CN106488930A - 新型多肽 - Google Patents

新型多肽 Download PDF

Info

Publication number
CN106488930A
CN106488930A CN201580031621.9A CN201580031621A CN106488930A CN 106488930 A CN106488930 A CN 106488930A CN 201580031621 A CN201580031621 A CN 201580031621A CN 106488930 A CN106488930 A CN 106488930A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sequence
seq
binding peptide
binding
variant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201580031621.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106488930B (zh
Inventor
F·弗雷德
埃琳·贡内里乌松
英马尔·赫伊登-古藤贝里
P-A·尼格伦
苏珊娜·柯林特
于非凡
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Affibody AB
Original Assignee
Affibody AB
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Affibody AB filed Critical Affibody AB
Publication of CN106488930A publication Critical patent/CN106488930A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106488930B publication Critical patent/CN106488930B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5412—IL-6
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/24—Antidepressants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • G01N33/6869—Interleukin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/52—Assays involving cytokines
    • G01N2333/54—Interleukins [IL]
    • G01N2333/5412—IL-6

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Virology (AREA)

Abstract

本公开内容涉及一类具有对白介素‑6的结合亲和力的工程化的多肽，并提供了包含序列EEX3X4AWX7EIHX11LPNLX16X17X18QX20X21AFIX25X26LX28X29的IL‑6结合多肽。本公开内容还涉及此类IL‑6结合多肽作为治疗剂、预后剂和/或诊断剂的用途。

