KR20170018888A

KR20170018888A - 신규 폴리펩티드

Info

Publication number: KR20170018888A
Application number: KR1020177000422A
Authority: KR
Inventors: 프레드릭 프리지드; 엘린 군네리우슨; 잉마리에 호이든-구텐버그; 페르-오케 니그렌; 수잔 클린트; 페이판 유
Original assignee: 애피바디 에이비
Priority date: 2014-06-13
Filing date: 2015-06-15
Publication date: 2017-02-20
Also published as: EP3154563B1; JP2020203909A; EP3154563A1; WO2015189430A1; US20170114099A1; US10669314B2; CN106488930A; JP7028557B2; CN106488930B; JP2017522864A; KR102399024B1

Abstract

본 개시내용은 인터류킨-6에 대하여 결합 친화도를 가지는 한 부류의 조작된 폴리펩티드에 관한 것이고, 서열 EEX₃X₄AWX₇EIH X₁₁LPNLX₁₆X₁₇X₁₈QX₂₀ X₂₁AFIX₂₅X₂₆LX₂₈X₂₉를 포함하는 IL-6 결합 폴리펩티드를 제공한다. 본 개시내용은 또한 치료제, 예후제, 및/또는 진단제로서의 상기 IL-6 결합 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다.

Description

신규 폴리펩티드 {NEW POLYPEPTIDE}

본 개시내용은 인터류킨-6 (이하, IL-6으로 지칭)에 대하여 결합 친화도를 가지는 한 부류의 조작된 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 치료제, 예후제, 및/또는 진단제로서의 상기 IL-6 결합 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다.

염증은 예를 들어, 병원체 및 손상된 세포를 파괴시키는, 선천성 면역계에 의한 시토카인으로 구동되는 반응이다. 일부 질환 병태, 예컨대, 류머티스성 관절염 (RA) 및 크론병에서, 염증계 조절은 손상되어 있고, 이로써, 조직 손상이 유도된다. 가장 많은 연구가 이루어진 염증 유도 인자들 중에 시토카인 인터류킨-6 (IL-6) 및 종양 괴사 인자 (TNF)가 있다. IL-6은 또한 B 세포 자극성 인자 2 (BSF2), 간세포 자극 인자 (HSF), 하이브리도마 성장 인자 (HGF) 및 인터페론-베타 2 (IFNB2)로도 알려져 있다.

인간 IL-6은 184개의 아미노산으로 구성된 단일 폴리펩티드 쇄로 이루어져 있고, 분자량은 21 kDa이지만, 가변적인 글리코실화 패턴에 기인하여 크기는 21-26 kDa으로 달라질 수 있다. IL-6은 T 세포, B 세포, 단핵구, 섬유모세포, 간세포, 내피 세포 및 각질세포를 비롯한, 매우 다양한 세포 유형에 의해 분비된다. 하류 신호전달은 급성 염증으로부터 후천성 면역 또는 만성 염증성 질환으로의 이행을 유도한다. IL-6 신호전달 및 그의 조절은 복잡하며, 이는 다수의 인자 및 기전을 포함한다. IL-6 신호전달은 시스-신호전달 경로로도 알려져 있는 고전적 IL-6 신호전달 경로를 통해, 또는 트랜스-신호전달 경로를 통해 발생할 수 있다. 고전적 IL-6 신호전달 경로에서, 순환 IL-6은 막 결합 IL-6 수용체 α (IL-6Rα)에 결합한 후, 이어서, 막 부착 gp130 보조-수용체를 동원하여 3성분 복합체를 형성하게 된다. 이어서 상기 복합체는 제2의 인접한 3성분 복합체와 이량체화되어 gp130 모이어티를 통한 신호 전달을 이끈다 (문헌 [Boulanger et al., 2003, Science 300(5628): 2101-2104]). 순환시, IL-6은 또한 IL-6Ra의 가용성 엑토도메인에 결합된 상태로도 존재할 수 있다. 상기 복합체는, 보조-수용체 gp130은 발현하지만, IL-6Rα는 없는 임의 세포의 IL-6 의존적 활성화를 포함하는 트랜스-신호전달 기전을 담당한다 (문헌 [Chalaris et al., 2011, Eur J Cell Biol 90(6-7): 484-494]; [Assier et al., 2010, Joint Bone Spine 77(6):532-6]). 트랜스-신호전달, 또는 염증 유발성 경로는 질환 병태와 가장 관련된 경로이며, 차단하는 것이 가장 바람직한 것으로 제안되어 왔다. 그에 반해, 고전적 신호전달 경로는 중요한 항-염증성 및 재생 과정을 담당하는 것으로 간주된다 (문헌 [Scheller et al., 2011, Biochim Biophys Acta 1813(5): 878-888]).

항-IL-6Rα 항체 토실리주맙 (악템라(Actemra)®)은 IL-6 관련 장애를 위한 임상적 용도로 승인을 받았다. 상이한 IL-6 유발 경로를 다루기 위해 다른 약물 후보 물질 또한 개발 중에 있다. 이러한 약물 후보 물질로는 IL-6 시토카인 그 자체에 결합하는, 항체 CNTO136 (시루쿠맙) (문헌 [Xu et al., 2011, Br J Clin Pharmacol 72(2): 270-281]; [Zhuang et al., 2013, Int J Clin Pharmacol Ther 51(3): 187-199) 및 MEDI5117 (문헌 [Finch et al., 2011, J Mol Biol 411(4): 791-807])을 포함한다. 추가로, 트랜스-신호전달 경로를 선택적으로 차단시키는 것을 목적으로 하는 gp130-Fc 융합 CR5/18이 개발 중에 있다 (문헌 [Kopf et al., 2010, Nat Rev Drug Discov 9(9): 703-718]; [Chalaris et al., 2012, Dig Dis 30(5): 492-499]).

염증성 질환의 예측할 수 없는 만성 성질 뿐만 아니라, 고도로 충족되지 못한 의학적 요구가 새로운 치료 방식 개발을 정당화한다. 조직 투과율은 분자 크기와 음의 연관성을 가지고 있기 때문에, 비교적 큰 항체 분자는 내재적으로 불충분한 조직 분포 및 투과 능력을 가진다.

따라서, 모노클로날 항체를 사용하는 것이 항상 최적의 요법이 되는 것은 아니며, IL-6에 높은 친화력을 갖는 제제(agent)를 제공하는 것이 지속적으로 요구된다. IL-6 관련 장애의 치료, 진단 및 예후에서 상기 분자를 사용하는 것 또는 큰 관심의 대상이 된다.

본 개시내용의 목적은 예를 들어, 치료적, 예후적 및 진단적 적용을 위해 사용될 수 있는 새로운 IL-6 결합 작용제를 제공하고자 하는 것이다.

본 개시내용의 목적은 현행 요법의 상기 언급된 단점 및 다른 단점을 완화시키면서, 다양한 형태의 염증성 및 자가면역 질환을 표적화하는 효율적인 요법을 허용하는 분자를 제공하고자 하는 것이다.

추가로, 본 개시내용의 목적은 예후적 및 진단적 적용에 적합한 분자를 제공하고자 하는 것이다.

당업자에게 본 개시내용으로부터 자명해지는 본 목적 및 다른 목적은 첨부된 특허청구범위에서 청구되는 바와 같고, 본원에서 일반적으로 개시되는 바와 같은 본 발명의 상이한 측면에 의해 충족된다.

따라서, 본 개시내용의 제1 측면에서, IL-6 결합 모티프 BM을 포함하는 IL-6 결합 폴리펩티드로서, 상기 모티프는

i) EEX₃X₄AWX₇EIHX₁₁LPNLX₁₆X₁₇X₁₈QX₂₀X₂₁AFIX₂₅X₂₆LX₂₈X₂₉

상기 식에서, 서로 독립적으로,

X₃은 A, F, H, K, Q, R, S, W 및 Y로부터 선택되고;

X₄는 A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V 및 Y로부터 선택되고;

X₇은 F, H, I, K, L, M, N, R, S, T, V, W 및 Y로부터 선택되고;

X₁₁은 A, I, K, L, M, N, R, S, T 및 V로부터 선택되고;

X₁₆은 N 및 T로부터 선택되고;

X₁₇은 A, I, T 및 V로부터 선택되고;

X₁₈은 D, E, G, H, K, N, Q, R, S 및 T로부터 선택되고;

X₂₀은 I, L, M, R, T 및 V로부터 선택되고;

X₂₁은 A, S, T 및 V로부터 선택되고;

X₂₅는 I, M, Q, S, T, V 및 W로부터 선택되고;

X₂₆은 K 및 S로부터 선택되고;

X₂₈은 F, L, M 및 Y로부터 선택되고;

X₂₉는 D 및 R로부터 선택되는 것; 및

ii) i)에서 정의된 서열과 93% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 것인, IL-6 결합 폴리펩티드를 제공한다.

IL-6 결합 폴리펩티드 관련 서열 부류에 관한 상기 정의는 수개의 상이한 선별 실험에서 IL-6과 그의 상호작용에 대해 선별된, 모체 스캐폴드의 무작위 폴리펩티드의 변이체 다수에 관한 통계학적 분석에 기초한 것이다. 확인된 IL-6 결합 모티프, 또는 "BM"은 모체 스캐폴드의 표적 결합 영역에 상응하는 것으로, 이 영역은 3-나선 다발 단백질 도메인 내에서 2개의 알파 나선으로 구성된다. 모체 스캐폴드에서, 두 BM 나선의 다양한 아미노산 잔기가 항체의 불변 Fc 부분과 상호작용하기 위한 결합 표면을 구성한다. 본 개시내용에서, 결합 표면 잔기의 무작위 변이 및 후속되는 변이체 선별을 통해서 Fc 상호작용 능력은 IL-6과 상호작용할 수 있는 능력으로 대체된다.

당업자가 이해하는 바와 같이, 임의의 폴리펩티드의 기능, 예컨대, 본 개시내용의 폴리펩티드의 IL-6 결합 능력은 폴리펩티드의 3차 구조에 의존한다. 그러므로, 폴리펩티드의 기능에는 영향을 주지 않으면서, 그 중의 아미노산 서열을 최소로 변이시킬 수 있다. 그러므로, 본 개시내용은 IL-6 결합 특징을 보유하는, IL-6 결합 폴리펩티드의 변형된 변이체를 포함한다.

이러한 방식으로, i)에서 정의된 폴리펩티드와 93% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 IL-6 결합 폴리펩티드 또한 본 개시내용에 포함된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 i)에서 정의된 폴리펩티드와 96% 이상 동일한 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 특정 기능성 군의 아미노산 잔기 (예컨대, 소수성, 친수성, 극성 등)에 속하는 아미노산 잔기는 동일한 기능성 군의 또 다른 아미노산 잔기 대신으로 교환될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같이, 상기와 같은 변이는 IL-6 결합 폴리펩티드 서열의 임의의 위치에서 이루어질 수 있다. 다른 실시양태에서, 상기와 같은 변이는 스캐폴드 아미노산 잔기로도 지칭되는 비가변 위치에서만 오직 이루어질 수 있다. 상기와 같은 경우에, 가변 위치, 즉, 서열 i)에서 "X"로 표시된 위치에서는 허용되지 않는다.

본 명세서 전역에 걸쳐 사용되는 바, "동일성(%)"이라는 용어는 예를 들어, 하기와 같이 계산될 수 있다. CLUSTAL W 알고리즘을 사용하여 표적 서열에 대해 질의 서열(query sequence)을 정렬한다 (문헌 [Thompson et al, Nucleic Acids Research, 22: 4673-4680 (1994)]). 정렬된 서열 중 가장 짧은 서열에 상응하는 윈도우에 걸쳐 비교가 이루어진다. 일부 경우에서, 정렬된 서열 중 가장 짧은 서열이 표적 서열일 수 있다. 다른 경우에서, 질의 서열은 정렬된 서열 중 가장 짧은 서열로 구성될 수 있다. 각 위치의 아미노산 잔기를 비교하고, 표적 서열에서 동일하게 상응하는 질의 서열 중의 위치의 백분율(%)을 동일성(%)으로서 기록한다.

본원에서 사용되는 바, "X_n" 및 "X_m"은 상기 정의된 바와 같은 서열 i)에서 n 및 m번째 위치의 아미노산을 나타내는 데 사용되며, 여기서, n 및 m은 상기 서열의 N 말단 단부로부터 계수되는, 상기 서열 내의 아미노산의 위치를 나타내는 정수이다. 예를 들어, X₃및X₇은 각각 서열 i)의 N 말단 단부로부터 3번 및 7번 위치의 아미노산을 나타낸다.

제1 측면에 따른 실시양태에서, 서열 i)에서 X_n이 독립적으로 하기 표 1에 따른 가능한 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 폴리펩티드를 제공한다. 당업자는 X_n이 열거된 가능한 잔기 군들 중 어느 하나로부터 선택될 수 있고, 이러한 선택은 X_m에서의 아미노산 선택과는 독립적이며, 여기서, n≠m이라는 것을 이해할 것이다. 따라서, 표 1에서 위치 X_n에서의 열거된 가능한 잔기 중 임의의 것은 표 1에서 임의의 다른 변수 위치의 열거된 가능한 잔기 중 임의의 것과 독립적으로 조합될 수 있다.

표 1은 하기와 같이 판독되어야 한다는 것을 당업자는 이해할 것이다: 제1 측면에 따른 한 실시양태에서, 서열 i) 중의 아미노산 잔기 "X_n"이 "가능한 잔기"로부터 선택되는 것인 폴리펩티드를 제공한다. 따라서, 표 1은 본 개시내용의 제1 측면의 수개의 구체적이고, 개별화된 실시양태를 개시한다. 예를 들어, 제1 측면에 따른 한 실시양태에서, 서열 i) 중의 X₃이 A, H, K, Q, R 및 Y로부터 선택되는 폴리펩티드를 제공하고, 제1 측면에 따른 또 다른 실시양태에서, 서열 i) 중의 X₃이 A, K, Q, R 및 Y로부터 선택되는 폴리펩티드를 제공한다. 의심의 여지를 없애기 위하여, 열거된 실시양태는 추가의 다른 실시양태에서 자유롭게 조합될 수 있다. 예를 들어, 상기의 한 조합된 실시양태는 X₃이 A, K, R 및 Y로부터 선택되고, 동시에, X₄가 H 및 K로부터 선택되고, X₁₁이 A, I, L 및 T로부터 선택되는 것인 폴리펩티드이다.

제1 측면에 따른 한 특정 실시양태에서,

서열 i)에서

X₃은 A, H, K, Q, R 및 Y로부터 선택되고;

X₇은 F, H, I, K, L, M, N, R, T, V, W 및 Y로부터 선택되고;

X₁₁은 A, I, K, L, N, S, T 및 V로부터 선택되고;

X₁₆은 T이고;

X₁₇은 A, I, T 및 V로부터 선택되고;

X₁₈은 D, E, H, K, N, Q, R, S 및 T로부터 선택되고;

X₂₀은 I, L, M, R 및 V로부터 선택되고;

X₂₁은 A, S 및 V로부터 선택되고;

X₂₅는 I, Q, S, T, V 및 W로부터 선택되고;

X₂₆은 K이고,

X₂₈은 F, L, M 및 Y로부터 선택되고;

X₂₉는 D인 것인, 폴리펩티드를 제공한다.

IL-6 결합 폴리펩티드의 서브부류를 정의하는 더욱 구체적인 실시양태에서, 서열 i)은 하기 11개의 조건 I-XI 중 6개 이상을 충족시킨다:

I. X₃은 K 및 R로부터 선택되고;

II. X₁₁은 A 및 L로부터 선택되고;

III. X₁₆은 T이고;

IV. X₁₇은 I 및 V로부터 선택되고;

V. X₁₈은 D 및 E로부터 선택되고;

VI. X₂₀은 M이고;

VII. X₂₁은 A이고;

VIII. X₂₅는 S 및 T로부터 선택되고;

IX. X₂₆은 K이고;

X. X₂₈은 F이고;

XI. X₂₉는 D이다.

제1 측면에 따른 IL-6 결합 폴리펩티드의 일부 예에서, 서열 i)은 11개의 조건 I-XI 중 7개 이상을 충족시킨다. 더욱 구체적으로, 서열 i)은 11개의 조건 I-XI 중 8개 이상, 예컨대, 11개의 조건 I-XI 중 9개 이상, 예컨대, 11개의 조건 I-XI 중 10개 이상, 예컨대, 11개의 조건 I-XI 모두를 충족시킬 수 있다.

제1 측면에 따른 IL-6 결합 폴리펩티드의 일부 실시양태에서, X₁₇X₂₀X₂₁이 VMA 및 IMA로부터 선택되는 것인, IL-6 결합 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, X₂₀X₂₁X₂₈은 MAF이다. 일부 실시양태에서, X₁₇X₂₀X₂₈은 VMF 및 IMF로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, X₁₇X₂₁X₂₈은 VAF 및 IAF로부터 선택된다.

하기 실험 섹션에서 상세하게 기술되는 바와 같이, IL-6 결합 폴리펩티드 변이체 선별을 통해 다수의 개별 IL-6 결합 모티프 (BM) 서열을 확인할 수 있었다. 이들 서열이 상기 측면에 따른 서열 i)의 개별 실시양태를 구성한다. 개별 IL-6 결합 모티프의 서열은 도 1에 제시된 서열번호 1-1551의 아미노산 위치 8-36에 상응한다. 그러므로, 본 측면에 따른 IL-6 결합 폴리펩티드의 한 실시양태에서, 서열 i)은 서열번호 1-1551로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 8번 위치에서부터 36번 위치까지의 서열에 상응한다. 한 실시양태에서, 서열 i)은 서열번호 1-1502로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 8번 위치에서부터 36번 위치까지의 서열에 상응한다. 한 실시양태에서, 서열 i)은 서열번호 7, 서열번호 15-89 및 서열번호 151-871로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 8번 위치에서부터 36번 위치까지의 서열에 상응한다. 한 실시양태에서, 서열 i)은 서열번호 1-6, 서열번호 8-14, 서열번호 90-150 및 서열번호 872-1502로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 8번 위치에서부터 36번 위치까지의 서열에 상응한다. 한 실시양태에서, 서열 i)은 서열번호 1-152 및 서열번호 1503-1515로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 8번 위치에서부터 36번 위치까지의 서열에 상응한다. 한 실시양태에서, 서열 i)은 서열번호 1-150 및 서열번호 1503-1515로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 8번 위치에서부터 36번 위치까지의 서열에 상응한다. 한 실시양태에서, 서열 i)은 서열번호 1-152로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 8번 위치에서부터 36번 위치까지의 서열에 상응한다. 또 다른 실시양태에서, 서열 i)은 서열번호 1-150으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 8번 위치에서부터 36번 위치까지의 서열에 상응한다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 서열 i)은 서열번호 7, 서열번호 15-89 및 서열번호 151-152로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 8번 위치에서부터 36번 위치까지의 서열에 상응한다. 한 실시양태에서, 서열 i)은 서열번호 1-6, 서열번호 8-14 및 서열번호 90-150으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 8번 위치에서부터 36번 위치까지의 서열에 상응한다. 한 실시양태에서, 서열 i)은 서열번호 1-14 및 서열번호 1503-1515로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 8번 위치에서부터 36번 위치까지의 서열에 상응한다. 한 실시양태에서, 서열 i)은 서열번호 1-14 및 서열번호 1512로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 8번 위치에서부터 36번 위치까지의 서열에 상응한다. 한 실시양태에서, 서열 i)은 서열번호 1-14로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 8번 위치에서부터 36번 위치까지의 서열에 상응한다. 한 실시양태에서, 서열 i)은 서열번호 1-5로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 8번 위치에서부터 36번 위치까지의 서열에 상응한다. 한 실시양태에서, 서열 i)은 서열번호 1512 중 8번 위치에서부터 36번 위치까지의 서열에 상응한다. 구체적인 개별 실시양태에서, 서열 i)은 개별적으로 서열번호 1-14 중 어느 하나 중 8번 위치에서부터 36번 위치까지의 서열에 상응한다.

본 개시내용의 일부 실시양태에서, 상기 정의된 바와 같은 BM은 3-나선 다발 단백질 도메인"의 부분을 형성한다." BM의 서열은 BM이 원래의 도메인에서 유사한 구조적 모티브를 대체하도록, 원래의 3-나선 다발 도메인의 서열에 "삽입"되거나 "이식"된다는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, 이론에 의해 제한받지 않고자 하면서, BM은 임의의 3-나선 다발의 3개의 나선 중 2개로 구성되는 것으로 간주되며, 따라서, 임의의 3-나선 다발 내에서 상기 2 나선 모티브를 대체할 수 있다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 2개의 BM 나선에 의한 3-나선 다발 도메인 중 2개의 나선 대체는 폴리펩티드의 기본 구조에 영향을 주지 않도록 수행되어야 한다. 즉, 본 발명의 상기 실시양태에 따른 폴리펩티드의 Cα 백본의 전체 폴딩은, 예컨대, 2차 구조의 동일한 요소를 동일한 순서로 가지는 것 등과 같이, 부분을 형성하는 3-나선 다발 단백질 도메인과 실질적으로 동일하다. 따라서, 본 측면의 상기 실시양태에 따른 폴리펩티드가 원래의 도메인과 동일한 폴드를 가지는 경우, 본 개시내용에 따른 BM은 3-나선 다발 도메인의 "부분을 형성"하고, 이는 예컨대, 유사한 CD 스펙트럼을 초래하는 특성과 같은 기본 구조적 특성을 공유한다는 것을 암시한다. 당업자는 관련된 다른 파라미터를 알고 있다.

특정 실시양태에서, 따라서, IL-6 결합 모티프 (BM)는 3-나선 다발 도메인의 부분을 형성한다. 예를 들어, BM은 본질적으로 상기 3-나선 다발 단백질 도메인 내에 서로 연결하는 루프와 함께 2개의 알파 나선으로 구성될 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 3-나선 다발 단백질 도메인은 박테리아 수용체 단백질의 도메인으로부터 선택된다. 상기 도메인의 비제한적인 예로는 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터의 단백질 A의 5가지의 상이한 3-나선 도메인, 예컨대, 도메인 B 및 그의 유도체가 있다. 일부 실시양태에서, 3-나선 다발 단백질 도메인은 스타필로코쿠스 단백질 A의 도메인 B로부터 유래된 단백질 Z의 변이체이다.

본원에 개시된 IL-6 결합 폴리펩티드가 3-나선 다발 단백질 도메인의 부분을 형성하는 것인 일부 실시양태에서, IL-6 결합 폴리펩티드는 결합 모듈 (BMod)을 포함할 수 있고, 그의 아미노산 서열은 하기로부터 선택된다:

iii) K-[BM]-DPSQSX_aX_bLLX_cEAKKLX_dX_eX_fQ;

상기 식에서,

[BM]은 본원에서 정의된 IL-6 결합 모티프이되, 단, X₂₉는 D이고;

X_a는 A 및 S로부터 선택되고;

X_b는 N 및 E로부터 선택되고;

X_c는 A, S 및 C로부터 선택되고;

X_d는 E, N 및 S로부터 선택되고;

X_e는 D, E 및 S로부터 선택되고;

X_f는 A 및 S로부터 선택되는 것; 및

iv) iii)에 의해 정의된 서열과 91% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열.

일부 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 생산 및 보관 동안 그 뿐만 아니라, 생체내에서 높은 구조적 안정성, 예컨대, 이성체화에 대한, 화학적 변형에 대한, 물리적 조건에서의 변화에 대한 및 단백질 분해에 대한 저항성을 보이는 것이 유익할 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 IL-6 결합 폴리펩티드가 3-나선 다발 단백질 도메인의 부분을 형성하는 것인 다른 실시양태에서, IL-6 결합 폴리펩티드는 결합 모듈 (BMod)을 포함할 수 있고, 그의 아미노산 서열은 하기로부터 선택된다:

v) K-[BM]-QPEQSX_aX_bLLX_cEAKKLX_dX_eX_fQ,

상기 식에서,

[BM]은 본원에서 정의된 IL-6 결합 모티프이되, 단, X₂₉는 R이고;

X_a는 A 및 S로부터 선택되고;

X_b는 N 및 E로부터 선택되고;

X_c는 A, S 및 C로부터 선택되고;

X_d는 E, N 및 S로부터 선택되고;

X_e는 D, E 및 S로부터 선택되고;

X_f는 A 및 S로부터 선택되는 것; 및

vi) v)에 의해 정의된 서열과 91% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열.

