利用聚球藻PCC 7942制备漆酶的方法

<160> 10

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> cyanobacteria Synechococcus

<220>

<223> SEQ NO: 1

<400> 1

5-3 ACTACGCACAGCAATTTCGT 20

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> cyanobacteria Synechococcus

<220>

<223> SEQ NO: 2

<400> 2

5-3 GTAACCCCAGCGCGGTTG 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> cyanobacteria Synechococcus

<220>

<223> SEQ NO: 3

<400> 3

5-3 GGTGTGCAGTTCCAAGCA 18

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> cyanobacteria Synechococcus

<220>

<223> SEQ NO: 4

<400> 4

5-3 TTGAGGGACGAATCTTCAGC 20

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> SEQ NO: 5

<400> 5

5-3 ATGAGGGAAGCGGTGATCGCCGAAGTATC 29

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> SEQ NO: 6

<400> 2

5-3 TTATTTGCCGACTACCTTGGTGATCTC 27

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> SEQ NO: 7

<400> 7

5-3 CTCTTCCGCTTCCTCGCTC 19

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> SEQ NO: 8

<400> 8

5-3 ATCTCATGACCAAAATCCCTT 21

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> cyanobacteria Synechococcus

<220>

<223> SEQ NO: 9

<400> 9

5-3 ATGGATAGAAGAGGTTTTAATAGAAGAGT 29

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> cyanobacteria Synechococcus

<220>

<223> SEQ NO: 10

<400> 10

5-3 CTAATGTTCATGTTCATGGGC 21

Claims

1.一种利用聚球藻PCC 7942制备漆酶的方法，其特征在于，包括步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S7942NSIIRA片段包括序列号为SEQNO:1的上游引物和序列号为SEQ NO:2的下游引物；所述S7942NSIILA片段包括序列号为SEQNO:3的上游引物和序列号为SEQ NO:4的下游引物；所述aadA片段包括序列号为SEQ NO:5的上游引物和序列号为SEQ NO:6的下游引物；所述rep-origin片段包括序列号为SEQ NO:7的上游引物和序列号为SEQ NO:8的下游引物；所述SLAC片段包括序列号为SEQ NO:9的上游引物和序列号为SEQ NO:10的下游引物。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在S4中，所述具有第一筛选抗性的Bg-11固体培养基中的第一筛选抗性浓度为2μL/mL～5μL/mL。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一筛选抗性为大观霉素和链霉素双抗性。

5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，在S4后，还包括S5：对所述转化子进行PCR验证，分离阳性克隆并以具有第二筛选抗性的Bg-11固体培养基作为培养基进行平板培养和/或以具有第二筛选抗性的Bg-11液体培养基作为培养基进行液体培养。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在S5中，所述具有第二筛选抗性的Bg-11固体培养基和所述具有第二筛选抗性的Bg-11液体培养基中的第二筛选抗性浓度均为20μL/mL～50μL/mL。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述第二筛选抗性为大观霉素和链霉素双抗性。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S2具体包括：

将所述接种液添加至所述第二份Bg-11液体培养基中培养，直至所述第二菌体的OD730达到0.4～0.5；

使用第三份Bg-11液体培养基清洗OD 730为0.4～0.5的第二菌体并离心收集；

使用第四份Bg-11液体培养基悬浮经过清洗的所述OD 730为0.4～0.5的第二菌体，直至所述第二菌体的OD 730达到2.0～2.5，获得所述第一培养体系；其中，所述第四份Bg-11液体培养基的体积为所述第二份Bg-11液体培养基的体积的1/5。

9.根据权利要求1或8所述的方法，其特征在于，在S2中，所述接种液与所述第二份Bg-11液体培养基的体积比大于5％。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组质粒在-20℃下冷藏保存备用。