Description

新型多肽
发明领域
本公开内容涉及对白细胞介素-6(以下称为IL-6)具有结合亲和力的一类工程化多肽。本公开内容还涉及此类IL-6结合多肽作为治疗剂、预后剂和/或诊断剂的用途。
背景
炎症是由细胞因子驱动的先天免疫系统的响应，以破坏例如病原体和损伤的细胞。在一些疾病状况诸如类风湿关节炎(RA)和克罗恩病中，炎症系统的调节被损害，导致组织损伤。其中研究最多的炎症诱导物是细胞因子白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子(TNF)。IL-6也被称为B细胞刺激因子2(BSF2)、肝细胞刺激因子(HSF)、杂交瘤生长因子(HGF)和干扰素-β2(IFNB2)。
人IL-6由具有21kDa的分子量的184个氨基酸的多肽单链组成，但是，可变化的糖基化模式导致在21-26kDa之间变化的大小。IL-6由很多种细胞类型分泌，包括T细胞、B细胞、单核细胞、成纤维细胞、肝细胞、内皮细胞和角质细胞。下游信号传导引起从急性炎症向获得性免疫或慢性炎性疾病的转换。IL-6信号传导及其调节是复杂的并涉及很多因子和机制。IL-6信号传导可经由经典IL-6信号传导途径发生，所述典型的IL-6信号传导途径也被称为顺式信号传导途径(cis-signaling pathway)，或经由反式信号传导途径(trans-signaling pathway)发生。在经典IL-6信号传导途径中，循环IL-6与膜结合的IL-6受体α(IL-6Rα)结合，然后招募膜锚定的gp130辅助受体，导致三元复合体的形成。该复合体随后与第二毗邻三元复合体形成二聚体，导致经由gp130部分的信号转导(Boulanger等,2003,Science 300(5628):2101-2104)。在循环中，IL-6还可与IL-6Ra的可溶胞外域结合存在。此类复合体负责反式信号传导机制，所述反式信号传导机制涉及表达辅助受体gp130但缺乏IL-6Ra的任何细胞的IL-6依赖性激活(Chalaris等,2011,Eur J Cell Biol 90(6-7):484-494；Assier等,2010,Joint Bone Spine 77(6):532-6)。已暗示反式信号传导途径或促炎途径是与疾病状况最相关的途径，并因此是最优选阻断的途径。相反，经典信号传导途径被认为负责重要的抗炎过程和再生过程(Scheller等,2011,Biochim Biophys Acta 1813(5):878-888)。
抗IL-6Rα抗体托珠单抗已被批准用于IL-6相关紊乱的临床应用。其他的药物候选物也被开发以解决不同的IL-6触发途径。这些候选物包括抗体CNTO136(sirukumab)(Xu等,2011,Br J Clin Pharmacol 72(2):270-281；Zhuang等,2013,Int JClin Pharmacol Ther 51(3):187-199)和MEDI5117(Finch等,2011,J Mol Biol 411(4):791-807),这些抗体与IL-6细胞因子本身结合。另外，旨在选择性地阻断反式信号传导途径的gp130-Fc融合物CR5/18正在被开发(Kopf等,2010,Nat Rev Drug Discov 9(9):703-718；Chalaris等,2012,Dig Dis 30(5):492-499)。
炎性疾病的不可预期且慢性的性质以及高度未被满足的医疗需求使得有必要开发新的治疗模式。由于组织渗透率与分子的大小负相关，相对大的抗体分子固有地具有差的组织分布和渗透能力。
因此，单克隆抗体的使用对于疗法并不总是最佳的，并且对于提供对IL-6具有高亲和力的剂存在持续的需求。还很感兴趣的是提供此类分子在IL-6相关紊乱的治疗、诊断和预后中的应用。
发明概述
本公开内容的目的是提供新型IL-6结合剂，所述新型IL-6结合剂可例如被用于治疗应用、预后应用和诊断应用。
本公开内容的目的是提供允许靶向多种形式的炎性疾病和自身免疫疾病同时减轻当前疗法的以上提到的和其他缺点的有效疗法的分子。
本公开内容的另外的目的是提供适于预后应用和诊断应用的分子。
对于领域技术人员由本公开内容是明显的这些目的和其他目的由如在所附权利要求书中要求保护的和如本文一般性公开的本发明的不同方面来满足。
因此，在本公开内容的第一方面，提供了IL-6结合多肽，所述IL-6结合多肽包含IL-6结合基序BM，该基序由选自以下的氨基酸序列组成：
i)EEX3X4AWX7EIHX11LPNLX16X17X18QX20X21AFIX25X26LX28X29
其中，彼此独立地，
X3选自A、F、H、K、Q、R、S、W和Y；
X4选自A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V和Y；
X7选自F、H、I、K、L、M、N、R、S、T、V、W和Y；
X11选自A、I、K、L、M、N、R、S、T和V；
X16选自N和T；
X17选自A、I、T和V；
X18选自D、E、G、H、K、N、Q、R、S和T；
X20选自I、L、M、R、T和V；
X21选自A、S、T和V；
X25选自I、M、Q、S、T、V和W；
X26选自K和S；
X28选自F、L、M和Y；且
X29选自D和R；
以及
ii)与在i)中定义的序列具有至少93％同一性的氨基酸序列。
一类序列相关的IL-6结合多肽的以上定义基于亲本支架的许多随机多肽变体的统计学分析，所述多肽变体在若干不同的选择实验中针对其与IL-6的相互作用来选择。所鉴定的IL-6结合基序，或“BM”相应于亲本支架的靶结合区域，所述区域构成在三螺旋束蛋白结构域内的2个α螺旋。在亲本支架中，两个BM螺旋的改变的氨基酸残基构成用于与抗体的恒定Fc部分相互作用的结合表面。在本公开内容中，结合表面残基的随机变化和随后的变体选择已将Fc相互作用能力替换为与IL-6相互作用的能力。
如技术人员将认识到的，任何多肽的功能诸如本公开内容的多肽的IL-6结合能力取决于多肽的三级结构。因此，对多肽中的氨基酸序列作出微小改变而不影响其功能是可能的。因此，本公开内容包括IL-6结合多肽的修饰的变体，所述变体是IL-6结合特征被保留的变体。
以这种方式，本公开内容还包括IL-6结合多肽，所述IL-6结合多肽包含与如i)中定义的多肽具有93％或更大的同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽可包含与如i)中定义的多肽至少96％同一的序列。例如，属于氨基酸残基的特定功能分组(例如疏水性、亲水性、极性等)的氨基酸残基可被交换为来自相同功能组的另一个氨基酸残基是可能的。
在一些实施方案中，此类变化可在如本文公开的IL-6结合多肽的序列的任何位置中做出。在其他实施方案中，此类变化可仅在非可变位置中，也称为支架氨基酸残基作出。在此类情况中，在可变位置，即序列i)中用“X”表示的位置中的改变不被允许。
如在整个说明书中使用的术语“％同一性”可例如如下计算。利用CLUSTAL W算法(Thompson等，Nucleic Acids Research,22:4673-4680(1994))将查询序列与靶序列对齐。在相应于最短的对齐序列的窗口上进行比较。在某些例子中，最短的对齐序列可以是靶序列。在其他例子中，查询序列可构成最短的对齐序列。将每个位置处的氨基酸残基进行比较，并且将在靶序列中具有相同的对应物的查询序列中的位置的百分比被报告为同一性％。
如本文使用的“Xn”和“Xm”被用于表示如以上定义的序列i)中位置n和m中的氨基酸，其中n和m是表示从所述序列的N-末端计数所述序列内的氨基酸的位置的整数。例如，X3和X7分别表示从序列i)的N-末端起位置3和7中的氨基酸。
在根据第一方面的实施方案中，提供了其中序列i)中的Xn独立地选自根据表1的一组可能的残基的多肽。技术人员将领会到Xn可选自所列出的可能的残基组中的任何一个并且该选择独立于Xm中的氨基酸的选择，其中n≠m。因此，表1中所列的位置Xn中的可能残基中的任一个可独立地与表1中所列的任何其他位置中的可能残基组合。
技术人员将领会到表1应被如下解读：在根据第一方面的一个实施方案中，提供了其中序列i)中的氨基酸残基“Xn”选自“可能的残基”的多肽。因此，表1公开了本公开内容的第一方面的若干个特定且个体化的实施方案。例如，在根据第一方面的一个实施方案中，提供了其中序列i)中的X3选自A、H、K、Q、R和Y的多肽，并且在根据第一方面的另一个实施方案中，提供了其中序列i)中的X3选自A、K、Q、R和Y的多肽。为了避免疑问，所列的实施方案在其他实施方案中可自由地组合。例如，一个如此组合的实施方案是其中X3选自A、K、R和Y，而X4选自H和K，且X11选自A、I、L和T的多肽。
表1.本公开内容的第一方面的实施方案
在根据第一方面的一个特定的实施方案中，提供了多肽，其中在序列i)中，
X3选自A、H、K、Q、R和Y；
X4选自A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V和Y；
X7选自F、H、I、K、L、M、N、R、T、V、W和Y；
X11选自A、I、K、L、N、S、T和V；
X16为T；
X17选自A、I、T和V；
X18选自D、E、H、K、N、Q、R、S和T；
X20选自I、L、M、R和V；
X21选自A、S和V；
X25选自I、Q、S、T、V和W；
X26为K；
X28选自F、L、M和Y；并且
X29为D。
在定义IL-6结合多肽的亚类的更特定的实施方案中，序列i)满足以下11个条件I-XI中的至少6个：
I.X3选自K和R；
II.X11选自A和L；
III.X16为T；
IV.X17选自I和V；
V.X18选自D和E；
VI.X20为M；
VII.X21为A；
VIII.X25选自S和T；
IX.X26为K；
X.X28为F；以及
XI.X29为D。
在根据第一方面的IL-6结合多肽的一些实例中，序列i)满足11个条件I-XI中的至少7个。更特别地，序列i)可满足11个条件I-XI中的至少8个，诸如11个条件I-XI中的至少9个，诸如11个条件I-XI中的至少10个，诸如11个条件I-XI的全部。
在根据第一方面的IL-6结合多肽的一些实施方案中，提供了IL-6结合多肽，其中X17X20X21选自VMA和IMA。在一些实施方案中，X20X21X28为MAF。在一些实施方案中，X17X20X28选自VMF和IMF。在一些实施方案中，X17X21X28选自VAF和IAF。
如在以下实验部分中详细描述的，IL-6结合多肽变体的选择已导致鉴定出大量个体IL-6结合基序(BM)序列。这些序列构成根据该方面的序列i)的单独实施方案。个体IL-6结合基序的序列相应于图1中展示的SEQ ID NO:1-1551中的氨基酸位置8-36。因此，在根据该方面的IL-6结合多肽的一个实施方案中，序列i)相应于选自由SEQ ID NO:1-1551组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。在一个实施方案中，序列i)相应于选自由SEQ ID NO:1-1502组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。在一个实施方案中，序列i)相应于选自由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:15-89和SEQ ID NO:151-871组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。在一个实施方案中，序列i)相应于选自由SEQ ID NO:1-6、SEQ ID NO:8-14、SEQID NO:90-150和SEQ ID NO:872-1502组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。在一个实施方案中，序列i)相应于选自由SEQ ID NO:1-152和SEQ ID NO:1503-1515组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。在一个实施方案中，序列i)相应于选自由SEQ ID NO:1-150和SEQ ID NO:1503-1515组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。在一个实施方案中，序列i)相应于选自由SEQ ID NO:1-152组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。在另一个实施方案中，序列i)相应于选自由SEQ ID NO:1-150组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。在仍然另一个实施方案中，序列i)相应于选自由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:15-89和SEQ ID NO:151-152组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。在一个实施方案中，序列i)相应于选自由SEQ ID NO:1-6、SEQ ID NO:8-14和SEQ ID NO:90-150组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。在一个实施方案中，序列i)相应于选自由SEQ ID NO:1-14和SEQID NO:1503-1515组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。在一个实施方案中，序列i)相应于选自由SEQ ID NO:1-14和SEQ ID NO:1512组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。在一个实施方案中，序列i)相应于选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。在一个实施方案中，序列i)相应于选自由SEQ ID NO:1-5组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。在一个实施方案中，序列i)相应于SEQ ID NO:1512中从位置8至位置36的序列。在特定的个体实施方案中，序列i)单独地相应于SEQ ID NO:1-14中的任一个从位置8至位置36的序列。
在本公开内容的一些实施方案中，如以上定义的BM“形成”三螺旋束蛋白结构域的“一部分”。这被理解为意指将BM的序列“插入”进原始三螺旋束结构域的序列中或“移植”到原始三螺旋束结构域的序列上，以使得BM替代原始结构域中的相似结构基序。例如，不希望受理论的束缚，BM被认为构成三螺旋束的三个螺旋中的两个，并因此可替代任何三螺旋束内的这种双螺旋基序。如本领域技术人员将认识到的，三螺旋束结构域的两个螺旋被两个BM螺旋的替代的进行必须不影响多肽的基本结构。即，根据本发明的该实施方案的多肽的Cα骨架的整体折叠与它形成其的一部分的三螺旋束蛋白结构域的整体折叠基本上相同，例如以相同的顺序具有二级结构的相同元件等。因此，如果根据该方面的该实施方案的多肽具有与原始结构域相同的折叠，则根据本公开内容的BM“形成”三螺旋束结构域的“一部分”，意味着共有基本的结构特性，例如，导致相似的CD光谱的那些特性。技术人员知道相关的其他参数。
在特定实施方案中，IL-6结合基序(BM)因此形成三螺旋束蛋白结构域的一部分。例如，BM可基本上构成所述三螺旋束蛋白结构域内具有互相连接的环的两个α螺旋。在特定的实施方案中，所述三螺旋束蛋白结构域选自细菌受体蛋白的结构域。此类结构域的非限制性实例是来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的蛋白A的五个不同的三螺旋结构域，诸如结构域B，及其衍生物。在一些实施方案中，三螺旋束蛋白结构域是蛋白Z的变体，所述蛋白Z源自葡萄球菌蛋白A的结构域B。
在其中如本文公开的IL-6结合多肽形成三螺旋束蛋白结构域的一部分的实施方案中，IL-6结合多肽可包含结合模块(BMod)，所以结合模块的氨基酸序列选自以下：
iii)K-[BM]-DPSQSXaXbLLXcEAKKLXdXeXfQ；
其中
[BM]为如本文定义的IL-6结合基序，条件是X29为D；
Xa选自A和S；
Xb选自N和E；
Xc选自A、S和C；
Xd选自E、N和S；
Xe选自D、E和S；
Xf选自A和S；以及
iv)与由iii)定义的序列具有至少91％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中可以是有益的是，所述多肽在产生和贮存期间以及在体内表现出高的结构稳定性，诸如对异构化、对化学修饰、对物理条件的改变以及对蛋白水解的耐受。因此，在其中如本文公开的IL-6结合多肽形成三螺旋束蛋白结构域的一部分的实施方案中，IL-6结合多肽可包含结合模块(BMod)，所述结合模块的氨基酸序列选自以下：
v)K-[BM]-QPEQSXaXbLLXcEAKKLXdXeXfQ，
其中
[BM]为如本文定义的IL-6结合基序，条件是X29为R；
Xa选自A和S；
Xb选自N和E；
Xc选自A、S和C；
Xd选自E、N和S；
Xe选自D、E和S；
Xf选自A和S；以及
vi)与由v)定义的序列具有至少91％同一性的氨基酸序列。
如以上所讨论的，与以上的氨基酸序列相比包含不很大程度上影响多肽的三级结构及功能的微小变化的多肽也在本公开内容的范围内。因此，在一些实施方案中，序列iv)和vi)分别与由iii)和v)定义的序列具有至少93％，诸如至少95％，诸如至少97％的同一性。
在一个实施方案中，序列iii)或v)中的Xa为A。
在一个实施方案中，序列iii)或v)中的Xa为S。
在一个实施方案中，序列iii)或v)中的Xb为N。
在一个实施方案中，序列iii)或v)中的Xb为E。
在一个实施方案中，序列iii)或v)中的Xc为A。
在一个实施方案中，序列iii)或v)中的Xc为S。
在一个实施方案中，序列iii)或v)中的Xc为C。
在一个实施方案中，序列iii)或v)中的Xd为E。
在一个实施方案中，序列iii)或v)中的Xd为N。
在一个实施方案中，序列iii)或v)中的Xd为S。
在一个实施方案中，序列iii)或v)中的Xe为D。
在一个实施方案中，序列iii)或v)中的Xe为E。
在一个实施方案中，序列iii)或v)中的Xe为S。
在一个实施方案中，序列iii)或v)中的XdXe选自EE、ES、SE、SD和SS。
在一个实施方案中，序列iii)或v)中的XdXe为ES。
在一个实施方案中，序列iii)或v)中的XdXe为SE。
在一个实施方案中，序列iii)或v)中的XdXe为SD。
在一个实施方案中，序列iii)或v)中的Xf为A。
在一个实施方案中，序列iii)或v)中的Xf为S。
在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为A；Xb为N；Xc为A且Xf为A。
在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为A；Xb为N；Xc为C且Xf为A。
在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为S；Xb为E；Xc为S且Xf为S。
在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为S；Xb为E；Xc为C且Xf为S。
在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为A；Xb为N；Xc为A；XdXe为ND且Xf为A。
在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为A；Xb为N；Xc为C；XdXe为ND且Xf为A。
在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为S；Xb为E；Xc为S；XdXe为ND且Xf为S。
在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为S；Xb为E；Xc为C；XdXe为ND且Xf为S。
在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为A；Xb为N；Xc为A；XdXe为SE且Xf为A。
在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为A；Xb为N；Xc为C；XdXe为SE且Xf为A。
在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为S；Xb为E；Xc为S；XdXe为SE且Xf为S。
在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为S；Xb为E；Xc为C；XdXe为SE且Xf为S。
在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为A；Xb为N；Xc为A；XdXe为SD且Xf为A。
在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为A；Xb为N；Xc为C；XdXe为SD且Xf为A。
在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为S；Xb为E；Xc为S；XdXe为SD且Xf为S。
在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为S；Xb为E；Xc为C；XdXe为SD且Xf为S。
在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为A；Xb为N；Xc为A；XdXe为ES且Xf为A。
在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为A；Xb为N；Xc为C；XdXe为ES且Xf为A。
在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为S；Xb为E；Xc为S；XdXe为ES且Xf为S。
在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为S；Xb为E；Xc为C；XdXe为ES且Xf为S。
在仍然另外的实施方案中，序列iii)相应于选自由图1中展示的SEQ ID NO:1-1551组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。在另一个实施方案中，序列iii)相应于选自由SEQ ID NO:1-1502组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。在一个实施方案中，序列iii)相应于选自由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:15-89和SEQ ID NO:151-871组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。在一个实施方案中，序列iii)相应于选自由SEQ ID NO:1-6、SEQ ID NO:8-14、SEQ ID NO:90-150和SEQ ID NO:872-1502组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。在一个实施方案中，序列iii)相应于选自由SEQ ID NO:1-152和SEQ ID NO:1503-1515组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。在一个实施方案中，序列iii)相应于选自由SEQ ID NO:1-150和SEQ ID NO:1503-1515组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。在一个实施方案中，序列iii)相应于选自由SEQ ID NO:1-152组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。在另一个实施方案中，序列iii)相应于选自由SEQ ID NO:1-150组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。在仍然另一个实施方案中，序列iii)相应于选自由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:15-89和SEQ ID NO:151-152组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。在一个实施方案中，序列iii)相应于选自由SEQ ID NO:1-6、SEQ ID NO:8-14和SEQID NO:90-150组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。在一个实施方案中，序列iii)相应于选自由SEQ ID NO:1-14和SEQ ID NO:1503-1515组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。在一个实施方案中，序列iii)相应于选自由SEQ ID NO:1-14和SEQ ID NO:1512组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。在一个实施方案中，序列iii)相应于选自由SEQID NO:1-14组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。在一个实施方案中，序列iii)相应于选自由SEQ ID NO:1-5组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。在一个实施方案中，序列iii)相应于序列SEQ ID NO:1512中从位置7至位置55的序列。在特定的个体实施方案中，序列iii)单独地相应于SEQ ID NO:1-14的任一个中从位置7至位置55的序列。
并且，在另外的实施方案中，提供了IL-6结合多肽，所述IL-6结合多肽包含选自以下的氨基酸序列：
vii)YA-[BMod]-AP；
其中[BMod]是如以上定义的IL-6结合模块；和
viii)与由vii)定义的序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
可选地，提供了IL-6结合多肽，所述IL-6结合多肽包含选自以下的氨基酸序列：
ix)FN-[BMod]-AP；
其中[BMod]为如以上定义的IL-6结合模块；和
x)与由ix)定义的序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
如以上所讨论的，与以上的氨基酸序列相比包含不很大程度上影响多肽的三级结构及功能的微小变化的多肽也落在本公开内容的范围内。因此，在一些实施方案中，序列viii)和x)可分别例如与由vii)和ix)定义的序列至少92％，诸如至少94％，诸如至少96％，诸如至少98％同一。
在一些实施方案中，IL-6结合基序可形成包含选自以下的氨基酸序列的多肽的一部分：
ADNNFNK-[BM]-DPSQSANLLSEAKKLNESQAPK；
ADNKFNK-[BM]-DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK；
ADNKFNK-[BM]-DPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK；
ADAQQNNFNK-[BM]-DPSQSTNVLGEAKKLNESQAPK；
AQHDE-[BM]-DPSQSANVLGEAQKLNDSQAPK；
VDNKFNK-[BM]-DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK；
AEAKYAK-[BM]-DPSESSELLSEAKKLNKSQAPK；
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNDAQAPK；
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNDSQAPK；
AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK；
AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK；
AEAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLSESQAPK；
AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLESSQAPK；
AEAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLESSQAPK；
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK；
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK；
VDAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLSESQAPK；
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLESSQAPK；
VDAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLESSQAPK；
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNKAQAPK；以及
AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNKAQAPK；