상기 논의된 바와 같이, 상기 아미노산 서열과 비교하여, 폴리펩티드의 3차 구조 및 기능에 크게 영향을 미치지 않는 최소의 변화를 포함하는 폴리펩티드 또한 본 개시내용의 범주 내에 포함된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 서열 iv) 및 vi)은 각각 iii) 및 v)에서 정의된 서열과 93% 이상, 예컨대, 95% 이상, 예컨대, 97% 이상의 동일성을 가진다.

한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서 X_a는 A이다.

한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서 X_a는 S이다.

한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서 X_b는 N이다.

한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서 X_b는 E이다.

한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서 X_c는 A이다.

한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서 X_c는 S이다.

한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서 X_c는 C이다.

한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서 X_d는 E이다.

한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서 X_d는 N이다.

한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서 X_d는 S이다.

한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서 X_e는 D이다.

한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서 X_e는 E이다.

한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서 X_e는 S이다.

한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서 X_dX_e는 EE, ES, SE, SD 및 SS로부터 선택된다.

한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서 X_dX_e는 ES이다.

한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서 X_dX_e는 SE이다.

한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서 X_dX_e는 SD이다.

한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서 X_f는 A이다.

한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서 X_f는 S이다.

한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서, X_a는 A이고; X_b는 N이고; X_c는 A이고, X_f는 A이다.

한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서, X_a는 A이고; X_b는 N이고; X_c는 C이고, X_f는 A이다.

한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서, X_a는 S이고; X_b는 E이고; X_c는 S이고, X_f는 S이다.

한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서, X_a는 S이고; X_b는 E이고; X_c는 C이고, X_f는 S이다.

한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서, X_a는 A이고; X_b는 N이고; X_c는 A이고; X_dX_e는 ND이고, X_f는 A이다.

한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서, X_a는 A이고; X_b는 N이고; X_c는 C이고; X_dX_e는 ND이고, X_f는 A이다.

한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서, X_a는 S이고; X_b는 E이고; X_c는 S이고; X_dX_e는 ND이고, X_f는 S이다.

한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서, X_a는 S이고; X_b는 E이고; X_c는 C이고; X_dX_e는 ND이고, X_f는 S이다.

한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서, X_a는 A이고; X_b는 N이고; X_c는 A이고; X_dX_e는 SE이고, X_f는 A이다.

한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서, X_a는 A이고; X_b는 N이고; X_c는 C이고; X_dX_e는 SE이고, X_f는 A이다.

한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서, X_a는 S이고; X_b는 E이고; X_c는 S이고; X_dX_e는 SE이고, X_f는 S이다.

한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서, X_a는 S이고; X_b는 E이고; X_c는 C이고; X_dX_e는 SE이고, X_f는 S이다.

한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서, X_a는 A이고; X_b는 N이고; X_c는 A이고; X_dX_e는 SD이고, X_f는 A이다.

한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서, X_a는 A이고; X_b는 N이고; X_c는 C이고; X_dX_e는 SD이고, X_f는 A이다.

한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서, X_a는 S이고; X_b는 E이고; X_c는 S이고; X_dX_e는 SD이고, X_f는 S이다.

한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서, X_a는 S이고; X_b는 E이고; X_c는 C이고; X_dX_e는 SD이고, X_f는 S이다.

한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서, X_a는 A이고; X_b는 N이고; X_c는 A이고; X_dX_e는 ES이고, X_f는 A이다.

한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서, X_a는 A이고; X_b는 N이고; X_c는 C이고; X_dX_e는 ES이고, X_f는 A이다.

한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서, X_a는 S이고; X_b는 E이고; X_c는 S이고; X_dX_e는 ES이고, X_f는 S이다.

한 실시양태에서, 서열 iii) 또는 v)에서, X_a는 S이고; X_b는 E이고; X_c는 C이고; X_dX_e는 ES이고, X_f는 S이다.

추가의 다른 실시양태에서, 서열 iii)은 도 1에 제시된 서열번호 1-1551로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 7번 위치에서부터 55번 위치까지의 서열에 상응한다. 또 다른 실시양태에서, 서열 iii)은 서열번호 1-1502로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 7번 위치에서부터 55번 위치까지의 서열에 상응한다. 한 실시양태에서, 서열 iii)은 서열번호 7, 서열번호 15-89 및 서열번호 151-871로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 7번 위치에서부터 55번 위치까지의 서열에 상응한다. 한 실시양태에서, 서열 iii)은 서열번호 1-6, 서열번호 8-14, 서열번호 90-150 및 서열번호 872-1502로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 7번 위치에서부터 55번 위치까지의 서열에 상응한다. 한 실시양태에서, 서열 iii)은 서열번호 1-152 및 서열번호 1503-1515로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 7번 위치에서부터 55번 위치까지의 서열에 상응한다. 한 실시양태에서, 서열 iii)은 서열번호 1-150 및 서열번호 1503-1515로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 7번 위치에서부터 55번 위치까지의 서열에 상응한다. 한 실시양태에서, 서열 iii)은 서열번호 1-152로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 7번 위치에서부터 55번 위치까지의 서열에 상응한다. 또 다른 실시양태에서, 서열 iii)은 서열번호 1-150로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 7번 위치에서부터 55번 위치까지의 서열에 상응한다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 서열 iii)은 서열번호 7, 서열번호 15-89 및 서열번호 151-152로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 7번 위치에서부터 55번 위치까지의 서열에 상응한다. 한 실시양태에서, 서열 iii)은 서열번호 1-6, 서열번호 8-14 및 서열번호 90-150로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 7번 위치에서부터 55번 위치까지의 서열에 상응한다. 한 실시양태에서, 서열 iii)은 서열번호 1-14 및 서열번호 1503-1515로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 7번 위치에서부터 55번 위치까지의 서열에 상응한다. 한 실시양태에서, 서열 iii)은 서열번호 1-14 및 서열번호 1512로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 7번 위치에서부터 55번 위치까지의 서열에 상응한다. 한 실시양태에서, 서열 iii)은 서열번호 1-14로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 7번 위치에서부터 55번 위치까지의 서열에 상응한다. 한 실시양태에서, 서열 iii)은 서열번호 1-5로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 7번 위치에서부터 55번 위치까지의 서열에 상응한다. 한 실시양태에서, 서열 iii)은 서열번호 1512의 서열 중 7번 위치에서부터 55번 위치까지의 서열에 상응한다. 구체적인 개별 실시양태에서, 서열 iii)은 개별적으로 서열번호 1-14 중 어느 하나에서 7번 위치에서부터 55번 위치까지의 서열에 상응한다.

또한, 추가의 실시양태에서,

vii) YA-[ BMod ]-AP;

상기 식에서, [ BMod ]는 상기 정의된 바와 같은 IL-6 결합 모듈인 것이고;

viii) vii)에서 정의된 서열과 90% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, IL-6 결합 폴리펩티드를 제공한다.

대안적으로,

ix) FN-[ BMod ]-AP;

x) ix)에서 정의된 서열과 90% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, IL-6 결합 폴리펩티드를 제공한다.

상기 논의된 바와 같이, 상기 아미노산 서열과 비교하여, 폴리펩티드의 3차 구조 및 기능에 크게 영향을 미치지 않는 최소의 변화를 포함하는 폴리펩티드 또한 본 개시내용의 범주 내에 포함된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 서열 viii) 및 x)은 각각 vii) 및 ix)에서 정의된 서열과 예를 들어, 92% 이상, 예컨대, 94% 이상, 예컨대, 96% 이상, 예컨대, 98% 이상 동일할 수 있다.

일부 실시양태에서, IL-6 결합 모티프는

ADNNFNK-[BM]-DPSQSANLLSEAKKLNESQAPK;

ADNKFNK-[BM]-DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK;

ADNKFNK-[BM]-DPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK;

ADAQQNNFNK-[BM]-DPSQSTNVLGEAKKLNESQAPK;

AQHDE-[BM]-DPSQSANVLGEAQKLNDSQAPK;

VDNKFNK-[BM]-DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK;

AEAKYAK-[BM]-DPSESSELLSEAKKLNKSQAPK;

VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNDAQAPK;

VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNDSQAPK;

AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;

AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK;

AEAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLSESQAPK;

AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLESSQAPK;

AEAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLESSQAPK;

VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;

VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK;

VDAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLSESQAPK;

VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLESSQAPK;

VDAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLESSQAPK;

VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNKAQAPK; 및

AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNKAQAPK

(상기 식에서, [BM]은 상기 정의된 IL-6 결합 모티프이다)로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 부분을 형성할 수 있다.

한 실시양태에서, IL-6 결합 폴리펩티드는

xi) VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;

상기 식에서, [BM]은 상기 정의된 IL-6 결합 모티프인 것; 및

xii) xi)에서 정의된 서열과 89% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, IL-6 결합 폴리펩티드는

xiii) AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;

상기 식에서, [BM]은 상기 정의된 IL-6 결합 모티프인 것; 및

xiv) xiii)에 의해 정의된 서열과 89% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.

또한 다시, 상기 논의된 바와 같이, 상기 아미노산 서열과 비교하여, 폴리펩티드의 3차 구조 및 기능에 크게 영향을 미치지 않는 최소의 변화를 포함하는 폴리펩티드 또한 본 개시내용의 범주 내에 포함된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 서열 xii) 및 xiv)는 각각 xi) 및 xiii)에 의해 정의된 서열과 예를 들어, 91% 이상, 예컨대, 93% 이상, 예컨대, 94% 이상, 예컨대, 96% 이상, 예컨대, 98% 이상 동일할 수 있다.

상기 폴리펩티드 중 서열 xi)은 서열번호 1-1551로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 서열 xi)은 서열번호 1-1502로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 서열 xi)은 서열번호 7, 서열번호 15-89 및 서열번호 151-871로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 서열 xi)은 서열번호 1-6, 서열번호 8-14, 서열번호 90-150 및 서열번호 872-1502로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 서열 xi)은 서열번호 1-152 및 서열번호 1503-1515로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 서열 xi)은 서열번호 1-150 및 서열번호 1503-1515로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 서열 xi)은 서열번호 1-152로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 서열 xi)은 서열번호 1-150로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 서열 xi)은 서열번호 7, 서열번호 15-89 및 서열번호 151-152로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 서열 xi)은 서열번호 1-6, 서열번호 8-14 및 서열번호 90-150로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 서열 xi)은 서열번호 1-14 및 서열번호 1503-1515로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 서열 xi)은 서열번호 1-14 및 서열번호 1512로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 서열 xi)은 서열번호 1-14로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 서열 xi)은 서열번호 1-5로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 서열 xi)은 서열번호 1512이다. 구체적인 개별 실시양태에서, 서열 xi)은 개별적으로 서열번호 1-14 중 어느 하나이다.

본원에서 정의된 폴리펩티드의 IL-6에의 결합은 생체내 또는 시험관내에서 IL-6을 통한 정규 시스- 및/또는 트랜스-신호전달을 방해할 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 시스-신호전달 경로를 통한 IL-6 의존적 신호전달을 차단할 수 있는 본원에서 정의된 IL-6 결합 폴리펩티드를 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본원에서 정의된 IL-6 결합 폴리펩티드는 트랜스-신호전달 경로를 통한 IL-6 의존적 신호전달을 차단할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본원에서 정의된 IL-6 결합 폴리펩티드는 시스-신호전달 경로 및 트랜스-신호전달 경로, 둘 모두를 통한 IL-6 의존적 신호전달을 차단할 수 있다.

반수 최대 억제 농도 (IC50)는 특정 생물학적 또는 생화학적 기능을 억제하는 데 있어서 물질의 효능을 나타내는 측정치이다. 이러한 정량적 측정치는 주어진 생물학적 프로세스를 절반만큼 억제시키는 데 특정 물질이 얼마만큼 필요한지를 나타내는 것이며, 이는 당업계에서 보편적으로 사용된다. 한 특정 실시양태에서, 차단의 반수 최대 억제 농도 (IC50)가 최대 1x10^-6 M, 예컨대, 최대 1x10^-7 M, 예컨대, 최대 1x10^-8 M, 예컨대, 최대 1x10^-9 M, 예컨대, 최대 1x10^-10 M이 되도록 IL-6 신호전달을 차단할 수 있는 본원에서 정의된 IL-6 결합 폴리펩티드를 제공한다. 상기 차단은 시스- 또는 트랜스-신호전달 경로의 차단일 수 있다. 한 실시양태에서, IL-6 결합 폴리펩티드는 IL-6/IL-6Rα와 gp130의 상호작용을 차단할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바, "IL-6 결합" 및 "IL-6에 대한 결합 친화도"라는 용어는 예를 들어, ELISA에 의해, 또는 표면 플라스몬 공명 (SPR) 기술 사용에 의해 시험될 수 있는 폴리펩티드의 특성을 나타낸다. 예를 들어, 하기 실시예에서 기술되는 바와 같이, IL-6 결합 친화도는, 폴리펩티드 샘플을 항체 코팅된 ELISA 플레이트 상에 포획하고, 비오티닐화된 IL-6을 첨가한 후, 스트렙트아비딘 접합된 HRP를 첨가하는 실험으로 시험될 수 있다. TMB 기질을 첨가하고, 다중 웰 플레이트 판독기, 예컨대, 빅토르(Victor)³ (퍼킨 엘머(Perkin Elmer))를 사용하여 450 nm에서의 흡광도를 측정한다. 이어서, 당업자는 적어도, 상기 실험에 의해 수득된 결과를 해석하여 IL-6에 대한 폴리펩티드의 결합 친화도의 정량적 측정치를 확립할 수 있다. 예를 들어, 상호작용에 대한 EC50 값 (반수 최대 유효 농도)을 측정하기 위해 정량적 측정치가 요구되는 경우, ELISA 또한 사용될 수 있다. 상기 기술된 바와 같이 ELISA를 사용하여 비오티닐화된 IL-6의 희석률 시리즈에 대한 폴리펩티드의 반응을 측정한다. 이어서, 당업자는 상기 실험에 의해 수득된 결과를 해석할 수 있고, EC50 값은 예를 들어, 그래프패드 프리즘 5(GraphPad Prism 5) 및 비선형 회귀를 사용하여 상기 결과로부터 계산될 수 있다.

IL-6 결합 친화도는 또한 IL-6, 또는 그의 단편을 표면 플라스몬 공명 (SPR) 장치의 센서 칩 상에 고정화시키고, 시험하고자 하는 폴리펩티드를 함유하는 샘플을 칩 위로 통과시키는 실험으로 시험될 수 있다. 대안적으로, 시험하고자 하는 폴리펩티드를 상기 장치의 센서 칩 상에 고정화시키고, IL-6, 또는 그의 단편을 함유하는 샘플을 칩 위로 통과시킨다. 이어서, 당업자는 적어도, 상기 실험에 의해 수득된 결과를 해석하여 IL-6에 대한 폴리펩티드의 결합 친화도의 정량적 측정치를 확립할 수 있다. 예를 들어, 상호작용에 대한 K_D 값을 측정하기 위해 정량적 측정치가 요구되는 경우, 표면 플라스몬 공명 방법 또한 사용될 수 있다. 결합 값은 예를 들어, 비아코어(Biacore) (GE 헬쓰케어(GE Healthcare)) 또는 프로테온(ProteOn) XPR 36 (바이오-래드(Bio-Rad)) 장치에서 정의될 수 있다. IL-6을 적합하게는 상기 장치의 센서 칩 상에 고정시키고, 연속 희석에 측정하고자 하는 것이 그의 친화도인 것인 폴리펩티드의 샘플을 제조하고, 무작위순으로 주사한다. 이어서, 장치 제조사에 의해 제공되는 예를 들어, BIA이벨류에이션(BIAevaluation) 4.1 소프트웨어, 또는 다른 적합한 소프트웨어의 1:1 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델을 이용하여 상기 결과로부터 K_D 값을 계산할 수 있다.

따라서, 한 실시양태에서, 상호작용의 EC50 값이 최대 1x10^-7 M, 예컨대, 최대 1x10^-8 M, 예컨대, 최대 1x10^-9 M, 예컨대, 최대 1x10^-10 M이 되도록 IL-6에 결합할 수 있는 본원에서 정의된 IL-6 결합 폴리펩티드를 제공한다.

한 실시양태에서, IL-6 결합 폴리펩티드는 상호작용의 K_D 값이 최대 1x10^-8 M, 예컨대, 최대 1x10^-9 M, 예컨대, 최대 1x10^-10 M이 되도록 IL-6에 결합할 수 있

당업자는 본 개시내용의 범주로부터 벗어나지 않으면서 폴리펩티드를 특정한 적용에 맞게 적합화시키기 위해 본원에 개시된 임의의 측면에 따른 IL-6 결합 폴리펩티드를 다양하게 변형시키고/거나, 그에 첨가할 수 있다는 것을 이해할 것이다.

예를 들어, 한 실시양태에서, 폴리펩티드가 C 말단 및/또는 N 말단에서 추가의 아미노산에 의해 연장되었고/거나, 그를 포함하는 것인, 본원에 기술된 IL-6 결합 폴리펩티드를 제공한다. 상기 폴리펩티드는 폴리펩티드 쇄 내 맨 첫 번째 및/또는 맨 마지막 위치에 하나 이상의 추가의 아미노산 잔기를 가진 폴리펩티드로서 이해되어야 한다. 따라서, IL-6 결합 폴리펩티드는 임의의 적합한 개수의 추가의 아미노산 잔기, 예를 들어, 1 이상의 추가의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 각각의 추가의 아미노산 잔기는 예를 들어, 폴리펩티드의 생성, 정제, 생체내 또는 시험관내 안정화, 커플링, 또는 검출 개선을 위해 개별적으로 또는 집합적으로 부가될 수 있다. 상기 추가의 아미노산 잔기는 화학적 커플링을 위해 부가된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 상기의 한 예는 시스테인 잔기의 부가이다. 추가의 아미노산 잔기는 또한 폴리펩티드의 정제 또는 검출을 위한 "태그," 예컨대, His₆ 태그 (HisGlu)₃ 태그 ("HEHEHE" 태그) 또는 "myc" (c-myc) 태그, 또는 상기 태그에 특이적인 항체와의 상호작용 또는 His₆-태그의 경우, 고정화된 금속 친화도 크로마토그래피 (IMAC)를 위한 "FLAG" 태그를 제공할 수 있다.

상기 논의된 추가의 아미노산은 (공지된 유기 화학 방법을 이용하는) 화학적 접합 수단 또는 임의의 다른 수단, 예컨대, 융합 단백질로서 IL-6 결합 폴리펩티드의 발현에 의해 IL-6 결합 폴리펩티드에 커플링될 수 있거나, 또는 직접적으로 또는 링커, 예를 들어, 아미노산 링커를 통해 임이의 다른 방식으로 결합될 수 있다.

상기 논의된 추가의 아미노산은 예를 들어, 하나 이상의 폴리펩티드 도메인(들)을 포함할 수 있다. 추가의 폴리펩티드 도메인은 IL-6 결합 폴리펩티드에 또 다른 기능, 예를 들어, 추가의 또 다른 결합 기능, 또는 효소적 기능, 독성 기능, 형광성 신호전달 기능 또는 그의 조합을 제공할 수 있다.

추가의 폴리펩티드 도메인은 또한 동일한 IL-6 결합 기능을 가지는 또 다른 IL-6 결합 모이어티를 제공할 수 있다. 따라서, 추가의 실시양태에서, 다량체 형태의 IL-6 결합 폴리펩티드를 제공한다. 상기 다량체는 2개 이상의 본원에 개시된 바와 같은 IL-6 결합 폴리펩티드를 단량체 단위로서 포함하되, 그의 아미노산 서열은 동일하거나, 상이할 수 있는 것으로 이해된다. 폴리펩티드의 다량체 형태는 적합한 개수의 도메인을 포함할 수 있으며, 그 각각의 것은 IL-6 결합 모티프를 가지고, 각각은 다량체 내에서 단량체를 형성한다. 이러한 도메인들은 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있지만, 대안적으로, 도메인들은 상이한 아미노산 서열을 가질 수 있다. 다시 말해, 본 발명의 IL-6 결합 폴리펩티드는 동종다량체 또는 이종다량체, 예를 들어, 동종이량체 또는 이종이량체를 형성할 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 단량체 단위가 서로 공유적으로 커플링되어 있는 IL-6 결합 폴리펩티드를 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 IL-6 결합 폴리펩티드 단량체 단위는 융합 단백질로서 발현된다. 한 실시양태에서, 이량체 형태의 IL-6 결합 폴리펩티드를 제공한다.

추가로, 본원에 기술된 IL-6 결합 폴리펩티드 또는 그의 다량체가 제1 도메인 또는 제1 모이어티를 구성하고, 제2 및 추가의 모이어티는 IL-6에 결합하는 것 이외의 다른 기능을 가지는 "이종성" 융합 폴리펩티드 또는 단백질 또는 접합체 또한 고려되고, 이는 본 개시내용의 범위 내에 포함된다. 상기 단백질내 융합 폴리펩티드 또는 접합체의 제2 및 추가의 모이어티/모이어티들은 적합하게는 원하는 생물학적 활성을 가진다.

따라서, 본 개시내용의 제2 측면에서, 제1 측면에 따른 IL-6 결합 폴리펩티드로 이루어진 제1 모이어티, 및 원하는 생물학적 활성을 가지는 폴리펩티드로 이루어진 제2 모이어티를 포함하는, 융합 단백질 또는 접합체를 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 융합 단백질 또는 접합체는 추가로 제2 모이어티의 생물학적 활성과 동일하거나, 상이할 수 있는 원하는 생물학적 활성을 포함하는 추가의 모이어티를 포함할 수 있다.

원하는 생물학적 활성의 비제한적인 예로는 치료학적 활성, 결합 활성 및 효소적 활성을 포함한다. 한 실시양태에서, 원하는 생물학적 활성을 가지는 제2 모이어티는 치료학적으로 활성인 폴리펩티드이다.

치료학적으로 활성인 폴리펩티드의 비제한적인 예로는 생체분자, 예컨대, 인간 내인성 효소, 호르몬, 성장 인자, 케모카인, 시토카인 및 림포카인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 분자가 있다.

결합 활성의 비제한적인 예로는 융합 단백질 또는 접합체의 생체내 반감기를 연장시키는 결합 활성, 및 생물학적 활성을 차단하는 작용을 하는 결합 활성이 있다. 한 특정 실시양태에서, 결합 활성은 융합 단백질 또는 접합체의 생체내 반감기를 연장시키는 알부민 결합 활성이다. 한 실시양태에서, 상기 알부민 결합 활성은 연쇄상구균의 단백질 G 또는 그의 유도체의 알부민 결합 도메인에 의해 제공된다.