其中[BM]为如以上定义的IL-6结合基序。
在一个实施方案中，IL-6结合多肽包含选自以下的氨基酸序列：
xi)VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK；
其中[BM]为如以上定义的IL-6结合基序；以及
xii)与xi)中定义的序列具有至少89％同一性的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，IL-6结合多肽包含选自以下的氨基酸序列：
xiii)AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK；
其中[BM]为如以上定义的IL-6结合基序；以及
xiv)与xiii)中定义的序列具有至少89％同一性的氨基酸序列。
再次，与以上的氨基酸序列相比包含不很大程度上影响多肽的三级结构及功能的微小变化的多肽也落在本公开内容的范围内。因此，在一些实施方案中，序列xii)和xiv)可分别例如与由xi)和xiii)定义的序列至少91％，诸如至少93％，诸如至少94％，诸如至少96％，诸如至少98％同一。
此类多肽中的序列xi)可选自由SEQ ID NO:1-1551组成的组。在另一个实施方案中，序列xi)选自由SEQ ID NO:1-1502组成的组。在一个实施方案中，序列xi)选自由SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:15-89和SEQ ID NO:151-871组成的组。在一个实施方案中，序列xi)选自由SEQ ID NO:1-6、SEQ ID NO:8-14、SEQ ID NO:90-150和SEQ ID NO:872-1502组成的组。在一个实施方案中，序列xi)选自由SEQ ID NO:1-152和SEQ ID NO:1503-1515组成的组。在一个实施方案中，序列xi)选自由SEQ ID NO:1-150和SEQ ID NO:1503-1515组成的组。在一个实施方案中，序列xi)选自由SEQ ID NO:1-152组成的组。在另一个实施方案中，序列xi)选自由SEQ ID NO:1-150组成的组。在仍然另一个实施方案中，序列xi)选自由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:15-89和SEQ ID NO:151-152组成的组。在一个实施方案中，序列xi)选自由SEQ ID NO:1-6、SEQ ID NO:8-14和SEQ ID NO:90-150组成的组。在一个实施方案中，序列xi)选自由SEQ ID NO:1-14和SEQ ID NO:1503-1515组成的组。在一个实施方案中，序列xi)选自由SEQ ID NO:1-14和SEQ ID NO:1512组成的组。在一个实施方案中，序列xi)选自由SEQ ID NO:1-14组成的组。在一个实施方案中，序列xi)选自由SEQ ID NO:1-5组成的组。在一个实施方案中，序列xi)是SEQ ID NO:1512。在特定的个体实施方案中，序列xi)单独地为SEQ ID NO:1-14中的任一个。
如本文定义的多肽与IL-6的结合可在体内或在体外干扰经由IL-6的经典顺式信号传导和/或反式信号传导。因此，在一个实施方案中，提供了如本文定义的IL-6结合多肽，所述IL-6结合多肽能够阻断经由顺式信号传导途径的IL-6依赖性信号传导。在另一个实施方案中，如本文定义的IL-6结合多肽能够阻断经由反式信号传导途径的IL-6依赖性信号传导。在另一个实施方案中，如本文定义的IL-6结合多肽能够阻断经由顺式信号传导途径和反式信号传导途径两者的IL-6依赖性信号传导。
半最大抑制浓度(IC50)是物质在抑制特定的生物或生化功能方面的效力的测量。该定量测量指示需要多少特定的物质以半数抑制给定的生物过程，并且是本领域经常使用的。在一个特定的实施方案中，提供了如本文定义的能够阻断IL-6信号传导的IL-6结合多肽，以使得阻断的半最大抑制浓度(IC50)为至多1x10-6M，诸如至多1x10-7M，诸如至多1x10- 8M，诸如至多1x10-9M，诸如至多1x10-10M。该阻断可以是顺式信号传导途径或反式信号传导途径的阻断。在一个实施方案中，IL-6结合多肽能够阻断L-6/IL-6Rα与gp130的相互作用。
如在本说明书中使用的术语“IL-6结合”和“对IL-6的结合亲和力”是指可例如通过ELISA或使用表面等离子体共振(SPR)技术测试的多肽的特性。例如，如在以下实施例中描述的，IL-6结合亲和力可在以下实验中被测试：其中多肽的样品被捕获在包被抗体的ELISA板上，并加入生物素化的IL-6，随后是链霉亲和素缀合的HRP。添加TMB底物，并使用多孔板读取器，诸如Victor3(Perkin Elmer)来测量在450nm处的吸光度。然后，技术人员可解释通过此类实验获得的结果，以至少建立多肽对IL-6的结合亲和力的定性测量。如果期望定量测量来例如确定相互作用的EC50值(半最大有效浓度)，也可使用ELISA。多肽对稀释系列的生物素化的IL-6的响应利用如以上描述的ELISA来测量。然后，技术人员可解释通过此类实验获得的结果，且EC50值可利用例如GraphPad Prism 5和非线性回归从结果计算。
IL-6结合亲和力还可在以下实验中测试，在所述实验中，IL-6或其片段被固定在表面等离子体共振(SPR)仪器的传感器芯片上，且包含待测试的多肽的样品在芯片上通过。可选地，待被检测的多肽被固定在仪器的传感芯片上，并且使包含IL-6或其片段的样品在芯片上通过。然后，技术人员可解释通过此类实验获得的结果，以至少建立多肽对IL-6的结合亲和力的定性测量。如果期望定量测量来例如确定相互作用的KD值，也可使用表面等离子体共振方法。例如，结合值可以在Biacore(GE Healthcare)或ProteOn XPR 36(Bio-Rad)仪器中来定义。IL-6被适当地固定在仪器的传感器芯片上，并且将要被确定亲和力的多肽的样品通过连续稀释被制备并以随机顺序被注射。然后，KD值可利用例如由仪器制造商提供的BIAevaluation 4.1软件的1:1Langmui结合模型，或其他合适的软件从结果计算。
因此，在一个实施方案中，提供了如本文定义的IL-6结合多肽，所述IL-6结合多肽能够与IL-6结合，以使得相互作用的EC50值为至多1x10-7M，诸如至多1x10-8M，诸如至多1x10-9M，诸如至多1x10-10M。
在一个实施方案中，IL-6结合多肽能够与IL-6结合，以使得相互作用的KD值为至多1x10-8M，诸如至多1x10-9M，诸如至多1x10-10M。
技术人员将理解，可对根据本文公开的任何方面的IL-6结合多肽进行多种修饰和/或添加，以对特定应用定制多肽而不偏离本公开内容的范围。
例如，在一个实施方案中，提供了如本文描述的IL-6结合多肽，所述IL-6结合多肽已在C末端和/或N末端延长和/或包含另外的氨基酸。此类多肽应被理解为在多肽链的第一个位置和/或最后一个位置(the very first and/or the very last position)处具有一个或更多个另外的氨基酸残基的多肽。因此，IL-6结合多肽可包含任何适合数量的另外的氨基酸残基，例如至少一个另外的氨基酸残基。每个另外的氨基酸残基可单独或共同地被添加，以例如改进多肽的产生、纯化、体内或体外的稳定、偶联或检测。此类另外的氨基酸残基可包含出于化学偶联的目的添加的一个或更多个氨基酸残基。这样的一个实例是添加半胱氨酸残基。另外的氨基酸残基还可提供用于多肽的纯化或检测的“标签”，诸如His6标签、(HisGlu)3标签(“HEHEHE”标签)或“myc”(c-myc)标签或“FLAG”标签，用于与对标签特异性的抗体相互作用或在His6标签的情况中用于固定化金属亲和层析(IMAC)。
如以上讨论的另外的氨基酸可通过化学缀合(使用已知的有机化学方法)或通过任何其他的方法被偶联至IL-6结合多肽，诸如将IL-6结合多肽表达为融合蛋白或以任何其他方式直接或经由接头例如氨基酸接头连接。
如以上讨论的另外的氨基酸可例如包含一个或更多个多肽结构域。另外的多肽结构域可向IL-6结合多肽提供另一种功能，诸如例如仍另一种结合功能、酶促功能、毒性功能、荧光信号传导功能、或其组合。
此外，另外的多肽结构域可提供具有相同IL-6结合功能的另一种IL-6结合部分。因此，在另外的实施方案中，提供了多聚体形式的IL-6结合多肽。所述多聚体被理解为包含至少两个如本文公开的IL-6结合多肽作为单体单元，所述单体单元的氨基酸序列可相同或不同。多聚体形式的多肽可包括合适数目的结构域，每个结构域具有IL-6结合基序，并且每个结构域形成多聚体内的单体。这些结构域可具有相同的氨基酸序列，但可选地，它们可具有不同的氨基酸序列。换言之，本发明的IL-6结合多肽可形成同多聚体或异多聚体，例如同二聚体或异二聚体。在一个实施方案中，提供了IL-6结合多肽，其中所述单体单元共价偶联在一起。在另一个实施方案中，所述IL-6结合多肽单体单元被表达为融合蛋白。在一个实施方案中，提供了呈二聚体形式的IL-6结合多肽。
另外，其中本文描述的IL-6结合多肽或其多聚体构成第一结构域或第一部分，且第二和另外的部分具有除结合IL-6以外的其他功能的“异种”融合多肽或蛋白或缀合物也被构思，并落入本公开内容的范围内。此类蛋白中的融合多肽或缀合物的第二和另外的一个或更多个部分也适当地具有期望的生物学活性。
因此，在本公开内容的第二方面，提供了融合蛋白或缀合物，其包含由根据第一方面的IL-6结合多肽组成的第一部分，和由具有期望的生物学活性的多肽组成的第二部分。在另一个实施方案中，所述融合蛋白或缀合物可另外包含另外的部分，所述另外的部分包含期望的生物学活性，所述期望的生物学活性可与所述第二部分的生物学活性相同或不同。
期望的生物学活性的非限制性实例包括治疗活性、结合活性、以及酶促活性。在一个实施方案中，具有期望的生物学活性的第二部分是治疗活性多肽。
治疗活性多肽的非限制性实例是生物分子，例如选自由人内源酶、激素、生长因子、趋化因子、细胞因子和淋巴因子组成的组的分子。
结合活性的非限制性实例是增强融合蛋白或缀合物的体内半衰期的结合活性以及发挥作用以阻断生物学活性的结合活性。在一个特定的实施方案中，结合活性是增加融合蛋白或缀合物的体内半衰期的白蛋白结合活性。在一个实施方案中，所述白蛋白结合活性由链球菌G蛋白的白蛋白结合结构域或其衍生物提供。
在本公开内容的该方面的一个实施方案中，提供了包含另外的免疫应答修饰剂的IL-6结合多肽、融合蛋白或缀合物。另外的免疫应答修饰剂的非限制性实例包括免疫抑制剂或免疫调控剂或其他抗炎剂。例如，如本文描述的IL-6结合多肽、融合蛋白或缀合物可与以下组合使用：病情改变抗风湿药物(disease-modifying antirheumatic drug，DMARD)，诸如金盐、咪唑硫嘌呤、甲氨蝶呤和来氟米特；钙调磷酸酶抑制剂，诸如环孢菌素A或FK506；淋巴细胞再循环调控剂；mTOR抑制剂，诸如雷帕霉素；具有免疫抑制特性的子囊霉素；糖皮质激素；皮质类固醇；环磷酰胺；免疫抑制单克隆抗体；粘附分子抑制剂，诸如LFA-1拮抗剂、ICAM-1或ICAM-3拮抗剂、VCAM-4拮抗剂或VLA-4拮抗剂；抗-TNF剂，诸如依那西普或TNF的单克隆抗体，例如英夫利昔、阿达木单抗、戈利木单抗(golimumab)和赛妥珠单抗(certolizumab pegol)；促炎细胞因子的阻断剂；IL-1阻断剂诸如阿那白滞素或IL-1陷阱(trap)；IL-17阻断剂；趋化因子阻断剂；非甾体抗炎药物(NSAID)诸如阿司匹林；以及抗感染剂和其他免疫应答调控剂。因此，在一个实施方案中，所述免疫应答改变剂选自由以下组成的组：病情改变抗风湿药物(DMARD)、钙调磷酸酶抑制剂、淋巴细胞再循环调控剂、mTOR抑制剂、具有免疫抑制特性的子囊霉素、糖皮质激素、皮质类固醇、环磷酰胺、免疫抑制单克隆抗体、粘附分子抑制剂、抗-TNF剂、促炎细胞因子的阻断剂、IL-1阻断剂、IL-17阻断剂、趋化因子阻断剂、非甾体抗炎药物(NSAID)及其组合。
如技术人员理解的，根据第一方面的IL-6结合多肽可用于融合蛋白或用作任何其他部分的缀合物伴侣。因此，治疗活性多肽和免疫应答改变剂的以上列举绝不应被解释为限制性的。
技术人员知道融合蛋白的构建往往涉及在待被融合的功能部分之间应用接头，并且存在具有不同特性的不同种类的接头，诸如柔性的氨基酸接头、刚性的氨基酸接头和可裂解的氨基酸接头。接头已被用来例如增加稳定性或改善融合蛋白的折叠，以增加融合蛋白的表达、改善融合蛋白的生物学活性、使融合蛋白能够靶向或改变融合蛋白的药代动力学。因此，在一个实施方案中，如本文公开的融合蛋白还包含至少一个接头，诸如选自以下的至少一个接头：柔性的氨基酸接头、刚性的氨基酸接头和可裂解的氨基酸接头。
柔性的接头在连接的结构域需要一定程度的移动或相互作用时常被用于本领域，并且在一些实施方案中可以是特别有用的。此类接头通常包括小的、非极性氨基酸(例如G)或极性氨基酸(例如S或T)。一些柔性的接头主要由G和S残基的延伸组成，例如(GGGGS)p。调节“p”的拷贝数允许接头的优化，以实现功能部分之间的适当分离或以保持必要的内部部分相互作用。除了G和S接头之外，其他的柔性接头是本领域已知的，诸如包含另外的氨基酸残基的G和S接头,所述另外的氨基酸残基诸如T和A以保持柔性，以及极性氨基酸残基以改善溶解性。被构思用于本文的柔性接头的实例还包括KESGSVSSEQLAQFRSLD、EGKSSGSGSEKST和GSAGSAAGSGEF。
因此，在一个实施方案中，所述接头是包含甘氨酸(G)、丝氨酸(S)和/或苏氨酸(T)残基的柔性接头。在一个实施方案中，所述接头具有选自(GnSm)p和(SmGn)p的通式，其中，独立地，n＝1-7、m＝0-7、n+m≤8且p＝1-7。在一个实施方案中，n＝1-5。在一个实施方案中，m＝0-5。在一个实施方案中，p＝1-5。在一个更具体的实施方案中，n＝4、m＝1且p＝1-4。在甚至更具体的实施方案中，所述接头为(GGGGS)3。在另一个具体的实施方案中，所述接头为GGGGS。在另一个具体的实施方案中，所述接头为VDGS。在另一个具体的实施方案中，所述接头为ASGS。
以上方面还包括其中根据第一方面的IL-6结合多肽，或如在根据第二方面的融合蛋白或缀合物中包含的IL-6结合多肽还包含标记物的多肽，所述标记物诸如选自由以下组成的组的标记物：荧光染料和金属、发色团染料、化学发光化合物和生物发光蛋白、酶、放射性核素和放射性颗粒。例如，此类标记物可用于检测多肽。
例如，在其中标记的IL-6结合多肽包含根据本公开内容的第一方面的IL-6结合多肽和标记物的实施方案中，标记的多肽例如可以被用于间接标记IL-6表达细胞，诸如炎症相关的癌症的细胞。
在其他的实施方案中，标记的IL-6结合多肽作为还包含具有期望的生物学活性的第二部分的融合蛋白或缀合物中的部分存在。标记物在一些例子中可仅被偶联至IL-6结合多肽，且在一些例子中被偶联至IL-6结合多肽和缀合物或融合蛋白的第二部分或另外的部分两者。此外，标记物可仅被偶联至第二部分或另外的部分并且不偶联至IL-6结合部分也是可能的。因此，在又另一个实施方案中，提供了IL-6结合多肽，所述IL-6结合多肽包含第二部分和任何选地另外的部分，其中所述标记物仅被偶联至所述第二部分或另外的部分。
在其中IL-6结合多肽、融合蛋白或缀合物是放射性标记的实施方案中，此类放射性标记的多肽可包含放射性核素。大部分的放射性核素具有金属的性质并且金属通常不能与存在于蛋白和肽中的元素形成稳定的共价键。出于这个原因，用放射性金属对蛋白和肽的标记借助于与金属离子形成称为螯合物的非共价化合物的螯合剂，即多齿配体来进行。在IL-6结合多肽、融合蛋白或缀合物的实施方案中，放射性核素的掺入通过提供螯合环境实现，通过螯合环境的提供放射性核素可被配位、螯合或络合至多肽。
螯合剂的一个实例是聚氨基聚羧酸盐(polyaminopolycarboxylate)类型的螯合剂。这样的聚氨基聚羧酸盐螯合剂可被区分为两类：大环螯合剂和无环螯合剂。
在一个实施方案中，IL-6结合多肽、融合蛋白或缀合物包含由经由半胱氨酸残基的硫醇基或赖氨酸残基的ε胺基缀合至IL-6结合多肽的聚氨基聚羧酸盐螯合剂提供的螯合环境。
用于铟、镓、钇、铋、放射性锕系元素(radioactinides)和放射性镧系元素(radiolanthanides)的放射性同位素的最常用的大环螯合剂是DOTA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸)的不同衍生物。在一个实施方案中，IL-6结合多肽、融合蛋白或缀合物的螯合环境由DOTA或其衍生物提供。更具体地，在一个实施方案中，由本公开内容所包括的螯合多肽通过使DOTA衍生物1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三-乙酸-10-马来酰亚胺乙基乙酰胺(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7-tris-acetic acid-10-maleimidoethylacetamide)(马来酰亚胺单酰胺-DOTA(maleimidomonoamide-DOTA))与所述多肽反应来获得。
另外，1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)及其衍生物可用作螯合剂。因此，在一个实施方案中，提供了IL-6结合多肽、融合蛋白或缀合物，其中聚氨基聚羧酸盐螯合剂是1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸或其衍生物。
最常用的无环聚氨基聚羧酸盐螯合剂是DTPA(二亚乙基三胺-五乙酸)的不同衍生物。因此，具有由二亚乙基三胺五乙酸或其衍生物提供的螯合环境的多肽也被本公开内容所包括。
在本公开内容的另外的方面，提供了编码如本文描述的IL-6结合多肽或融合蛋白的多核苷酸；包含所述多核苷酸的表达载体；和包含所述表达载体的宿主细胞。
本公开内容还包括产生如以上描述的多肽或融合蛋白的方法，所述方法包括在容许所述多肽由其表达载体表达的条件下培养所述宿主细胞，和分离所述多肽。
本公开内容的IL-6结合多肽可以可选地使用具有保护的反应性侧链的氨基酸和/或氨基酸衍生物通过非生物肽合成来制备，所述非生物肽合成包括
-将氨基酸和/或氨基酸衍生物逐步偶联以形成具有保护的反应性侧链的根据第一方面的多肽，
-从多肽的反应性侧链除去保护基团，和
-在水溶液中折叠多肽。
应理解根据本公开内容的IL-6结合多肽可独立地被用作治疗剂、诊断剂或预后剂；或被用作用于靶向例如对IL-6具有直接或间接的作用的其他治疗剂或诊断剂的工具。直接的治疗效果可例如通过抑制IL-6信号传导实现。
本公开内容的分子的小尺寸和稳健性赋予了超过基于常规单克隆抗体的疗法的若干种优势。此类优势包括施用模式诸如可选的施用途径、以比抗体高的剂量施用和不存在Fc介导的副作用。如本文公开的多肽的小尺寸与潜在的非常高的溶解性和稳定性结合允许例如用于皮下注射的在小体积内极大摩尔量的药物。对于全身性施用，这暗示了门诊患者利用方便的、小的预填充注射器或自动注射器以小体积和良好地耐受的剂量施用来“家庭使用”治疗。另外，在药物制品中高摩尔浓度的容量结合在多样的制剂中保持功能稳定性的能力开启了局部(topical)(例如皮肤或肺)或口服施用途径。其中可选的施用途径可与IL-6介导的疾病特别地相关的适应症的非限制性实例包括哮喘和银屑病。
在另一方面，提供了组合物，所述组合物包含如本文描述的IL-6结合多肽、融合蛋白或缀合物和至少一种药学上可接受的赋形剂或载体。在一个实施方案中，所述组合物还包含至少一种另外的活性剂，诸如至少两种另外的活性剂，诸如至少三种另外的活性剂。可证明在此类组合中有用的另外的活性剂的非限制性实例是如本文描述的免疫应答改变剂和抗癌剂。
抗癌剂的非限制性实例包括选自由以下组成的组的剂：奥瑞他汀(auristatin)、蒽环霉素、刺孢霉素、考布他汀、阿霉素、倍癌霉素(duocarmycin)、CC-1065抗肿瘤抗生素、海鞘素(ecteinascidin)、格尔德霉素、美登醇(maytansinoid)、甲氨蝶呤、真菌毒素、紫杉醇、蓖麻毒素、bouganin、白树毒素、假单胞菌外毒素38(PE38)、白喉毒素(DT)、及其类似物，及其衍生物及其组合。技术人员将领会到细胞毒素剂的非限制性实例包括所述剂的所有可能的变型,例如剂奥瑞他汀包括例如奥瑞他汀E、奥瑞他汀F、奥瑞他汀PE及其衍生物。
技术人员将领会到所述IL-6结合多肽、融合蛋白或缀合物或包含如本文描述的抗IL-6结合蛋白、融合蛋白或缀合物的组合物可利用标准施用技术施用至受试者，所述标准施用技术包括口服、局部、静脉内、腹膜内、皮下、肺、经皮、肌肉内、鼻内、含服(buccal)、舌下或栓剂施用。因此，在一个实施方案中，提供了用于口服、局部、静脉内、腹膜内、皮下、肺、经皮、肌肉内、鼻内、含服、舌下或栓剂施用的如本文描述的IL-6结合多肽、融合蛋白或缀合物或组合物。
IL-6还可充当用于诊断和预后某些癌症的有价值的标志物，诸如炎症相关的癌症，例如肺癌。乳腺癌和结肠癌。例如，IL-6已被与罹患结肠直肠癌的患者中的预后和差的存活联系起来(Ky等,Jpn J Clin Oncol.2010Jun；40(6):580-7)。
因此，在本公开内容的另一个方面，提供了如在本文中描述的IL-6结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物，用作药物、预后剂或诊断剂。在一个实施方案中，所述IL-6结合多肽被提供用作药物。
在一个实施方案中，提供了如在本文中描述的IL-6结合多肽、融合蛋白或缀合物或组合物，用作药物以体内调控IL-6功能。如本文使用的，术语“调控”指改变活性，诸如使IL-6功能亚等位基因部分地抑制或完全地抑制IL-6功能。
其中IL-6结合多肽可用于治疗、预后和/或诊断的IL-6相关紊乱的非限制性实例包括炎性疾病、自身免疫疾病、感染性疾病、癌症、糖尿病、神经性疾病和抑郁症，诸如类风湿性关节炎(RA)、幼年RA、幼年特发性关节炎或全身性幼年特发性关节炎，脉管炎，银屑病性关节炎，银屑病，强直性脊柱炎，慢性炎症性肠疾病诸如克罗恩氏病和溃疡性结肠炎；格雷夫斯病,贝赛特氏病，葡萄膜炎，巨细胞动脉炎，多发性硬化症(MS)，全身性硬化症，全身性红斑狼疮(SLE)，多肌炎，风湿性多肌痛(polymyalgia rheumatic)，哮喘，慢性阻塞性肺疾病(COPD)，复发性多软骨炎，胰腺炎，腹膜炎，肾炎，川崎病(Kawasaki’s disease)，干燥综合征，成人斯蒂尔病(adult Still’s disease)，结肠炎相关性癌症，直肠癌，肾癌，前列腺癌，恶性淋巴瘤，多发性骨髓瘤，卡斯尔曼病(Castleman’s disease)，乳腺癌，肺癌，阿耳茨海默氏病，HIV，糖尿病，脓毒症，恶病质，骨髓增生异常综合征(MDS)，肝硬化，移植物抗宿主疾病，心肌梗死，子宫内膜异位和骨质疏松。IL-6相关癌症的非限制性实例包括肺癌、乳腺癌和结肠癌(Schafer和Brugge,J Clin Invest.(2007)117(12):3660-3663；Nagasaki等,British Journal of Cancer(2014)110,469-478)。
因此，在一个实施方案中，提供了IL-6结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物，用于治疗、预后或诊断IL-6相关紊乱，诸如选自由以下组成的组的紊乱：炎性疾病、自身免疫疾病、感染性疾病、癌症、糖尿病、神经性疾病和抑郁症。在一个实施方案中，所述IL-6相关紊乱选自由炎性疾病和自身免疫疾病组成的组。在一个实施方案中，所述IL-6相关紊乱选自由以下组成的组:类风湿性关节炎(RA)、幼年RA、幼年特发性关节炎或全身性幼年特发性关节炎，脉管炎，银屑病性关节炎，银屑病，强直性脊柱炎，慢性炎症性肠疾病诸如克罗恩氏病和溃疡性结肠炎；格雷夫斯病，贝赛特氏病，葡萄膜炎，巨细胞动脉炎，多发性硬化症(MS)，全身性硬化症，全身性红斑狼疮(SLE)，多肌炎，风湿性多肌痛，哮喘，慢性阻塞性肺疾病(COPD)，复发性多软骨炎，胰腺炎，腹膜炎，肾炎，川崎病，干燥综合征和成人斯蒂尔病。在另一个实施方案中，所述IL-6相关紊乱为癌症，诸如选自由以下组成的组的癌症：结肠炎相关癌症、肾癌(renal cancer)、肾癌(kidney cancer)、前列腺癌、恶性淋巴细胞瘤、多发性骨髓瘤、卡斯尔曼病、乳腺癌和肺癌。在另一个实施方案中，所述IL-6相关紊乱选自以下：阿耳茨海默氏病、HIV、糖尿病、脓毒症、恶病质、骨髓增生异常综合征(MDS)、肝硬化、移植物抗宿主疾病、心肌梗死、子宫内膜异位和骨质疏松。
在相关的方面，提供了治疗IL-6相关紊乱的方法，包括对有相应需要的受试者施用有效量的如本文中描述的IL-6结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物。在所述方法的更具体的实施方案中，如本文中描述的IL-6结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物在体内调控IL-6功能。
在一个实施方案中，所述IL-6相关紊乱选自由以下组成的组：炎性疾病、自身免疫疾病、感染性疾病、癌症、糖尿病、神经性疾病和抑郁症，诸如由炎性疾病和自身免疫疾病组成的组。在所述方面的一个特定的实施方案中，所述IL-6相关紊乱选自由以下组成的组:类风湿性关节炎(RA)、幼年RA、幼年特发性关节炎或全身性幼年特发性关节炎，脉管炎，银屑病性关节炎，银屑病，强直性脊柱炎，慢性炎症性肠疾病诸如克罗恩氏病和溃疡性结肠炎；格雷夫斯病，贝赛特氏病，葡萄膜炎，巨细胞动脉炎，多发性硬化症(MS)，全身性硬化症，全身性红斑狼疮(SLE)，多肌炎，风湿性多肌痛，哮喘，慢性阻塞性肺疾病(COPD)，复发性多软骨炎，胰腺炎，腹膜炎，肾炎，川崎病，干燥综合征和成人斯蒂尔病。在另一个实施方案中，所述IL-6相关紊乱为癌症，诸如选自由以下组成的组的癌症：结肠炎相关癌症、肾癌(renalcancer)、肾癌(kidney cancer)、前列腺癌、恶性淋巴细胞瘤、多发性骨髓瘤、卡斯尔曼病、乳腺癌和肺癌。在另一个实施方案中，所述IL-6相关紊乱选自由以下组成的组：阿耳茨海默氏病、HIV、糖尿病、脓毒症、恶病质、骨髓增生异常综合征(MDS)、肝硬化、移植物抗宿主疾病、心肌梗死、子宫内膜异位和骨质疏松。
施用治疗有效量的如本文描述的IL-6结合多肽、融合蛋白或缀合物或组合物和至少一种第二药物物质可以是有益的，所述至少一种第二药物物质诸如如以上描述的免疫应答调控剂或抗癌剂。
如本文使用的，术语“共施用”包括相伴施用和顺序施用。因此，在一个实施方案中，提供了如以上定义的方法，所述方法还包括共施用如以上描述的免疫应答调控剂。在另一个实施方案中，提供了如以上定义的方法，所述方法还包括共施用如以上描述的抗癌剂。
在本公开内容的另一方面，提供了检测IL-6的方法，包括：提供疑似含有IL-6的样品，使所述样品与如本文描述的IL-6结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物接触，以及检测IL-6结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物的结合以指示样品中IL-6的存在。在一个实施方案中，所述方法还包括中间洗涤步骤用于在接触样品后移除未结合的多肽、融合蛋白、缀合物或组合物。
在一个实施方案中，所述方法为用于确定受试者中IL-6的存在的诊断或预后方法，所述方法包括以下步骤：
-使受试者或从受试者分离的样品与如本文描述的IL-6结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物接触，以及
-获得对应于已在所述受试者中或与所述样品结合的IL-6结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物的量的值。
在一个实施方案中，所述方法还包括中间洗涤步骤用于在接触受试者或样品之后且在获得值之前移除未结合的多肽、融合蛋白、缀合物或组合物。
在一个实施方案中，所述方法还包括将所述值与参照比较的步骤。所述参照可以是数值、阈值或视觉指示剂，例如基于显色反应。技术人员将领会到与参照比较的不同方式在本领域是已知的并且可以是适于使用的。
在此方法的一个实施方案中，所述受试者为哺乳动物受试者，诸如人类受试者。
在一个实施方案中，所述方法在体内进行。在另一个实施方案中，所述方法在体外进行。
尽管本发明已参考多种示例性方面和实施方案被描述，但本领域技术人员将理解，可做出多种改变，且等同物可代替其要素而不偏离本发明的范围。另外，许多修改可被做出以使特定情况或分子适应本发明的教导而不偏离其实质范围。因此，意图本发明不限于构思的任何特定的实施方案，而是本发明将包括落入所附权利要求书的范围内的所有实施方案。
附图简述
图1是本公开内容的IL-6结合多肽的实例(SEQ ID NO:1-1551)、对照多肽(SEQ IDNO:1552-1553)、白蛋白结合结构域(ABD)变体PP013(SEQ ID NO:1554)的氨基酸序列以及用于选择、筛选和/或表征本发明的示例的人IL-6(SEQ ID NO:1555)和鼠IL-6(SEQ ID NO:1556)的氨基酸序列的列表。在本公开内容的IL-6结合多肽中，推断的IL-6结合基序(BM)在每个序列中从位置8延伸至位置36。预测构成这些Z变体的每个内的完整三螺旋束的49个氨基酸残基长多肽的氨基酸序列从位置7延伸到位置55(在本文中被称为BMod)。
图2显示了如实施例2中描述的测定的，阻断hIL-6和hIL-6Rα之间的相互作用的结果。与被包括用于比较的hIL-6Rα结合抗体托珠单抗(黑色)相反，测试的IL-6结合Z变体(灰色)不干扰hIL-6与其受体hIL-6Rα的结合。
图3显示了如实施例2中描述的测定的，阻断hIL-6/hIL-6Rα复合体与hgp130结合的结果。对于所有测试的初始IL-6结合Z变体(灰色)以及对于被包括用于比较的托珠单抗(黑色)，都观察到浓度依赖性阻断。计算的每种变体的IC50值被显示于表3中。
图4显示了如实施例2中描述的测定的，在基于表达gp130的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的系统中IL-6介导的反式信号传导的浓度依赖性抑制。与ABD变体PP013(SEQ IDNO:1554)C末端融合的IL-6结合Z变体抑制反式信号传导，而与PP013融合的对照Z变体Z03638(SEQ ID NO:1552)并不。托珠单抗被包括用于比较。
图5显示了如实施例7中描述的测定的，阻断hIL-6/hIL-6Rα复合体与hgp130的结合的结果。对于所有测试的成熟IL-6结合Z变体(灰色)以及对于均被包括用于比较的托珠单抗(黑色)和初始结合物Z06814(SEQ ID NO:1512；虚线)，都观察到浓度依赖性阻断。所有成熟IL-6结合Z变体显示出比在实施例2中测定的初始结合物更有效的阻断(比较图3)。
图6显示了在实施例7中描述的TF-1细胞中和测定的结果。对于所有测试的IL-6结合Z变体(成熟Z变体以黑色显示；初始结合物Z06814(SEQ ID NO:1512)显示为灰色填充的三角形)以及对于托珠单抗(灰色填充的正方形)，都观察到IL-6引起的TF-1细胞增殖的浓度依赖依赖性抑制，但对于阴性对照抗体hIgG(灰色填充的圆圈)并不。
图7显示了如在实施例8中描述的通过在抗关节炎小鼠模型中测定IL-6触发的血清淀粉样蛋白-A(SAA)蛋白释放而评分的，与ABD变体PP013(SEQ ID NO:1554)融合的Z变体Z06814(SEQ ID NO:1512)的体内效力。四组小鼠被给予0mg/kg体重(实心正方形)、0.025mg/kg体重(空心圆点)、2.5mg/kg体重(空心三角形)或25mg/kg体重(实心三角形)的IL-6结合Z06814-ABD融合蛋白。作为对照，小鼠被给予25mg/kg的与ABD融合的对照Z变体(Z04726；SEQ ID NO:1553)(被称为Z对照-ABD)(空心正方形)。用hIL-6注射小鼠并随后测量SAA蛋白的水平。两个另外的对照组小鼠分别接受PBS(实心圆圈)和25mg/kg Z06814-ABD(叉)，但无随后的IL-6注射。
实施例
概述
以下实施例公开了靶向白介素6(IL-6)的新型Z变体分子的开发。Z变体利用噬菌体展示技术获得。对编码本文描述的IL-6结合多肽的基因测序，并且相应的氨基酸序列被列于图1中并由标识符SEQ ID NO:1-1551表示。
实施例1
IL-6结合Z变体的选择和ELISA筛选
在该实施例中，将人IL-6(hIL-6)和鼠IL-6(mIL-6)用作利用Z变体的噬菌体文库的噬菌体展示选择中的靶蛋白。对选择的克隆的DNA测序，并且克隆在大肠杆菌(E.coli)周质级分中产生并在ELISA(酶联免疫吸附测定)中针对IL-6测定。
材料和方法
靶蛋白人和鼠IL-6的生物素化:利用No-Weigh EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin(Thermo Scientific,目录号21327)根据制造商的建议以12x摩尔过量将hIL-6和mIL-6(Peprotech,目录号分别为200-06和216-16)生物素化。反应在室温(RT)进行持续30分钟。然后，利用Slide-a-lyzer透析盒(Thermo Scientific,目录号66333,3,500MWCO)根据制造商的指示进行缓冲液交换为磷酸缓冲的盐水(PBS，10mM磷酸盐、137mM NaCl、2.68mM KCl，pH 7.4)。
IL-6结合Z变体的噬菌体展示选择：基本上如等(2007)J Biotechnol,128:162-183中描述的在噬菌粒pAY02592中构建的被展示在噬菌体上的蛋白Z的随机变体的文库被用于选择IL-6结合Z变体。在该文库中，将白蛋白结合域(缩写为ABD，并且对应于来自链球菌(Streptococcus)菌株G148的G蛋白的GA3)用作对于Z变体的融合伴侣。该文库被表示为Zlib006Naive.II并具有1.5x1010个文库成员(Z变体)的大小。将来自包含噬菌粒文库Zlib006Naive.II的甘油储备液的大肠杆菌RRIΔM15细胞(Rüther等，(1982)NucleicAcids Res 10:5765-5772)接种在补充有100μg/ml氨苄青霉素的20l限定的不含脯氨酸的培养基[7g/l磷酸氢二钾、1g/l柠檬酸三钠二水合物、0.02g/l尿嘧啶、6.7g/l YNB(DifcoTM不含氨基酸的酵母氮源基础，Becton Dickinson)、5.5g/l一水合葡萄糖、0.3g/l L-丙氨酸、0.24g/l L-精氨酸单盐酸盐、0.11g/l L-天冬酰胺一水合物、0.1g/l L-半胱氨酸、0.3g/l L-谷氨酸、0.1g/l L-谷氨酰胺、0.2g/l甘氨酸、0.05g/l L-组氨酸、0.1g/l L-异亮氨酸、0.1g/l L-亮氨酸、0.25g/l L-赖氨酸单盐酸盐、0.1g/l L-甲硫氨酸、0.2g/l L-苯丙氨酸、0.3g/l L-丝氨酸、0.2g/l L-苏氨酸、0.1g/l L-色氨酸、0.05g/l L-酪氨酸、0.1g/lL-缬氨酸]中。使培养物在发酵罐(Belach Bioteknik,BR20)中在37℃生长。当细胞达到0.75的在600nm(OD600)处的光密度时，将约2.6l的培养物使用10x摩尔过量的M13K07辅助噬菌体(New England Biolabs，目录号N0315S)来感染。将细胞孵育持续30分钟，届时将发酵罐用补充有100μM异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)用于诱导表达和25μg/ml卡那霉素和12.5μg/ml羧苄青霉素的TSB-YE(胰蛋白酶大豆肉汤-酵母提取物；30g/l TSB、5g/l酵母提取物)填充至20l。使细胞在30℃生长持续22h并将培养物中的细胞通过以15,900g离心来沉淀。如在等，同上中描述的，将噬菌粒在PEG/NaCl(聚乙二醇/氯化钠)中从上清液沉淀两次，过滤并溶解在PBS和甘油中。使噬菌体储备液在使用前贮存于-80℃。
选择程序和噬菌体储备液制备基本上如WO2009/077175中针对另一种生物素化的靶的选择所描述的来进行。为了减少背景结合物(binders)的量，通过将噬菌体储备液与SA-珠在RT孵育持续30分钟进行预选择。用补充有5％BSA的PBS来预封闭在选择中使用的所有管和珠。在补充有3％BSA和0.1％Tween20的PBS中在RT在2h的期间进行选择，然后使用1mg珠/1.6μg生物素化的hIL-6或mIL-6在M-280链霉亲和素(SA-珠,Invitrogen,目录号11206D)上捕获靶-噬菌体复合体。将大肠杆菌菌株XL1-Blue(Agilenttechnologies,目录号200268)用于噬菌体扩增。
在被划分在四个不同的最终轨道中的四个循环中进行针对生物素化的hIL-6和mIL-6的选择：循环1中的轨道(1)被划分在第二循环或第四循环中，导致在循环2中共3个轨道(1-1至1-3)，在循环3中3个轨道(1-1-1至1-3-1)，和在循环4中四个轨道(1-1-1-1至1-3-1-2)。在洗涤之后，使用500μl 0.1M甘氨酸-HCl、pH 2.2从选择轨道洗脱结合的噬菌体，随后立即用50μl 1M Tris-HCl、pH 8.0和450μl PBS中和。在表2中显示了选择策略和使用的参数的概览，描述了在选择轨道中在降低的靶浓度和增加的洗涤次数方面的不同。
表2：用于初始选择的策略的概览
测序：使用标准PCR程序和以下引物从单菌落扩增PCR片段：AFFI-21(5’-tgcttccggctcgtatgttgtgtg；SEQ ID NO:1557)和AFFI-22(5’-cggaaccagagccaccaccgg；SEQ ID NO:1558)。使用生物素化的寡核苷酸AFFI-72(5’-生物素-cggaaccagagccaccaccgg；SEQ ID NO:1559)和根据制造商的建议使用的Terminator v3.1循环测序试剂盒(Applied Biosystems)进行扩增的片段的测序。测序反应物利用Magnatrix 8000(Magnetic Biosolution)仪器通过与磁性链霉亲和素包被的珠(Detach Streptavidin Beads，Nordiag,目录号2012-01)结合来纯化，并在ABI3130xl遗传分析仪(PE Applied Biosystems)上分析。
产生用于ELISA的Z变体：通过在深孔板(Nunc，目录号278752)中将来自选择的单菌落接种到补充有100μg/ml氨苄青霉素和0.1mM IPTG的1ml TSB-YE培养基中来产生测序的Z变体。将板在37℃孵育持续24小时。使细胞通过离心形成团块，在200μl的0.05％PBST(补充有0.05％Tween-20的PBS)中重悬，在-80℃冷冻并在水浴中解冻以释放细胞的周质级分。重复冷冻-解冻程序5次。将样品用PBST 0.05％稀释至总共800μl并通过离心使细胞形成团块。周质提取物的上清液包含作为与ABD的融合物的Z变体，表示为AQHDEALE-[Z#####]-VDYV-[ABD]-YVPG(等，同上)。Z#####是指单独的58个氨基酸残基Z变体。
Z变体的ELISA分析：在ELISA测定中分析Z变体与IL-6的结合。在4℃用2μg/ml在包被缓冲液(50mM碳酸钠，pH 9.6；Sigma,目录号C3041)中稀释的抗ABD山羊抗体(内部产生的)包被半区96孔ELISA板(Costar,目录号3690)过夜。倾倒掉抗体溶液并在RT用100μl的PBSC(补充有0.5％酪蛋白的PBS；Sigma，目录号C8654)封闭孔持续1.5小时。丢弃封闭溶液并将50μl周质溶液添加到孔中并在RT在缓慢震荡下孵育持续1.5h。倾倒掉上清液并用0.05％PBST洗涤孔4次。然后，将PBSC中的7.7nM浓度的50μl生物素化的hIL-6添加到每个孔中。将板在RT孵育持续1.5h，然后如以上描述的洗涤。将链霉亲和素缀合的HRP(ThermoScientific，目录号N100)在PBSC中1:30 000稀释并添加至孔，然后孵育45分钟。如以上描述的洗涤后，将50μl ImmunoPure TMB底物(Thermo Scientific，目录号34021)加入至孔中，并将板根据制造商的建议进行处理。结合特定的不相关蛋白的Z变体通过针对该特定的不相关蛋白测定而被用作阳性对照，并且通过针对hIL-6测定而被用作阴性对照。作为空白对照，添加PBST0.05％，而非周质样品。使用多孔板读取器(Victor3,Perkin Elmer)在450nm处测量吸光度。
结果
IL-6结合Z变体的噬菌体展示选择：在4个循环的针对生物素化的hIL-6和mIL-6的噬菌体展示选择后，制备个体克隆。
测序：对从第四轮选择随机挑取的克隆进行测序。每个Z变体被赋予了唯一的标识号#####且个体变体被称为Z#####。58个残基长Z变体的氨基酸序列在图1中和序列表中被列为SEQ ID NO:1503-1551。在每个序列中推断的IL-6结合基序(BM)从位置8延伸到位置36。预测构成这些Z变体的每个内的完整三螺旋束的49个氨基酸残基长多肽的氨基酸序列(BMod)从位置7延伸到位置55。
Z变体的ELISA分析：在四个选择循环之后获得的克隆在96孔板中产生并在ELISA中针对hIL-6结合活性筛选。以相应于至少3x阴性对照的信号给出响应的所有克隆被认为是阳性IL-6结合物。对不相关蛋白特异的对照分子给出针对特异性蛋白的阳性信号，然而针对hIL-6没有获得信号。
实施例2
IL-6结合Z变体的产生和体外表征
在该实施例中，将Z变体的亚组亚克隆、产生并在竞争ELISA和细胞测定中进行功能测定。分别应用两个不同的ELISA测定来研究IL-6结合Z变体是否能够阻断IL-6和IL-6Rα之间或IL-6和gp130受体之间的特异相互作用。利用分别模拟经典顺式信号传导途径和反式信号传导途径的两个不同的细胞测定来测定Z变体多肽的效价。最后，对Z变体的亚组进行圆二色性(CD)光谱学，以研究其二级结构并确定其熔解温度Tm。
材料和方法
Z变体的亚克隆:从文库载体pAY02592扩增以下13个IL-6结合Z变体的DNA：Z06777(SEQ ID NO:1503)、Z06779(SEQ ID NO:1504)、Z06789(SEQ ID NO:1505)、Z06791(SEQ IDNO:1506)、Z06792(SEQ ID NO:1507)、Z06799(SEQ ID NO:1508)、Z06802(SEQ ID NO:1509)、Z06805(SEQ ID NO:1510)、Z06809(SEQ ID NO:1511)、Z06814(SEQ ID NO:1512)、Z06829(SEQ ID NO:1513)、Z06834(SEQ ID NO:1514)、Z06844(SEQ ID NO:1515)。利用标准分子生物学技术(基本上如WO2009/077175中针对结合另一种靶的Z变体描述的)来应用用于构建具有N-末端His6标签的单体Z变体分子的亚克隆策略。将Z基因片段亚克隆进表达载体pAY01448，导致编码序列MGSSHHHHHHLQ-[Z#####]-VD。
将五个IL-6结合Z变体的亚组Z06789、Z06799、Z06809、Z06814和Z06829以及结合不相关靶的两个对照Z变体Z03638(SEQ ID NO:1552)和Z04726(SEQ ID NO:1553)以与ABD变体PP013(SEQ ID NO:1554)融合来亚克隆。由表达载体编码的构建体为MGSSLQ-[Z#####]-VDGS-PP013。
培养和纯化:用包含每个各自的IL-6结合Z变体的基因片段的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞(Novagen)，并在37℃在800ml或1000ml补充有50μg/ml卡那霉素的TSB-YE培养基中培养。为了诱导蛋白表达，在OD600＝2时，添加IPTG至0.2mM的终浓度并使培养物在37℃再孵育5小时。通过离心收获细胞。
具有His 6 -标签的IL-6结合Z变体的纯化:在天然或变性条件下进行蛋白纯化。
在天然条件下的纯化如下进行：将约2-5的每种细胞团块重悬在10ml PBS中。在通过声处理破碎细胞后，通过离心移除细胞碎片，并将每种上清液应用到用20ml洗涤缓冲液(46.6mM Na2HPO4、3.4mM NaH2PO4和300mM NaCl，pH 7.0)平衡的2ml Talon钴柱(Clontech,目录号635504)上。通过用洗涤缓冲液洗涤移除污染物，并且然后用洗脱缓冲液(50mMNaH2PO4、100mM NaCl、30mM HAc和70mM NaAc，pH 5.0)洗脱IL-6结合Z变体。
在变性条件下的纯化如下进行：将约2-5g的每种细胞团块重悬在10ml裂解缓冲液(7M盐酸胍、47mM Na2HPO4、2.65mM NaH2PO4、10mM Tris-HCl、104mM NaCl，pH 8.0)中，然后在37℃、150rpm孵育持续2h。如针对天然纯化的进行洗涤和洗脱步骤，只是使用不同的缓冲液(洗涤缓冲液：6M盐酸胍、47mM Na2HPO4、3.4mM NaH2PO4、300mM NaCl，pH 8.0；洗脱缓冲液：6M尿素、0.1M NaCl、29.6mM HAc、70.4mM NaAc和50mM NaH2PO4，pH 5.0)。纯化的Z变体根据制造商的方案使用PD-10柱(GE Healthcare)缓冲液交换为PBS。
通过测量在280nm处的吸光度，使用各自蛋白的消光系数来确定蛋白浓度。IL-6结合Z变体的纯度通过用考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE来分析。
与ABD融合的IL-6结合Z变体的纯化:将约2.5g的每种细胞团块重悬于20ml补充有(Merck)的TST-缓冲液(25mM Tris-HCl、1mM EDTA、200mM NaCl、0.05％Tween20,pH 8.0)中。通过声处理破碎细胞并通过离心澄清后，将每种上清液应用至具有1ml抗ABD琼脂糖的重力流柱上(WO2014/064237)。在用TST-缓冲液和5mM NH4Ac pH 5.5缓冲液洗涤之后，用0.1M HAc洗脱ABD融合的Z变体。利用PD-10柱(GE Healthcare)进行对PBS(2.68mM KCl、137mM NaCl、1.47mM KH2PO4、8.1mM Na2HPO4，pH 7.4)的缓冲液交换。然后，在1ml Detoxi-Gel Endotoxin Removing Columns(Pierce,目录号20344)上纯化ABD融合的Z变体以确保低的内毒素含量。通过测量在280nm处的吸光度，使用各自蛋白的消光系数来确定蛋白浓度。通过用考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE分析纯度，并利用LC/MS分析来确认每种纯化的Z-ABD变体的身份。
结合位点的分析：采用第一测定来评价IL-6结合Z变体对hIL-6和人IL-6Rα(hIL-6Rα)之间的相互作用的干扰。在该实验中，用抗-IL-6R捕获抗体(R&D Systems)以2μg/ml的浓度包被半区96孔ELISA板。将板在4℃孵育过夜并且然后在自来水中洗涤两次。然后，在PBSC中将板封闭持续1h，并以250ng/ml的浓度添加hIL-6Rα(R&D Systems)。将板在RT孵育持续1.5h并且然后用200μl 0.05％Tween/PBS洗涤4次。在单独的板中，用2.5nM的生物素化的hIL-6滴定13种带His6标签的Z变体多肽的系列稀释物(浓度范围500-0.5nM)。以相同的方式制备IL-6Rα抗体托珠单抗(Roche)并将其包括用于比较。然后将每种预混合的Z变体和生物素化的hIL-6的复合体转移至含有hIL-6Rα的孔。将板再孵育持续1.5h并且然后洗涤4次。添加链霉亲和素-HRP(Thermo Scientific)的1:8000稀释物并将板孵育持续1h。将板用0.05％Tween/PBS洗涤最后4次，并添加TMB底物(Thermo Scientific)持续15分钟，然后用2M H2SO4终止反应。利用微板读取器(Victor3,Perkin Elmer)在450nm处测量吸光度。
采用第二测定来评价IL-6结合Z变体对人gp130(hgp130)和hIL-6/hIL-6Rα复合体之间的相互作用的干扰。在该实验中，用Fc融合的hgp130(hgp130-Fc)以4μg/ml的浓度包被半区96孔ELISA板。将板在4℃孵育过夜并且然后在自来水中洗涤两次。然后，将板在PBSC中封闭持续1h。将板在RT孵育持续1.5h并且然后用200μl 0.05％Tween/PBS洗涤4次。在单独的板中，用固定的hIL-6/hIL-6Rα浓度(分别0.5nM和5nM)滴定13种带His6标签的Z变体多肽的系列稀释物(浓度范围500-0.5nM)。
以相同的方式制备IL-6Rα结合抗体托珠单抗(Roche)并将其包括用于比较。然后将预混合的每种Z变体多肽和hIL-6/hIL-6Rα的复合体转移至含有hgp130的孔。将板孵育持续1.5h并且然后洗涤4次。添加生物素化的抗IL-6Rα抗体(R&D Systems)并将板再孵育1.5h,然后洗涤。添加链霉亲和素-HRP(Thermo Scientific)的1:8000稀释物并将板孵育持续1h。然后，将板洗涤4次，并添加TMB底物(Thermo Scientific)持续15分钟，然后用2MH2SO4终止反应。利用微板读取器(Victor3,Perkin Elmer)在450nm处测量吸光度。
体外中和测定：评价经典信号传导途径的第一测定使用响应于人IL-6、TNF和GM-CSF而增殖的TF-1细胞系。在补充有10％FCS(Gibco)、Pen-Strep(Lonza)和2ng/ml rhGM-CSF(R&D Systems)的具有L-glut(Lonza)的RPMI1640中培养TF-1细胞。在使用前，将细胞在rhGM-CSF的不存在下在RPMI1640中洗涤两次。然后对细胞计数，并以4x104个细胞/孔的密度分配到96孔平底板中。在单独的板中，在0.099nM rhIL-6(R&D Systems,UK)的存在下孵育抑制化合物(IL-6结合Z变体，具有His6标签(浓度范围1000-0.1nM)或与ABD变体PP013融合(SEQ ID NO:1554；浓度范围200-0.007nM))和IL-6Rα结合抗体托珠单抗(Roche；浓度范围200-0.007nM)。另外，在有或无9μM rhHSA(Novozymes)下孵育ABD融合的变体。然后将预混合的Z变体多肽和hIL-6的复合体转移至含有TF-1细胞的孔，所述含有TF-1细胞的孔在加湿的5％CO2气氛中在37℃被孵育了持续72h。在孵育的最后4个小时期间，每孔添加10μl的CCK-8(Fluka,Sigma Aldrich)以确定增殖细胞的数目。利用微板读取器(Victor3,PerkinElmer)在450nm处测量吸光度。通过对四参数剂量响应曲线的非线性回归来评价关于细胞生长的数据，并利用GraphPad Prism程序确定半最大抑制浓度(IC50)。TF-1细胞的IL-6依赖性增殖被抑制分子的抑制为Abs450减去含有细胞但不含hIL-6的对照孔。
为了解决反式信号传导途径，使用第二测定。在本文中，用hIL-6和可溶性hIL-6Rα刺激人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，并且读取为单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的产生。使HUVEC(Lonza)在EGM-2bullet kit培养基(Lonza)中生长，并在培养物中传代不超过8次。在使用前，使细胞生长直至75％汇合。将细胞使用胰蛋白酶/EDTA(Lonza)分离，重悬并在新鲜的培养基中洗涤一次。然后，对细胞计数，并以2x104个细胞/孔的密度分配到96孔平底板中。在37℃在加湿的5％CO2气氛中培养细胞过夜。在单独的板中，在重组hIL-6(10ng/ml；0.5nM)和200ng/ml(5.6nM)的固定浓度的可溶性hIL-6Rα的存在下，在具有或不具有9μM rhHSA(Novozymes)下，孵育与ABD变体PP013(SEQ ID NO:1554)融合的IL-6结合Z变体Z06789、Z06799、Z06809、Z06814和Z06829，结合不同的靶的PP013融合的阴性对照Z03638(SEQ IDNO:1552)，以及托珠单抗(Roche)的系列稀释物(200-0.003nM)。然后将具有测试分子和hIL-6/hIL-6Rα的预混合溶液转移至含有HUVEC的孔，所述含有HUVEC的孔在37℃在加湿的5％CO2气氛中被孵育了持续24h。在孵育时期后收集无细胞的上清液并利用MCP-1DuosetELISA开发系统(R&D Systems)通过夹心ELISA确定人MCP-1水平。
MCP-1 ELISA:用抗MCP-1捕获抗体(R&D Systems)以1μg/ml的浓度包被半区96孔ELISA板。将板在4℃孵育过夜，在自来水中洗涤两次并在PBSC中封闭持续1h。然后将板用4x200μl 0.05％Tween/PBS洗涤4次，然后添加标准物和样品。将板在RT孵育持续2h，洗涤，然后添加0.1μg/ml生物素化的抗MCP-1抗体(R&D Systems)。然后，将板再孵育持续1.5h然后洗涤4次。然后，添加链霉亲和素-HRP(Thermo Scientific)的1:8000稀释物并将板孵育持续1h。将板洗涤最后4次，并添加TMB底物(Thermo Scientific)持续20分钟，然后用2MH2SO4终止反应。利用微板读取器(Victor3,Perkin Elmer)在450nm处测量吸光度。
CD分析：将纯化的带His6标签的Z变体的亚组在PBS中稀释至0.5mg/ml。对于每个稀释的Z变体，在20℃获取在250-195nm处的CD光谱。另外，进行可变温度测量(VTM)以确定熔解温度(Tm)。在VTM中，在221nm处测量吸光度，同时将温度以5℃/min的温度斜率从20℃提高至90℃。在Jasco J-810分光偏振计(Jasco Scandinavia AB)上使用具有1mm的光路长度的比色皿进行CD测量。
结果
培养和纯化:在大肠杆菌中产生13种被构建带有N-末端His6标签的IL-6结合Z变体(SEQ ID NO:1503-1515)。对于不同的IL-6结合Z变体，通过用分光光度计在280nm处测量吸光度而确定的来自约2-5g细菌团块的IMAC-纯化的蛋白的量的范围从约10mg至20mg。从与ABD变体PP013(SEQ ID NO:1554)融合的5种Z变体的约2.5g细胞团块获取2mg至12mg。每种最终蛋白制备物的SDS-PAGE分析显示，这些制备物主要包含IL-6结合Z变体。每种IL-6结合Z变体的正确身份和分子量通过HPLC-MS分析来证实。
结合位点的分析：在两个单独的竞争ELISA实验中研究13种测试的带His6标签的IL-6结合Z变体阻断(i)hIL-6和hIL-6Rα之间或(ii)hgp130和预先形成的hIL-6/hIL-6Rα复合体之间的相互作用的能力。当针对阻断hIL-6/hIL-6Rα相互作用测试时，13种Z变体均未显示出任何显著的影响。但是，所有的Z变体显示出预先形成的hIL-6/hIL-6Rα和hgp130之间的相互作用，即反式信号传导类似相互作用的清楚的浓度依赖性阻断(图3)。对于每种Z变体计算的IC50值被显示于表3中。被包括用于比较的抗体托珠单抗在两个实验中均显示出阻断效应。
表3：初始Z变体阻断hIL-6/hIL-6Rα与hgp130的相互作用的IC50值
体外中和测定：利用两种不同的细胞测定来分别研究IL-6结合Z变体阻断经典信号传导途径和反式信号传导途径中的IL-6依赖性信号传导的能力。评价经典信号传导途径的第一测定采用响应于人IL-6、TNF和GM-CSF而增殖的TF-1细胞系。IL-6到与被称为gp130的信号传导受体亚单位连接的细胞表面IL-6受体的直接信号传导被称为顺式信号传导。该测定显示所有13种变体都能够阻断TF-1细胞的IL-6依赖性生长。对于带His6标签的Z变体和与ABD变体PP013(SEQ ID NO:1554)重组地融合的Z变体，以及对于被包括用于比较的IL-6Rα结合抗体托珠单抗计算的IC50值被显示于表4中。
表4：初始Z变体阻断TF-1细胞的IL-6依赖性生长的IC50值
为了研究在基于细胞的系统中反式信号传导途径是否也能被阻断，使用表达gp130的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)进行第二测定。将HUVEC与预先形成的hIL-6/hIL-6Rα复合体一起孵育导致单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的IL-6反式信号传导依赖性分泌，允许IL-6结合Z变体的任何反式信号传导阻断能力的分析。在该测定中，在HSA的存在下分析与ABD变体PP013(SEQ ID NO:1554)重组地融合的5种Z变体。hIL-6Rα结合抗体托珠单抗被包括用于比较。所有5种研究的Z变体都显示出抑制反式信号传导(图4)。一种变体Z06814-ABD显示出比托珠单抗更强有力，并且与托珠单抗的5nM相比，表现出约1nM的IC50值。
CD分析：对于7种Z变体的CD光谱显示，每种变体在20℃具有α-螺旋结构。通过可变温度测量确定的熔解温度(Tm)被显示于表5中。
表5：选择的Z变体的熔解温度
实施例3
IL-6结合Z变体的第一成熟文库的设计和构建
在该实施例中，构建了成熟文库。使用该文库选择新的IL-6结合Z变体。来自成熟文库的选择通常被预期产生具有增强的亲和力的结合物(Orlova等，(2006)Cancer Res 66(8):4339-48)。在本研究中，使用裂池合成(split-pool synthesis)来生成随机化的单链接头，使得能够将定义的密码子在合成中掺入期望的位置中。
材料和方法
文库设计：文库基于在实施例1和2中描述的选择的IL-6结合Z变体的序列。在新的文库中，根据基于SEQ ID NO:1503-1551定义的Z变体序列的策略，使Z分子支架中的12个可变位置向某些氨基酸残基偏倚并使一个位置保持恒定。利用裂池合成生成147bp的DNA接头，所述接头编码Z变体氨基端序列的部分地随机的螺旋1和2。因此，侧翼为限制性位点XhoI和SacI的5’-AA ATA AAT CTC GAG GTA GAT GCC AAATAC GCC AAA GAA NNN NNN NNNGCG TGG NNN GAG ATC NNN NNN CTG CCT AAC CTC ACC NNN NNN CAANNN NNN GCC TTCATC NNN AAA TTA NNN GAT GAC CCA AGC CAG AGC TCA TTA TTT A-3’(SEQ ID NO:1560；随机密码子表示为NNN)从DNA 2.0(Menlo Park,CA,USA)订购。氨基酸残基在包括Z分子支架中的12个可变Z位置(9、10、11、14、17、18、24、25、27、28、32和35)的新文库中的理论分布在表6中给出。得到的理论文库大小为3.6x109个变体。
表6：文库设计，第一成熟
文库构建：使用AmpliTaq Gold聚合酶(Applied Biosystems，目录号4311816)根据供应商的建议在12个循环的PCR期间扩增文库，并用QIAquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN，目录号28106)根据供应商的建议纯化混合的产物。随机化文库片段的纯化的混合物(pool)用限制性内切酶XhoI和SacI-HF(New England Biolabs，目录号R0146L，和目录号R3156M)来消化，并使用PCR纯化试剂盒(Qiagen,目录号28106)来浓缩。随后，根据供应商的建议使产物在制备性2.5％琼脂糖凝胶(Nuisieve GTC琼脂糖，Cambrex，Invitrogen)上泳动并使用QIAGEN凝胶提取试剂盒(QIAGEN，目录号28706)纯化。