본 개시내용의 상기 측면의 한 실시양태에서, 추가의 면역 반응 조절제를 포함하는 IL-6 결합 폴리펩티드, 융합 단백질 또는 접합체를 제공한다. 추가의 면역 반응 조절제의 비제한적인 예로는 면역억제제 및 면역조절제, 또는 다른 항-염증제를 포함한다. 예를 들어, 본원에 기술된 IL-6 결합 폴리펩티드, 융합 단백질 또는 접합체는 질환 변형 항류마티스 약물 (DMARD), 예컨대, 금 염, 아자티오프린, 메토트렉세이트 및 레플루노미드; 칼시네우린 억제제, 예컨대, 시클로스포린 A 또는 FK 506; 림프구 재순환 조절제; mTOR 억제제, 예컨대, 라파마이신; 면역억제 특성을 가지는 아스코마이신; 글루코르코티코이드; 코르티코스테로이드; 시클로포스파미드; 면역억제제 모노클로날 항체; 부착 분자 억제제, 예컨대, LFA-1 길항제, ICAM-1 또는 -3 길항제, VCAM-4 길항제 또는 VLA-4 길항제; 항-TNF 작용제, 예컨대, 에타너셉트 또는 TNF에 대한 모노클로날 항체, 예를 들어, 인플릭스맙, 아달리무맙, 고리무맙 및 세톨리주맙 페골; 염증유발성(proinflammatory) 시토카인 차단제; IL-1 차단제, 예컨대, 아나킨라 또는 IL-1 트랩; IL-17 차단제; 케모카인 차단제; 비스테로이드성 항-염증성 약물 (NSAID), 예컨대, 아스피린; 및 항-감염제 및 다른 면역 반응 조절제와 조합하여 사용될 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 상기 면역 반응 조절제는 질환 변형 항류마티스 약물 (DMARD), 칼시네우린 억제제, 림프구 재순환 조절제, mTOR 억제제, 면역억제 특성을 가지는 아스코마이신, 글루코르코티코이드, 코르티코스테로이드, 시클로포스파미드, 면역억제제 모노클로날 항체, 부착 분자 억제제, 항-TNF 작용제, 염증유발성 시토카인 차단제, IL-1 차단제, IL-17 차단제, 케모카인 차단제, 비스테로이드성 항-염증성 약물 (NSAID) 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

당업자가 이해하는 바와 같이, 제1 측면에 따른 IL-6 결합 폴리펩티드는 임의의 다른 모이어티에의 접합체 파트너로서 또는 융합 단백질로 유용할 수 있다. 그러므로, 치료학적으로 활성인 폴리펩티드 및 면역 반응 조절제에 관한 상기 목록은 어느 방식으로든 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.

융합 단백질 구축은 대개 융합시키고자 하는 기능성 모이어티 사이에 링커를 사용하는 것을 포함하고, 다른 특성을 가진 다른 종류의 링커, 예컨대, 가요성 아미노산 링커, 강성 아미노산 링커 및 절단가능한 아미노산 링커가 존재한다는 것을 당업자는 알고 있다. 링커는 예를 들어, 안정성을 증가시키기 위해, 또는 융합 단백질의 폴딩을 개선시키는 데, 융합 단백질의 발현을 증가시키고, 그의 생물학적 활성을 개선시키고, 그의 표적화를 가능하게 하고, 그의 약동학적 성질을 변경시키기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 본원에 개시된 융합 단백질은 1종 이상의 링커, 예컨대, 가용성 아미노산 링커, 강성 아미노산 링커 및 절단가능한 아미노산 링커로부터 선택되는 1종 이상의 링커를 추가로 포함한다.

가용성 링커는 당업계에서 대개 결합된 도메인 특정 정도의 이동 또는 상호작용을 필요로 할 때에 사용되고, 일부 실시양태에서, 이는 특히 유용할 수 있다. 상기 링커는 일반적으로 작은, 비극성 (예를 들어, G) 또는 극성 (예를 들어, S 또는 T) 아미노산으로 구성된다. 일부 가용성 링커는 주로 G 및 S 잔기로 이루어진 스트레치, 예를 들어, (GGGGS)_p로 구성된다. 기능성 모이어티 사이를 적절히 분리시키기 위해, 또는 모이어티 사이의 필요한 상호작용을 유지시키기 위해 카피수 "p"를 조정함으로써 링커를 최적화시킬 수 있다. G 및 S 링커 이외에도, 다른 가용성 링커, 예컨대, 가요성 유지를 위해, 추가의 아미노산 잔기, 예컨대, T 및 A를 함유하는 G 및 S 링커 뿐만 아니라, 가용성을 개선시키기 위해, 극성 아미노산 잔기를 함유하는 G 및 S 링커가 당업계에 공지되어 있다. 본원에서 사용을 위해 고려되는 가용성 링커의 예로는 또한 KESGSVSSEQLAQFRSLD, EGKSSGSGSEKST 및 GSAGSAAGSGEF를 포함한다.

따라서 한 실시양태에서, 상기 링커는 글리신 (G), 세린 (S) 및/또는 트레오닌 (T) 잔기를 포함하는 가용성 링커이다. 한 실시양태에서, 상기 링커는 (G_nS_m)_p 및 (S_mG_n)_p (여기서, 독립적으로, n = 1-7, m = 0-7, n + m ≤ 8 및 p = 1-7)로부터 선택되는 일반식을 가진다. 한 실시양태에서, n = 1-5이다. 한 실시양태에서, m = 0-5이다. 한 실시양태에서, p = 1-5이다. 더욱 구체적인 실시양태에서, n = 4, m = 1 및 p = 1-4이다. 더욱더 구체적인 실시양태에서, 상기 링커는 (GGGGS)₃이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 링커는 GGGGS이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 링커는 VDGS이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 상기 링커는ASGS이다.

상기 측면은, 제1 측면에 따른 IL-6 결합 폴리펩티드, 또는 제2 측면에 따른 융합 단백질 또는 접합체에 포함된 IL-6 결합 폴리펩티드가 표지, 예컨대, 형광 염료 및 금속, 발색단 염료, 화학발광 화합물 및 생물발광 단백질, 효소, 방사성핵종 및 방사성 입자로 이루어진 군으로부터 선택되는 표지를 추가로 포함하는 것인, 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 상기 표지는 예를 들어 폴리펩티드의 검출을 위해 사용될 수 있다.

예를 들어, 표지된 IL-6 결합 폴리펩티드가 본 개시내용의 제1 측면에 따른 IL-6 결합 폴리펩티드 및 표지를 포함하는 실시양태에서, 표지된 폴리펩티드는 예를 들어, IL-6 발현 세포, 예컨대, 염증 관련 암 세포를 간접적으로 표지화하는 데 사용될 수 있다.

다른 실시양태에서, 표지된 IL-6 결합 폴리펩티드는 원하는 생물학적 활성을 가지는 제2 모이어티 또한 포함하는 융합 단백질 또는 접합체에서 모이어티로서 존재한다. 일부 경우에, 표지는 IL-6 결합 폴리펩티드에만 커플링될 수 있고, 일부 경우에는, IL-6 결합 폴리펩티드 및 접합체 또는 융합 단백질의 제2 또는 추가 모이어티, 둘 모두에 커플링될 수 있다. 추가로, 표지는 IL-6 결합 모이어티가 아닌, 제2 또는 추가 모이어티에만 오직 커플링될 수 있다는 것도 가능하다. 그러므로, 추가의 또 다른 실시양태에서, 상기 표지가 오직 상기 제2 또는 추가 모이어티에만 커플링된, 제2 모이어티 및 임의적으로 추가 모이어티를 포함하는 IL-6 결합 폴리펩티드를 제공한다.

IL-6 결합 폴리펩티드, 융합 단백질 또는 접합체가 방사성 표지된 것인 실시양태에서, 상기 방사성 표지된 폴리펩티드는 방사성핵종을 포함할 수 있다. 다수의 방사성핵종은 금속성 성질을 가지며, 금속은 전형적으로는 단백질 및 펩티드에 존재하는 원소와 안정적인 공유 결합을 형성하지 못한다. 이런 이유에서, 방사성 금속으로 단백질 및 펩티드를 표지화하는 것은 금속 이온과 킬레이트로 불리는 비공유결합 화합물들을 형성하는 킬레이터, 즉, 여러 자리 리간드를 사용하여 수행된다. IL-6 결합 폴리펩티드, 융합 단백질 또는 접합체의 한 실시양태에서, 방사성핵종의 도입은 킬레이팅 환경을 제공함으로써 이루어지며, 이를 통해 방사성핵종은 폴리펩티드에 배위되거나, 킬레이팅되거나, 착물을 형성할 수 있다.

킬레이터의 한 예로는 폴리아미노폴리카르복실레이트 유형의 킬레이터가 있다. 상기 폴리아미노폴리카르복실레이트 킬레이터는 두 부류: 거대환 및 비환 킬레이터로 구분될 수 있다.

한 실시양태에서, IL-6 결합 폴리펩티드, 융합 단백질 또는 접합체는, 시스테인 잔기의 티올 기 또는 리신 잔기의 엡실론 아민 기를 통해 IL-6 결합 폴리펩티드에 접합된 폴리아미노폴리카르복실레이트 킬레이터에 의해 제공되는 킬레이팅 환경을 포함한다.

인듐, 갈륨, 이트륨, 비스무트, 방사성 악티나이드 및 방사성 란타나이드의 방사성 동위 원소를 위한 가장 일반적으로 사용되는 거대환 킬레이터는 DOTA (1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산)의 상이한 유도체이다. 한 실시양태에서, IL-6 결합 폴리펩티드, 융합 단백질 또는 접합체의 킬레이팅 환경은 DOTA 또는 그의 유도체에 의해 제공된다. 더욱 구체적으로, 한 실시양태에서, 본 개시내용에 포함되는 킬레이팅 폴리펩티드는 DOTA 유도체 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7-트리스-아세트산-10-말레이미도에틸아세트아미드 (말레이미도모노아미드-DOTA)를 상기 폴리펩티드와 반응시킴으로써 수득된다.

추가로, 1,4,7-트리아자시클로노난-1,4,7-트리아세트산 (NOTA) 및 그의 유도체가 킬레이터로서 사용될 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 폴리아미노폴리카르복실레이트 킬레이터가 1,4,7-트리아자시클로노난-1,4,7-트리아세트산 또는 그의 유도체인 것인, IL-6 결합 폴리펩티드, 융합 단백질 또는 접합체를 제공한다.

가장 일반적으로 사용되는 비환 폴리아미노폴리카르복실레이트 킬레이터는 DTPA (디에틸렌트리아민-펜타아세트산)의 상이한 유도체이다. 그러므로, 디에틸렌트리아민펜타아세트산 또는 그의 유도체에 의해 제공되는 킬레이팅 환경을 가진 폴리펩티드 또한 본 개시내용에 포함된다.

본 개시내용의 추가 측면에서, 본원에 기술된 IL-6 결합 폴리펩티드 또는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터; 및 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.

상기 폴리펩티드가 그의 발현 벡터로부터 발현될 수 있도록 허용하는 조건하에서 상기 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 폴리펩티드를 단리시키는 단계를 포함하는, 상기 기술된 폴리펩티드 또는 융합 단백질을 제조하는 방법 또한 본 개시내용에 포함된다.

본 개시내용의 IL-6 결합 폴리펩티드는 대안적으로, 비생물학적 펩티드 합성이

- 아미노산 및/또는 아미노산 유도체를 단계적으로 커플링시켜, 보호된 반응성 측쇄를 가지는, 제1 측면에 따른 폴리펩티드를 형성하는 단계,

- 폴리펩티드의 반응성 측쇄로부터 보호기를 제거하는 단계, 및

- 수용액 중에서 폴리펩티드를 폴딩하는 단계를 포함하는 것인, 보호된 반응성 측쇄를 가지는 아미노산 및/또는 아미노산 유도체를 사용한 비생물학적 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다.

본 개시내용에 따른 IL-6 결합 폴리펩티드는 예컨대, IL-6에 대해 직접적 또는 간접적 영향을 미치면서, 그 자체로 치료제, 진단제 또는 예후제로서, 또는 다른 치료제 또는 진단제를 표적화하기 위한 수단으로서 유용할 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 직접적인 치료 효과는 예를 들어, IL-6 신호전달을 억제시킴으로써 달성될 수 있다.

본 개시내용의 분자의 작은 크기 및 강건성은 종래 모노클로날 항체 기반 요법에 비하여 수개의 장점을 부여한다. 그러한 장점으로는 투여 모드, 예컨대, 대안적 투여 경로, 항체보다 더 높은 용량의 투여량 및 Fc 매개의 부작용이 없다는 것을 포함한다. 본원에 개시된 폴리펩티드의 매우 높은 가용성 및 안정성에 대한 잠재능과 함께 조합된 작은 크기를 통해 예를 들어, 피하 주사하는 경우, 극도로 적은 몰량의 약물을 소량으로 주사할 수 있다. 전신 투여하는 경우, 이는 외래 환자가 편리한, 소형의 미리 충전된 시린지 또는 자동 주사기를 이용하여 소량 및 우수한 내성을 띠는 투여 용량으로 "가정용" 치료법을 사용하는 것을 제안한다. 추가로, 다양한 제제에서 기능적 안정성을 유지할 수 있는 능력과 함께 조합하여 약물 제제 중 높은 몰 농도에 대한 능력이 국소 (예를 들어, 피부 또는 폐) 또는 경구 투여 경로를 가능하게 만든다. IL-6 매개 질환에서 대안적 투여 경로가 특히 관련이 있을 수 있는 것인 적응증의 비제한적인 예로는 천식 및 건선을 포함한다.

또 다른 측면에서, 본원에 기술된 IL-6 결합 폴리펩티드, 융합 단백질 또는 접합체 및 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제 또는 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 조성물은 1종 이상의 추가 활성제, 예컨대, 2종 이상의 추가 활성제, 예컨대, 3종 이상의 추가 활성제를 추가로 포함한다. 상기 조합에서 유용한 것으로 입증될 수 있는 추가 활성제의 비제한적인 예로는 본원에 기술된 면역 반응 조절제 및 항암제이다.

항암제의 비제한적인 예로는 아우리스타틴, 안트라시클린, 칼리케아마이신, 콤브레타스타틴, 독소루비신, 두오카르마이신, CC-1065 항-종양 항생제, 에크테이사스시딘, 젤다나마이신, 메이탄시노이드, 메토트렉세이트, 미코톡신, 탁솔, 리신, 보우가닌, 젤로닌, 슈도모나스 외독소 38 (PE38), 디프테리아 독소 (DT), 및 그의 유사체, 및 그의 유도체 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 작용제를 포함한다. 당업자는 세포독성제의 비제한적인 예로는 상기 작용제의 모든 가능한 변이체를 포함하고, 예를 들어, 작용제인 아우리스타틴은 예를 들어, 아우리스타틴 E, 아우리스타틴 F, 아우리스타틴 PE, 및 그의 유도체를 포함한다는 것을 이해할 것이다.

당업자는 본원에 기술된 항-IL-6 결합 폴리펩티드, 융합 단백질 또는 접합체를 포함하는 상기 IL-6 결합 폴리펩티드, 융합 단백질 또는 접합체 또는 조성물이 경구, 국소, 정맥내, 복강내, 피하, 폐, 경피, 근육내, 비내, 협측, 설하 또는 좌제 투여를 비롯한, 표준 투여 기술을 사용하여 대상체에게 투여될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 한 실시양태에서, 경구, 국소, 정맥내, 복강내, 피하, 폐, 경피, 근육내, 비내, 협측, 설하 또는 좌제 투여용의, 본원에 기술된 IL-6 결합 폴리펩티드, 융합 단백질 또는 접합체 또는 조성물을 제공한다.

IL-6은 또한 특정 암, 예컨대, 염증 관련 암, 예를 들어, 폐암, 유방암 및 결장암의 진단 및 예후를 위해 가치있는 마커로서의 역할을 할 수 있다. 예를 들어, IL-6은 결장직장암을 앓는 환자에서의 예후 및 불량한 생존과 연관이 있다 (문헌 [Ky et al., Jpn J Clin Oncol. 2010 Jun;40(6):580-7]).

그러므로, 본 개시내용의 또 다른 측면에서, 의약, 예후제 또는 진단제로서 사용하기 위한 본원에 기술된 IL-6 결합 폴리펩티드, 융합 단백질, 접합체 또는 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 의약으로서 사용하기 위한 상기 IL-6 결합 폴리펩티드를 제공한다.

한 실시양태에서, 생체내에서 IL-6 기능을 조절하기 위한 의약으로서 사용하기 위한, 본원에 기술된 IL-6 결합 폴리펩티드, 융합 단백질 또는 접합체 또는 조성물을 제공한다. 본원에서 사용되는 바, "조절하다"라는 용어는 활성을 변화시키는 것, 예컨대, IL-6의 기능을 저차형태(hypomorph)로 만들거나, IL-6 기능을 부분적으로 억제 또는 완전히 억제시키는 것을 의미한다.

IL-6 결합 폴리펩티드가 치료, 예후 및/또는 진단에 유용할 수 있는 것인 IL-6 관련 장애의 비제한적인 예로는 염증성 질환, 자가면역 질환, 감염성 질환, 암, 당뇨병, 신경계 질환 및 우울증, 예컨대, 류마티스 관절염 (RA), 소아 RA, 소아 특발성 관절염 또는 전신 소아 특발성 관절염, 혈관염, 건선성 관절염, 건선, 강직 척추염, 만성 염증성 장 질환 예컨대, 크론병 및 궤양성 대장염; 그레이브스병, 베체트병, 포도막염, 거대 세포 동맥염, 다발성 경화증 (MS), 전신 경화증, 전신 홍반 루푸스 (SLE), 다발근육염, 류마티스성 다발성 근육통, 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 재발성 다발연골염, 췌장염, 복막염, 신염, 가와사키병, 쇼그렌 증후군, 성인 스틸병, 대장염 관련 암, 콩팥암, 신장암, 전립샘암, 악성 림프종, 다발성 골수종, 캐슬만병, 유방암, 폐암, 알츠하이머병, HIV, 당뇨병, 패혈증, 악액질, 골수형성이상 증후군 (MDS), 간경화증, 이식편대숙주 질환, 심근경색, 자궁내막증 및 골다공증을 포함한다. IL-6 관련 암의 비제한적인 예로는 폐암, 유방암 및 결장암을 포함한다 (문헌 [Schafer and Brugge, J Clin Invest. (2007) 117(12): 3660-3663]; [Nagasaki et al., British Journal of Cancer (2014) 110, 469-478]).

따라서, 한 실시양태에서, IL-6 관련 장애, 예컨대, 염증성 질환, 자가면역 질환, 감염성 질환, 암, 당뇨병, 신경계 질환 및 우울증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 장애의 치료, 예후, 또는 진단에서 사용하기 위한 IL-6 결합 폴리펩티드, 융합 단백질, 접합체 또는 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 IL-6 관련 장애는 염증성 질환 및 자가면역 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 상기 IL-6 관련 장애는 류마티스 관절염 (RA), 소아 RA, 소아 특발성 관절염 또는 전신 소아 특발성 관절염, 혈관염, 건선성 관절염, 건선, 강직 척추염, 만성 염증성 장 질환, 예컨대, 크론병 및 궤양성 대장염; 그레이브스병, 베체트병, 포도막염, 거대 세포 동맥염, 다발성 경화증 (MS), 전신 경화증, 전신 홍반 루푸스 (SLE), 다발근육염, 류마티스성 다발성 근육통, 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 재발성 다발연골염, 췌장염, 복막염, 신염, 가와사키병, 쇼그렌 증후군 및 성인 스틸병으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 상기 IL-6 관련 장애는 암, 예컨대, 대장염 관련 암, 콩팥암, 신장암, 전립샘암, 악성 림프종, 다발성 골수종, 캐슬만병, 유방암 및 폐암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 IL-6 관련 장애는 알츠하이머병, HIV, 당뇨병, 패혈증, 악액질, 골수형성이상 증후군 (MDS), 간경화증, 이식편대숙주 질환, 심근경색, 자궁내막증 및 골다공증으로부터 선택된다.

관련된 측면에서, IL-6 관련 장애 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의, 본원에 기술된 IL-6 결합 폴리펩티드, 융합 단백질, 접합체 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, IL-6 관련 장애 치료 방법을 제공한다. 상기 방법의 더욱 구체적인 실시양태에서, 본원에 기술된 IL-6 결합 폴리펩티드, 융합 단백질, 접합체 또는 조성물은 생체내에서 IL-6 기능을 조절한다.

한 실시양태에서, 상기 IL-6 관련 장애는 염증성 질환, 자가면역 질환, 감염성 질환, 암, 당뇨병, 신경계 질환 및 우울증으로 이루어진 군, 예컨대, 염증성 질환 및 자가면역 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 상기 측면의 한 특정 실시양태에서, IL-6 관련 장애는 류마티스 관절염 (RA), 소아 RA, 소아 특발성 관절염 또는 전신 소아 특발성 관절염, 혈관염, 건선성 관절염, 건선, 강직 척추염, 만성 염증성 장 질환, 예컨대, 크론병 및 궤양성 대장염; 그레이브스병, 베체트병, 포도막염, 거대 세포 동맥염, 다발성 경화증 (MS), 전신 경화증, 전신 홍반 루푸스 (SLE), 다발근육염, 류마티스성 다발성 근육통, 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 재발성 다발연골염, 췌장염, 복막염, 신염, 가와사키병, 쇼그렌 증후군 및 성인 스틸병으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 상기 IL-6 관련 장애는 암, 예컨대, 대장염 관련 암, 콩팥암, 신장암, 전립샘암, 악성 림프종, 다발성 골수종, 캐슬만병, 유방암 및 폐암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 IL-6 관련 장애는 알츠하이머병, HIV, 당뇨병, 패혈증, 악액질, 골수형성이상 증후군 (MDS), 간경화증, 이식편대숙주 질환, 심근경색, 자궁내막증 및 골다공증으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

치료학상 유효량의, 본원에 기술된 IL-6 결합 폴리펩티드, 융합 단백질 또는 접합체 또는 조성물 및 1종 이상의 제2 약물 물질, 예컨대, 상기 기술된 면역 반응 조절제 또는 항암제를 투여하는 것이 유익할 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "공동-투여"라는 용어는 동시 및 순차적 투여, 둘 모두를 포함한다. 따라서, 한 실시양태에서, 상기 기술된 바와 같이 면역 반응 조절제를 공동 투여하는 단계를 추가로 포함하는 상기 정의된 바와 같은 방법을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 기술된 바와 같이 항암제를 공동 투여하는 단계를 추가로 포함하는 상기 정의된 바와 같은 방법을 제공한다.

본 개시내용의 또 다른 측면에서, IL-6을 함유할 것으로 의심되는 샘플을 제공하는 단계, 상기 샘플을 본원에 기술된 바와 같은 IL-6 결합 폴리펩티드, 융합 단백질, 접합체 또는 조성물과 접촉시키는 단계, 및 상기 샘플 중 IL-6의 존재를 나타내는 IL-6 결합 폴리펩티드, 융합 단백질, 접합체 또는 조성물의 결합을 검출하는 단계를 포함하는, IL-6을 검출하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 샘플 접촉 후, 비결합 폴리펩티드, 융합 단백질, 접합체 또는 조성물을 제거하는 중간 세척 단계를 추가로 포함한다.

한 실시양태에서, 상기 방법은

- 대상체, 또는 대상체로부터 단리된 샘플을 본원에 기술된 IL-6 결합 폴리펩티드, 융합 단백질, 접합체 또는 조성물과 접촉시키는 단계, 및

- 상기 대상체에서 또는 상기 샘플에 결합한 IL-6 결합 폴리펩티드, 융합 단백질, 접합체 또는 조성물의 양에 상응하는 값을 수득하는 단계를 포함하는, 대상체에서 IL-6의 존재를 측정하는 진단학적 또는 예후적 방법이다.

한 실시양태에서, 상기 방법은 대상체 또는 샘플 접촉 후, 및 값을 수득하기 전, 비결합 폴리펩티드, 융합 단백질, 접합체 또는 조성물을 제거하는 중간 세척 단계를 추가로 포함한다.

한 실시양태에서, 상기 방법은 상기 값을 참조와 비교하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 참조는 예를 들어 색상 반응을 기반으로 하여, 수치, 역치 또는 시각적 지시자에 의해 이루어질 수 있다. 참조와 비교하는 상이한 비교 방식들이 당업계에 공지되어 있고, 이는 사용하는 데 적합할 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다.

상기 방법의 한 실시양태에서, 상기 대상체는 포유동물 대상체, 예컨대, 인간 대상체이다.

한 실시양태에서, 상기 방법은 생체내에서 수행된다. 또 다른 실시양태에서, 상기 방법은 시험관내에서 수행된다.

본 발명은 다양한 예시적인 측면 및 실시양태를 참조로 기술되었지만, 본 발명의 범주로부터 벗어남 없이, 다양하게 변형될 수 있고, 그의 요소 대신으로 등가물이 치환될 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 추가로, 본 발명의 본질적인 범주로부터 벗어남 없이, 특정 상황 또는 분자를 본 발명의 교시에 맞게 적합화시키기 위해 다수의 수정이 이루어질 수 있다. 그러므로, 본 발명을 고려되는 임의의 특정 실시양태로 제한하고자 하지 않으며, 본 발명은 첨부된 특허청구범위의 범주 내에 포함되는 모든 실시양태를 포함하는 것으로 한다.