噬菌粒载体pAY02592(基本上如等，同上中描述的pAffi1)用相同酶限制性内切，并使用苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀来纯化。将限制性片段和载体以5:1的摩尔比率用T4DNA连接酶(Fermentas,目录号EL0011)在RT连接持续2h，然后在4℃孵育过夜。通过苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀回收连接的DNA，然后在10mM Tris-HCl，pH 8.5中溶解。因此，所得的在载体pAY02592中的文库编码Z变体，每个Z变体与源自链球菌G蛋白的白蛋白结合域(ABD)融合。
连接反应(约160ng DNA/转化)被电穿孔进入电感受态大肠杆菌ER2738细胞(50μl，Lucigen，Middleton，WI，USA)。紧接在电穿孔之后，加入约1ml的恢复培养基(供给ER2738细胞)。在37℃孵育转化的细胞持续60分钟。取出样品用于滴定并用于确定转化株的数目。然后，将细胞汇集并在37℃在1l的补充有2％葡萄糖、10μg/ml四环素和100μg/ml氨苄青霉素的TSB-YE培养基中培养过夜。以4,000g持续7分钟使细胞成为团块并重悬于PBS/甘油溶液(约40％甘油)中，等分并储存在-80℃。对来自Z变体的文库的克隆进行测序，以验证内含物并且以评价所构建文库与该文库设计相比的结果。如实施例1中描述的进行测序，并验证氨基酸分布。
噬菌体储备液的制备：在20l发酵罐(Belach Bioteknik)中制备包含噬菌粒文库的噬菌体储备液。将来自包含该噬菌粒文库的甘油储备液的细胞接种于10l的补充有1g/l葡萄糖、100mg/l氨苄青霉素和10mg/l四环素的TSB-YE(胰蛋白酶大豆肉汤-酵母提取物；30g/l TSB、5g/l酵母提取物)中。当细胞达到0.64的在600nm处的光密度(OD600)时，使用5x摩尔过量的M13K07辅助噬菌体感染约1.1l的培养物。将细胞孵育30分钟，届时用复合发酵培养基[2.5g/l(NH4)2SO4；5.0g/l酵母提取物；30g/l胰蛋白胨、2g/l K2HPO4，3g/l KH2PO4，1.25g/l；Na3C6H5O7·2H2O；Breox FMT30消泡剂0.1ml/l]填充发酵罐直至10l。添加以下组分：10ml羧苄青霉素25mg/ml；5ml卡那霉素50mg/ml；1ml 1M异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)；17.5ml/l的300g/l MgSO4和5ml的微量元素溶液[35g/l FeCl3·6 H2O；10.56g/lZnSO4·7H2O；2.64g/l CuSO4·5H2O；13.2g/l MnSO4·H2O；13.84g/l CaCl2·2H2O，溶解于1.2M HCl]。开始葡萄糖限制的补料分批培养，其中将600g/l葡萄糖溶液补料到反应器(开始时3.5g/h，20h后37.5g/h并且直到培养结束)。通过自动添加25％NH4OH使pH被控制在pH7。补充空气(5l/min)并将搅拌器设置为500rpm。补料分批培养24h后，OD600为22。通过以15,900g离心使培养物中的细胞成团。如实施例1中描述的，使噬菌体颗粒在PEG/NaCl中从上清液沉淀2次，过滤并溶解于PBS和甘油中。将噬菌体储备液贮存于-80℃，直到在选择中使用。
结果
文库构建：基于具有被证实的结合特性的一组IL-6结合Z变体(实施例1和2)来设计新文库。设计的文库的理论大小为3.6x109种Z变体。转化到大肠杆菌ER2738细胞后通过滴定确定的文库的实际大小为3.5x109种转化株。
文库质量通过测序192种转化株和通过将它们的实际序列与理论设计比较来测试。与设计的文库比较，实际文库的内容物显示是令人满意的。因此成功构建了IL-6的潜在结合物的成熟文库。
实施例4
来自第一成熟文库的Z变体的选择、筛选和表征
材料和方法
成熟的IL-6结合Z变体的噬菌体展示选择：如实施例1中描述的使靶蛋白hIL-6(R&D Systems,目录号206-IL/CF)和mIL-6(Abnova,目录号P4346Il6)生物素化。使用如实施例3中描述的Z变体分子的新的文库，在基本上如实施例1中描述但有以下例外的针对hIL-6和mIL-6的四个循环中进行噬菌体展示选择。在选择时，分别将胎牛血清(FCS,Gibco,目录号10108-165)和人血清白蛋白(HSA,Albucult,Novozymes,目录号230-005)添加至选择缓冲液至10％和1.5μM的最终浓度。用补充有3％BSA的PBS 0.1％预封闭在选择中使用的所有管和珠。在循环1A中，通过将噬菌体储备液与SA-珠一起孵育进行预选择步骤。对于所有轨道，在循环1中，选择体积为2ml。为了捕获噬菌体-靶复合体，每4μg生物素化的hIL-6或mIL-6使用1mg珠。
循环1中的六个轨道(1-6)被划分在第二循环或第三循环，导致在循环2中共七个轨道(1-1至6-2)，在循环3中共十二个轨道(1-1-1至6-2-1)，以及在循环4中共十二个轨道(1-1-1-1至6-2-1-1)。
使用以下两种不同程序洗脱结合的噬菌体颗粒：1)500μl 0.1M甘氨酸-HCl，pH2.2，随后立即用50μl 1M Tris-HCl，pH 8.0，和450μl PBS中和，或2)500μl的100mM磷酸钠和150mM氯化钠，pH 5.5并用500μl PBS中和。
在表7中显示了选择策略的概览，描述了在随后的循环中通过使用降低的靶浓度和增加的洗涤次数获得的增加的严格性。
表7：用于第一成熟的选择策略的概览
噬菌体颗粒的扩增：选择循环1和2之间的噬菌体颗粒的扩增基本如实施例1中描述的进行，具有以下例外。使用大肠杆菌ER2738用于噬菌体扩增，且以5x过量使用M13K07辅助噬菌体。选择循环2和4之间的噬菌体颗粒的扩增如下通过在溶液中进行细菌感染完成。在用噬菌体颗粒感染对数生长期大肠杆菌ER2738后，加入补充有2％葡萄糖、10μg/ml四环素和100μg/ml氨苄青霉素的TSB，随后在37℃伴随旋转孵育持续30min。此后，用M13K07辅助噬菌体感染细菌。将感染的细菌通过离心成团，重悬于补充有100μM IPTG、25μg/ml卡那霉素和100μg/ml氨苄霉素的TSB-YE培养基中并在30℃生长过夜。将过夜培养物离心并将上清液中的噬菌体颗粒用PEG/NaCl缓冲液沉淀两次。最后，将噬菌体颗粒重悬于选择缓冲液，然后进入下一个选择循环。在最后的选择循环中，将对数生长期细菌用洗脱物感染，并稀释，然后涂布在补充有0.2g/l氨苄青霉素的TBAB平板(30g/l胰蛋白胨血琼脂基，Oxoid目录号CMO233B)上以形成用于ELISA筛选的单菌落。
潜在结合物的测序：挑取来自不同的选择轨道的个体克隆用于测序。对ELISA筛选中运行的所有克隆进行测序。基本上如实施例1中描述的进行基因片段的扩增和基因片段的序列分析。
Z变体的ELISA筛选：从IL-6成熟文库的选择的克隆随机挑取包含Z变体(被表达为Z变体ABD融合蛋白)的单菌落，并如实施例1中描述的培养。如在实施例1中的进行周质上清液的制备，但以6个冷冻解冻循环。使用0.58nM浓度的生物素化的hIL-6，基本上如实施例1中描述的进行ELISA筛选。初始IL-6结合物Z06814的周质级分被用作阳性对照。通过使用只含有ABD的周质产生阴性对照。
人IL-6结合物的ELISA EC50分析：使选择的IL-6结合物经历如以上描述的利用ELISA分析对生物素化的hIL-6的系列稀释物的响应。以25nM的浓度加入生物素化的蛋白，并且以1:3逐步稀释直到11pM。还在不添加靶蛋白下测定所有Z变体作为背景对照。包含初始IL-6结合物Z06814(SEQ ID.NO:1512)的周质样品作为阳性对照被包括和分析。作为阴性对照，仅含有ABD的周质被针对生物素化的hIL-6测定。使源自针对mIL-6的选择的两种结合物Z11612(SEQ ID NO:151)和Z11616(SEQ ID NO:152)如以上描述的经历利用ELISA分析对生物素化的mIL-6的系列稀释物的响应。以227nM的浓度加入生物素化的蛋白，并以1:3逐步稀释直到104pM。利用GraphPad Prism 5和非线性回归分析得到的值。
结果
成熟的IL-6结合Z变体的噬菌体展示选择：在各自包含4个循环的共12个平行轨道中进行选择。不同的选择轨道在靶浓度、靶类型(hIL-6或mIL-6)、选择时间、洗涤条件和洗脱缓冲液的pH方面不同。
测序：对随机挑取的克隆测序。如实施例1中描述的，每个个体Z变体被给予识别号码Z#####。总计鉴定出809种新的独特的Z变体分子。
58个残基长Z变体的氨基酸序列在图1和序列表中被列为SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:15-89和SEQ ID NO:151-871。在每个序列中，推测的IL-6结合基序(BM)从位置8延伸至位置36。预测构成这些Z变体的每个内的完整三螺旋束(BMod)的49个氨基酸残基长多肽的氨基酸序列从位置7延伸到位置55。
Z变体的ELISA筛选：在四个选择循环之后获得的克隆在96孔板中产生并利用ELISA针对hIL-6结合活性筛选。对所有随机挑取的克隆分析。发现809种独特的Z变体中的796种针对0.58nM浓度的hIL-6给出3x阴性对照或更高(0.3-2.1AU)的响应。来自使用hIL-6作为选择靶的所有选择轨道的克隆显示出阳性信号。阴性对照具有0.078-0.102AU的吸光度。板的代表性组的空白对照的平均响应为0.087AU。
IL-6结合物的ELISA EC50分析：Z变体的亚组基于以上描述的ELISA实验中的结果(分别对每个板上的阳性对照归一化的最高ELISA值)来选择，并以ELISA格式经历靶滴定。使周质样品与生物素化的hIL-6或mIL-6的系列稀释物一起孵育。还针对hIL-6测定具有初始结合物Z06814(SEQ ID NO:1512)的周质样品作为阳性对照。分析获得的值并计算它们的各自EC50值(表8和9)。
表8：针对hIL-6的计算的EC50值
表9：针对mIL-6的计算的EC50值
实施例5
IL-6结合Z变体的第二成熟文库的设计和构建
在该实施例中,基本上如实施例4中描述的构建第二成熟文库。使用该文库选择IL-6结合Z变体。
材料和方法
文库设计：文库主要基于在实施例4中描述的选择的人IL-6结合Z变体的序列。在新的文库中，根据主要基于来自第一成熟的Z变体，即SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:15-89和SEQID NO:151-871定义的序列的策略，使Z分子支架中的13个可变位置向某些氨基酸残基偏倚。通过ColibraTM技术产生随机化双链接头，ColibraTM技术利用连接和随后建立的双链DNA的限制性酶切使得能够掺入随机化三核苷酸构造块组。侧翼为限制性位点XhoI和SacI，编码Z变体氨基酸序列的部分地随机化的螺旋1和2的双链DNA 5’-AA ATA AAT CTC GAGGTA GAT GCC AAA TAC GCC AAA GAA NNN NNN NNN GCT NNN NNN GAG ATC NNN NNN CTGCCG AAC CTG ACC NNN NNN CAG NNN NNN GCC TTC ATC NNN AAA TTA NNN GAT GAC CCAAGC CAG AGC TCA TTA TTT A-3’(SEQ ID NO:1561；随机化密码子表示为NNN)的文库购自Isogenica(Essex,UK)。在表10中给出了新的文库中氨基酸残基的理论分布，包括Z分子支架中的八个可变氨基酸位置(10、11、14、18、24、25、27和32)和五个恒定氨基酸位置(9、13、17、28和35)。得到的理论文库大小为2.6x107个变体。
文库构建和噬菌体储备液制备：基本上如实施例3中描述的构建文库。如实施例3中描述的制备文库的噬菌体储备液
表10：文库设计，第二成熟
结果
文库构建和噬菌体储备液制备：基于具有被证实的结合特性的一组IL-6结合Z变体(实施例4)来设计新文库。设计的文库的理论大小为2.6x107种Z变体。转化到大肠杆菌ER2738细胞后通过滴定确定的文库的实际大小为1.8x109种转化株。
文库质量通过测序192种转化株和通过将它们的实际序列与理论设计比较来测试。与理论文库比较，实际文库的内容物显示是令人满意的。因此成功构建了IL-6的潜在结合物的成熟文库。
实施例6
来自第二成熟文库的Z变体的选择、筛选和表征
材料和方法
成熟的IL-6结合Z变体的第二噬菌体展示选择：如实施例4中描述的将靶蛋白hIL-6生物素化。使用实施例5中描述的Z变体分子的第二成熟文库，基本上如实施例4中描述的针对hIL-6进行噬菌体展示选择，但有以下例外。对于所有轨道，在循环1中，选择体积为4ml。在循环2中，选择轨道1-2和1-3在一个共同的管中处理并且不被分离，直到在最后的1min洗涤后，届时它们被分别处理。同样，在循环4中，每组选择轨道1-1-1-1至1-1-1-3、1-1-1-4至1-1-1-6、1-1-2-1至1-1-2-3以及1-1-2-4至1-1-2-6分别在共同的管中处理并在最后的1min洗涤后分至三个单独的管中，并且然后分别利用表11中概括的不用洗涤策略处理。如实施例1中描述的，使用甘氨酸-HCl、pH2.2洗脱结合的噬菌体颗粒。基本上如实施例1中描述的进行在选择循环之间的噬菌体颗粒的扩增。
在表11中显示了选择策略和使用的参数的概览，描述了在选择轨道中在降低的靶浓度和增加的洗涤次数方面的不同。
潜在结合物的测序：挑取来自不同的选择轨道的个体克隆用于测序。对经历ELISA筛选的所有克隆测序。基本如实施例1中描述的进行基因片段的扩增和基因片段的序列分析。
Z变体的ELISA筛选：从IL-6第二成熟文库的所选克隆随机挑取包含Z变体(如在实施例1中描述的被表达为Z变体ABD融合蛋白)的单菌落，并如实施例1中描述的培养。基本上如实施例1中描述的进行周质上清液的制备和ELISA筛选，并在150μl PBST 0.05％中进行冷冻解冻并重复8次。以0.25nM的浓度使用生物素化的hIL-6。在每个ELISA板上，以一式两份使用IL-6结合物Z06814(SEQ ID NO:1512)的周质级分作为阳性对照。作为阴性对照，针对生物素化的hIL-6测定仅含有ABD的周质。
表11：用于第二成熟的选择策略的概览
IL-6结合物的ELISA EC50分析：使选择的IL-6结合物经历如在实施例2中描述的利用ELISA分析对生物素化的hIL-6的系列稀释物的响应。以5nM的浓度加入生物素化的蛋白，并以1:3逐步稀释直到83fM。作为背景对照，还在不加入靶蛋白下测定所有Z变体。含有初始IL-6结合Z06814(SEQ ID NO:1512)以及成熟结合物Z11632(SEQ ID NO:7)的周质样品被包括作为阳性对照。作为阴性对照，针对生物素化的hIL-6测定仅含有ABD的周质。利用GraphPad Prism 5和非线性回归分析得到的值。
结果
成熟的IL-6结合Z变体的第二噬菌体展示选择：在总共17个平行的轨道中进行选择，每个轨道含有四个循环。如表11中概述的，选择轨道在靶浓度、选择时间和洗涤条件方面不同。
潜在结合物的测序：对随机挑取的克隆测序。每个个体Z变体如实施例1中描述的被给予识别号码Z#####。总计鉴定出707种新的独特的Z变体分子。58个残基长Z变体的氨基酸序列在图1和序列表中被列为SEQ ID NO:1-6、SEQ ID NO:8-14、SEQ ID NO:90-150和SEQID NO:872-1502。在每个序列中，推测的IL-6结合基序(BM)从位置8延伸至位置36。预测构成这些Z变体的每个内的完整三螺旋束(BMod)的49个氨基酸残基长多肽的氨基酸序列从位置7延伸到位置55。
Z变体的ELISA筛选：在四个选择循环之后获得的克隆在96孔板中产生并利用ELISA针对人IL-6结合活性筛选。对所有随机挑取的克隆进行分析。发现707种独特的Z变体中的705种针对0.25nM浓度的hIL-6给出3x阴性对照或更高(0.3-2.3AU)的响应。源自所有选择轨道的克隆都显示出阳性信号。板上的阴性对照的平均响应为0.085AU。
IL-6结合物的ELISA EC50分析：基于以上描述的ELISA实验中的结果选择Z变体的亚组。使表现出超过1.6AU的吸光度或在将响应针对每个板上的一式两份的阳性对照Z06814(SEQ ID NO:1512)的平均响应归一化之后超过1.7的响应的所有Z变体经历如实施例4中描述的ELISA格式的靶滴定。具有成熟结合物Z11632(SEQ ID NO:7)以及初始结合物Z06814(SEQ ID NO:1512)的周质样品也被测定作为阳性对照。分析获得的值并计算它们的各自EC50值(表12)。
表12：从来自第二成熟的Z变体以及阳性对照Z06814和Z11632的ELISA滴定分析计算的EC50值
实施例7
IL-6结合Z变体的亚组的亚克隆、产生和表征
在该实施例中，产生亲和力成熟的IL-6结合Z变体的亚组并通过SPR、ELISA、基于细胞的测定和CD来功能测定。SPR被用来测量Z变体与IL-6相互作用的动力学参数。竞争ELISA被用来研究Z变体与人IL-6蛋白的结合模式。基于TF-1细胞的测定被用来测定Z变体阻断IL-6依赖性信号传导的能力。CD被用来研究Z变体的二级结构并确定它们的熔解温度。
材料和方法
将Z变体亚克隆进表达载体：从文库载体pAY02592扩增以下14种IL-6结合Z变体的DNA：Z11632(SEQ ID NO:7)、Z14630(SEQ ID NO:6)、Z14700(SEQ ID NO:8)、Z14712(SEQ IDNO:9)、Z14861(SEQ ID NO:4)、Z14862(SEQ ID NO:10)、Z14976(SEQ ID NO:1)、Z14984(SEQID NO:5)、Z15015(SEQ ID NO:2)、Z15036(SEQ ID NO:11)、Z15110(SEQ ID NO:12)、Z15122(SEQ ID NO:3)、Z15126(SEQ ID NO:13)和Z15142(SEQ ID NO:14)。如实施例2中描述的进行亚克隆。将Z基因片段亚克隆进表达载体pAY01448，导致编码序列MGSSHHHHHHLQ-[Z#####]-VD。
蛋白表达和在变性条件下的纯化：用包含每个各自的IL-6结合Z变体的基因片段的质粒转化大肠杆菌Rosetta细胞(Novagen)，并在37℃在100ml补充有50μg/ml卡那霉素的TSB-YE培养基中培养。在OD600＝2时，通过以1mM的终浓度加入IPTG来诱导表达，并使培养物在25℃孵育另外的16-20h。通过离心收获细胞。
在基本上如实施例2中描述的变性条件下进行蛋白纯化。通过测量在280nm处的吸光度，使用各自蛋白的消光系数来确定蛋白浓度。IL-6结合Z变体的纯度通过用考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE来分析。
蛋白表达和在变性条件下的纯化：用含有成熟变体Z11632(SEQ ID NO:7)、Z14630(SEQ ID NO:6)、Z14700(SEQ ID NO:8)、Z14712(SEQ ID NO:9)、Z14861(SEQ ID NO:4)、Z14862(SEQ ID NO:10)、Z14976(SEQ ID NO:1)、Z14984(SEQ ID NO:5)、Z15015(SEQ IDNO:2)、Z15036(SEQ ID NO:11)、Z15110(SEQ ID NO:12)、Z15122(SEQ ID NO:3)、Z15142(SEQ ID NO:14)的基因片段、初始Z变体Z06814(SEQ ID NO:1512)的基因片段以及对照Z变体Z04726(SEQ ID NO:1553)的基因片段的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞(NEB,目录号C2527I)。在37℃在1000ml补充有50μg/ml卡那霉素的LB培养基中培养转化的细菌细胞。为了诱导蛋白表达，在OD600＝0.8时添加IPTG至0.1mM的最终浓度，并在25℃孵育培养物持续17h。通过在4℃和8000rpm离心持续30min收获细胞。丢弃上清液并在10ml PBS中重悬细胞团块。在通过声处理破碎细胞后，通过离心移除细胞碎片，并将每种上清液应用到用20ml洗涤缓冲液(20mM NaH2PO4、10mM NaCl、20mM咪唑，pH 6.0)平衡的2ml Ni-NTA柱(QIAGEN,目录号30410)上。通过用洗涤缓冲液洗涤移除污染物，并用洗脱缓冲液(20mM NaH2PO4、10mMNaCl、250mM咪唑，pH 6.0)洗脱Z变体。使洗脱液在离子交换柱(Life Technologies,目录号4481317)上经历纯化，并通过增加盐浓度洗脱Z变体。然后使用VIVASPIN 6柱(Sartorius,目录号VS0691)使洗脱液的缓冲溶液对PBS(10mM Na2HPO4、1.8mM KH2PO4、137mM NaCl、2.7mM KCl)交换。通过用考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE分析Z变体的纯度。
ProteOn动力学分析：对在变性条件下纯化的6种带His6标签的Z变体确定对人IL-6的动力学常数(kon和koff)和亲和力(KD)。将IL-6结合变体Z06814(SEQ ID NO:1512)、Z14861(SEQ ID NO:4)、Z014976(SEQ ID NO:1)、Z14984(SEQ ID NO:5)、Z15015(SEQ IDNO:2)和Z15122(SEQ ID NO:3)在10mM NaAc缓冲液，pH 4.5中稀释至5μg/ml，并分别固定在GLC芯片(Bio-Rad,目录号176-5011)上。利用胺偶联化学根据制造商的建议进行固定并且使用PBST 0.05％作为运行缓冲液。在动力学实验中也使用PBST0.05％作为运行缓冲液，使用的流速为60μl/min。将分析物hIL-6在PBST0.05％运行缓冲液中稀释至50nM、12.5nM、3.1nM、0.78nM、0.19nM和0nM的终浓度并以一式三份注射3min，然后在运行缓冲液中解离持续90min。解离后，用补充有0.05％Tween 20的HCl再生表面。在Bio-Rad manager软件(Bio-Rad)中利用1:1模型从传感图计算动力学常数。
结合位点的分析：如实施例2中描述的评估14种成熟IL-6结合Z变体(在变性条件下纯化的)对人gp130(hgp130)和hIL-6/hIL-6Rα复合体之间的相互作用的干扰。初始结合物Z06814和hIL-6Rα结合抗体托珠单抗被包括用于比较。
基于TF-1细胞的测定：在具有L-谷氨酰胺(HyClone,目录号SH30027)补充有10％FBS(HyClone,目录号SH30919.03)、Pen-Strep(HyClone,目录号15140-163)和2ng/mlrhGM-CSF(R&D Systems,目录号215-GM-010)的RPMI1640中培养TF-1细胞。在使用前，将细胞在rhGM-CSF的不存在下在RPMI-1640中洗涤两次。然后对细胞计数并以4x104个细胞/孔的密度分配到96孔板(Corning,目录号3596)中。在单独的板中，在0.099nM rhIL-6(R&DSystems,目录号206-IL/CF)的存在下孵育Z变体(在天然条件下纯化的)的系列稀释物(浓度范围10-0.00061nM)、托珠单抗(Roche)和对照IgG(Jackson Immunoresearch,目录号Jac-009-000-003)。然后将这些预混合物转移至含有TF-1细胞的孔，所述含有TF-1细胞的孔被在37℃在加湿的5％CO2气氛中孵育了持续72h。在孵育的最后4个小时，使每孔包含10μl WST(DoGen,目录号EZ3000)。利用Victor X3板读取器(Perkin Elmer)在450nM测量吸光度。通过使每个孔的吸光度除以每个板中的IL-6处理的孔的平均吸光度计算相对细胞生活力。通过对四参数剂量响应曲线的非线性回归来评价数据，并利用GraphPad Prism软件确定半最大抑制浓度(IC50)。
CD分析：使用在天然条件下纯化的Z变体如实施例2中描述的进行CD分析。
结果
ProteOn动力学分析：在ProteOn仪器上通过在包含不同的固定的Z变体的表面上注射多种浓度的hIL-6来分析6种带His6标签的IL-6结合Z变体与人IL-6的相互作用。表面的配体固定水平在每个100-220RU之间。利用1:1相互作用模型，hIL-6与Z变体的结合的动力学参数(KD、ka(kon)和kd(koff))的归纳在表13中给出。
表13：hIL-6与Z变体的结合的动力学参数
Z变体 SEQ ID NO: kon(M-1s-1) koff(s-1) KD(M)
His6-Z06814 1512 4.3x105 8.8x10-5 2.0x10-10
His6-Z14861 4 3.6x105 6.3x10-5 1.7x10-10
His6-Z14976 1 3.1x105 2.7x10-5 8.8x10-11
His6-Z14984 5 3.0x105 7.4x10-5 2.5x10-10
His6-Z15015 2 4.3x105 7.2x10-5 1.7x10-10
His6-Z15122 3 3.1x105 3.9x10-5 1.2x10-10
结合位点的分析：所有成熟IL-6结合Z变体显示出对在预先形成的hIL-6/hIL-6Rα复合体和hgp130之间的类似反式信号传导的相互作用的清晰的浓度依赖性阻断(图5)。每种成熟Z变体显示出比初始结合物Z06814和托珠单抗两者均高的阻断能力，即所述阻断能力会相应于小于1.6nM的IC50值。
基于TF-1细胞的测定：进行基于TF-1细胞的测定，以评价IL-6结合Z变体在经典信号传导途径中的效力和潜力。该测定显示所有的亲和力成熟的IL-6结合Z变体都能够阻断TF-1细胞的IL-6依赖性生长(图6)。在表14中显示了对Z变体以及对hIL-6Rα结合抗体托珠单抗计算的IC50值。
表14：成熟Z变体阻断TF-1细胞的IL-6依赖性生长的IC50值
Z变体 SEQ ID NO: IC50(M)
His6-Z11632 7 1.2x10-10
His6-Z14630 6 8.7x10-11
His6-Z14700 8 1.0x10-10
His6-Z14712 9 2.2x10-10
His6-Z14861 4 1.9x10-10
His6-Z14862 10 4.3x10-10
His6-Z14976 1 4.2x10-11
His6-Z14984 5 2.7x10-10
His6-Z15015 2 2.7x10-11
His6-Z15036 11 1.8x10-10
His6-Z15110 12 9.3x10-10
His6-Z15122 3 8.5x10-11
His6-Z15142 14 5.1x10-10
His6-Z06814 1512 1.3x10-10
托珠单抗 N/A 4.1x10-10
CD分析：对10种成熟Z变体确定的CD光谱显示，每种变体在20℃具有α-螺旋结构。通过可变温度测量确定的熔解温度(Tm)被显示于表15中。
表15：成熟Z变体的亚组的熔解温度
实施例8
与ABD融合的IL-6结合Z变体的体内活性:
利用血清淀粉样蛋白A(SAA)小鼠模型探索与ABD融合的IL-6结合Z变体的体内阻断效果。急性期蛋白SAA从肝细胞分泌并可由促炎性细胞因子IL-1、IL-6和TNF诱导。由于人和小鼠细胞因子的序列同一性，人变体能够作用于其相应的小鼠受体并引起鼠SAA响应。要注意的是，人TNF蛋白仅能够与鼠TNFRII相互作用(不是鼠TNFRI)。
材料和方法
如实施例2中描述的，克隆IL-6靶向Z变体Z06814(SEQ ID NO:1512)和结合不相关靶的对照Z变体Z04726(SEQ ID NO:1535)，并以与ABD变体PP013(SEQ ID NO:1554)融合的方式产生。在以5μg/kg腹膜内(i.p.)施用hIL-6(R&D Systems)之前9h，以多种剂量(0,0.025、2.5或25mg/kg体重)的Z06814-ABD皮下(s.c.)注射四组Balb/c小鼠(n＝8)。第5组小鼠(n＝8)接受25mg/kg的Z04726-ABD。两个另外的对照组小鼠分别接受PBS(n＝4)和25mg/kg的Z06814-ABD(n＝8)，但无随后的IL-6注射。20h后，通过心脏穿刺取得血液，并收集血清。
通过ELISA(Tridelta)根据制造商的指示对血清测定鼠SAA的含量。简而言之，将稀释的血清样品与抗SAA-HRP一起添加至SAA预包被的板。将板孵育持续1h并且然后洗涤4次。添加TMB底物20min，然后用终止溶液终止反应。利用微板读取器(Victor3,PerkinElmer)在450nm处测量吸光度。
结果
利用IL-6触发的血清淀粉样蛋白-A(SAA)释放的小鼠模型体内评估Z变体Z06814(SEQ ID NO:1512)的抗关节炎效力。注射5μg/kg体重hIL-6之前9h，给予四组小鼠0、0.025、2.5或25mg/kg体重的IL-6结合Z06814-ABD融合蛋白或25mg/kg对照Z04726-ABD融合蛋白。在另外的22h后，测量SAA蛋白的水平并在不同组之间比较。在未接受Z06814-ABD或接受25mg/kg对照Z04726-ABD融合物的动物中，血清中的SAA蛋白水平增加至约500-600μg/ml的水平。仅给予PBS(且无hIL-6)的对照动物表现出16-64μg/ml的范围内的水平。在给予Z06814-ABD的动物中，以剂量依赖的方式测量到显著较低的SAA蛋白水平(图7)。对于给予最高剂量的Z06814-ABD(25mg/kg体重)的组，SAA蛋白水平与未给予hIL-6注射的动物一样低。
实施方案的分项列举
1.ABD结合多肽，包含IL-6结合基序BM，该基序由选自以下的氨基酸序列组成：
i)EEX3X4AWX7EIHX11LPNLX16X17X18QX20X21AFIX25X26LX28X29
其中，彼此独立地，
X3选自A、F、H、K、Q、R、S、W和Y；
X4选自A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V和Y；
X7选自F、H、I、K、L、M、N、R、S、T、V、W和Y；
X11选自A、I、K、L、M、N、R、S、T和V；
X16选自N和T；
X17选自A、I、T和V；
X18选自D、E、G、H、K、N、Q、R、S和T；
X20选自I、L、M、R、T和V；
X21选自A、S、T和V；
X25选自I、M、Q、S、T、V和W；
X26选自K和S；
X28选自F、L、M和Y；并且
X29选自D和R；
和
ii)与在i)中定义的序列具有至少93％同一性的氨基酸序列。
2.根据项目1所述的IL-6结合多肽，其中在序列i)中：
X3选自A、H、K、Q、R和Y；
X4选自A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V和Y；
X7选自F、H、I、K、L、M、N、R、T、V、W和Y；
X11选自A、I、K、L、N、S、T和V；
X16为T；
X17选自A、I、T和V；
X18选自D、E、H、K、N、Q、R、S和T；
X20选自I、L、M、R和V；
X21选自A、S和V；
X25选自I、Q、S、T、V和W；
X26为K；
X28选自F、L、M和Y；并且
X29为D。
3.根据项目1或2所述的IL-6结合多肽，其中序列i)满足以下11个条件I-XI中的至少6个：
I.X3选自K和R；
II.X11选自A和L；
III.X16为T；
IV.X17选自I和V；
V.X18选自D和E；
VI.X20为M；
VII.X21为A；
VIII.X25选自S和T；
IX.X26为K；
X.X28为F；以及
XI.X29为D。
4.根据项目3所述的IL-6结合多肽，其中序列i)满足所述11个条件I-XI中的至少7个。
5.根据项目4所述的IL-6结合多肽，其中序列i)满足所述11个条件I-XI中的至少8个。
6.根据项目5所述的IL-6结合多肽，其中序列i)满足所述11个条件I-XI中的至少9个。
7.根据项目6所述的IL-6结合多肽，其中序列i)满足所述11个条件I-XI中的至少10个。
8.根据项目7所述的IL-6结合多肽，其中序列i)满足所有所述11个条件I-XI。
9.根据任一前述项目所述的IL-6结合多肽，其中X17X20X21选自VMA和IMA。
10.根据项目1-8中任一项所述的IL-6结合多肽，其中X20X21X28是MAF。
11.根据项目1-8中任一项所述的IL-6结合多肽，其中X17X20X28选自VMF和IMF。
12.根据项目1-8中任一项所述的IL-6结合多肽，其中X17X21X28选自VAF和IAF。
13.根据任一前述项目所述的IL-6结合多肽，其中序列i)相应于选自由SEQ IDNO:1-1551组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。
14.根据项目13所述的IL-6结合多肽，其中序列i)相应于选自由SEQ ID NO:1-1502组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。
15.根据项目14所述的IL-6结合多肽，其中序列i)相应于选自由SEQ ID NO:7、SEQID NO:15-89和SEQ ID NO:151-871组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。
16.根据项目14所述的IL-6结合多肽，其中序列i)相应于选自由SEQ ID NO:1-6、SEQ ID NO:8-14、SEQ ID NO:90-150和SEQ ID NO:872-1502组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。
17.根据项目13所述的IL-6结合多肽，其中序列i)相应于选自由SEQ ID NO:1-152和SEQ ID NO:1503-1515组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。
18.根据项目17所述的IL-6结合多肽，其中序列i)相应于选自由SEQ ID NO:1-150和SEQ ID NO:1503-1515组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。
19.根据项目17所述的IL-6结合多肽，其中序列i)相应于选自由SEQ ID NO:1-152组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。
20.根据项目18或19所述的IL-6结合多肽，其中序列i)相应于选自由SEQ ID NO:1-150组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。
21.根据项目19所述的IL-6结合多肽，其中序列i)相应于选自由SEQ ID NO:7、SEQID NO:15-89和SEQ ID NO:151-152组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。
22.根据项目20所述的IL-6结合多肽，其中序列i)相应于选自由SEQ ID NO:1-6、SEQ ID NO:8-14和SEQ ID NO:90-150组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。
23.根据项目18所述的IL-6结合多肽，其中序列i)相应于选自由SEQ ID NO:1-14和SEQ ID NO:1503-1515组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。
24.根据项目23所述的IL-6结合多肽，其中序列i)相应于选自由SEQ ID NO:1-14和SEQ ID NO:1512组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。
25.根据项目24所述的IL-6结合多肽，其中序列i)相应于选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。
26.根据项目16、22和25中任一项所述的IL-6结合多肽，其中序列i)相应于选自由SEQ ID NO:1-5组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。
27.根据项目24所述的IL-6结合多肽，其中序列i)相应于SEQ ID NO:1512中从位置8至位置36的序列。
28.根据任一前述项目所述的IL-6结合多肽，其中所述IL-6结合基序形成三螺旋束蛋白结构域的一部分。
29.根据项目28所述的IL-6结合多肽，其中所述IL-6结合基序基本上形成所述三螺旋束蛋白结构域内具有相互连接环的双螺旋的一部分。
30.根据项目29所述的IL-6结合多肽，其中所述三螺旋束蛋白结构域选自细菌受体结构域。
31.根据项目30所述的IL-6结合多肽，其中所述三螺旋束蛋白结构域选自来自金黄色葡萄球菌的蛋白A的结构域或其衍生物。
32.根据任一前述项目所述的IL-6结合多肽，其包含结合模块BMod,所述结合模块的氨基酸序列选自以下：
iii)K-[BM]-DPSQSXaXbLLXcEAKKLXdXeXfQ；
其中
[BM]为如项目1-27的任一项中定义的IL-6结合基序，条件是X29为D；
Xa选自A和S；
Xb选自N和E；
Xc选自A、S和C；
Xd选自E、N和S；
Xe选自D、E和S；
Xf选自A和S；以及
iv)与由iii)定义的序列具有至少91％同一性的氨基酸序列。
33.根据项目1-31中任一项所述的IL-6结合多肽，其包含结合模块BMod，所述结合模块的氨基酸序列选自以下：
v)K-[BM]-QPEQSXaXbLLXcEAKKLXdXeXfQ，
其中
[BM]为如项目1-27的任一项中定义的IL-6结合基序，条件是X29为R；
Xa选自A和S；
Xb选自N和E；
Xc选自A、S和C；
Xd选自E、N和S；
Xe选自D、E和S；
Xf选自A和S；以及
vi)与由v)定义的序列具有至少91％同一性的氨基酸序列。
34.根据项目1-32中任一项所述的IL-6结合多肽，其中序列iii)相应于选自由SEQID NO:1-1551组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。
35.根据项目34所述的IL-6结合多肽，其中序列iii)相应于选自由SEQ ID NO:1-1502组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。
36.根据项目35所述的IL-6结合多肽，其中序列iii)相应于选自由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:15-89和SEQ ID NO:151-871组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。
37.根据项目35所述的IL-6结合多肽，其中序列iii)相应于选自由SEQ ID NO:1-6、SEQ ID NO:8-14、SEQ ID NO:90-150和SEQ ID NO:872-1502组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。
38.根据项目34所述的IL-6结合多肽，其中序列iii)相应于选自由SEQ ID NO:1-152和SEQ ID NO:1503-1515组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。
39.根据项目38所述的IL-6结合多肽，其中序列iii)相应于选自由SEQ ID NO:1-150和SEQ ID NO:1503-1515组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。
40.根据项目35或38所述的IL-6结合多肽，其中序列iii)相应于选自由SEQ IDNO:1-152组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。
41.根据项目39或40所述的IL-6结合多肽，其中序列iii)相应于选自由SEQ IDNO:1-150组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。
42.根据项目40所述的IL-6结合多肽，其中序列iii)相应于选自由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:15-89和SEQ ID NO:151-152组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。
43.根据项目41所述的IL-6结合多肽，其中序列iii)相应于选自由SEQ ID NO:1-6、SEQ ID NO:8-14和SEQ ID NO:90-150组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。
44.根据项目39所述的IL-6结合多肽，其中序列iii)相应于选自由SEQ ID NO:1-14和SEQ ID NO:1503-1515组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。
45.根据项目44所述的IL-6结合多肽，其中序列iii)相应于选自由SEQ ID NO:1-14和SEQ ID NO:1512组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。
46.根据项目45所述的IL-6结合多肽，其中序列iii)相应于选自由SEQ ID NO:1-14组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。
47.根据项目37、43和46中任一项所述的IL-6结合多肽，其中序列iii)相应于选自由SEQ ID NO:1-5组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。
48.根据项目45所述的IL-6结合多肽，其中序列iii)相应于SEQ ID NO:1512中从位置7至位置55的序列。
49.根据任一前述项目所述的IL-6结合多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：
vii)YA-[BMod]-AP；
其中[BMod]是如项目32-48的任一项中定义的IL-6结合模块；和
viii)与由vii)定义的序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
50.根据项目1-48中任一项所述的IL-6结合多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：
ix)FN-[BMod]-AP；
其中[BMod]是如项目32-48的任一项中定义的IL-6结合模块；和
x)与由ix)定义的序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
51.根据任一前述项目所述的IL-6结合多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：
ADNNFNK-[BM]-DPSQSANLLSEAKKLNESQAPK；
ADNKFNK-[BM]-DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK；
ADNKFNK-[BM]-DPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK；
ADAQQNNFNK-[BM]-DPSQSTNVLGEAKKLNESQAPK；
AQHDE-[BM]-DPSQSANVLGEAQKLNDSQAPK；
VDNKFNK-[BM]-DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK；
AEAKYAK-[BM]-DPSESSELLSEAKKLNKSQAPK；
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNDAQAPK；
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNDSQAPK；
AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK；
AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK；
AEAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLSESQAPK；
AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLESSQAPK；
AEAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLESSQAPK；
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK；
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK；
VDAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLSESQAPK；
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLESSQAPK；
VDAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLESSQAPK；
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNKAQAPK；以及
AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNKAQAPK；
其中[BM]为如项目1-27的任一项中定义的IL-6结合基序。
52.根据项目1-49中任一项所述的IL-6结合多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：
xi)VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK；
其中[BM]为如项目1-27的任一项中定义的IL-6结合基序；以及
xii)与xi)中定义的序列具有至少89％同一性的氨基酸序列。
53.根据项目1-49中任一项所述的IL-6结合多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：
xiii)AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK；
其中[BM]为如项目1-27的任一项中定义的IL-6结合基序；以及
xiv)与xiii)中定义的序列具有至少89％同一性的氨基酸序列。
54.根据项目52所述的IL-6结合多肽，其中序列xi)选自由SEQ ID NO:1-1551组成的组。
55.根据项目54所述的IL-6结合多肽，其中序列xi)选自由SEQ ID NO:1-1502组成的组。
56.根据项目55所述的IL-6结合多肽，其中序列xi)选自由SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:15-89和SEQ ID NO:151-871组成的组。
57.根据项目55所述的IL-6结合多肽，其中序列xi)选自由SEQ ID NO:1-6、SEQ IDNO:8-14、SEQ ID NO:90-150和SEQ ID NO:872-1502组成的组。
58.根据项目54所述的IL-6结合多肽，其中序列xi)选自由SEQ ID NO:1-152和SEQID NO:1503-1515组成的组。
59.根据项目58所述的IL-6结合多肽，其中序列xi)选自由SEQ ID NO:1-150和SEQID NO:1503-1515组成的组。
60.根据项目55或58所述的IL-6结合多肽，其中序列xi)选自由SEQ ID NO:1-152组成的组。
61.根据项目59或60所述的IL-6结合多肽，其中序列xi)选自由SEQ ID NO:1-150组成的组。
62.根据项目60所述的IL-6结合多肽，其中序列xi)选自由SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:15-89和SEQ ID NO:151-152组成的组。
63.根据项目61所述的IL-6结合多肽，其中序列xi)选自由SEQ ID NO:1-6、SEQ IDNO:8-14和SEQ ID NO:90-150组成的组。
64.根据项目59所述的IL-6结合多肽，其中序列xi)选自由SEQ ID NO:1-14和SEQID NO:1503-1515组成的组。
65.根据项目64所述的IL-6结合多肽，其中序列xi)选自由SEQ ID NO:1-14和SEQID NO:1512组成的组。
66.根据项目65所述的IL-6结合多肽，其中序列xi)选自由SEQ ID NO:1-14组成的组。
67.根据项目57、63和66中任一项所述的IL-6结合多肽，其中序列xi)选自由SEQID NO:1-5组成的组。
68.根据项目65所述的IL-6结合多肽，其中序列xi)为SEQ ID NO:1512。
69.根据任一前述项目所述的IL-6结合多肽，其能够阻断经由顺式信号传导途径和/或反式信号传导途径的IL-6依赖性信号传导。
70.根据项目69所述的IL-6结合多肽，其中所述阻断的半最大抑制浓度(IC50)为至多1x10-6M，诸如至多1x10-7M，诸如至多1x10-8M，诸如至多1x10-9M，诸如至多1x10-10M。
71.根据项目69或70所述的IL-6结合多肽，其能够阻断IL-6/IL-6Rα与gp130的相互作用。
72.根据任一前述项目所述的IL-6结合多肽，其能够与IL-6结合，以使得相互作用的EC50值为至多1x10-7M，诸如至多1x10-8M，诸如至多1x10-9M，诸如至多1x10-10M。
73.根据任一前述项目所述的IL-6结合多肽，其能够与IL-6结合，以使得相互作用的KD值为至多1x10-8M，诸如至多1x10-9M，诸如至多1x10-10M。
74.根据任一前述项目所述的IL-6结合多肽，其在C-末端和/或N-末端包含另外的氨基酸。
75.根据项目74所述的IL-6结合多肽，其中所述另外的氨基酸改进所述多肽的产生、纯化、体内或体外的稳定、偶联或检测。
76.根据任一前述项目所述的IL-6结合多肽，所述IL-6结合多肽为多聚体形式，所述多聚体形式包含至少2个IL-6结合多肽单体单元，所述单体单元的氨基酸序列可以是相同或不同的。
77.根据项目76所述的IL-6结合多肽，其中所述IL-6结合多肽单体单元共价地偶联在一起。
78.根据项目77所述的IL-6结合多肽，其中所述IL-6结合多肽单体单元表达为融合蛋白。
79.根据项目78所述的IL-6结合多肽，所述IL-6结合多肽为二聚体形式。
80.融合蛋白或缀合物，所述融合蛋白或缀合物包含：
-第一部分，所述第一部分由根据任一前述项目所述的IL-6结合多肽组成；和
-第二部分，所述第二部分由具有期望的生物学活性的多肽组成。
81.根据项目80所述的融合蛋白或缀合物，其中所述期望的生物学活性是治疗活性。
82.根据项目80所述的融合蛋白或缀合物，其中所述期望的生物学活性是结合活性。
83.根据项目82所述的融合蛋白或缀合物，其中所述结合活性是白蛋白结合活性，所述白蛋白结合活性增加所述融合蛋白或缀合物的体内半衰期。
84.根据项目83所述的融合蛋白或缀合物，其中所述第二部分包含链球菌G蛋白的白蛋白结合结构域或其衍生物。
85.根据项目82所述的融合蛋白或缀合物，其中所述结合活性发挥作用阻断生物学活性。
86.根据项目80所述的融合蛋白或缀合物，其中所述期望的生物学活性是酶促活性。
87.根据项目81所述的融合蛋白或缀合物，其中所述第二部分是治疗活性多肽。
88.根据项目87所述的融合蛋白或缀合物，其中所述第二部分是免疫应答改变剂。
89.根据项目87所述的融合蛋白或缀合物，其中所述第二部分是抗癌剂。
90.根据项目80、81、86、88和89中任一项所述的融合蛋白或缀合物，其中所述第二部分选自由人内源酶、激素、生长因子、趋化因子、细胞因子和淋巴因子组成的组。
91.根据任一前述项目所述的IL-6结合多肽、融合蛋白或缀合物，所述IL-6结合多肽、融合蛋白或缀合物还包含标记物。
92.根据项目91所述的IL-6结合多肽、融合蛋白或缀合物，其中所述标记物选自由荧光染料和金属、发色团染料、化学发光化合物和生物发光蛋白、酶、放射性核素和放射性颗粒组成的组。
93.根据任一前述项目所述的IL-6结合多肽、融合蛋白或缀合物，所述IL-6结合多肽、融合蛋白或缀合物包括由经由半胱氨酸残基的硫醇基或赖氨酸残基的胺基缀合至所述IL-6结合多肽的聚氨基聚羧酸盐螯合剂提供的螯合环境。
94.多核苷酸，所述多核苷酸编码根据项目1-79中任一项所述的多肽。
95.表达载体，所述表达载体包含根据项目94所述的多核苷酸。
96.宿主细胞，所述宿主细胞包含根据项目95所述的表达载体。
97.制备根据项目1-79中任一项所述的多肽的方法，所述方法包括
-在容许所述多肽由所述表达载体表达的条件下培养根据项目96所述的宿主细胞，和
-分离所述多肽。
98.组合物，所述组合物包含根据项目1-93中任一项所述的IL-6结合多肽、融合蛋白或缀合物和至少一种药学上可接受的赋形剂或载体。
99.根据项目98所述的组合物，所述组合物还包含至少一种另外的活性剂，诸如选自免疫应答改变剂和抗癌剂的剂。
100.根据项目1-93中任一项所述的IL-6结合多肽、融合蛋白或缀合物或根据项目98-99中任一项所述的组合物，用于口服、局部、静脉内、腹膜内、皮下、肺、经皮、肌肉内、鼻内、含服、舌下或栓剂施用，诸如用于局部施用。
101.根据项目1-93中任一项所述的IL-6结合多肽、融合蛋白或缀合物或根据项目98-99中任一项所述的组合物，用于作为药物、诊断剂或预后剂使用。
102.根据项目1-93中任一项所述的IL-6结合多肽、融合蛋白或缀合物或根据项目98-99中任一项所述的组合物，用于作为药物使用。
103.根据项目102所述的用于使用的IL-6结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物，其中所述多肽、融合蛋白、缀合物或组合物体内调控IL-6功能。
104.根据项目101-103中任一项所述的用于使用的IL-6结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物，用于在IL-6相关紊乱的治疗、预后或诊断中使用。
105.根据项目101-103中任一项所述的用于使用的IL-6结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物，用于在IL-6相关紊乱的治疗中使用。
106.根据项目105所述的用于使用的IL-6结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物，其中所述IL-6相关紊乱选自由以下组成的组：炎性疾病、自身免疫疾病、感染性疾病、癌症、糖尿病、神经性疾病和抑郁症。
107.根据项目106所述的用于使用的IL-6结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物，其中所述IL-6相关紊乱选自由炎性疾病和自身免疫疾病组成的组。
108.根据项目107所述的用于使用的IL-6结合多肽、融合蛋白、缀合物和组合物，其中所述IL-6相关紊乱选自由以下组成的组:类风湿性关节炎(RA)、幼年RA、幼年特发性关节炎或全身性幼年特发性关节炎，脉管炎，银屑病性关节炎，银屑病，强直性脊柱炎，慢性炎症性肠疾病诸如克罗恩氏病和溃疡性结肠炎；格雷夫斯病，贝赛特氏病，葡萄膜炎，巨细胞动脉炎，多发性硬化症(MS)，全身性硬化症，全身性红斑狼疮(SLE)，多肌炎，风湿性多肌痛，哮喘，慢性阻塞性肺疾病(COPD)，复发性多软骨炎，胰腺炎，腹膜炎，肾炎，川崎病，干燥综合征和成人斯蒂尔病。
109.根据项目106所述的用于使用的IL-6结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物，其中所述IL-6相关紊乱为癌症，诸如选自由以下组成的组的癌症：结肠炎相关癌症、肾癌(renal cancer)、肾癌(kidney cancer)、前列腺癌、恶性淋巴细胞瘤、多发性骨髓瘤、卡斯尔曼病、乳腺癌和肺癌。
110.根据项目106所述的用于使用的IL-6结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物，其中所述IL-6相关紊乱选自以下：阿耳茨海默氏病、HIV、糖尿病、脓毒症、恶病质、骨髓增生异常综合征(MDS)、肝硬化、移植物抗宿主疾病、心肌梗死、子宫内膜异位和骨质疏松。
111.治疗IL-6相关紊乱的方法，所述方法包括对有相应需要的受试者施用有效量的根据项目1-93中任一项所述的IL-6结合多肽、融合蛋白或缀合物或根据项目98-99中任一项所述的组合物。
112.根据项目111所述的方法，其中所述IL-6相关紊乱选自由以下组成的组：炎性疾病、自身免疫疾病、感染性疾病、癌症、糖尿病、神经性疾病和抑郁症。
113.根据项目112所述的方法，其中所述IL-6相关紊乱选自由炎性疾病和自身免疫疾病组成的组。
114.根据项目113所述的方法，其中所述IL-6相关紊乱选自由以下组成的组:类风湿性关节炎(RA)、幼年RA、幼年特发性关节炎或全身性幼年特发性关节炎，脉管炎，银屑病性关节炎，银屑病，强直性脊柱炎，慢性炎症性肠疾病诸如克罗恩氏病和溃疡性结肠炎；格雷夫斯病，贝赛特氏病，葡萄膜炎，巨细胞动脉炎，多发性硬化症(MS)，全身性硬化症，全身性红斑狼疮(SLE)，多肌炎，风湿性多肌痛，哮喘，慢性阻塞性肺疾病(COPD)，复发性多软骨炎，胰腺炎，腹膜炎，肾炎，川崎病，干燥综合征和成人斯蒂尔病。
115.根据项目112所述的方法，其中所述IL-6相关紊乱为癌症，诸如选自由以下组成的组的癌症：结肠炎相关癌症、肾癌(renal cancer)、肾癌(kidney cancer)、前列腺癌、恶性淋巴细胞瘤、多发性骨髓瘤、卡斯尔曼病、乳腺癌和肺癌。
116.根据项目112所述的方法，其中所述IL-6相关紊乱选自以下：阿耳茨海默氏病、HIV、糖尿病、脓毒症、恶病质、骨髓增生异常综合征(MDS)、肝硬化、移植物抗宿主疾病、心肌梗死、子宫内膜异位和骨质疏松。
117.检测IL-6的方法，所述方法包括：提供疑似含有IL-6的样品，使所述样品与根据项目1-90中任一项所述的IL-6结合多肽、融合蛋白或缀合物或根据项目98-99中任一项所述的组合物接触，以及检测IL-6结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物的结合以指示IL-6在所述样品中的存在。
118.用于确定IL-6在受试者中存在的方法，所述方法包括以下步骤：
--使所述受试者、或从受试者分离的样品与根据项1-93中任一项所述的IL-6结合多肽、融合蛋白或缀合物或根据项目98-99中任一项所述的组合物接触，以及
-获得对应于已在所述受试者中或与所述样品结合的IL-6结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物的量的值。
119.根据项目118所述的方法，所述方法还包括将所述值与参照比较的步骤。
120.根据项目118或119所述的方法，其中所述受试者为哺乳动物受试者，诸如人类受试者。
121.根据项目118-120中任一项所述的方法，其中所述方法在体内进行。
122.根据项目118-120中任一项所述的方法，其中所述方法在体外进行。