도 1은 본 개시내용의 IL-6 결합 폴리펩티드의 예 (서열번호 1-1551), 대조군 폴리펩티드 (서열번호 1552-1553), 알부민 결합 도메인 (ABD) 변이체 PP013 (서열번호 1554)의 아미노산 서열 뿐만 아니라, 인간 IL-6 (서열번호 1555) 및 뮤린 IL-6 (서열번호 1556)의 아미노산 서열의 목록이다. 본 개시내용의 IL-6 결합 폴리펩티드에서, 도출된 IL-6 결합 모티프 (BM)는 각 서열에서 8번 위치에서부터 36번 위치까지에 이른다. 각각의 상기 Z 변이체 내의 완전한 3-나선 다발을 구성하는 것으로 예측된, 49개의 아미노산 잔기 길이의 폴리펩티드의 아미노산 서열은 7번 위치에서부터 55번 위치까지에 이른다 (이는 본원에서 BMod로 지칭된다).
도 2는 실시예 2에 기술된 바와 같이 검정된, hIL-6과 hIL-6Rα 사이의 상호작용 차단 결과를 보여주는 것이다. 비교를 위해 포함된 hIL-6Rα 결합 항체 토실리주맙 (검은색)과 달리, 시험된 IL-6 결합 Z 변이체 (회색)는 hIL-6의 그의 수용체 hIL-6Rα에의 결합을 간섭하지 못했다.
도 3은 실시예 2에 기술된 바와 같이 검정된, hIL-6/hIL-6Rα 복합체의 hgp130에의 결합 차단 결과를 보여주는 것이다. 시험된 모든 제1 IL-6 결합 Z 변이체 (회색)에 대해서 뿐만 아니라, 비교를 위해 포함된 토실리주맙 (검은색)에 대해서도 농도 의존적 차단이 관찰되었다. 각 변이체의 계산된 IC50 값은 하기 표 3에 제시되어 있다.
도 4는 실시예 2에 기술된 바와 같이 검정된, gp130을 발현하는 인간 제대정맥 내피 세포 (HUVEC) 기반 시스템에서의 IL-6 매개 트랜스-신호전달의 농도 의존적 억제를 보여주는 것이다. C 말단에서 ABD 변이체 PP013 (서열번호 1554)에 융합된 IL-6 결합 Z 변이체는 트랜스-신호전달을 억제시킨 반면, PP013과 융합된 대조군 Z 변이체 Z03638 (서열번호 1552)은 억제시키지 못했다. 토실리주맙은 비교를 위해 포함시켰다.
도 5는 실시예 7에 기술된 바와 같이 검정된, hIL-6/hIL-6Rα 복합체의 hgp130에의 결합 차단 결과를 보여주는 것이다. 시험된 모든 성숙한 IL-6 결합 Z 변이체 (회색)에 대해서 뿐만 아니라, 둘 모두 비교를 위해 포함된 것인, 토실리주맙 (검은색) 및 1차 결합인자(binder) Z06814 (서열번호 1512; 파선)에 대해서도 농도 의존적 차단이 관찰되었다. 성숙한 IL-6 결합 Z 변이체 모두 실시예 2에서 검정된 1차 결합인자보다 더 효율적인 차단을 보였다 (도 3과 비교).
도 6은 실시예 7에 기술된 TF-1 세포 중화 검정법의 결과를 보여주는 것이다. 시험된 모든 IL-6 결합 Z 변이체 (성숙화된 Z 변이체 (검은색으로 표시); 1차 결합인자 Z06814 (서열번호 1512) (회색 필링형(filled) 삼각형으로 표시))에 대해, 및 토실리주맙 (회색 필링형 사각형으로 표시)에 대해 IL-6 유도성 TF-1 세포 증식의 농도 의존적 억제가 관찰되었지만, 음성 대조군 항체 hIgG (회색 필링형 동그라미 표시)에 대해서는 관찰되지 않았다.
도 7은 실시예 8에 기술된 바와 같이, 항-관절염 마우스 모델에서 IL-6 유발된 혈청 아밀로이드-A (SAA) 단백질 방출을 검정함으로써 점수화된, ABD 변이체 PP013 (서열번호 1554)과 융합된 Z 변이체 Z06814 (서열번호 1512)의 생체내 효능을 보여주는 것이다. 4개의 마우스 군에 0 (필링형 사각형 표시), 0.025 (개방형 점 표시), 2.5 (개방형 삼각형 표시) 또는 25 (폐쇄형 삼각형 표시) mg/kg (체중)의 IL-6 결합 Z06814-ABD 융합 단백질을 제공하였다. 대조군으로서, 마우스에 25 mg/kg의, ABD와 융합된 대조군 Z 변이체 (Z04726; 서열번호 1553) (Z_대조군-ABD로 지칭된다) (개방형 사각형 표시)를 제공하였다. 마우스에 hIL-6를 주사하고, 이어서, SAA 단백질의 수준을 측정하였다. 추가로 두 대조군의 마우스는 각각 PBS (필링형 동그라미 표시) 및 25 mg/kg Z06814-ABD (X 표시)를 받았지만, 이후, 후속되는 IL-6 주사는 받지 않았다.

실시예

요약

하기 실시예는 인터류킨 6 (IL-6)을 표적화하는 신규한 Z 변이체 분자의 개발을 개시한다. 파지 디스플레이 기술을 이용하여 Z 변이체를 수득하였다. 본원에 기술된 IL-6 결합 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 서열분석하고, 상응하는 아미노산 서열은 도 1에 열거되어 있고, 식별자 서열번호 1-1551에 의해 표시되어 있다.

실시예 1

IL-6 결합 Z 변이체의 선별 및 ELISA 스크리닝

본 실시예에서, 인간 (hIL-6) 및 뮤린 IL-6 (mIL-6)을 Z 변이체의 파지 라이브러리를 이용하는 파지 디스플레이 선별에서의 표적 단백질로서 사용하였다. 선별된 클론의 DNA를 서열분석하고, 클론을 E. 콜라이(E. coli) 주변 세포질 분획에서 제조하고, ELISA (효소 결합 면역흡착 검정법)로 IL-6에 대해 검정하였다.

물질 및 방법

표적 단백질인 인간 및 뮤린 IL-6의 비오티닐화: 제조사의 권고 사항에 따라 12 x 몰 과량으로 노-웨이트 EZ-링크 술포-NHS-LC-비오틴(No-Weigh EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin) (써모 사이언티픽(Thermo Scientific), 카탈로그 번호 21327)을 이용하여 hIL-6 및 mIL-6 (각각 펩프로테크(Peprotech), 카탈로그 번호 200-06 및 216-16)을 비오티닐화하였다. 반응은 실온 (RT)에서 30 min 동안 수행하였다. 이어서, 슬라이드-a-라이저(Slide-a-lyzer) 투석 카세트 (써모 사이언티픽, 카탈로그 번호 66333, 3,500 MWCO)를 이용하여 제조사의 설명서에 따라 완충제를 포스페이트 완충처리된 염수 (PBS, 10 mM 포스페이트, 137 mM NaCl, 2.68 mM KCl, pH 7.4)로 교환하였다.

IL-6 결합 Z 변이체의 파지 디스플레이 선별: 본질적으로 문헌 [Groenwall et al. (2007) J Biotechnol, 128:162-183]에 기술된 바와 같이 파지미드 pAY02592에서 구축된, 박테리오파지 상에 디스플레이된 단백질 Z의 무작위 변이체의 라이브러리를 사용하여 IL-6 결합 Z 변이체를 선별하였다. 상기 라이브러리에서, 알부민 결합 도메인 (ABD로 약칭하고, 이는 스타필로코쿠스 균주 G148로부터의 단백질 G의 GA3에 상응한다)을 Z 변이체에의 융합 파트너로서 사용하였다. 본 라이브러리는 Zlib006Naive.II로 표시되고, 1.5 x 10¹⁰개의 라이브러리 구성원 (Z 변이체)으로 이루어진 크기를 가진다. 파지미드 라이브러리 Zlib006Naive.II를 함유하는 글리세롤 스톡으로부터의 E. 콜라이 RRIΔM15 세포 (문헌 [Ruether et al., (1982) Nucleic Acids Res 10:5765-5772])를 100 ㎍/ml 암피실린으로 보충된, 20 ℓ의 규정된 프롤린 무함유 배지 [7 g/ℓ 디포타슘 히드로겐포스페이트, 1 g/ℓ 트리소듐 시트레이트 이수화물, 0.02 g/ℓ 우라실, 6.7 g/ℓ YNB (디프코™ 이스트 니트로겐 베이스(Difco™ 효모 Nitrogen Base) w/o 아미노산, 벡톤 디킨슨(Becton Dickinson)), 5.5 g/ℓ 글루코스 일수화물, 0.3 g/ℓ L-알라닌, 0.24 g/ℓ L-아르기닌 모노히드로클로라이드, 0.11 g/ℓ L-아스파라긴 일수화물, 0.1 g/ℓ L-시스테인, 0.3 g/ℓ L-글루탐산, 0.1 g/ℓ L-글루타민, 0.2 g/ℓ 글리신, 0.05 g/ℓ L-히스티딘, 0.1 g/ℓ L-이소류신, 0.1 g/ℓ L-류신, 0.25 g/ℓ L-리신 모노히드로클로라이드, 0.1 g/ℓ L-메티오닌, 0.2 g/ℓ L-페닐알라닌, 0.3 g/ℓ L-세린, 0.2 g/ℓ L-트레오닌, 0.1 g/ℓ L-트립토판, 0.05 g/ℓ L-티로신, 0.1 g/ℓ L-발린] 중에서 접종하였다. 배양물을 발효조 (벨라치 바이오테크니크(Belach Bioteknik), BR20)에서 37℃에서 성장시켰다. 세포의 600 nm (OD₆₀₀)에서의 광학 밀도가 0.75에 도달하였을 때, 10 x 몰 과량의 M13K07 헬퍼 파지 (뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs), 카탈로그 번호 N0315S)를 이용하여 대략 2.6 ℓ의 배양물을 감염시켰다. 세포를 30 min 동안 인큐베이션시키고, 그 후, 발효조를, 발현 유도를 위해 100 μM 이소프로필-β-D-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG)로 보충되고, 25 ㎍/ml 카나마이신 및 12.5 ㎍/ml 카르베니실린으로 보충된, TSB-YE (트립틱 소이 브로쓰-이스트 익스트랙트(Tryptic Soy Broth-Yeast Extract); 30 g/ℓ TSB, 5 g/ℓ 효소 추출물)로 최대 20 ℓ까지 충전시켰다. 세포를 30℃에서 22 h 동안 성장시키고, 15,900 g로 원심분리하여 배양물 중 세포를 펠릿화하였다. 문헌 [Groenwall et al., 상기 문헌 동일]에 기술된 바와 같이, 파지 입자를 PEG/NaCl (폴리에틸렌 글리콜/염화나트륨) 중에서 2회에 걸쳐 상청액으로부터 침전시키고, 여과하고, PBS 및 글리세롤 중에 용해시켰다. 파지 스톡을 사용 전 -80℃에서 보관하였다.

선별 방법 및 파지 스톡 제조는 WO2009/077175에 또 다른 비오티닐화된 표적에 대한 선별에 대하여 기술된 바와 같이 수행하였다. 배경 결합인자의 양을 감소시키기 위해, 파지 스톡을 SA-비드와 함께 RT에서 30 min 동안 인큐베이션시킴으로써 사전 선별을 수행하였다. 선별에서 사용된 튜브 및 비드는 모두 5% BSA로 보충된 PBS로 미리 차단시켰다. 3% BSA 및 0.1% 트윈20으로 보충된 PBS 중 RT에서 30 min 동안 선별을 수행한 후, 이어서, 1.6 ㎍ 비오티닐화된 hIL-6 또는 mIL-6당 1 mg 비드를 사용하여 다이나비즈(Dynabeads)® M-280 스트렙트아비딘 (SA-비드, 인비트로겐(Invitrogen), 카탈로그 번호 11206D) 상에서 표적-파지 복합체 포획을 수행하였다. E. 콜라이 균주 XL1-블루(XL1-Blue) (애질런트 테크놀러지즈(Agilent technologies), 카탈로그 번호 200268)를 파지 증폭을 위해 사용하였다.

상이한 4개의 최종 트랙으로 나누어진 4개 사이클로 비오티닐화된 hIL-6 및 mIL-6에 대한 선별을 수행하였다: 사이클 1에서 트랙 (1)은 제2 사이클 또는 제4 사이클에서 나누어졌고, 그 결과, 사이클 2에서는 총 3개의 트랙 (1-1 내지 1-3), 사이클 3에서는 3개의 트랙 (1-1-1 내지 1-3-1) 및 사이클 4에서는 4개의 트랙 (1-1-1-1 내지 1-3-1-2)을 얻었다. 세척 후, 500 ㎕ 0.1 M 글리신-HCl, pH 2.2를 사용하여 선별 트랙으로부터 결합된 파지를 용리시킨 후, 50 ㎕ 1 M 트리스-HCl, pH 8.0, 및 450 ㎕ PBS를 이용하여 즉시 중화시켰다. 표적 농도 강하 및 세척 횟수 증가면에 있어서 선별 트랙의 차이를 기술하는, 사용된 선별 전략법 및 파라미터에 관한 개요는 하기 표 2에 제시되어 있다.

서열분석: 표준 PCR 프로그램 및 프라이머 AFFI-21 (5'-tgcttccggctcgtatgttgtgtg; 서열번호 1557) 및 AFFI-22 (5'-cggaaccagagccaccaccgg; 서열번호 1558)를 이용하여 단일 콜로니로부터 PCR 단편을 증폭시켰다. 제조사의 권고 사항에 따라 사용된, 비오티닐화된 올리고뉴클레오티드 AFFI-72 (5'-비오틴-cggaaccagagccaccaccgg; 서열번호 1559) 및 빅다이^® 터미네이터 v3.1 사이클 시퀀싱 키트(BigDye^® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit) (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))를 이용하여 증폭된 단편의 서열분석을 수행하였다. 마그나트릭스(Magnatrix) 8000 (마그네틱 바이오솔루션(Magnetic Biosolution)) 장치를 이용하여 자기 스트렙트아비딘 코팅된 비드 (Detach 스트렙트아비딘 Beads, Nordiag, 카탈로그 번호 2012-01)에의 결합에 의해 서열분석 반응물을 정제하고, ABI 프리즘^® 3130xl 제네틱 애널라이저(ABI PRISM^® 3130xl Genetic Analyzer) (PE 어플라이드 바이오시스템즈(PE Applied Biosystems)) 상에서 분석하였다.

ELISA를 위한 Z 변이체의 제조: 딥-웰 플레이트 (눈크(Nunc), 카탈로그 번호 278752)에서 100 ㎍/ml 암피실린 및 0.1 mM IPTG로 보충된, 1 ml TSB-YE 배지 중에서 선별로부터의 단일 콜로니를 접종함으로써 서열분석된 Z 변이체를 제조하였다. 플레이트를 37℃에서 24 h 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 원심분리에 의해 펠릿화하고, 200 ㎕ PBST 0.05% (0.05% 트윈-20으로 보충된 PBS) 중에 재현탁시키고, -80℃에서 냉동시키고, 수조에서 해동시켜 세포의 주변 세포질 분획을 유리시켰다. 냉동-해동 방법을 5회 반복하였다. 샘플을 총 800 ㎕가 되도록 PBST 0.05%로 희석하고, 세포를 원심분리에 의해 펠릿화하였다. 주변 세포질 추출물의 상청액은, AQHDEALE-[Z#####]-VDYV-[ABD]-YVPG로 표시되는, ABD에의 융합물로서 Z 변이체를 함유하였다 (문헌 [Groenwall et al., 상기 문헌 동일]). Z#####은 개별, 58개의 아미노산 잔기 Z 변이체를 나타낸다.

Z 변이체의 ELISA 분석: ELISA 검정법으로 Z 변이체의 IL-6에의 결합을 분석하였다. 96 웰 ELISA 플레이트 (코스타(Costar), 카탈로그 번호 3690) 면적의 절반부를 코팅 완충제 (50 mM 탄산나트륨, pH 9.6; 시그마, 카탈로그 번호 C3041) 중에 희석된 2 ㎍/ml의 항-ABD 염소 항체 (사내 제조됨)로 4℃에서 밤새도록 코팅하였다. 항체 용액을 따라 내고, 웰을 RT에서 1.5 h 동안 100 ㎕의 PBSC (0.5% 카세인으로 보충된 PBS; 시그마(Sigma), 카탈로그 번호 C8654)로 차단시켰다. 차단 용액을 폐기하고, 50 ㎕ 주변 세포질 용액을 웰에 첨가하고, 천천히 진탕시키면서 RT에서 1.5 h 동안 인큐베이션시켰다. 상청액을 따라 내고, 웰을 PBST 0.05%로 4회에 걸쳐 세척하였다. 이어서, PBSC 중 7.7 nM 농도의, 50 ㎕의 비오티닐화된 hIL-6을 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 RT에서 1.5 h 동안 인큐베이션시킨 후, 상기 기술된 바와 같이 세척하였다. 스트렙트아비딘 접합된 HRP (써모 사이언티픽, 카탈로그 번호 N100)를 PBSC 중에 1:30,000로 희석하고, 웰에 첨가한 후, 45 min 동안 인큐베이션시켰다. 상기 기술된 바와 같이 세척한 후, 50 ㎕ 이뮤노퓨어(ImmunoPure) TMB 기질 (써모 사이언티픽, 카탈로그 번호 34021)을 웰에 첨가하고, 플레이트를 제조사의 권고 사항에 따라 처리하였다. 비관련 특이 단백질에 결합하는 Z 변이체를, 상기 비관련 특이 단백질에 대해 검정함으로써 양성 대조군으로서 사용하였고, hIL-6에 대해 검정함으로써 음성 대조군으로서 사용하였다. 블랭크 대조군으로서 주변 세포질 샘플 대신 PBST 0.05%를 첨가하였다. 다중 웰 플레이트 판독기 (빅토르³, 퍼킨 엘머)를 사용하여 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

결과

IL-6 결합 Z 변이체의 파지 디스플레이 선별: 비오티닐화된 hIL-6 및 mIL-6에 대한 파지 디스플레이 선별을 4 사이클에 걸쳐 수행한 후, 개별 클론을 제조하였다.

서열분석: 4회차 선별로부터 무작위로 채집된 클론에 대해 서열분석을 수행하였다. 각 Z 변이체에 고유 식별 번호 #####을 제공하고, 개별 변이체를 Z#####으로 지칭한다. 58개의 잔기 길이인 Z 변이체의 아미노산 서열은 서열번호 1503-1551로서 도 1에 및 서열 목록에 열거되어 있다. 도출된 IL-6 결합 모티프 (BM)는 각 서열에서 8번 위치에서부터 36번 위치까지에 이른다. 각각의 상기 Z 변이체 내의 완전한 3-나선 다발을 구성하는 것으로 예측된, 49개의 아미노산 잔기 길이의 폴리펩티드의 아미노산 서열 (BMod)은 7번 위치에서부터 55번 위치까지에 이른다.

Z 변이체의 ELISA 분석: 4 사이클의 선별 후 수득된 클론을 96 웰 플레이트에서 제조하고, ELISA로 hIL-6 결합 활성에 대해 스크리닝하였다. 적어도 3 x 음성 대조군에 상응하는 신호로 반응을 보이는 모든 클론을 양성 IL-6 결합인자로서 간주하였다. 비관련 단백질에 대해 특이적인 대조군 분자는 특이 단백질에 대해 양성 신호를 보인 반면, hIL-6에 대해서는 어떤 신호도 얻지 못했다.

실시예 2

IL-6 결합 Z 변이체의 제조 및 시험관내 특징 규명

본 실시예에서, Z 변이체의 서브세트를 서브클로닝하고, 제조하고, 경쟁 ELISA 및 세포 검정법으로 기능적으로 평가하였다. 상이한 두 ELISA 검정법을 적용하여 IL-6 결합 Z 변이체가 각각 IL-6과 IL-6Rα 사이의, 또는 IL-6과 gp130 수용체 사이의 특이적인 상호작용을 차단할 수 있는지 여부를 조사하였다. 각각 고전적인 시스-신호전달 경로 및 트랜스-신호전달 경로를 모방하는 상이한 두 세포 검정법을 사용하여 Z 변이체 폴리펩티드의 효력을 평가하였다. 마지막으로, Z 변이체의 서브세트에 대하여 그의 2차 구조를 조사하고, 그의 융점, Tm을 측정하기 위해 원평광 이색성 (CD) 분광법을 수행하였다.

물질 및 방법

Z 변이체의 서브클로닝: 13개의 IL-6 결합 Z 변이체, Z06777 (서열번호 1503), Z06779 (서열번호 1504), Z06789 (서열번호 1505), Z06791 (서열번호 1506), Z06792 (서열번호 1507), Z06799 (서열번호 1508), Z06802 (서열번호 1509), Z06805 (서열번호 1510), Z06809 (서열번호 1511), Z06814 (서열번호 1512), Z06829 (서열번호 1513), Z06834 (서열번호 1514), Z06844 (서열번호 1515)의 DNA를 라이브러리 벡터 pAY02592로부터 증폭시켰다. (또 다른 표적에 결합하는 Z 변이체에 대하여 본질적으로 WO2009/077175에 기술된 바와 같이) 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 N 말단 His₆ 태그를 사용하여 단량체 Z 변이체 분자를 구축하는 서브클로닝 전략법를 적용시켰다. Z 유전자 단편을 발현 벡터 pAY01448으로 서브클로닝하여 코딩된 서열 MGSSHHHHHHLQ-[Z#####]-VD를 얻었다.

5개의 IL-6 결합 Z 변이체의 서브세트, Z06789, Z06799, Z06809, Z06814 및 Z06829, 및 비관련 표적에 결합하는 2개의 대조군 Z 변이체, Z03638 (서열번호 1552) 및 Z04726 (서열번호 1553)을 ABD 변이체 PP013 (서열번호 1554)과 융합하여 서브클로닝하였다. 발현 벡터에 의해 코딩된 구축물은 MGSSLQ-[Z#####]-VDGS-PP013이었다.

배양 및 정제: 각 IL-6 결합 Z 변이체 각각의 유전자 단편을 함유하는 플라스미드로 E. 콜라이 BL21(DE3) 세포 (노바겐(Novagen))를 형질전환시키고, 50 ㎍/ml 카나마이신으로 보충된 800 또는 1,000 ml의 TSB-YE 배지 중 37℃에서 배양하였다. 단백질 발현을 유도하기 위해, IPTG를 OD₆₀₀ = 2에서 최종 농도 0.2 mM로 첨가하고, 37℃에서 추가로 5 h 동안 배양물을 인큐베이션시켰다. 원심분리에 의해 세포를 수거하였다.

His ₆ -태그를 이용한 IL-6 결합 Z 변이체의 정제: 천연(native) 또는 변성 조건하에서 단백질 정제를 수행하였다.

천연 조건하에서의 정제를 하기와 같이 수행하였다: 대략 2-5 g의 각 세포 펠릿을 10 ml PBS 중에 재현탁시켰다. 음파 처리에 의해 세포를 파괴한 후, 원심분리에 의해 세포 부스러기를 제거하고, 각 상청액을, 20 ml 세척 완충제 (46.6 mM Na₂HPO₄, 3.4 mM NaH₂PO₄, 및 300 mM NaCl, pH 7.0)로 평형화된 2 ml 탈론(Talon) 코발트 칼럼 (클론테크(Clontech), 카탈로그 번호 635504) 상에 적용시켰다. 세척 완충제로 세척하여 오염 물질을 제거하고, 이어서, 용리 완충제 (50 mM NaH₂PO₄, 100 mM NaCl, 30 mM HAc 및 70 mM NaAc, pH 5.0)를 이용하여 IL-6 결합 Z 변이체를 용리시켰다.

변성 조건하에서의 정제를 하기와 같이 수행하였다: 대략 2-5 g의 각 세포 펠릿을 10 ml 용해 완충제 (7 M 구아니디늄 히드로클로라이드, 47 mM Na₂HPO₄, 2.65 mM NaH₂PO₄, 10 mM 트리스-HCl, 104 mM NaCl, pH 8.0) 중에 재현탁시키고, 37℃에서 150 rpm으로 2 h 동안 인큐베이션시켰다. 세척 및 용리 단계는 천연 정제에 것과 같되, 단, 상이한 완충제 (세척 완충제: 6 M 구아니디늄 히드로클로라이드, 47 mM Na₂HPO₄, 3.4 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, pH 8.0; 용리 완충제: 6 M 우레아, 0.1 M NaCl, 29.6 mM HAc, 70.4 mM NaAc 및 50 mM NaH₂PO₄, pH 5.0)를 사용하여 수행하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 PD-10 칼럼 (GE 헬쓰케어)을 사용하여 정제된 Z 변이체에서 완충제를 PBS로 교환하였다.

각 단백질의 흡광 계수를 사용하여 280 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 단백질 농도를 측정하였다. 쿠마시 블루(Coomassie Blue)로 염색된 SDS-PAGE에 의해 IL-6 결합 Z 변이체의 순도를 분석하였다.

ABD와 융합된 IL-6 결합 Z 변이체의 정제: 대략 2.5 g의 각 세포 펠릿을, 벤조나제(Benzonase)® (머크(Merck))로 보충된, 20 ml TST-완충제 (25 mM 트리스-HCl, 1 mM EDTA, 200 mM NaCl, 0.05% 트윈20, pH 8.0) 중에 재현탁시켰다. 음파 처리에 의해 세포를 파괴하고, 원심분리에 의해 정화시킨 후, 각 상청액을 1 ml 항-ABD 아가로스와 함께 중력 유동 칼럼 상에 적용시켰다 (WO2014/064237). TST-완충제 및 5 mM NH₄Ac pH 5.5 완충제로 세척한 후, ABD 융합된 Z 변이체를 0.1 M HAc로 용리시켰다. PD-10 칼럼 (GE 헬쓰케어)을 이용하여 PBS (2.68 mM KCl, 137 mM NaCl, 1.47 mM KH₂PO₄, 8.1 mM Na₂HPO₄, pH 7.4)로 완충제를 교환하였다. 이어서, 1 ml 데톡시-겔 엔도톡신 리무빙 칼럼즈(Detoxi-Gel Endotoxin Removing Columns) (피어스(Pierce), 카탈로그 번호 20344) 상에서 ABD 융합된 Z 변이체를 정제하여 낮은 내독소 함량을 확인하였다. 각 단백질의 흡광 계수를 사용하여 280 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 단백질 농도를 측정하였다. 쿠마시 블루로 염색된 SDS-PAGE에 의해 순도를 분석하고, LC/MS 분석을 이용하여 각각의 정제된 Z-ABD 변이체의 아이덴티티를 확인하였다.

결합 부위 분석: 제1 검정법을 사용하여 hIL-6과 인간 IL-6Rα (hIL-6Rα) 사이의 상호작용을 방해하는 IL-6 결합 Z 변이체의 간섭을 평가하였다. 본 실험에서, 96 웰 ELISA 플레이트 면적의 절반부를 2 ㎍/ml 농도의 항-IL-6R 포획 항체 (R&D 시스템즈(R&D Systems))로 코팅하였다. 플레이트를 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시킨 후, 수돗물로 세척하였다. 이어서, 플레이트를 PBSC 중에서 1 h 동안 차단하고, hIL-6Rα (R&D 시스템즈)를 250 ng/ml 농도로 첨가하였다. 플레이트를 RT에서 1.5 h 동안 인큐베이션시킨 후, 200 ㎕ 0.05% 트윈/PBS로 4회에 걸쳐 세척하였다. 별개의 플레이트에서, 13개의 His₆-태그 부착된 Z 변이체 폴리펩티드의 연속 희석액 (농도 범위 500-0.5 nM)을 2.5 nM의 비오티닐화된 hIL-6으로 적정하였다. IL-6Rα 항체 토실리주맙 (로슈(Roche))을 같은 방식으로 제조하고, 비교를 위해 포함시켰다. 이어서, 미리 혼합된, 각각의 Z 변이체 및 비오티닐화된 hIL-6의 복합체를 hIL-6Rα를 함유하는 웰로 옮겼다. 플레이트를 추가로 1.5 h 동안 인큐베이션시킨 후, 4회에 걸쳐 세척하였다. 스트렙트아비딘-HRP (써모 사이언티픽)의 1:8,000 희석액을 첨가하고, 플레이트를 1 h 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 0.05% 트윈/PBS로 최종 4회에 걸쳐 세척하고, 2 M H₂SO₄로 반응을 중단시키기 전 15 min 동안 TMB 기질 (써모 사이언티픽)을 첨가하였다. 마이크로플레이트 판독기 (빅토르³, 퍼킨 엘머)를 사용하여 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

제2 검정법을 사용하여 인간 gp130 (hgp130)과 hIL-6/hIL-6Rα 복합체 사이의 상호작용을 방해하는 IL-6 결합 Z 변이체의 간섭을 평가하였다. 본 실험에서, 96 웰 ELISA 플레이트 면적의 절반부를 4 ㎍/ml 농도의 Fc-융합된 hgp130 (hgp130-Fc)으로 코팅하였다. 플레이트를 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시킨 후, 수돗물로 세척하였다. 이어서, 플레이트를 PBSC 중에서 1 h 동안 차단하였다. 플레이트를 RT에서 1.5 h 동안 인큐베이션시킨 후, 200 ㎕ 0.05% 트윈/PBS로 4회에 걸쳐 세척하였다. 별개의 플레이트에서, 13개의 His₆-태그 부착된 Z 변이체 폴리펩티드의 연속 희석액 (농도 범위 500-0.5 nM)을 고정 농도의 hIL-6/hIL-6Rα (각각 0.5 nM 및 5 nM)로 적정하였다.

IL-6Rα 결합 항체 토실리주맙 (로슈)을 같은 방식으로 제조하고, 비교를 위해 포함시켰다. 이어서, 미리 혼합된, 각각의 Z 변이체 폴리펩티드 및 hIL-6/hIL-6Rα의 복합체를 hgp130을 함유하는 웰로 옮겼다. 플레이트를 1.5 h 동안 인큐베이션시킨 후, 4회에 걸쳐 세척하였다. 비오티닐화된 항-IL-6Rα 항체 (R&D 시스템즈)를 첨가하고, 플레이트를 추가로 1.5 h 동안 인큐베이션시킨 후, 세척하였다. 스트렙트아비딘-HRP (써모 사이언티픽)의 1:8,000 희석액을 첨가하고, 플레이트를 1 h 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 플레이트를 최종 4회에 걸쳐 세척하고, 2 M H₂SO₄로 반응을 중단시키기 전 15 min 동안 TMB 기질 (써모 사이언티픽)을 첨가하였다. 마이크로플레이트 판독기 (빅토르³, 퍼킨 엘머)를 사용하여 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

시험관내 중화 검정법: 고전적 신호전달 경로를 평가하는 제1 검정법은 인간 IL-6, TNF 및 GM-CSF에 대한 반응으로 증식하는 TF-1 세포주를 사용하였다. TF-1 세포를, 10% FCS (기브코(Gibco)), Pen-Strep (론자(Lonza)) 및 2 ng/ml rhGM-CSF (R&D 시스템즈)로 보충된 L-glut (론자)를 포함하는 RPMI1640 중에서 배양하였다. 사용하기 전, 세포를 rhGM-CSF의 부재하에 RPMI1640 중에서 2회에 걸쳐 세척하였다. 이어서, 세포를 계수하고, 웰당 4x10⁴개의 세포인 밀도로 96 웰 바닥이 평평한 플레이트에 분배하였다. 별개의 플레이트에서, 0.099 nM rhIL-6 (R&D 시스템즈, 영국)의 존재하에서 억제 화합물 (His₆-태그를 포함하거나 (농도 범위 1,000-0.1 nM), 또는 ABD 변이체 PP013 (서열번호 1554; 농도 범위 200-0.007 nM)과 융합된 IL-6 결합 Z 변이체), 및 IL-6Rα 결합 항체 토실리주맙 (로슈; 농도 범위 200-0.007 nM)의 일련의 희석액을 인큐베이션시켰다. 추가로, ABD-융합된 변이체를 9 μM rhHSA (노보자임즈(Novozymes))와 함께 또는 그의 부재에서 인큐베이션시켰다. 이어서, 미리 혼합된, Z 변이체 폴리펩티드 및 hIL-6의 복합체를 TF-1 세포를 함유하는 웰로 옮기고, 이를 습윤화된 5% CO₂ 대기 중 37℃에서 72 h 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 마지막 4시간 동안, 웰당 10 ㎕의 CCK-8 (플루카(Fluka), 시그마 알드리치(Sigma Aldrich))을 첨가하여 증식 세포의 개수를 측정하였다. 마이크로플레이트 판독기 (빅토르³, 퍼킨 엘머)를 사용하여 450 nm에서의 흡광도 (Abs450)를 측정하였다. 4-파라미터 용량-반응 곡선으로의 비선형 회귀에 의해 세포 성장에 관한 데이터를 평가하고, 그래프패드프리즘 프로그램을 사용하여 반수 최대 억제 농도 (IC50)를 측정하였다. 억제성 분자에 의해 TF-1 세포의 IL-6-의존적 증식 억제는 Abs450에서 hIL-6을 제외한 세포를 함유한 대조군 웰을 감산한 값과 같았다.

트랜스-신호전달 경로를 다루기 위해, 제2 검정법을 사용ㅎ였다. 여기서, 인간 제대정맥 내피 세포 (HUVEC)를 hIL-6 및 가용성 hIL-6Rα로 자극시켰고, 판독값은 단핵구 화학주성인자 단백질-1 (MCP-1)의 생산이었다. HUVEC (론자)를 EGM-2 블릿 키트 매질 (론자) 중에서 성장시키고, 8회 이하로 배양물 중에서 계대접종(passaged)하였다. 사용 전 전면생장률(confluence)이 75%가 될 때까지 세포를 성장시켰다. 트립신/EDTA (론자)를 이용하여 세포를 분리시키고, 재현탁시키고, 새 배지 중에서 1회에 걸쳐 세척하였다. 이어서, 세포를 계수하고, 웰당 2 x 10⁴개의 세포인 밀도로 96 웰 바닥이 평평한 플레이트에 분배하였다. 세포를 습윤화된 5% CO₂ 대기 중 37℃에서 밤새도록 배양하였다. 별개의 플레이트에서, ABD 변이체 PP013 (서열번호 1554)과 융합된 IL-6 결합 Z 변이체 Z06789, Z06799, Z06809, Z06814 및 Z06829, 다른 표적에 결합하는 PP013-융합된 음성 대조군 Z03638 (서열번호 1552)의 일련의 희석액 (100-0.0015 nM), 및 토실리주맙 (로슈)의 일련의 희석액 (200-0.003 nM)을 9 μM rhHSA (노보자임즈)와 함께 또는 그의 부재에서 재조합 hIL-6 (10 ng/ml; 0.5 nM) 및 200 ng/ml (5.6 nM) 고정 농도의 가용성 hIL-6Rα의 존재하에서 인큐베이션시켰다. 이어서, 시험 분자 및 hIL-6/hIL-6Rα와 함께 미리 혼합된 용액을 HUVEC를 함유하는 웰로 옮기고, 이를 습윤화된 5% CO₂ 대기 중 37℃에서 24 h 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 기간 후, 무세포 상청액을 수집하고, MCP-1 듀오세트(Duoset) ELISA 개발 시스템 (R&D 시스템즈)을 사용하여 샌드위치 ELISA에 의해 인간 MCP-1 수준을 측정하였다.

MCP -1 ELISA: 96 웰 ELISA 플레이트 면적의 절반부를 1 ㎍/ml 농도의 항-MCP-1 포획 항체 (R&D 시스템즈)로 코팅하였다. 플레이트를 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시키고, 수돗물에서 2회에 걸쳐 세척하고, PBSC 중에서 1 h 동안 차단시켰다. 이어서, 표준 및 샘플을 첨가하기 전에, 플레이트를 4 x 200 ㎕ 0.05% 트윈/PBS로 4회에 걸쳐 세척하였다. 플레이트를 RT에서 2 h 동안 인큐베이션시키고, 세척한 후, 0.1 ㎍/ml 비오티닐화된 항-MCP-1 항체 (R&D 시스템즈)를 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 추가로 1.5 h 동안 인큐베이션시킨 후, 4회에 걸쳐 세척하였다. 이어서, 스트렙트아비딘-HRP (써모 사이언티픽)의 1:8,000 희석액을 첨가하고, 플레이트를 1 h 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 최종 4회에 걸쳐 세척하고, 2 M H₂SO₄로 반응을 중단시키기 전 20 min 동안 TMB 기질 (써모 사이언티픽)을 첨가하였다. 마이크로플레이트 판독기 (빅토르³, 퍼킨 엘머)를 사용하여 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

CD 분석: 정제된 His₆-태그 부착된 Z 변이체 서브세트를 PBS 중에서 0.5 mg/ml로 희석하였다. 각각의 희석된 Z 변이체에 대해, 20℃에서 250-195 nm에서의 CD 스펙트럼을 수득하였다. 추가로, 융점(Tm)을 측정하기 위해 다양한 온도 측정 (VTM)을 수행하였다. VTM에서, 5℃/min 온도 기울기로 온도를 20℃에서 90℃로 승온시키면서, 221 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 광로 길이가 1 mm인 셀을 사용하여, 자스코(Jasco) J-810 분광편광계 (자스코 스칸디나비아 AB(Jasco Scandinavia AB))에서 CD 측정을 수행하였다.

결과

배양 및 정제: N 말단 His₆ 태그로 구축된 13개의 IL-6 결합 Z 변이체 (서열번호 1503-1515)를 E. 콜라이에서 제조하였다. 280 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 분광광도법에 의해 측정된, 대략 2-5 g 박테리아 펠릿으로부터의 IMAC-정제된 단백질의 양의 범위는 상이한 IL-6 결합 Z 변이체에 대하여 대략 10 mg 내지 20 mg이었다. 대략 2.5 g 박테리아 펠릿으로부터, ABD 변이체 PP013 (서열번호 1554)에 융합된 5개의 Z 변이체 2 mg 내지 12 mg을 수득하였다. 각각의 최종 단백질 제제를 SDS-PAGE 분석한 결과, 상기 단백질 제제는 주로 IL-6 결합 Z 변이체를 함유하는 것으로 나타났다. 각 IL-6 결합 Z 변이체의 정확한 아이덴티티 및 분자량은 HPLC-MS 분석에 의해 확인하였다.

결합 부위 분석: 별개의 두 경쟁 ELISA 실험에서 (i) hIL-6과 hIL-6Rα 또는 (ii) hgp130과 미리 형성된 hIL-6/hIL-6Rα 복합체 사이의 상호작용을 방해할 수 있는 13개의 시험된 IL-6 결합 His₆-태그 부착된 Z 변이체의 능력을 조사하였다. hIL-6/hIL-6Rα 상호작용 차단에 대해 시험하였을 때, 13개의 Z 변이체 중 어느 것도 임의의 유의적인 효과도 보이지 않았다 (도 2). 그러나, 모든 Z 변이체는 미리 형성된 hIL-6/hIL-6Rα와 hgp130 사이의 상호작용, 즉, 트랜스-신호전달 유사 상호작용(trans-signaling-resembling interaction)을 농도에 의존하는 방식으로 뚜렷하게 차단하는 것으로 나타났다 (도 3). 각 Z 변이체에 대해 계산된 IC50 값은 하기 표 3에 제시되어 있다. 비교를 위해 포함된 항체 토실리주맙은 두 실험 모두에서 차단 효과를 보였다.

시험관내 중화 검정법: 각각 고전적 신호전달 경로 및 트랜스-신호전달 경로에서 IL-6 의존적 신호전달을 차단할 수 있는 IL-6 결합 Z 변이체의 능력을 조사하기 위해 상이한 두 세포 검정법을 사용하였다. 고전적 신호전달 경로를 평가하는 제1 검정법은 인간 IL-6, TNF 및 GM-CSF에 대한 반응으로 증식하는 TF-1 세포주를 사용하였다. gp130으로 불리는 신호전달 수용체 서브유니트와 함께 세포 표면 IL-6 수용체에 대한 IL-6의 직접적인 신호전달이 시스-신호전달로 명명된다. 본 검정법에서, 13개의 변이체 모두 TF-1 세포의 IL-6 의존적 성장을 차단할 수 있는 것으로 나타났다. His₆-태그 부착된 Z 변이체 및 ABD 변이체 PP013 (서열번호 1554)에 재조합적으로 융합된 Z 변이체 뿐만 아니라, 비교를 위해 포함된, hIL-6Rα 결합 항체 토실리주맙에 대한 계산된 IC50 값은 하기 표 4에 제시되어 있다.

트랜스-신호전달 경로 또한 세포 기반 시스템에서 차단될 수 있는지 여부를 조사하기 위해, gp130을 발현하는 인간 제대정맥 내피 세포 (HUVEC)를 이용하는 제2 검정법을 수행하였다. HUVEC를 미리 형성된 hIL-6/hIL-6Rα 복합체와 함께 인큐베이션시켰을 때, 단핵구 화학주성인자 단백질-1 (MCP-1)의 IL-6 트랜스-신호전달 의존적 분비가 이루어졌고, 이를 통해 IL-6 결합 Z 변이체의 임의의 트랜스-신호전달 차단 능력을 분석할 수 있었다. 본 검정법에서, ABD 변이체 PP013 (서열번호 1554)에 재조합적으로 융합된 5개의 Z 변이체를 HSA의 존재하에서 분석하였다. hIL-6Rα 결합 항체 토실리주맙은 비교를 위해 포함시켰다. 조사된 5개의 Z 변이체 모두 트랜스-신호전달을 억제시키는 것으로 나타났다. (도 4). 한 변이체인 Z06814-ABD는 토실리주맙보다 효능이 더욱 강력한 것으로 나타났고, 대략적인 IC50 값은 토실리주맙의 경우, 5 nM인 것과 비교하였을 때, 1 nM인 것으로 나타났다.

CD 분석: 7개의 Z 변이체에 대해 측정된 CD 스펙트럼 결과, 각각이 20℃에서 α-나선 구조를 가지는 것으로 나타났다. 다양한 온도 측정을 통해 측정된 융점 (Tm)은 하기 표 5에 제시되어 있다.

실시예 3

IL-6 결합 Z 변이체의 제1 성숙 라이브러리의 디자인 및 구축

본 실시예에서는, 성숙 라이브러리를 구축하였다. 라이브러리는 새로운 IL-6 결합 Z 변이체의 선별을 위해 사용되었다. 성숙 라이브러리로부터의 선별은 결합인자의 친화도를 증가시키는 것으로 예상된다 (문헌 [Orlova et al., (2006) Cancer Res 66(8):4339-48]). 본 연구에서는 스플릿-풀(split-pool) 합성을 사용하여 무작위화된 단일 가닥 링커를 생성하였고, 이를 통해, 합성에서 원하는 위치에 정의된 코돈을 도입할 수 있었다.

물질 및 방법

라이브러리 디자인: 라이브러리는 실시예 1 및 2에 기술된 IL-6 결합 Z 변이체의 서열의 선별에 기초하였다. 새 라이브러리에서, 서열번호 1503-1551에서 정의된 Z 변이체 서열에 기초한 전략법에 따라, Z 분자 스캐폴드 중 12개의 가변 위치는 특정 아미노산 잔기 쪽으로 편향되어 있었고, 한 위치는 일정하게 유지되었다. 스플릿-풀 합성을 사용하여, Z 변이체 아미노산 서열의 부분적으로 무작위화된 나선 1 및 2를 코딩하는, 147 bp의 DNA 링커를 생성하였다. 따라서, 제한 부위 XhoI 및 SacI 측면에 위치하는, 5'-AA ATA AAT CTC GAG GTA GAT GCC AAA TAC GCC AAA GAA NNN NNN NNN GCG TGG NNN GAG ATC NNN NNN CTG CCT AAC CTC ACC NNN NNN CAA NNN NNN GCC TTC ATC NNN AAA TTA NNN GAT GAC CCA AGC CAG AGC TCA TTA TTT A-3' (서열번호 1560; 무작위화된 코돈은 NNN으로 표시)을 DNA 2.0 (미국 캘리포니아주 멘로 파크)으로부터 정돈하였다. Z 분자 스캐폴드 중 12개의 가변 Z 위치 (9, 10, 11, 14, 17, 18, 24, 25, 27, 28, 32 및 35)를 포함하는, 새 라이브러리 중의 아미노산 잔기의 이론적 분포는 하기 표 6에 제시되어 있다. 생성된 이론적 라이브러리 크기는 3.6 x 10⁹개의 변이체이다.

라이브러리 구축: 12 사이클의 PCR 동안 앰플리Taq 골드(AmpliTaq Gold) 폴리머라제 (어플라이드 바이오시스템즈, 카탈로그 번호 4311816)를 사용하여 라이브러리를 증폭시키고, QIA퀵 PCR 퓨리피케이션 키트(QIAquick PCR Purification Kit) (퀴아젠(QIAGEN), 카탈로그 번호 28106)를 사용하여 공급업체의 권고 사항에 따라 풀링된 생성물을 정제하였다. 무작위화된 라이브러리 단편으로 이루어진 정제된 풀을 제한 효소 XhoI 및 SacI-HF (뉴 잉글랜드 바이오랩스, 카탈로그 번호 R0146L, 및 카탈로그 번호 R3156M)로 분해시키고, PCR 퓨리피케이션 키트 (퀴아젠, 카탈로그 번호 28106)를 사용하여 농축시켰다. 이어서, 생성물을 분취용 2.5% 아가로스 겔 (누이시브(Nuisieve) GTC 아가로스, 캄브렉스(Cambrex), 인비트로겐) 상에서 전개시키고, 퀴아젠 겔 추출 키트 (퀴아젠, 카탈로그 번호 28706)를 사용하여 공급업체의 권고 사항에 따라 정제하였다.

(본질적으로 문헌 [Groenwall et al, 상기 문헌 동일]에 기술된 pAffi1과 같은) 파지미드 벡터 pAY02592를 같은 효소로 제한하고, 페놀/클로로포름 추출 및 에탄올 침전을 이용하여 정제하였다. RT에서 2 h 동안 T4 DNA 리가제 (퍼멘타스, 카탈로그 번호 EL0011)를 이용하여 제한된 단편 및 벡터를 5:1 몰비로 라이게이션시킨 후, 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 페놀/클로로포름 추출 및 에탄올 침전에 의해 라이게이션된 DNA를 회수한 후, 10 mM 트리스-HCl, pH 8.5 중에 용해시켰다. 따라서, 벡터 pAY02592 내의 생성된 라이브러리는, 각각이 연쇄상구균 단백질 G로부터 유래된 알부민 결합 도메인 (ABD)에 융합된 Z 변이체를 코딩하였다.

라이게이션 반응물 (대략 160 ng DNA/형질전환)을 전기적격(electrocompetent) E. 콜라이 ER2738 세포 (50 ㎕, 루시겐(Lucigen: 미국 위스콘신주 미들턴)) 내로 전기천공시켰다. 전기천공 직후, (ER2738 세포로 보충된) 대략 1 ml의 회수 배지를 첨가하였다. 형질전환된 세포를 37℃에서 60 min 동안 인큐베이션시켰다. 적정 및 형질전환체 개수 측정을 위해 샘플을 취하였다. 이어서, 세포를 풀링하고, 2% 글루코스, 10 ㎍/ml 테트라시클린 및 100 ㎍/ml 암피실린으로 보충된, 1 ℓ의 TSB-YE 배지 중에서 37℃에서 밤새도록 배양하였다. 세포를 4,000 g로 7 min 동안 펠릿화하고, PBS/글리세롤 용액 (대략 40% 글리세롤) 중에 재현탁시키고, 분취하고, -80℃에서 보관하였다. 라이브러리 디자인과 비교하여 구축된 라이브러리의 결과를 평가하고, 내용물을 확인하기 위해, Z 변이체의 라이브러리로부터의 클론을 서열분석하였다. 서열분석은 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행하고, 아미노산 분포를 확인하였다.