Claims (17)

1.IL-6结合多肽，所述IL-6结合多肽包含IL-6结合基序BM，所述IL-6结合基序BM由选自以下的氨基酸序列组成：
i)EEX3X4AWX7EIHX11LPNLX16X17X18QX20X21AFIX25X26LX28X29
其中，彼此独立地，
X3选自A、F、H、K、Q、R、S、W和Y；
X4选自A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V和Y；
X7选自F、H、I、K、L、M、N、R、S、T、V、W和Y；
X11选自A、I、K、L、M、N、R、S、T和V；
X16选自N和T；
X17选自A、I、T和V；
X18选自D、E、G、H、K、N、Q、R、S和T；
X20选自I、L、M、R、T和V；
X21选自A、S、T和V；
X25选自I、M、Q、S、T、V和W；
X26选自K和S；
X28选自F、L、M和Y；并且
X29选自D和R；
和
ii)与在i)中定义的序列具有至少93％同一性的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的IL-6结合多肽，其中序列i)相应于选自由SEQ ID NO:1-1551组成的组，诸如选自由SEQ ID NO:1-14和SEQ ID NO:1512组成的组的序列中从位置8到位置36的序列，例如相应于SEQ ID NO:1512中从位置8至位置36的序列。
3.根据任一前述权利要求所述的IL-6结合多肽，其中所述IL-6结合基序形成三螺旋束蛋白结构域的一部分。
4.根据任一前述权利要求所述的IL-6结合多肽，所述IL-6结合多肽包含结合模块BMod，所述结合模块BMod的氨基酸序列选自以下：
iii)K-[BM]-DPSQSXaXbLLXcEAKKLXdXeXfQ；
其中
[BM]为如权利要求1-2的任一项中定义的IL-6结合基序，条件是X29为D；
Xa选自A和S；
Xb选自N和E；
Xc选自A、S和C；
Xd选自E、N和S；
Xe选自D、E和S；
Xf选自A和S；以及
iv)与由iii)定义的序列具有至少91％同一性的氨基酸序列。
5.根据任一前述权利要求所述的IL-6结合多肽，所述IL-6结合多肽包含选自以下的氨基酸序列：
xi)VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK；
其中[BM]为如权利要求1-2的任一项中定义的IL-6结合基序；以及
xii)与xi)中定义的序列具有至少89％同一性的氨基酸序列。
6.根据权利要求5所述的IL-6结合多肽，其中序列xi)选自由SEQ ID NO:1-1551组成的组，诸如选自由SEQ ID NO:1-14和SEQ ID NO:1512组成的组，例如SEQ ID NO:1512。
7.根据任一前述权利要求所述的IL-6结合多肽，所述IL-6结合多肽能够阻断经由顺式信号传导途径和/或反式信号传导途径的IL-6依赖性信号传导。
8.根据权利要求7所述的IL-6结合多肽，其中所述阻断的半最大抑制浓度为至多1x10- 6M，诸如至多1x10-7M，诸如至多1x10-8M，诸如至多1x10-9M，诸如至多1x10-10M。
9.根据权利要求7或8所述的IL-6结合多肽，所述IL-6结合多肽能够阻断IL-6/IL-6Rα与gp130的相互作用。
10.根据任一前述权利要求所述的IL-6结合多肽，所述IL-6结合多肽能够与IL-6结合，以使得所述相互作用的EC50值为至多1x10-7M，诸如至多1x10-8M，诸如至多1x10-9M，诸如至多1x10-10M，或以使得所述相互作用的KD值为至多1x10-8M，诸如至多1x10-9M，诸如至多1x10-10M。
11.融合蛋白或缀合物，所述融合蛋白或缀合物包含：
-第一部分，所述第一部分由根据任一前述权利要求所述的IL-6结合多肽组成；和
-第二部分，所述第二部分由具有期望的生物学活性的多肽组成。
12.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码根据权利要求1-10的任一项所述的多肽。
13.组合物，所述组合物包含根据权利要求1-11中任一项所述的IL-6结合多肽、融合蛋白或缀合物和至少一种药学上可接受的赋形剂或载体。
14.根据权利要求1-11中任一项所述的IL-6结合多肽、融合蛋白或缀合物或根据权利要求13所述的组合物，用于作为药物、诊断剂或预后剂使用。
15.根据权利要求14所述的用于使用的IL-6结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物，其中所述多肽、融合蛋白、缀合物或组合物体内调控IL-6功能。
16.根据权利要求14-15中任一项所述的用于使用的IL-6结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物，用于在IL-6相关紊乱的治疗、预后或诊断中使用。
17.根据权利要求16所述的用于使用的IL-6结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物，其中所述IL-6相关紊乱选自由以下组成的组：炎性疾病、自身免疫疾病、感染性疾病、癌症、糖尿病、神经性疾病和抑郁症，
例如选自由以下组成的组：类风湿性关节炎、幼年类风湿性关节炎、幼年特发性关节炎或全身性幼年特发性关节炎，脉管炎，银屑病性关节炎，银屑病，强直性脊柱炎，慢性炎症性肠疾病诸如克罗恩氏病和溃疡性结肠炎；格雷夫斯病，贝赛特氏病，葡萄膜炎，巨细胞动脉炎，多发性硬化症，全身性硬化症，全身性红斑狼疮，多肌炎，风湿性多肌痛，哮喘，慢性阻塞性肺疾病，复发性多软骨炎，胰腺炎，腹膜炎，肾炎，川崎病，干燥综合征和成人斯蒂尔病，或
例如选自由以下组成的组的癌症：结肠炎相关癌症、肾癌(renal cancer)、肾癌(kidney cancer)、前列腺癌、恶性淋巴细胞瘤、多发性骨髓瘤、卡斯尔曼病、乳腺癌和肺癌，或
例如选自以下：阿耳茨海默氏病、HIV、糖尿病、脓毒症、恶病质、骨髓增生异常综合征(MDS)、肝硬化、移植物抗宿主疾病、心肌梗死、子宫内膜异位和骨质疏松。
CN201580031621.9A 2014-06-13 2015-06-15 新型多肽 Active CN106488930B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP14172331 2014-06-13
EP14172331.2 2014-06-13
PCT/EP2015/063362 WO2015189430A1 (en) 2014-06-13 2015-06-15 New polypeptide