파지 스톡 제조: 파지미드 라이브러리를 함유하는 파지 스톡을 20 ℓ 발효조 (벨라치 바이오테크니크)에 제조하였다. 파지미드 라이브러리를 함유하는 글리세롤 스톡으로부터의 세포를 1 g/ℓ 글루코스, 100 mg/ℓ 암피실린 및 10 mg/ℓ 테트라시클린으로 보충된 10ℓ의 TSB-YE (트립틱 소이 브로쓰-이스트 익스트랙트; 30 g/ℓ TSB, 5 g/ℓ 효모 추출물)에 접종하였다. 세포의 600 nm에서의 광학 밀도 (OD₆₀₀)가 0.64에 도달하였을 때, 5 x 몰 과량의 M13K07 헬퍼 파지를 이용하여 대략 1.1 ℓ의 배양물을 감염시켰다. 세포를 30 min 동안 인큐베이션시켰고, 그 후, 발효조를 복합 발효 배지 [2.5 g/ℓ (NH₄)₂SO₄; 5.0 g/ℓ 효모 추출물; 30 g/ℓ 트립톤, 2 g/ℓ K₂HPO₄; 3 g/ℓ KH₂PO₄, 1.25 g/ℓ; Na₃C₆H₅O₇ · 2 H₂O; 브레옥스(Breox) FMT30 소포제 0.1 ml/ℓ]로 최대 10 ℓ까지 충전시켰다. 하기 성분을 첨가하였다: 10 ml 카르베니실린 25 mg/ml; 5 ml 카나마이신 50 mg/ml; 1 ml 1 M 이소프로필-β-D-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG); 17.5 ml/ℓ의 300 g/ℓ MgSO₄ 및 5 ml의 미량 원소 용액 [35 g/ℓ FeCl₃·6 H₂O; 10.56 g/ℓ ZnSO₄·7 H₂O; 2.64 g/ℓ CuSO₄·5 H₂O; 13.2 g/ℓ MnSO₄·H₂O; 13.84 g/ℓ CaCl₂·2 H₂O, 1.2 M HCl 중 용해된 것]. 반응기에 600 g/ℓ 글루코스 용액을 공급한 글루코스 제한된 유가 배양(fed-batch)을 시작하였다 (시작 시점에 3.5 g/h, 20 h 후 및 배양 종료시까지, 37.5 g/h). 25% NH₄OH 자동 첨가를 통해 pH를 pH 7로 조절하였다. 대기를 보충하고 (5 ℓ/min), 교반기를 500 rpm로 설정하였다. 24 h의 유가 배양 후, OD₆₀₀은 22였다. 15,900 g로 원심분리하여 배양물 중 세포를 펠릿화하였다. 실시예 1에 기술된 바와 같이 PEG/NaCl 중 상청액으로부터 2회에 걸쳐 파지 입자를 침전시키고, 여과하고, PBS 및 글리세롤 중에 용해시켰다. 선별에서 사용할 때까지 파지 스톡을 -80℃에서 보관하였다.

결과

라이브러리 구축: 결합 특성이 확인된 IL-6 결합 Z 변이체 세트에 기초하여 새 라이브러리를 디자인하였다 (실시예 1 및 2). 디자인된 라이브러리의 이론상의 크기는 3.6 x 10⁹개의 Z 변이체였다. E. 콜라이 ER2738 세포에의 형질전환 후 적정에 의해 측정된, 라이브러리의 실제 크기는 3.5 x 10⁹개의 형질전환체였다.

192개의 형질전환체의 서열분석에 의해, 및 그의 실제 서열을 이론상의 디자인과 비교함으로써 라이브러리 품질을 시험하였다. 디자인된 라이브러리와 비교된 실제 라이브러리의 내용물은 만족스러운 것으로 나타났다. 따라서, 잠재적인 결합인자의 IL-6에의 성숙 라이브러리가 성공적으로 구축되었다.

실시예 4

제1 성숙 라이브러리로부터의 Z 변이체의 선별, 스크리닝 및 특징 규명

물질 및 방법

성숙화된 IL-6 결합 Z 변이체의 파지 디스플레이 선별: 표적 단백질 hIL-6 (R&D 시스템즈, 카탈로그 번호 206-IL/CF) 및 mIL-6 (앱노바(Abnova), 카탈로그 번호 P4346 Il6)을 실시예 1에 기술된 바와 같이 비오티닐화하였다. 실시예 3에 기술된 Z 변이체 분자의 새 라이브러리를 사용하여, 인간 제대정맥 내피 세포에 기술된 바와 같이, 단, 하기 사항을 예외로 하여 4 사이클로 hIL-6 및 mIL-6에 대해 파지 디스플레이 선별을 수행하였다. 선별시, 우태아 혈청 (FCS, 기브코, 카탈로그 번호10108-165) 및 인간 혈청 알부민 (HSA, 알부컬트(Albucult), 노보자임즈, 카탈로그 번호 230-005)을 각각 10% 및 1.5 μM인 최종 농도로 선별 완충제 중에 첨가하였다. 선별에서 사용된 모든 튜브 및 비드는 모두 3% BSA로 보충된 PBST 0.1%로 미리 차단시켰다. 사이클 1A에서, 파지 스톡을 SA-비드와 함께 인큐베이션시킴으로써 사전 선별 단계를 수행하였다. 모든 트랙에 대한 사이클 1에서 선별 부피는 2 ml였다. 파지-표적 복합체의 포획을 위해, 4 ㎍ 비오티닐화된 hIL-6 또는 mIL-6당 1 mg 비드를 사용하였다.

사이클 1 중 6개의 트랙 (1-6)을 제2 사이클 또는 제3 사이클로 나누어, 통틀어, 사이클 2 중 7개의 트랙 (1-1 내지 6-2), 사이클 3 중 12개의 트랙 (1-1-1 내지 6-2-1) 및 사이클 4 중 12개의 트랙 (1-1-1-1 내지 6-2-1-1)을 얻었다.

결합된 파지 입자는 2가지 다른 방법을 사용하여 용리시켰다; 1) 500 ㎕ 0.1 M 글리신-HCl, pH 2.2, 이어서, 50 ㎕ 1 M 트리스-HCl, pH 8.0, 및 450 ㎕ PBS로 즉시 중화, 또는 2) 500 ㎕의 100 mM 인산나트륨 및 150 mM 염화나트륨, pH 5.5 및 500 ㎕ PBS로 중화.

강하된 표적 농도 및 증가된 세척 횟수를 사용하여 수득된 후속 사이클에서의 증가된 엄격도를 기술하는, 선별 전략법에 관한 개요는 하기 표 7에 제시되어 있다.

파지 입자 증폭: 선별 사이클 1과 2 사이의 파지 입자의 증폭은 본질적으로 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행하되, 단, 하기 사항은 예외로 하였다. E . 콜라이 ER2738을 파지 증폭을 위해 사용하였고, M13K07 헬퍼 파지를 5 x 과량으로 사용하였다. 하기 사항에 따라 용액 중 박테리아의 감염에 의해 선별 사이클 2과 4 사이의 파지 입자의 증폭을 수행하였다. 파지 입자로 로그기(log phase) E. 콜라이 ER2738을 감염시킨 후, 2% 글루코스, 10 ㎍/ml 테트라시클린 및 100 ㎍/ml 암피실린으로 보충된 TSB를 첨가한 후, 37℃에서 30 min 동안 회전시키면서, 인큐베이션시켰다. 이후, 박테리아를 M13K07 헬퍼 파지로 감염시켰다. 감염된 박테리아를 원심분리에 의해 펠릿화하고, 100 μM IPTG, 25 ㎍/ml 카나마이신 및 100 ㎍/ml 암피실린으로 보충된 TSB-YE 배지 중 재현탁시키고, 30℃에서 밤새도록 성장시켰다. 밤새도록 배양한 배양물을 원심분리하고, 상청액 중 파지 입자를 PEG/NaCl 완충제로 2회에 걸쳐 침전시켰다. 마지막으로, 파지 입자를 선별 완충제 중에 재현탁시킨 후, 다음 선별 사이클로 진입하였다. 최종 선별 사이클에서, 로그기 박테리아를 용리액으로 감염시키고, 희석시킨 후, ELISA 스크리닝에서 사용하기 위한 단일 콜로니를 형성하기 위해, 0.2 g/ℓ 암피실린으로 보충된 TBAB 플레이트 (30 g/ℓ 트립토스 혈액 아가 베이스, 옥소이드(Oxoid) 카탈로그 번호 CMO233B) 상에 도말하였다.

잠재적인 결합인자의 서열분석: 서열분석을 위해 상이한 선별 트랙으로부터의 개별 클론을 채취하였다. ELISA 스크리닝에서 전개된 모든 클론을 서열분석하였다. 본질적으로 실시예 1에 기술된 바와 같이 유전자 단편의 증폭 및 유전자 단편의 서열 분석을 수행하였다.

Z 변이체의 ELISA 스크리닝: (Z 변이체 ABD 융합 단백질로서 발현된) Z 변이체를 함유하는 단일 콜로니를 IL-6 성숙 라이브러리의 선별된 클론으로부터 무작위적으로 채취하고, 실시예 1에 기술된 바와 같이 배양하였다. 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행하되, 단, 예외적으로 6회에 걸친 냉동 해동 사이클을 거쳐 주변 세포질 상청액을 제조하였다. 0.58 nM 농도의 비오티닐화된 hIL-6을 사용하여 본질적으로 실시예 1에 기술된 바와 같이 ELISA 스크리닝을 수행하였다. 1차 IL-6 결합인자 Z06814의 주변 세포질 분획을 양성 대조군으로서 사용하였다. 음성 대조군은 오직 ABD만을 함유하는 주변 세포질을 사용함으로써 음성 대조군을 생성하였다.

인간 IL-6 결합인자의 ELISA EC50 분석: IL-6 결합인자의 선별물을 상기 기술된 바와 같이 ELISA를 사용하여 비오티닐화된 hIL-6 희석액 시리즈에의 반응에 대해 분석하였다. 비오티닐화된 단백질을 25 nM 농도로 첨가하고, 1:3으로 단계식으로 하향으로 11 pM까지 희석시켰다. 배경 대조군으로서 표적 단백질을 첨가하지 않고, Z 변이체 모두를 또한 검정하였다. 1차 IL-6 결합인자 Z06814 (서열번호 1512)를 함유하는 주변 세포질 샘플을 포함하고, 양성 대조군으로서 분석하였다. 음성 대조군으로서, 오직 ABD만을 함유하는 주변 세포질은 비오티닐화된 hIL-6에 대하여 검정하였다. mIL-6, Z11612 (서열번호 151) 및 Z11616 (서열번호 152)에 대한 선별로부터 기원하는 두 결합인자를 상기 기술된 비와 같이 ELISA를 사용하여 비오티닐화된 mIL-6의 희석액 시리즈에의 반응에 대하여 분석하였다. 비오티닐화된 단백질을 227 nM 농도로 첨가하고, 1:3으로 단계식으로 하향으로 104 pM까지 희석시켰다. 그래프패드 프리즘 5 및 비선형 회귀를 사용하여 수득된 값을 분석하였다.

결과

성숙한 IL-6 결합 Z 변이체의 파지 디스플레이 선별: 각각 4 사이클을 포함하는 총 12개의 병렬 트랙으로 선별을 수행하였다. 상이한 선별 트랙은 표적 농도, 표적 유형 (hIL-6 또는 mIL-6), 선별 시간, 세척 조건 및 용리 완충제의 pH를 달리하였다.

서열분석: 무작위적으로 채취된 클론을 서열분석하였다. 실시예 1에 기술된 바와 같이, 각 개별 Z 변이체에 식별 번호 Z#####을 제공하였다. 통틀어, 809개의 새로운 고유 Z 변이체 분자가 확인되었다.

58개의 잔기 길이인 Z 변이체의 아미노산 서열은 서열번호 7, 서열번호 15-89 및 서열번호 151-871로서 도 1에 및 서열 목록에 열거되어 있다. 도출된 IL-6 결합 모티프 (BM)는 각 서열에서 8번 위치에서부터 36번 위치까지에 이른다. 각각의 상기 Z 변이체 내의 완전한 3-나선 다발을 구성하는 것으로 예측된, 49개의 아미노산 잔기 길이의 폴리펩티드의 아미노산 서열 (BMod)은 7번 위치에서부터 55번 위치까지에 이른다.

Z 변이체의 ELISA 스크리닝: 4 선별 사이클 후 수득된 클론을 96 웰 플레이트에서 제조하고, ELISA를 사용하여 hIL-6 결합 활성에 대해 스크리닝하였다. 무작위적으로 채취된 모든 클론을 분석하였다. 809개의 고유 Z 변이체 중 796개가 0.58 nM 농도에서 hIL-6에 대하여 3 x 음성 대조군 또는 그보다 높은 반응 (0.3-2.1 AU)을 보이는 것으로 나타났다. 선별 표적으로서 hIL-6을 사용한 모든 선별 트랙으로부터의 클론은 양성 신호를 보였다. 음성 대조군은 0.078-0.102 AU의 흡광도를 보였다. 대표적인 플레이트 세트의 블랭크 대조군의 평균 반응은 0.087 AU였다.

IL-6 결합인자의 ELISA EC50 분석: 상기 기술된 ELISA 실험의 결과 (각각 각 플레이트에서의 양성 대조군에 대하여 정규화된 최고 ELISA 값)에 기초하여 Z 변이체의 서브세트를 선별하였고, ELISA 포맷으로 표적 적정을 수행하였다. 주변 세포질 샘플을 비오티닐화된 hIL-6 또는 mIL-6의 연속 희석액과 인큐베이션시켰다. 양성 대조군으로서 1차 결합인자 Z06814 (서열번호 1512)를 포함하는 주변 세포질 샘플 또한 hIL-6에 대해 검정하였다. 수득된 값을 분석하고, 그의 각 EC50 값을 계산하였다 (하기 표 8 및 9).

실시예 5

IL-6 결합 Z 변이체의 제2 성숙 라이브러리의 디자인 및 구축

본 실시예에서는, 본질적으로 실시예 4에 기술된 바와 같이 제2 성숙 라이브러리를 구축하였다. 라이브러리는 IL-6 결합 Z 변이체의 선별을 위해 사용되었다.

물질 및 방법

라이브러리 디자인: 라이브러리는 주로 실시예 4에 기술된 인간 IL-6 결합 Z 변이체의 서열의 선별에 기초하였다. 새 라이브러리에서, Z 분자 스캐폴드 중 13개의 가변 위치는 주로 제1 성숙화로부터의 Z 변이체에 기초한 전략법에 따라 특정 아미노산 잔기 쪽으로, 즉, 서열번호 7, 서열번호 15-89 및 서열번호 151-871에 정의된 서열로 편향되어 있었다. 콜리브라(Colibra)™ 기술에 의해 무작위화된 이중 가닥 링커를 생성하였고, 이를 통해 라이게이션을 사용하여 무작위화된 트리뉴클레오티드 빌딩 블록 세트를 도입할 수 있고, 이어서, 구축된 이중 가닥 DNA를 제한할 수 있다. 제한 부위 XhoI 및 SacI 측면에 위치하는, Z 변이체 아미노산 서열의 부분적으로 무작위화된 나선 1 및 2를 코딩하는 이중 가닥 DNA, 5'-AA ATA AAT CTC GAG GTA GAT GCC AAA TAC GCC AAA GAA NNN NNN NNN GCT NNN NNN GAG ATC NNN NNN CTG CCG AAC CTG ACC NNN NNN CAG NNN NNN GCC TTC ATC NNN AAA TTA NNN GAT GAC CCA AGC CAG AGC TCA TTA TTT A-3' (서열번호 1561; 무작위화된 코돈은 NNN으로 표시)의 라이브러리를 이소게니카(Isogenica) (엑섹스(Essex: 영국))로부터 정돈하였다. Z 분자 스캐폴드 중 8개의 가변 아미노산 위치 (10, 11, 14, 18, 24, 25, 27 및 32) 및 5개의 불변 아미노산 위치 (9, 13, 17, 28, 및 35)를 포함하는 새 라이브러리 중의 아미노산 잔기의 이론적 분포는 하기 표 10에 제시되어 있다. 생성된 이론적 라이브러리 크기는 2.6 x 10⁷개의 변이체였다.

라이브러리 구축 및 파지 스톡 제조: 본질적으로 실시예 3에 기술된 바와 같이, 라이브러리를 구축하였다. 실시예 3에 기술된 바와 같이, 라이브러리의 파지 스톡을 제조하였다.

결과

라이브러리 구축 및 파지 스톡 제조: 결합 특성이 확인된 IL-6 결합 Z 변이체 세트에 기초하여 새 라이브러리를 디자인하였다 (실시예 4). 디자인된 라이브러리의 이론상의 크기는 2.6 x 10⁷개의 Z 변이체였다. E. 콜라이 ER2738 세포에의 형질전환 후 적정에 의해 측정된, 라이브러리의 실제 크기는 1.8 x 10⁹개의 형질전환체였다.

192개의 형질전환체의 서열분석에 의해, 및 그의 실제 서열을 이론상의 디자인과 비교함으로써 라이브러리 품질을 시험하였다. 이론상의 라이브러리와 비교된 실제 라이브러리의 내용물은 만족스러운 것으로 나타났다. 따라서, 잠재적인 결합인자의 IL-6에의 성숙 라이브러리가 성공적으로 구축되었다.

실시예 6

제2 성숙 라이브러리로부터의 Z 변이체의 선별, 스크리닝 및 특징 규명

물질 및 방법

성숙한 IL-6 결합 Z 변이체의 제2 파지 디스플레이 선별: 표적 단백질 hIL-6을 실시예 4에 기술된 바와 같이 비오티닐화하였다. 실시예 5에 기술된 Z 변이체 분자의 제2 성숙 라이브러리를 사용하여, 본질적으로 실시예 4에 기술된 바와 같이, 단, 하기 사항을 예외로 하여 hIL-6에 대해 파지 디스플레이 선별을 수행하였다. 모든 트랙에 대한 사이클 1에서 선별 부피는 4 ml였다. 사이클 2에서, 선별 트랙 1-2 및 1-3은 하나의 공동 튜브에서 취급하였고, 최종 1 min 동안 세척 후까지 분리시키지 않았으며, 그 후에 따로따로 처리하였다. 또한 사이클 4에서도, 선별 트랙 1-1-1-1 내지 1-1-1-3, 1-1-1-4 내지 1-1-1-6, 1-1-2-1 내지1-1-2-3 및 1-1-2-4 내지 1-1-2-6의 각 세트를 각각 하나의 공동 튜브에서 취급하였고, 마지막 1 min 후 3개의 별개의 튜브로 분리하고, 그 이후, 하기 표 11에 개략적으로 설명된 상이한 세척 전략법을 사용하여 별개로 처리하였다. 결합된 파지 입자를 실시예 1에 기술된 바와 같이, 글리신-HCl, pH 2.2를 사용하여 용리시켰다. 선별 사이클 사이의 파지 입자의 증폭은 본질적으로 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행하였다.

표적 농도 강하 및 세척 횟수 증가면에 있어서 선별 트랙의 차이를 기술하는, 사용된 선별 전략법 및 파라미터에 관한 개요는 하기 표 11에 제시되어 있다.

잠재적인 결합인자의 서열분석: 서열분석을 위해 상이한 선별 트랙으로부터의 개별 클론을 채취하였다. ELISA 스크리닝에 적용된 모든 클론을 서열분석 하였다. 본질적으로 실시예 1에 기술된 바와 같이 유전자 단편의 증폭 및 유전자 단편의 서열 분석을 수행하였다.

Z 변이체의 ELISA 스크리닝: (실시예 1에 기술된 바와 같이 Z 변이체 ABD 융합 단백질로서 발현된) Z 변이체를 함유하는 단일 콜로니를 IL-6 제2 성숙 라이브러리의 선별된 클론으로부터 무작위적으로 채취하고, 실시예 1에 기술된 바와 같이 배양하였다. 주변 세포질 상청액의 제조 및 ELISA 스크리닝을 본질적으로 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행하였고, 냉동 해동 사이클은 150 ㎕ PBST 0.05% 중에서 수행하였고, 8회 반복하였다. 비오티닐화된 hIL-6을 0.25 nM 농도로 사용하였다. IL-6 결합인자 Z06814 (서열번호 1512)의 주변 세포질 분획을 이중으로 각 ELISA 플레이트에서 양성 대조군으로서 사용하였다. 음성 대조군으로서, 오직 ABD만을 함유하는 주변 세포질을 비오티닐화된 hIL-6에 대해 검정하였다.

IL-6 결합인자의 ELISA EC50 분석: IL-6 결합인자의 선별물을 실시예 2에 기술된 바와 같이 ELISA를 사용하여 비오티닐화된 hIL-6 희석액 시리즈에의 반응에 대해 분석하였다. 비오티닐화된 단백질을 5 nM 농도로 첨가하고, 1:3으로 단계식으로 하향으로 83 fM까지 희석시켰다. 배경 대조군으로서 표적 단백질을 첨가하지 않고, Z 변이체 모두를 또한 검정하였다. 1차 IL-6 결합인자 Z06814 (서열번호 1512) 뿐만 아니라, 성숙한 결합인자 Z11632 (서열번호 7)를 함유하는 주변 세포질 샘플은 양성 대조군으로서 포함하였다. 음성 대조군으로서, 오직 ABD만을 함유하는 주변 세포질은 비오티닐화된 hIL-6에 대하여 검정하였다. 그래프패드 프리즘 5 및 비선형 회귀를 사용하여 수득된 값을 분석하였다.

결과

성숙한 IL-6 결합 Z 변이체의 제2 파지 디스플레이 선별: 각 트랙이 4 사이클을 함유하는 것인, 총 17개의 병렬 트랙으로 선별을 수행하였다. 선별 트랙은 표 11에 개략적으로 설명된 바와 같이 표적 농도, 선별 시간 및 세척 조건를 달리하였다.

잠재적인 결합인자의 서열분석: 무작위적으로 채취된 클론을 서열분석하였다. 실시예 1에 기술된 바와 같이, 각 개별 Z 변이체에 식별 번호 Z#####을 제공하였다. 통틀어, 707개의 새로운 고유 Z 변이체 분자가 확인되었다. 58개의 잔기 길이인 Z 변이체의 아미노산 서열은 서열번호 1-6, 서열번호 8-14, 서열번호 90-150 및 서열번호 872-1502로서 도 1에 및 서열 목록에 열거되어 있다. 도출된 IL-6 결합 모티프 (BM)는 각 서열에서 8번 위치에서부터 36번 위치까지에 이른다. 각각의 상기 Z 변이체 내의 완전한 3-나선 다발을 구성하는 것으로 예측된, 49개의 아미노산 잔기 길이의 폴리펩티드의 아미노산 서열 (BMod)은 7번 위치에서부터 55번 위치까지에 이른다.

Z 변이체의 ELISA 스크리닝: 4 선별 사이클 후 수득된 클론을 96 웰 플레이트에서 제조하고, ELISA를 사용하여 인간 IL-6 결합 활성에 대해 스크리닝하였다. 무작위적으로 채취된 모든 클론을 분석하였다. 707개의 고유 Z 변이체 중 705개가 0.25 nM 농도에서 hIL-6에 대하여 3 x 음성 대조군 또는 그보다 높은 반응 (0.3-2.3 AU)을 보이는 것으로 나타났다. 모든 선별 트랙으로부터의 기원하는 클론은 양성 신호를 보였다. 플레이트 상의 음성 대조군의 평균 반응은 0.085 AU였다.

IL-6 결합인자의 ELISA EC50 분석: 상기 기술된 ELISA 실험의 결과에 기초하여 Z 변이체의 서브세트를 선별하였다. 각 플레이트 상에서 이중 양성 대조군 Z06814 (서열번호 1512)의 평균 반응에 대하여 반응을 정규화한 후, 1.6 AU 초과의 흡광도 또는 1.7 초과의 반응을 보인 Z 변이체 모두 실시예 4에 기술된 바와 같이 ELISA 포맷으로 표적 적정을 수행하였다. 양성 대조군으로서 성숙한 결합인자 Z11632 (서열번호 7) 뿐만 아니라, 1차 결합인자 Z06814 (서열번호 1512)를 포함하는 주변 세포질 샘플 또한 검정하였다. 수득된 값을 분석하고, 그의 각 EC50 값을 계산하였다 (하기 표 12).

실시예 7

IL-6 결합 Z 변이체의 서브세트의 서브클로닝 , 제조, 및 특징 규명

본 실시예에서는, 친화도 성숙화된 IL-6 결합 Z 변이체를 제조하고, SPR, ELISA, 세포-기반 검정법 및 CD에 의해 기능적으로 평가하였다. SPR은 IL-6과 상호작용하는 Z 변이체의 동역학적 파라미터를 측정하기 위해 사용하였다. 경쟁적 ELISA를 적용하여 인간 IL-6 단백질에의 Z 변이체의 결합 모드를 조사하였다. TF-1 세포-기반 검정법을 적용하여 IL-6 의존적 신호전달을 차단할 수 있는 Z 변이체의 능력을 평가하였다. CD를 사용하여 Z 변이체의 2차 구조를 조사하고, 그의 융점을 측정하였다.

물질 및 방법

Z 변이체의 발현 벡터로의 서브클로닝: 14개의 IL-6 결합 Z 변이체, Z11632 (서열번호 7), Z14630 (서열번호 6), Z14700 (서열번호 8), Z14712 (서열번호 9), Z14861 (서열번호 4), Z14862 (서열번호 10), Z14976 (서열번호 1), Z14984 (서열번호 5), Z15015 (서열번호 2), Z15036 (서열번호 11), Z15110 (서열번호 12), Z15122 (서열번호 3), Z15126 (서열번호 13) 및 Z15142 (서열번호 14)의 DNA를 라이브러리 벡터 pAY02592로부터 증폭시켰다. 실시예 2에 기술된 바와 같이 서브클로닝을 수행하였다. Z 유전자 단편을 발현 벡터 pAY01448로 서브클로닝하여 코딩된 서열 MGSSHHHHHHLQ-[Z#####]-VD를 얻었다.

단백질 발현 및 변성된 조건하에서의 정제: 각각, 각각의 IL-6 결합 Z 변이체의 유전자 단편을 함유하는 플라스미드로 E. 콜라이 로제타(Rosetta) 세포 (노바겐)를 형질전환시키고, 50 ㎍/ml 카나마이신으로 보충된, 100 ml의 TSB-YE 배지 중 37℃에서 배양하였다. 최종 농도 1 mM로 IPTG를 첨가하여 OD₆₀₀ = 0.8로 발현을 유도하고, 25℃에서 추가로 16-20 h 동안 배양물을 인큐베이션시켰다. 원심분리에 의해 세포를 수거하였다.

본질적으로 실시예 2에 기술된 바와 같이 변성된 조건하에서 단백질 정제를 수행하였다. 각 단백질의 흡광 계수를 이용하여, 280 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 단백질 농도를 측정하였다. 쿠마시 블루로 염색된 SDS-PAGE에 의해 IL-6 결합 Z 변이체의 순도를 분석하였다.

단백질 발현 및 천연 조건하에서의 정제: 성숙화된 변이체 Z11632 (서열번호 7), Z14630 (서열번호 6), Z14700 (서열번호 8), Z14712 (서열번호 9), Z14861 (서열번호 4), Z14862 (서열번호 10), Z14976 (서열번호 1), Z14984 (서열번호 5), Z15015 (서열번호 2), Z15036 (서열번호 11), Z15110 (서열번호 12), Z15122 (서열번호 3), Z15142 (서열번호 14)의 유전자 단편, 1차 Z 변이체 Z06814 (서열번호 1512)의 유전자 단편 뿐만 아니라, 대조군 Z 변이체 Z04726 (서열번호 1553)의 유전자 단편을 함유하는 플라스미드로 E.콜라이 BL21 (DE3) 세포 (NEB, 카탈로그 번호 C2527I)를 형질전환시켰다. 50 ㎍/ml 카나마이신으로 보충된, 1,000 ml의 LB 배지 중 37℃에서 배양하였다. 단백질 발현을 유도하기 위해, IPTG를 OD₆₀₀ = 0.8에서 최종 농도 0.1 mM로 첨가하고, 25℃에서 17 h 동안 배양물을 인큐베이션시켰다. 4℃에서 및 8,000 rpm으로 30 min 동안 원심분리하여 의해 세포를 수거하였다. 상청액을 폐기하고, 세포 펠릿을 10 ml PBS 중에 재현탁시켰다. 음파 처리에 의해 세포를 파괴한 후, 원심분리에 의해 세포 부스러기를 제거하고, 각 상청액을, 20 ml 세척 완충제 (20 mM NaH₂PO₄, 10 mM NaCl, 20 mM 이미다졸, pH 6.0)로 평형화된 2 ml Ni-NTA 칼럼 (퀴아젠, 카탈로그 번호 30410) 상에 적용시켰다. 세척 완충제로 세척하여 오염 물질을 제거하고, 용리 완충제 (20 mM NaH₂PO₄, 10 mM NaCl, 250 mM 이미다졸, pH 6.0)를 이용하여 Z 변이체를 용리시켰다. 용리제를 이온 교환 칼럼 (라이프 테크놀러지(Life Technologies), 카탈로그 번호 4481317) 상에서 정제하고, 염 농도를 증가시키면서 Z 변이체를 용리시켰다. 이어서, VIVASPIN 6 칼럼 (사르토리우스(Sartorius), 카탈로그 번호 VS0691)을 사용하여 용리제의 완충제 용액을 PBS (10 mM Na₂HPO₄, 1.8 mM KH₂PO₄, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl)로 교환하였다. 쿠마시 블루로 염색된 SDS-PAGE에 의해 Z 변이체의 순도를 분석하였다.

프로테온 ( ProteOn ) 동역학적 분석: 인간 IL-6에 대한 동역학적 상수 (k_온 및 k_오프) 및 친화도 (K_D)를 변성된 조건하에서 정제된 6개의 His₆-태그 부착된 Z 변이체에 대해 측정하였다. IL-6 결합 변이체 Z06814 (서열번호 1512), Z14861 (서열번호 4), Z014976 (서열번호 1), Z14984 (서열번호 5), Z15015 (서열번호 2), 및 Z15122 (서열번호 3)를 10 mM NaAc 완충제, pH 4.5 중에 5 ㎍/ml로 희석시키고, GLC 칩 (바이로-래드, 카탈로그 번호 176-5011) 상에 따로따로 고정화시켰다. 제조사의 권고 사항에 따라 아민 커플링 화학법을 사용하여 고정화를 수행하고, PBST 0.05%를 전개 완충제로서 사용하였다. 60 ㎕/min의 유속을 사용하는 동역학적 실험에서 PBST 0.05% 또한 전개 완충제로서 사용하였다. 분석물 hIL-6을 50 nM, 12.5nM, 3.1 nM, 0.78 nM, 0.19 nM 및 0 nM의 최종 농도로 PBST 0.05% 전개 완충제 중에서 희석시키고, 삼중으로 3 min 동안 주사한 후, 90 min 동안 전개 완충제 중에서 해리시켰다. 해리 후, 0.05% 트윈 20이 보충된 HCl을 이용하여 표면을 재생시켰다. 바이로-래드 매니저 소프트웨어 (바이로-래드)에서 1:1 모델을 이용하여 센서그램으로부터 동역학적 상수를 계산하였다.

결합 부위 분석: 인간 gp130 (hgp130)과 hIL-6/hIL-6Rα 복합체 사이의 상호작용을 방해하는 (변성된 조건하에서 정제된) 14개의 성숙한 IL-6 결합 Z 변이체의 간섭을 실시예 2에 기술된 바와 같이 평가하였다. 1차 결합인자 Z06814 및 hIL-6Rα 결합 항체 토실리주맙은 비교를 위해 포함시켰다.

TF -1 세포-기반 검정법: 10% FBS (하이클론(HyClone), 카탈로그 번호 SH30919.03), Pen-Strep (하이클론, 카탈로그 번호 15140-163) 및 2 ng/ml rhGM-CSF (R&D 시스템즈, 카탈로그 번호 215-GM-010)로 보충된, L-글루타민 (하이클론, 카탈로그 번호 SH30027)을 포함하는 RPMI1640 중에서 TF-1 세포를 배양하였다. 사용 전, rhGM-CSF의 부재하에 RPMI-1640 중에서 세포를 2회에 걸쳐 세척하였다. 이어서, 세포를 계수하고, 웰당 4 x 10⁴개의 세포인 밀도로 96 웰 플레이트 (코닝(Corning), 카탈로그 번호 3596)에 분배하였다. 별개의 플레이트에서, (변성된 조건하에서 정제된) Z 변이체, 토실리주맙 (로슈) 및 대조군 IgG (잭슨 이뮤노리서치(Jackson Immunoresearch), 카탈로그 번호 Jac-009-000-003)의 연속 희석액 (농도 범위 10-0.00061 nM)을 0.099 nM rhIL-6 (R&D 시스템즈, 카탈로그 번호 206-IL/CF) 존재하에서 인큐베이션시켰다. 이어서, 상기의 사전 혼합물을 TF-1 세포를 함유하는 웰로 옮기고, 이를 습윤화된 5% CO₂ 대기 중 37℃에서 72 h 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 마지막 4시간 동안, 웰당 10 ㎕의 WST (도겐(DoGen), 카탈로그 번호 EZ3000)를 포함시켰다. 빅토르X3 플레이트 판독기 (퍼킨 엘머)를 사용하여 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 각 플레이트에서 IL-6 처리된 웰의 평균 흡광도로 각 웰의 흡광도를 나눔으로써 상대적인 세포 생존능을 계산하였다. 4-파라미터 용량-반응 곡선으로의 비선형 회귀에 의해 데이터를 평가하고, 그래프패드프리즘 소프트웨어를 사용하여 반수 최대 억제 농도 (IC50)를 측정하였다.

CD 분석: 천연 조건하에서 정제된 Z 변이체를 사용하여 실시예 2에 기술된 바와 같이 CD 분석을 수행하였다.

결과

프로테온 동역학적 분석: 고정화된 상이한 Z 변이체를 함유하는 표면 상에 다양한 농도의 hIL-6을 주사하여 프로테온 장치에서 6개의 His₆-태그 부착된 IL-6-결합 Z 변이체와 인간 IL-6의 상호작용을 분석하였다. 표면의 리간드 고정화 수준은 각각 100-220 RU 사이였다. 1:1 상호작용 모델을 이용한, hIL-6의 Z 변이체에의 결합에 대한 동역학적 파라미터 (KD, ka (k_온) 및 kd (k_오프))에 관한 용약은 하기 표 13에 제시되어 있다.

결합 부위 분석: 모든 성숙한 IL-6 결합 Z 변이체는, 미리 형성된 hIL-6/hIL-6Rα 복합체와 hgp130 사이의 상호작용과 유사한 트랜스-신호전달의 뚜렷한 농도-의존적 차단을 보였다 (도 5). 각각의 성숙한 Z 변이체는 1차 결합인자 Z06814 및 토실리주맙, 둘 모두보다 더 높은 차단 능력을 보였으며, 즉, 이는 1.6 nM 미만인 IC50 값에 상응하는 값이었다.

TF -1 세포-기반 검정법: TF-1 세포-기반 검정법을 수행하여 고전적 신호전달 경로에서의 IL-6 결합 Z 변이체 의 효능 및 효력을 평가하였다. 본 검정법에서는 모든 친화도-성숙화된 IL-6 결합 Z 변이체가 TF-1 세포의 IL-6 의존적 성장을 차단할 수 있는 것으로 나타났다 (도 6). Z 변이체, 및 hIL-6Rα 결합 항체 토실리주맙에 대한 계산된 IC50 값은 하기 표 14에 제시되어 있다.

CD 분석: 10개의 성숙화된 Z 변이체에 대해 측정된 CD 스펙트럼 결과, 각각이 20℃에서 α-나선 구조를 가지는 것으로 나타났다. 다양한 온도 측정을 통해 측정된 융점 (Tm)은 하기 표 15에 제시되어 있다.

실시예 8

ABD와 융합된 IL-6 결합 Z 변이체의 생체내 활성

ABD와 융합된 IL-6 결합 Z 변이체의 생체내 차단 효과를 조사하기 위해 혈청 아밀로이드 A (SAA) 마우스 모델을 사용하였다. 급성기(acute phagse 단백질 SAA는 간 세포로부터 분비되고, 이는 염증유발성 시토카인 IL-1, IL-6 및 TNF에 의해 유도될 수 있다. 인간 및 마우스 시토카인의 서열 상동성에 기인하여, 인간 변이체는 그의 상응하는 마우스 수용체에 대하여 작용할 수 있고, 뮤린 SAA 반응을 유도할 수 있다. 인간 TNF 단백질이 (뮤린 TNFRI이 아닌) 오직 뮤린 TNFRII와 상호작용할 수 있다는 것에 주의한다.

물질 및 방법

IL-6을 표적화하는 Z 변이체 Z06814 (서열번호 1512), 및 비관련 표적에 결합하는 대조군 Z 변이체 Z04726 (서열번호 1535)을 실시예 2에 기술된 바와 같이, 클로닝하고, ABD 변이체 PP013 (서열번호 1554)과 융합된 형태로 제조하였다. 5 ㎍/kg으로 hIL-6 (R&D 시스템즈)을 복강내 (i.p.) 투여하기 9 h 전, 다양한 용량 (0, 0.025, 2.5 또는 25 mg/kg (체중))의 Z06814-ABD를 4개의 Balb/c 마우스 군 (n=8)에 피하로 (s.c.) 주사하였다. 5번째 마우스 군 (n=8)은 25 mg/kg의 Z04726-ABD를 받았다. 추가의 두 대조군 마우스 군은 각각 PBS (n=4) 및 25 mg/kg의 Z06814-ABD (n=8)를 받았지만, 후속된 IL-6 주사는 수행하지 않았다. 20 h 후, 심장 천자에 의해 혈액을 채취하고, 혈청을 수집하였다.

ELISA (트리델타(Tridelta))에 의해 제조사의 설명서에 따라 뮤린 SAA의 함량에 대해 혈청을 평가하였다. 간략하면, 희석된 혈청 샘플을 항-SAA-HRP와 함께 SAA-미리 코팅된 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 1 h 동안 인큐베이션시킨 후, 4회에 걸쳐 세척하였다. 20 min 동안 TMB 기질을 첨가하고, 정지액을 이용하여 반응을 중단시켰다. 마이크로플레이트 판독기 (빅토르³, 퍼킨 엘머)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

결과

마우스 모델을 사용하여 생체내에서 IL-6 유발된 혈청 아밀로이드-A (SAA) 단백질 방출에 대하여 Z 변이체 Z06814 (서열번호 1512)의 항-관절염 효능을 평가하였다. 5 ㎍/kg (체중)의 hIL-6을 주사하기 9 h 전, 0, 0.025, 2.5 또는 25 mg/kg (체중)의 IL-6 결합 Z06814-ABD 융합 단백질 또는 25 mg/kg의 대조군 Z04726-ABD 융합 단백질을 4개의 마우스 군에 제공하였다. 추가로 22 h 경과 후, SAA 단백질 수준을 측정하고, 상이한 군 사이의 비교를 수행하였다. Z06814-ABD를 받지 않았거나, 또는 25 mg/kg의 대조군 Z04726-ABD 융합물을 받은 동물에서, 혈청 중 SAA 단백질 수준은 대략 500-600 ㎍/ml 수준으로 증가하였다. 오직 PBS만 제공받은 (어떤 hIL-6도 받지 않은) 대조군 동물은 16-64 ㎍/ml 범위의 수준을 보였다. Z06814-ABD를 제공받은 동물에서, 용량에 의존하는 방식으로, 유의적으로 더 낮은 SAA 단백질 수준이 측정되었다 (도 7). 최고 용량의 Z06814-ABD (25 mg/kg (체중))를 제공받은 군의 경우, SAA 단백질 수준은 어떤 hIL-6 주사도 받지 않은 동물만큼 낮았다.

실시양태의 항별 목록

1. IL-6 결합 모티프 BM을 포함하는 IL-6 결합 폴리펩티드로서, 상기 모티프는

상기 식에서, 서로 독립적으로,

X₃은 A, F, H, K, Q, R, S, W 및 Y로부터 선택되고;

X₇은 F, H, I, K, L, M, N, R, S, T, V, W 및 Y로부터 선택되고;

X₁₁은 A, I, K, L, M, N, R, S, T 및 V로부터 선택되고;

X₁₆은 N 및 T로부터 선택되고;

X₁₇은 A, I, T 및 V로부터 선택되고;

X₁₈은 D, E, G, H, K, N, Q, R, S 및 T로부터 선택되고;

X₂₀은 I, L, M, R, T 및 V로부터 선택되고;

X₂₁은 A, S, T 및 V로부터 선택되고;

X₂₅는 I, M, Q, S, T, V 및 W로부터 선택되고;

X₂₆은 K 및 S로부터 선택되고;

X₂₈은 F, L, M 및 Y로부터 선택되고;

X₂₉는 D 및 R로부터 선택되는 것; 및

ii) i)에서 정의된 서열과 93% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 것인, IL-6 결합 폴리펩티드.

2. 제1항에 있어서, 서열 i)에서

X₃은 A, H, K, Q, R 및 Y로부터 선택되고;

X₇은 F, H, I, K, L, M, N, R, T, V, W 및 Y로부터 선택되고;

X₁₁은 A, I, K, L, N, S, T 및 V로부터 선택되고;

X₁₆은 T이고;

X₁₇은 A, I, T 및 V로부터 선택되고;

X₁₈은 D, E, H, K, N, Q, R, S 및 T로부터 선택되고;

X₂₀은 I, L, M, R 및 V로부터 선택되고;

X₂₁은 A, S 및 V로부터 선택되고;

X₂₅는 I, Q, S, T, V 및 W로부터 선택되고;

X₂₆은 K이고;

X₂₈은 F, L, M 및 Y로부터 선택되고;

X₂₉는 D인 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열 i)이 하기 11개의 조건 I-XI:

I. X₃은 K 및 R로부터 선택되고;

II. X₁₁은 A 및 L로부터 선택되고;

III. X₁₆은 T이고;

IV. X₁₇은 I 및 V로부터 선택되고;

V. X₁₈은 D 및 E로부터 선택되고;

VI. X₂₀은 M이고;

VII. X₂₁은 A이고;

VIII. X₂₅는 S 및 T로부터 선택되고;

IX. X₂₆은 K이고;

X. X₂₈은 F이고;

XI. X₂₉는 D인 조건 중 6개 이상을 충족시키는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

4. 제3항에 있어서, 서열 i)이 11개의 조건 I-XI 중 7개 이상을 충족시시키는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

5. 제4항에 있어서, 서열 i)이 11개의 조건 I-XI 중 8개 이상을 충족시시키는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

6. 제5항에 있어서, 서열 i)이 11개의 조건 I-XI 중 9개 이상을 충족시시키는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

7. 제6항에 있어서, 서열 i)이 11개의 조건 I-XI 중 10개 이상을 충족시시키는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

8. 제7항에 있어서, 서열 i)이 11개의 조건 I-XI을 모두 충족시시키는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, X₁₇X₂₀X₂₁이 VMA 및 IMA로부터 선택되는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, X₂₀X₂₁X₂₈이 MAF인 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, X₁₇X₂₀X₂₈이VMF 및 IMF로부터 선택되는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

12. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, X₁₇X₂₁X₂₈이 VAF 및 IAF로부터 선택되는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 i)이 서열번호 1-1551로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 8번 위치에서부터 36번 위치까지의 서열에 상응하는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

14. 제13항에 있어서, 서열 i)이 서열번호 1-1502로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 8번 위치에서부터 36번 위치까지의 서열에 상응하는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

15. 제14항에 있어서, 서열 i)이 서열번호 7, 서열번호 15-89 및 서열번호 151-871로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 8번 위치에서부터 36번 위치까지의 서열에 상응하는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

16. 제14항에 있어서, 서열 i)이 서열번호 1-6, 서열번호 8-14, 서열번호 90-150 및 서열번호 872-1502로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 8번 위치에서부터 36번 위치까지의 서열에 상응하는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

17. 제13항에 있어서, 서열 i)이 서열번호 1-152 및 서열번호 1503-1515로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 8번 위치에서부터 36번 위치까지의 서열에 상응하는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

18. 제17항에 있어서, 서열 i)이 서열번호 1-150 및 서열번호 1503-1515로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 8번 위치에서부터 36번 위치까지의 서열에 상응하는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

19. 제17항에 있어서, 서열 i)이 서열번호 1-152로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 8번 위치에서부터 36번 위치까지의 서열에 상응하는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 서열 i)이 서열번호 1-150으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 8번 위치에서부터 36번 위치까지의 서열에 상응하는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

21. 제19항에 있어서, 서열 i)이 서열번호 7, 서열번호 15-89 및 서열번호 151-152로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 8번 위치에서부터 36번 위치까지의 서열에 상응하는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

22. 제20항에 있어서, 서열 i)이 서열번호 1-6, 서열번호 8-14 및 서열번호 90-150으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 8번 위치에서부터 36번 위치까지의 서열에 상응하는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

23. 제18항에 있어서, 서열 i)이 서열번호 1-14 및 서열번호 1503-1515로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 8번 위치에서부터 36번 위치까지의 서열에 상응하는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

24. 제23항에 있어서, 서열 i)이 서열번호 1-14 및 서열번호 1512로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 8번 위치에서부터 36번 위치까지의 서열에 상응하는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

25. 제24항에 있어서, 서열 i)이 서열번호 1-14로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 8번 위치에서부터 36번 위치까지의 서열에 상응하는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

26. 제16항, 제22항 및 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 i이 서열번호 1-5로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 8번 위치에서부터 36번 위치까지의 서열에 상응하는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

27. 제24항에 있어서, 서열 i)이 서열번호 1512 중 8번 위치에서부터 36번 위치까지의 서열에 상응하는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-6 결합 모티프가 3-나선 다발 단백질 도메인의 부분을 형성하는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

29. 제28항에 있어서, 상기 IL-6 결합 모티프가 본질적으로 상기 3-나선 다발 단백질 도메인 내에 서로 연결하는 루프와 함께 2개의 나선의 부분을 형성하는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

30. 제29항에 있어서, 상기 3-나선 다발 단백질 도메인이 박테리아 수용체 도메인으로부터 선택되는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

31. 제30항에 있어서, 상기 3-나선 다발 단백질 도메인이 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터의 단백질 A의 도메인 또는 그의 유도체로부터 선택되는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 모듈 BMod를 포함하고, 그의 아미노산 서열은

iii) K-[BM]-DPSQSX_aX_bLLX_cEAKKLX_dX_eX_fQ

상기 식에서,

[BM]은 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에서 정의된 IL-6 결합 모티프이되, 단, X₂₉는 D이고;

X_a는 A 및 S로부터 선택되고;

X_b는 N 및 E로부터 선택되고;

X_c는 A, S 및 C로부터 선택되고;

X_d는 E, N 및 S로부터 선택되고;

X_e는 D, E 및 S로부터 선택되고;

X_f는 A 및 S로부터 선택되는 것; 및

iv) iii)에 의해 정의된 서열과 91% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열로부터 선택되는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

33. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 모듈 BMod를 포함하고, 그의 아미노산 서열은

v) K-[BM]-QPEQSX_aX_bLLX_cEAKKLX_dX_eX_fQ,

상기 식에서,

[BM]은 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에서 정의된 IL-6 결합 모티프이되, 단, X₂₉는 R이고;

X_a는 A 및 S로부터 선택되고;

X_b는 N 및 E로부터 선택되고;

X_c는 A, S 및 C로부터 선택되고;

X_d는 E, N 및 S로부터 선택되고;

X_e는 D, E 및 S로부터 선택되고;

X_f는 A 및 S로부터 선택되는 것; 및

vi) v)에서 정의된 서열과 91% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열로부터 선택되는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

34. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 iii)이 서열번호 1-1551로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 7번 위치에서부터 55번 위치까지의 서열에 상응하는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

35. 제34항에 있어서, 서열 iii)이 서열번호 1-1502로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 7번 위치에서부터 55번 위치까지의 서열에 상응하는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

36. 제35항에 있어서, 서열 iii)이 서열번호 7, 서열번호 15-89 및 서열번호 151-871로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 7번 위치에서부터 55번 위치까지의 서열에 상응하는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

37. 제35항에 있어서, 서열 iii)이 서열번호 1-6, 서열번호 8-14, 서열번호 90-150 및 서열번호 872-1502로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 7번 위치에서부터 55번 위치까지의 서열에 상응하는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

38. 제34항에 있어서, 서열 iii)이 서열번호 1-152 및 서열번호 1503-1515로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 7번 위치에서부터 55번 위치까지의 서열에 상응하는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

39. 제38항에 있어서, 서열 iii)이 서열번호 1-150 및 서열번호 1503-1515로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 7번 위치에서부터 55번 위치까지의 서열에 상응하는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

40. 제35항 또는 제38항에 있어서, 서열 iii)이 서열번호 1-152로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 7번 위치에서부터 55번 위치까지의 서열에 상응하는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 서열 iii)이 서열번호 1-150으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 7번 위치에서부터 55번 위치까지의 서열에 상응하는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

42. 제40항에 있어서, 서열 iii)이 서열번호 7, 서열번호 15-89 및 서열번호 151-152로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 7번 위치에서부터 55번 위치까지의 서열에 상응하는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

43. 제41항에 있어서, 서열 iii)이 서열번호 1-6, 서열번호 8-14 및 서열번호 90-150으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 7번 위치에서부터 55번 위치까지의 서열에 상응하는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

44. 제39항에 있어서, 서열 iii)이 서열번호 1-14 및 서열번호 1503-1515로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 7번 위치에서부터 55번 위치까지의 서열에 상응하는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

45. 제44항에 있어서, 서열 iii)이 서열번호 1-14 및 서열번호 1512로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 7번 위치에서부터 55번 위치까지의 서열에 상응하는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

46. 제45항에 있어서, 서열 iii)이 서열번호 1-14로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 7번 위치에서부터 55번 위치까지의 서열에 상응하는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

47. 제37항, 제43항 및 제46항에 있어서, 서열 iii)이 서열번호 1-5로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 7번 위치에서부터 55번 위치까지의 서열에 상응하는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

48. 제45항에 있어서, 서열 iii)이 서열번호 1512 중 7번 위치에서부터 55번 위치까지의 서열에 상응하는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서,

vii) YA-[ BMod ]-AP;

상기 식에서, [ BMod ]는 제32항 내지 제48항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 IL-6 결합 모듈인 것; 및

viii) vii)에 의해 정의된 서열과 90% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

50. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서,

ix) FN-[BMod]-AP;

x) ix)에 의해 정의된 서열과 90% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서,

ADNNFNK-[BM]-DPSQSANLLSEAKKLNESQAPK;

ADNKFNK-[BM]-DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK;

ADNKFNK-[BM]-DPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK;

ADAQQNNFNK-[BM]-DPSQSTNVLGEAKKLNESQAPK;

AQHDE-[BM]-DPSQSANVLGEAQKLNDSQAPK;

VDNKFNK-[BM]-DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK;

AEAKYAK-[BM]-DPSESSELLSEAKKLNKSQAPK;

VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNDAQAPK;

VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNDSQAPK;

AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;

AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK;

AEAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLSESQAPK;

AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLESSQAPK;

AEAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLESSQAPK;

VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;

VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK;

VDAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLSESQAPK;

VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLESSQAPK;

VDAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLESSQAPK;

VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNKAQAPK; 및

AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNKAQAPK로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고,

여기서, [BM]은 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에서 정의된 IL-6 결합 모티프인 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

52. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서,

xi) VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;

상기 식에서, [BM]은 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 IL-6 결합 모듈인 것; 및

xii) xi)에서 정의된 서열과 89% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

53. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서,

xiii) AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK

xiv) xiii)에 의해 정의된 서열과 89% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

54. 제52항에 있어서, 서열 xi)이 서열번호 1-1551로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

55. 제54항에 있어서, 서열 xi)이 서열번호 1-1502로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

56. 제55항에 있어서, 서열 xi)이 서열번호 7, 서열번호 15-89 및 서열번호 151-871로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

57. 제55항에 있어서, 서열 xi)이 서열번호 1-6, 서열번호 8-14, 서열번호 90-150 및 서열번호 872-1502로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

58. 제54항에 있어서, 서열 xi)이 서열번호 1-152 및 서열번호 1503-1515로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

59. 제58항에 있어서, 서열 xi)이 서열번호 1-150 및 서열번호 1503-1515로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

60. 제55항 또는 제58항에 있어서, 서열 xi)이 서열번호 1-152로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

61. 제59항 또는 제60항에 있어서, 서열 xi)이 서열번호 1-150으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

62. 제60항에 있어서, 서열 xi)이 서열번호 7, 서열번호 15-89 및 서열번호 151-152로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

63. 제61항에 있어서, 서열 xi)이 서열번호 1-6, 서열번호 8-14 및 서열번호 90-150으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

64. 제59항에 있어서, 서열 xi)이 서열번호 1-14 및 서열번호 1503-1515로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

65. 제64항에 있어서, 서열 xi)이 서열번호 1-14 및 서열번호 1512로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

66. 제65항에 있어서, 서열 xi)이 서열번호 1-14로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

67. 제57항, 제63항 및 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 xi)이 서열번호 1-5로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

68. 제65항에 있어서, 서열 xi)이 서열번호 1512인 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

69. 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 시스-신호전달 경로 및/또는 트랜스-신호전달 경로를 통해 IL-6 의존적 신호전달을 차단할 수 있는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

70. 제69항에 있어서, 차단의 반수 최대 억제 농도 (IC50)가 최대 1x10^-6 M, 예컨대, 최대 1x10^-7 M, 예컨대, 최대 1x10^-8 M, 예컨대, 최대 1x10^-9 M, 예컨대, 최대 1x10^-10 M인 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

71. 제69항 또는 제70항에 있어서, IL-6/IL-6Rα와 gp130과의 상호작용을 차단할 수 있는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

72. 제1항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상호작용의 EC50 값이 최대 1x10^-7 M, 예컨대, 최대 1x10^-8 M, 예컨대, 최대 1x10^-9 M, 예컨대, 최대 1x10^-10 M이 되도록 IL-6에 결합할 수 있는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

73. 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상호작용의 K_D 값이 최대 1x10^-8 M, 예컨대, 최대 1x10^-9 M, 예컨대, 최대 1x10^-10 M이 되도록 IL-6에 결합할 수 있는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

74. 제1항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, C 말단 및/또는 N 말단 단부에 추가의 아미노산을 포함하는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

75. 제74항에 있어서, 상기 추가의 아미노산(들)이 폴리펩티드의 생성, 정제, 생체내 또는 시험관내 안정화, 커플링, 또는 검출을 개선시키는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

76. 제1항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 2개 이상의 IL-6 결합 폴리펩티드 단량체 단위를 포함하고, 그의 아미노산 서열은 동일하거나, 상이할 수 있는 것인, 다량체 형태의 IL-6 결합 폴리펩티드.

77. 제76항에 있어서, 상기 IL-6 결합 폴리펩티드 단량체 단위가 함께 공유적으로 커플링되어 있는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

78. 제77항에 있어서, IL-6 결합 폴리펩티드 단량체 단위가 융합 단백질로서 발현되는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

79. 제78항에 있어서, 이량체 형태인 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.

80. - 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항에 따른 IL-6 결합 폴리펩티드로 이루어진 제1 모이어티; 및

- 원하는 생물학적 활성을 가지는 폴리펩티드로 이루어진 제2 모이어티를 포함하는, 융합 단백질 또는 접합체.

81. 제80항에 있어서, 상기 원하는 생물학적 활성이 치료학적 활성인 것인, 융합 단백질 또는 접합체.

82. 제80항에 있어서, 상기 원하는 생물학적 활성이 결합 활성인 것인, 융합 단백질 또는 접합체.

83. 제82항에 있어서, 상기 결합 활성이, 융합 단백질 또는 접합체의 생체내 반감기를 연장시키는 알부민 결합 활성인 것인, 융합 단백질 또는 접합체.

84. 제83항에 있어서, 상기 제2 모이어티가 연쇄상구균 단백질 G의 알부민 결합 도메인 또는 그의 유도체를 포함하는 것인, 융합 단백질 또는 접합체.

85. 제82항에 있어서, 상기 결합 활성이 생물학적 활성을 차단하는 작용을 하는 것인, 융합 단백질 또는 접합체.

86. 제80항에 있어서, 상기 원하는 생물학적 활성이 효소 활성인 것인, 융합 단백질 또는 접합체.

87. 제81항에 있어서, 제2 모이어티가 치료학적으로 활성인 폴리펩티드인 것인, 융합 단백질 또는 접합체.

88. 제87항에 있어서, 제2 모이어티가 면역 반응 조절제인 것인, 융합 단백질 또는 접합체.

89. 제87항에 있어서, 제2 모이어티가 항암제인 것인, 융합 단백질 또는 접합체.

90. 제80항, 제81항, 제86항, 제88항 및 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 모이어티가 인간 내인성 효소, 호르몬, 성장 인자, 케모카인, 시토카인 및 림포카인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 융합 단백질 또는 접합체.

91. 제1항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 표지를 추가로 포함하는 것인, IL-6 결합 폴리펩티드, 융합 단백질 또는 접합체.

92. 제91항에 있어서, 형광 염료 및 금속, 발색단 염료, 화학발광 화합물 및 생물발광 단백질, 효소, 방사성핵종 및 방사성 입자로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, IL-6 결합 폴리펩티드, 융합 단백질 또는 접합체.

93. 제1항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 시스테인 잔기의 티올 기 또는 리신 잔기의 아민 기를 통해 IL-6 결합 폴리펩티드에 접합된 폴리아미노폴리카르복실레이트 킬레이터에 의해 제공되는 킬레이팅 환경을 포함하는 것인, IL-6 결합 폴리펩티드, 융합 단백질 또는 접합체.

94. 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.

95. 제94항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.

96. 제95항에 따른 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.

97. - 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드가 상기 발현 벡터로부터 발현될 수 있도록 허용하는 조건하에서 제96항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계, 및

- 상기 폴리펩티드를 단리시키는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 제조하는 방법.

98. 제1항 내지 제93항 중 어느 한 항에 따른 IL-6 결합 폴리펩티드, 융합 단백질 또는 접합체, 및 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제 또는 담체를 포함하는 조성물.

99. 제98항에 있어서, 1종 이상의 추가 활성제, 예컨대, 면역 반응 조절제 및 항암제로부터 선택되는 작용제를 추가로 포함하는 것인 조성물.

100. 제1항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 또는 제98항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 경구, 국소, 정맥내, 복강내, 피하, 폐, 경피, 근육내, 비내, 협측, 설하 또는 좌제 투여를 위한, 예컨대, 국소 투여를 위한, IL-6 결합 폴리펩티드, 융합 단백질 또는 접합체, 또는 조성물.

101. 제1항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 또는 제98항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 의약, 진단제 또는 예후제로서 사용하기 위한, IL-6 결합 폴리펩티드, 융합 단백질 또는 접합체, 또는 조성물.

102. 제1항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 또는 제98항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 의약으로서 사용하기 위한, IL-6 결합 폴리펩티드, 융합 단백질 또는 접합체, 또는 조성물.

103. 제102항에 있어서, 상기 폴리펩티드, 융합 단백질, 접합체 또는 조성물이 생체내에서 IL-6 기능을 조절하는 데 사용하기 위한 것인, IL-6 결합 폴리펩티드, 융합 단백질, 접합체 또는 조성물.

104. 제101항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, IL-6 관련 장애의 치료, 예후, 또는 진단에서 사용하기 위한 것인, IL-6 결합 폴리펩티드, 융합 단백질, 접합체 또는 조성물.

105. 제101항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, IL-6 관련 장애 치료에서 사용하기 위한 것인, IL-6 결합 폴리펩티드, 융합 단백질, 접합체 또는 조성물.

106. 제105항에 있어서, 상기 IL-6 관련 장애가 염증성 질환, 자가면역 질환, 감염성 질환, 암, 당뇨병, 신경계 질환 및 우울증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 데 사용하기 위한 것인, IL-6 결합 폴리펩티드, 융합 단백질, 접합체 또는 조성물.

107. 제106항에 있어서, 상기 IL-6 관련 장애가 염증성 질환 및 자가면역 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 데 사용하기 위한 것인, IL-6 결합 폴리펩티드, 융합 단백질, 접합체 또는 조성물.

108. 제107항에 있어서, 상기 IL-6 관련 장애가 류마티스 관절염 (RA), 소아 RA, 소아 특발성 관절염 또는 전신 소아 특발성 관절염, 혈관염, 건선성 관절염, 건선, 강직 척추염, 만성 염증성 장 질환, 예컨대, 크론병 및 궤양성 대장염; 그레이브스병, 베체트병, 포도막염, 거대 세포 동맥염, 다발성 경화증 (MS), 전신 경화증, 전신 홍반 루푸스 (SLE), 다발근육염, 류마티스성 다발성 근육통, 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 재발성 다발연골염, 췌장염, 복막염, 신염, 가와사키병, 쇼그렌 증후군 및 성인 스틸병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 데 사용하기 위한 것인, IL-6 결합 폴리펩티드, 융합 단백질, 접합체 또는 조성물.

109. 제106항에 있어서, 상기 IL-6 관련 장애가 암, 예컨대, 대장염 관련 암, 콩팥암, 신장암, 전립샘암, 악성 림프종, 다발성 골수종, 캐슬만병, 유방암 및 폐암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암인 데 사용하기 위한 것인, IL-6 결합 폴리펩티드, 융합 단백질, 접합체 또는 조성물.

110. 제106항에 있어서, 상기 IL-6 관련 장애가 알츠하이머병, HIV, 당뇨병, 패혈증, 악액질, 골수형성이상 증후군 (MDS), 간경화증, 이식편대숙주 질환, 심근경색, 자궁내막증 및 골다공증으로부터 선택되는 것인 데 사용하기 위한 것인, IL-6 결합 폴리펩티드, 융합 단백질, 접합체 또는 조성물.

111. IL-6 관련 장애 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의, 제1항 내지 제93항 중 어느 한 항에 따른 IL-6 결합 폴리펩티드, 융합 단백질 또는 접합체, 또는 제98항 내지 제99항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, IL-6 관련 장애를 치료하는 방법.

112. 제111항에 있어서, 상기 IL-6 관련 장애가 염증성 질환, 자가면역 질환, 감염성 질환, 암, 당뇨병, 신경계 질환 및 우울증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.

113. 제112항에 있어서, 상기 IL-6 관련 장애가 염증성 질환 및 자가면역 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.

114. 제113항에 있어서, 상기 IL-6 관련 장애가 류마티스 관절염 (RA), 소아 RA, 소아 특발성 관절염 또는 전신 소아 특발성 관절염, 혈관염, 건선성 관절염, 건선, 강직 척추염, 만성 염증성 장 질환, 예컨대, 크론병 및 궤양성 대장염; 그레이브스병, 베체트병, 포도막염, 거대 세포 동맥염, 다발성 경화증 (MS), 전신 경화증, 전신 홍반 루푸스 (SLE), 다발근육염, 류마티스성 다발성 근육통, 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 재발성 다발연골염, 췌장염, 복막염, 신염, 가와사키병, 쇼그렌 증후군 및 성인 스틸병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.

115. 제112항에 있어서, 상기 IL-6 관련 장애가 암, 예컨대, 대장염 관련 암, 콩팥암, 신장암, 전립샘암, 악성 림프종, 다발성 골수종, 캐슬만병, 유방암 및 폐암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암인 것인 방법.

116. 제112항에 있어서, 상기 IL-6 관련 장애가 알츠하이머병, HIV, 당뇨병, 패혈증, 악액질, 골수형성이상 증후군 (MDS), 간경화증, 이식편대숙주 질환, 심근경색, 자궁내막증 및 골다공증으로부터 선택되는 것인 방법.

117. IL-6을 함유할 것으로 의심되는 샘플을 제공하는 단계, 상기 샘플을 제1항 내지 제90항 중 어느 한 항에 따른 IL-6 결합 폴리펩티드, 융합 단백질 또는 접합체, 또는 제98항 내지 제99항 중 어느 한 항에 따른 조성물과 접촉시키는 단계, 및 샘플 중 IL-6의 존재를 나타내는 IL-6 결합 폴리펩티드, 융합 단백질, 접합체 또는 조성물의 결합을 검출하는 단계를 포함하는, IL-6을 검출하는 방법.

118. - 대상체, 또는 대상체로부터 단리된 샘플을 제1항 내지 제93항 중 어느 한 항에 따른 IL-6 결합 폴리펩티드, 융합 단백질 또는 접합체, 또는 제98항 내지 제99항 중 어느 한 항에 따른 조성물과 접촉시키는 단계, 및

- 상기 대상체에서 또는 상기 샘플에 결합한 IL-6 결합 폴리펩티드, 융합 단백질, 접합체 또는 조성물의 양에 상응하는 값을 수득하는 단계를 포함하는, 대상체에서 IL-6의 존재를 측정하는 방법.

119. 제118항에 있어서, 상기 값을 참조와 비교하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.

120. 제118항 또는 제119항에 있어서, 상기 대상체가 포유동물 대상체, 예컨대, 인간 대상체인 것인 방법.

121. 제118항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 생체내에서 수행되는 것인 방법.

122. 제118항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 시험관내에서 수행되는 것인 방법.

Claims

IL-6 결합 모티프 BM을 포함하는 IL-6 결합 폴리펩티드로서, 상기 모티프는
i) EEX₃X₄AWX₇EIHX₁₁LPNLX₁₆X₁₇X₁₈QX₂₀X₂₁AFIX₂₅X₂₆LX₂₈X₂₉
상기 식에서, 서로 독립적으로,
X₃은 A, F, H, K, Q, R, S, W 및 Y로부터 선택되고;
X₄는 A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V 및 Y로부터 선택되고;
X₇은 F, H, I, K, L, M, N, R, S, T, V, W 및 Y로부터 선택되고;
X₁₁은 A, I, K, L, M, N, R, S, T 및 V로부터 선택되고;
X₁₆은 N 및 T로부터 선택되고;
X₁₇은 A, I, T 및 V로부터 선택되고;
X₁₈은 D, E, G, H, K, N, Q, R, S 및 T로부터 선택되고;
X₂₀은 I, L, M, R, T 및 V로부터 선택되고;
X₂₁은 A, S, T 및 V로부터 선택되고;
X₂₅는 I, M, Q, S, T, V 및 W로부터 선택되고;
X₂₆은 K 및 S로부터 선택되고;
X₂₈은 F, L, M 및 Y로부터 선택되고;
X₂₉는 D 및 R로부터 선택되는 것; 및
ii) i)에서 정의된 서열과 93% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 것인, IL-6 결합 폴리펩티드.
제1항에 있어서, 서열 i)이 서열번호 1-1551로 이루어진 군으로부터 선택되는, 예컨대, 서열번호 1-14 및 서열번호 1512로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 중 8번 위치에서부터 36번 위치까지의 서열에 상응하는 것인, 예를 들어, 서열번호 1512 중 8번 위치에서부터 36번 위치까지의 서열에 상응하는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 IL-6 결합 모티프가 3-나선 다발 단백질 도메인의 부분을 형성하는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 모듈 BMod를 포함하고, 그의 아미노산 서열은
iii) K-[BM]-DPSQSX_aX_bLLX_cEAKKLX_dX_eX_fQ
상기 식에서,
[BM]은 제1항 또는 제2항에서 정의된 IL-6 결합 모티프이되, 단, X₂₉는 D이고;
X_a는 A 및 S로부터 선택되고;
X_b는 N 및 E로부터 선택되고;
X_c는 A, S 및 C로부터 선택되고;
X_d는 E, N 및 S로부터 선택되고;
X_e는 D, E 및 S로부터 선택되고;
X_f는 A 및 S로부터 선택되는 것; 및
iv) iii)에 의해 정의된 서열과 91% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열로부터 선택되는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
xi) VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK
상기 식에서, [BM]은 제1항 또는 제2항에서 정의된 바와 같은 IL-6 결합 모티프인 것; 및
xii) xi)에서 정의된 서열과 89% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.
제5항에 있어서, 서열 xi)이 서열번호 1-1551로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이고, 예컨대, 서열번호 1-14 및 서열번호 1512로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이고, 예를 들어, 서열번호 1512인 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 시스-신호전달 경로 및/또는 트랜스-신호전달 경로를 통해 IL-6 의존적 신호전달을 차단할 수 있는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.
제7항에 있어서, 차단의 반수 최대 억제 농도가 최대 1x10^-6 M, 예컨대, 최대 1x10^-7 M, 예컨대, 최대 1x10^-8 M, 예컨대, 최대 1x10^-9 M, 예컨대, 최대 1x10^-10 M인 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.
제7항 또는 제8항에 있어서, IL-6/IL-6Rα와 gp130과의 상호작용을 차단할 수 있는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상호작용의 EC50 값이 최대 1x10^-7 M, 예컨대, 최대 1x10^-8 M, 예컨대, 최대 1x10^-9 M, 예컨대, 최대 1x10^-10 M이 되도록, 또는 상호작용의 K_D 값이 최대 1x10^-8 M, 예컨대, 최대 1x10^-9 M, 예컨대, 최대 1x10^-10 M이 되도록 IL-6에 결합할 수 있는 것인 IL-6 결합 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 IL-6 결합 폴리펩티드로 이루어진 제1 모이어티; 및
- 원하는 생물학적 활성을 가지는 폴리펩티드로 이루어진 제2 모이어티를 포함하는 융합 단백질 또는 접합체.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 IL-6 결합 폴리펩티드, 융합 단백질 또는 접합체, 및 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제 또는 담체를 포함하는 조성물.
의약, 진단제 또는 예후제로서 사용하기 위한, 제1항 내지 제11항 및 제13항 중 어느 한 항의 IL-6 결합 폴리펩티드, 융합 단백질 또는 접합체, 또는 조성물.
제14항에 있어서, 상기 폴리펩티드, 융합 단백질, 접합체 또는 조성물이 생체내에서 IL-6 기능을 조절하는 것인, IL-6 결합 폴리펩티드, 융합 단백질, 접합체 또는 조성물.
제14항 또는 제15항에 있어서, IL-6 관련 장애의 치료, 예후, 또는 진단에서 사용하기 위한 것인, IL-6 결합 폴리펩티드, 융합 단백질, 접합체 또는 조성물.
제16항에 있어서, 상기 IL-6 관련 장애가 염증성 질환, 자가면역 질환, 감염성 질환, 암, 당뇨병, 신경계 질환 및 우울증으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
예를 들어, 류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염, 소아 특발성 관절염 또는 전신 소아 특발성 관절염, 혈관염, 건선성 관절염, 건선, 강직 척추염, 만성 염증성 장 질환, 예컨대, 크론병 및 궤양성 대장염; 그레이브스병, 베체트병, 포도막염, 거대 세포 동맥염, 다발성 경화증, 전신 경화증, 전신 홍반 루푸스, 다발근육염, 류마티스성 다발성 근육통, 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환, 재발성 다발연골염, 췌장염, 복막염, 신염, 가와사키병, 쇼그렌 증후군 및 성인 스틸병, 또는
예를 들어, 대장염 관련 암, 콩팥암, 신장암, 전립샘암, 악성 림프종, 다발성 골수종, 캐슬만병, 유방암 및 폐암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암으로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 또는
예를 들어, 알츠하이머병, HIV, 당뇨병, 패혈증, 악액질, 골수형성이상 증후군 (MDS), 간경화증, 이식편대숙주 질환, 심근경색, 자궁내막증 및 골다공증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, IL-6 결합 폴리펩티드, 융합 단백질, 접합체 또는 조성물.