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106488930A true CN106488930A (zh) 2017-03-08
CN106488930B CN106488930B (zh) 2021-11-02

Family

ID=51063259

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201580031621.9A Active CN106488930B (zh) 2014-06-13 2015-06-15 新型多肽

Country Status (6)

Country Link
US (1) US10669314B2 (zh)
EP (1) EP3154563B1 (zh)
JP (2) JP7028557B2 (zh)
KR (1) KR102399024B1 (zh)
CN (1) CN106488930B (zh)
WO (1) WO2015189430A1 (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3154564B1 (en) 2014-06-13 2019-08-21 Affibody AB New polypeptide
UY37651A (es) 2017-03-31 2018-10-31 Swedish Orphan Biovitrum Ab Publ Polipéptido de unión al il-1r-i
KR102014056B1 (ko) * 2017-04-18 2019-08-27 앱클론(주) 단백질의 순도 및 항원에 대한 친화성이 향상된 폴리펩티드, 이의 항체 또는 항원 결합 단편과의 복합체, 및 이들의 제조방법
EP3765496A1 (en) * 2018-03-13 2021-01-20 Affibody AB Polypeptides based on a novel scaffold
WO2023152144A1 (en) 2022-02-08 2023-08-17 Affibody Ab Protein z variants binding thymic stromal lymphopoietin and their medical use

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6830894B1 (en) * 1998-11-03 2004-12-14 Adherex Technologies, Inc. Compounds and methods for modulating claudin-mediated functions
CN101273053A (zh) * 2005-07-13 2008-09-24 安进芒廷维尤公司 Il-6结合蛋白
WO2009077175A1 (en) * 2007-12-19 2009-06-25 Affibody Ab Polypeptide derived from protein a and able to bind pdgf
WO2011110515A1 (en) * 2010-03-08 2011-09-15 Affibody Ab Immunoglobulin g fc region binding polypeptide
WO2013126006A1 (en) * 2012-02-20 2013-08-29 Swedish Orphan Biovitrum Ab (Publ) Polypeptides binding to human complement c5
WO2014064237A1 (en) * 2012-10-25 2014-05-01 Affibody Ab Abd binding polypeptide

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL123815A (en) 1995-09-28 2007-05-15 Yeda Res & Dev Synthetic peptides that inhibit il-6 activity
US7820790B2 (en) * 2005-07-13 2010-10-26 Amgen Mountain View Inc. IL-6 binding proteins
EP2077272A1 (en) * 2007-12-21 2009-07-08 Affibody AB Polypeptide libraries with a predetermined scaffold
US9434944B2 (en) 2011-08-31 2016-09-06 University Of Zurich Modulators of miR-323-3p for the prevention or treatment of rheumatoid arthritis
WO2013083813A2 (en) 2011-12-07 2013-06-13 Universität Zürich Modulators of spermine/spermidine n'-acetyltransferase (ssat) and ssat associated proteins for use in prevention or treatment of rheumatoid arthritis
EP3154564B1 (en) * 2014-06-13 2019-08-21 Affibody AB New polypeptide

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6830894B1 (en) * 1998-11-03 2004-12-14 Adherex Technologies, Inc. Compounds and methods for modulating claudin-mediated functions
CN101273053A (zh) * 2005-07-13 2008-09-24 安进芒廷维尤公司 Il-6结合蛋白
WO2009077175A1 (en) * 2007-12-19 2009-06-25 Affibody Ab Polypeptide derived from protein a and able to bind pdgf
WO2011110515A1 (en) * 2010-03-08 2011-09-15 Affibody Ab Immunoglobulin g fc region binding polypeptide
WO2013126006A1 (en) * 2012-02-20 2013-08-29 Swedish Orphan Biovitrum Ab (Publ) Polypeptides binding to human complement c5
WO2014064237A1 (en) * 2012-10-25 2014-05-01 Affibody Ab Abd binding polypeptide

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NYGREN PER-AKE: "Alternative binding proteins: affibody binding proteins developed from a small three-helix bundle scaffold", 《FEBS JOURNAL》 *
TERUAKI KOBAYASHI ET AL.: "In vitro selection of a peptide inhibitor of human IL-6 using mRNA display", 《MOLECULAR BIOTECHNOLOGY》 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2015189430A1 (en) 2015-12-17
JP7028557B2 (ja) 2022-03-02
US20170114099A1 (en) 2017-04-27
KR20170018888A (ko) 2017-02-20
CN106488930B (zh) 2021-11-02
EP3154563B1 (en) 2019-08-14
US10669314B2 (en) 2020-06-02
KR102399024B1 (ko) 2022-05-17
EP3154563A1 (en) 2017-04-19
JP2020203909A (ja) 2020-12-24
JP2017522864A (ja) 2017-08-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110144009B (zh) Cd47单域抗体及其用途
CN103154023B (zh) 铁调素的结合蛋白
CN106488930A (zh) 新型多肽
JP7208963B2 (ja) Ｉｌ－１７ａ結合ポリペプチド
KR20200033306A (ko) 생체 내 내성이 높은 항체 약물 결합체
WO2022001864A1 (zh) 一种抗体-药物偶联物，其制备方法及应用
CN106536567A (zh) 新型多肽
UA125111C2 (uk) Високоафінне і агрегаційно стабільне антитіло на основі варіабельного домену vl та похідного vhh
WO2021113740A1 (en) Compositions and methods for reducing off-target toxicity of antibody drug conjugates
CN117186224B (zh) 抗cd40抗体
WO2023206242A1 (zh) 无钩状效应的抗人cd73单克隆抗体
CN117186223A (zh) 抗pd-l1抗体及编码其的核酸、制备方法和应用
CA2970857A1 (en) Anti-cxcl12 antibody molecules and their uses
CN117820475A (zh) 针对il-17a的新型纳米抗体、药物、制备、方法及应用
CN117186224A (zh) 抗cd40抗体
CN117843782A (zh) 靶向人lilrb4的纳米抗体及其应用
CN117186226A (zh) 抗cd38纳米抗体及其应用
CN114380913A (zh) 一种全人源抗pd-l1抗体及其应用
CN117264065A (zh) 一种her2抗原结合分子及其应用
CN116410313A (zh) Cd30人源化鼠单抗开发
CN115894696A (zh) 抗ptk7单域抗体及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant