KR20180117242A

KR20180117242A - 단백질의 순도 및 항원에 대한 친화성이 향상된 폴리펩티드, 이의 항체 또는 항원 결합 단편과의 복합체, 및 이들의 제조방법

Info

Publication number: KR20180117242A
Application number: KR1020170049732A
Authority: KR
Inventors: 이종호; 이현종; 고봉국; 김규태; 이종서
Original assignee: 앱클론(주)
Priority date: 2017-04-18
Filing date: 2017-04-18
Publication date: 2018-10-29
Also published as: WO2018194376A1; JP2020517275A; CN110536902B; ES2957266T3; JP7127862B2; US20210122816A1; KR102014056B1; EP3613766C0; CN110536902A; EP3613766A1; EP3613766A4; EP3613766B1

Abstract

본 발명은 단백질의 순도 및 타겟 항원에 대한 친화성이 향상된 폴리펩티드, 이의 항체 또는 항원 결합 단편과의 복합체, 및 이들의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 폴리펩티드 또는 이의 복합체는 진핵세포에서 생산될 경우에도 글리코실레이션이 발생하지 않으므로 생산되는 단백질의 순도가 높고 타겟 항원에 대한 친화성이 높아 질병의 진단 또는 치료용 시약으로서의 가치가 매우 높다.

Description

단백질의 순도 및 항원에 대한 친화성이 향상된 폴리펩티드, 이의 항체 또는 항원 결합 단편과의 복합체, 및 이들의 제조방법{A Polypeptide Having Improved Purity Of Protein And Affinity For Antigen, A Complex With An Antibody Or Antigen-binding Fragment Thereof, And A Method For Producing The Same}

본 발명은 단백질의 순도 및 항원에 대한 친화성이 향상된 폴리펩티드, 이의 항체 또는 항원 결합 단편과의 복합체, 및 이들의 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 기 공지된 폴리펩티드의 스캐폴드에서 특정 위치의 아미노산 서열을 치환함으로써 진핵세포 내에서 폴리펩티드를 발현할 경우 발생하는 글리코실레이션을 방지하여 단백질의 순도와 항원에 대한 친화성을 향상시킨 폴리펩티드 등에 관한 것이다.

애피바디(Affibody®) 분자는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)의 단백질 A(Protein A) 중 IgG에 친화성이 있는 부위인 Z-도메인(Z-domain)으로, 58개의 아미노산 잔기로 이루어진 작은 단백질이다. 이러한 애피바디 분자의 단백질 서열에서 IgG와 결합면을 형성하는 13개의 아미노산은 아미노산 서열에 따라 다양한 타겟 항원에 대한 결합이 가능하며, 무작위적인 배열이 가능하여 라이브러리(library)를 구축할 수 있다. 애피바디 분자는 항체와 유사하게 라이브러리로부터 파아지 디스플레이(phage display), 효모단백질 잡종법(yeast two hybrid, Y2H) 등의 스크리닝 방법을 통해서 다양한 타겟 항원에 대하여 결합할 수 있는 애피바디 분자들을 선별할 수 있다. 타겟 항원과 결합이 가능한 애피바디 분자의 특성을 이용하여 최근 HER2 및 아밀로이드 베타(amyloid-β)에 특이적으로 결합하는 애피바디가 개발된 바 있다(Orlova et al. 2006, Cancer Res., Gronwall et al., 2007, J. Biotechnol.). 또한, 애피바디는 분자량이 6kDa 으로 매우 작아, 일반적으로 150 kDa의 분자량을 가진 IgG 형태의 항체와 비교하여 인체 투여 시 전신적으로 확산되고, 신장여과로 빠르게 제거되는 특징이 있다. 따라서, 애피바디는 주로 진단시료 연구개발에 응용되고 있다(Goldstein R et al., 2013, Expert Rev Anticancer Ther.). 애피바디는 일반 IgG와 결합된 이중항체의 형태로도 개발되어 지고 있다(Yu F et al., 2014, MAbs).

인간을 포함한 진핵 생명체의 세포에서는 단백질 번역 후 변형(post translation modification, PTM)이 일어난다. 번역 후 변형의 예로는 아세틸화(acetylation), 인산화(phosphorylation) 등이 있으며, 이러한 번역 후 변형은 단백질의 다양성에 영향을 미치며 세포내 신호전달에서 중요한 역할을 하기도 하고, 세포의 생리작용을 조절하는 역할을 한다. 때문에 이러한 세포 내 단백질에서 발생하는 비정상적인 번역 후 변형은 암을 비롯한 각종 질병을 일으키는 원인이 되기도 한다. 그러나 특정 단백질의 서열정보만으로는 이 단백질이 번역 후 변형이 될 것인지를 정확히 예측하는 것이 불가능하기 때문에, 이를 확인하려면 각종 실험을 통한 번역 후의 변형 발생 여부를 확인하는 작업이 동반되어야만 한다.

따라서 발현하고자 하는 단백질을 세균과 같은 원핵생물이 아닌, 동물세포 등 진핵생물에서 발현할 경우, 이와 같은 번역 후 변형에 의해 원하는 특성을 갖지 않는 단백질이 생산될 가능성이 존재한다. 실례로 항체의 경우 가변부위 영역(variable region)에 번역 후 변형의 일종인 글리코실레이션(glycosylation)이 발생하는 경우 항체의 균질성을 떨어뜨리며, 타겟 특이적 결합을 방해할 수 있다는 보고가 있다(Wright A et al., 1991, EMBO).

제1 세대 Z 변이체에 기반한 폴리펩티드 스캐폴드에 관한 발명이 PCT 공개공보 WO95/19374에 개시된 바 있고, 제2 세대 Z 변이체에 기반한 폴리펩티드 스캐폴드에 관한 발명이 PCT 공개공보 WO2009/080811에 개시된 바 있다.

그러나, 상기 문헌들에는 본 발명과 같은 번역 후 변형(즉, 글리코실레이션)이 발생 여부와 상기 번역 후 변형이 결과물인 폴리펩티드의 균질성이나 타겟 특이적 결합능에 미치는 영향에 대해 개시, 교시, 암시되어 있지 않으며, 개선의 필요성에 대해서도 전혀 인식하지 못하고 있다.

또한, 무엇보다도 폴리펩티드를 이용한 의약품의 경우, 특히 타겟에 특이적으로 결합하는 특성을 이용하고자 하는 폴리펩티드의 경우라면 단백질의 순도(균질성)와 타겟 특이적 결합능의 개선에 대한 지속적인 요구가 존재한다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명의 발명자들은 Z 변이체에 기반한 폴리펩티드 스캐폴드의 일종인 애피바디(Affibody®) 분자를 진핵세포에서 발현시킬 경우, 타겟 결합에 연관된 서열에 존재하는 번역 후 변형 부위의 존재로 인하여 결합특성이 저하될 수 있다는 점을 발견하였다. 이러한 사실로부터 본 발명자들은 항원 특이적 결합능을 가진 애피바디 단백질을 동물세포에서 생산한 결과 실제로 타겟 결합 부위에서 글리코실레이션(glycosylation)이 발생하며 이로 인해 단백질의 균질성과 타겟 특이적 결합성에 악영향을 미치는 것을 확인하였다.

이에 본 발명자들은 진핵세포에서 발현하는 경우에도 단백질의 균질성과 타겟 특이적 결합 특성을 저하시킬 가능성이 없는 아미노산 서열을 가진 애피바디 분자를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 애피바디의 58개 전체 아미노산 서열 중 2개 위치의 아미노산 서열을 변형(치환)시키는 경우 글리코실레이션이 일어나지 않으며, 항원(특히 IL-6)에 대한 결합능이 향상됨을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 진핵세포 내에서 생산되어도 글리코실레이션이 방지되어 단백질의 순도 및 타겟 항원에 대한 친화성이 향상되는 폴리펩티드(애피바디 분자)를 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기의 폴리펩티드(애피바디 분자)와 임의의 타겟 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편으로 이루어져 단백질의 순도 및 타겟 항원에 대한 친화성이 향상된 폴리펩티드 복합체를 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기의 폴리펩티드(애피바디 분자) 및 상기 폴리펩티드와 항체 또는 항원 결합 단편으로 이루어진 폴리펩티드 복합체의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 명세서에서 용어 “친화성(affinity)”은 특정 대상에 대하여 특이적으로 결합하려고 하는 성질 또는 능력을 의미한다. 본 발명과 같은 생물학 분야에서는 특정 물질 간, 예컨대 효소와 기질이 결합하는 능력, 항체가 항원과 결합하는 능력 등 결합력의 강도를 나타내는 용어로 사용된다.

본 명세서에서 용어 “아미노산(amino acid)”은 단백질 분자의 가장 기본적인 구성 단위를 의미한다. 아미노산의 구조를 보면 탄소 원자 1개에 아미노기(- NH₂)와 카르복실기(-COOH)가 붙어 있으며 여기에 수소와 R기가 연결되어 있다.

또한, 본 명세서에서 용어 “단백질(protein)”은 모든 생물의 몸을 구성하는 고분자 유기물로서 수많은 아미노산의 연결체이다. 천연아미노산에는 20여 종류가 있는데, 이 아미노산들이 펩티드 결합이라고 하는 화학결합으로 서로 연결되어 길게 측쇄형으로 된 것을 폴리펩티드(polypeptide)라고 한다. 본 발명의 폴리펩티드는 당 업계에 공지된 합성 방법, 예를 들어 단백질을 발현하는 핵산분자를 포함하는 발현벡터를 숙주세포에 형질전환하여 재조합 단백질을 합성하거나, 고체상 합성 기술(solid-phase synthesis techniques)에 따라 제조될 수 있다(Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)).

본 명세서에서 용어 “글리코실레이션(glycosylation)”은 세포(진핵생물)의 단백질 번역후 과정(post-translational modification)의 일종으로서 골지체에서 일어나는 반응이다. N-글리코실레이션과 O-글리코실레이션으로 나뉘는데, 이는 붙는 작용기에 따라 다르다. 세포에서 생성된 단백질에 락토스나 푸코스 등의 당이 붙는 과정을 통틀어 '글리코실레이션(당화)'이라고 한다. 글리코실레이션의 과정으로 당사슬이 단백질에 연결되면 단백질이 '폴딩(folding)'과정을 거쳐 입체적인 구조물을 형성한다. 이는 단백질이 풀어지지 않고 오랫동안 유지될 수 있는 안정성을 부여한다. 또한 단백질에 부착된 당사슬은 세포막으로 이동되어 세포막 단백질이 되어 항원과 같은 효과를 내기도 한다. 이렇게 글리코실레이션 된 단백질을 당단백질(glycoprotein)이라고 하는데 대표적인 당단백질에는 면역반응에서 중요한 역할을 하는 항체 등이 있다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 하기 일반식 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로서,

i) 하기 일반식 1의 23번째 아미노산 T가 N으로 치환되거나,

ii) 하기 일반식 1의 54번째 아미노산 S가 A로 치환되거나, 또는

iii) 하기 일반식 1의 23번째 아미노산 T와, 54번째 아미노산 S가 각각 N 및 A로 치환되어 진핵세포 내에서 생산시 글리코실레이션(glycosylation)이 방지되어서, 단백질의 순도 및 타겟 항원에 대한 친화성(affinity)이 향상되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드를 제공한다:

일반식 1

VDX₃KX₅X₆KEX₉X₁₀X₁₁AX₁₃X₁₄EIX₁₇X₁₈LPNLTX₂₄X₂₅QX₂₇X₂₈AFIX₃₂X₃₃LX₃₅DDPSQSX₄₂X₄₃LLX₄₆EAKKLNDSQAPK;

상기 일반식 1에서, 각각의 X₃, X₅, X₆, X₉, X₁₀, X₁₁, X₁₃, X₁₄, X₁₇, X₁₈, X₂₄, X₂₅, X₂₇, X₂₈, X₃₂, X₃₃, X₃₅, X₄₂, X₄₃, 및 X₄₆은 독립적인 임의의 아미노산 잔기로서,

X₃은 A 및 N으로부터 선택되고,

X₅는 F 및 Y로부터 선택되며,

X₆은 A 및 N으로부터 선택되고,

X₉는 A, B, C, E, G, H, K, L, M, S, T, V, 및 Q로부터 선택되며,

X₁₀은 A, B, F, G, H, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되고,

X₁₁은 A, B, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, V, W, 및 Y로부터 선택되며,

X₁₃은 C, D, F, G, H, I, L, P, Q, S, T, 및 V로부터 선택되고,

X₁₄는 A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되며,

X₁₇은 A, B, E, F, G, H, I, L, M, P, Q, R, T, V, W, 및 Y로부터 선택되고,

X₁₈은 A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되며,

X₂₄는 A, C, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, 및 W로부터 선택되고,

X₂₅는 A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되며,

X₂₇은 A, C, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, 및 W로부터 선택되고,

X₂₈은 A, B, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, 및 Y로부터 선택되며,

X₃₂는 A, D, F, G, I, L, M, N, Q, R, S, T, V, W로부터 선택되고,

X₃₃은 K, S, 로부터 선택되며,

X₃₅는 A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되고,

X₄₂는 A 및 S로부터 선택되며,

X₄₃은 A, C, 및 S로부터 선택되고,

X₄₆은 D, E, 및 S로부터 선택된다.

본 명세서의 일반식에서 정의한 X_y의 형식으로 표현된 아미노산 잔기는 본 일반식의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드의 타겟 항원에 대한 특이적인 결합특성을 제공하는 아미노산 잔기의 위치로, 상기 X_y는 20가지의 모든 천연 아미노산 잔기중에서 선택될 수 있으며, 상기 y는 일반식의 아미노산 서열 중 y번째에 해당함을 의미한다.

본 명세서에서 X_y의 형식으로 정의되지 아니한 위치의 아미노산 잔기는 스캐폴드 아미노산 또는 스캐폴드라고 지칭한다. 상기 스캐폴드 아미노산은 본 발명의 폴리펩티드의 타겟 항원과의 결합친화성을 부여하는 상기 X_y 형태의 무작위적 아미노산과는 구별되는 아미노산 서열로서 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리펩트디 복합체로서의 구조적 안정성을 부여한다.

또한, 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기 일반식 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로서,

i) 하기 일반식 2의 23번째 아미노산 T가 N으로 치환되거나,

ii) 하기 일반식 2의 54번째 아미노산 S가 A로 치환되거나,

또는 iii) 하기 일반식 2의 23번째 아미노산 T와, 54번째 아미노산 S가 각각 N 및 A로 치환되어 진핵세포 내에서 생산시 글리코실레이션(glycosylation)이 방지되어서, 단백질의 순도 및 타겟 항원에 대한 친화성(affinity)이 향상되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드를 제공한다:

일반식 2

AEAKYAKEX₉X₁₀X₁₁AIX₁₇X₁₈LPNLTX₂₄X₂₅QX₂₇X₂₈AFIX₃₂X₃₃LX₃₅DDPSQSX₄₂X₄₃LLX₄₆EAKKLNDSQAPK;

상기 일반식 2에서, 각각의 X₉, X₁₀, X₁₁, X₁₃, X₁₄, X₁₇, X₁₈, X₂₄, X₂₅, X₂₇, X₂₈, X₃₂, X₃₃, X₃₅, X₄₂, X₄₃, 및 X₄₆은 독립적인 임의의 아미노산 잔기로서, 상기 일반식 1에서 정의한 것과 동일한 의미를 가진다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 각각의 X₉, X₁₀, X₁₁, X₁₃, X₁₄, X₁₇, X₁₈, X₂₄, X₂₅, X₂₇, X₂₈, X₃₂, X₃₃, X₃₅, X₄₂, X₄₃, 및 X₄₆은 독립적인 임의의 아미노산 잔기로서,

X₉는 E, G, 및 M으로부터 선택되고,

X₁₀은 A, F, H, K, Q, R, S, W 및 Y로부터 선택되며,

X₁₁은 A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V 및 Y로부터 선택되고,

X₁₃은 C, D, F, G, H, I, L, P, Q, S, T, 및 V로부터 선택되며,

X₁₄는 F, H, I, K, L, M, N, R, S, T, V, W 및 Y로부터 선택되고;

X₁₇은 A, B, E, F, G, H, I, L, M, P, Q, R, T, V, W, 및 Y로부터 선택되며,

X₁₈은 A, I, K, L, M, N, R, S, T 및 V로부터 선택되고;

X₂₄는 A, I, T 및 V로부터 선택되며,

X₂₅는 D, E, G, H, K, N, Q, R, S 및 T로부터 선택되고;

X₂₇은 I, L, M, R, T 및 V로부터 선택되며;

X₂₈은 A, S, T 및 V로부터 선택되고;

X₃₂는 I, M, Q, S, T, V 및 W로부터 선택되며;

X₃₃은 K, S로부터 선택되고,

X₃₅는 F, L, M, S, V, 및 Y로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 상기 폴리펩티드는 상기 Xy 서열의 무작위적 배열 변화를 통하여 임의의 항원에 대하여 친화성을 가지도록 변화될 수 있다. 그러한 의미에서 본 발명은 기존에 알려진 타겟 항원과 결합이 가능한 스캐폴드 자체가 아닌, 스캐폴드로서 특정 위치의 아미노산 잔기가 다른 아미노산으로 치환되어 순도와 타겟 항원에 대한 친화성이 향상된 개선된 형태의 스캐폴드를 제공하는 것이다.

상기 치환된 아미노산의 위치는 상술한 바와 같이, 상기 일반식 1 또는 2의 23번째 아미노산 T와, 54번째 아미노산 S이며, 상기 아미노산 잔기들은 독립적으로 23번째 아미노산 T가 N으로 치환되거나, 54번째 아미노산 S가 A로 치환되거나, 또는 23번째 아미노산 T와 54번째 아미노산 S가 각각 N 및 A로 치환된다.

위와 같은 아미노산 잔기의 치환으로 본 발명의 일반식의 서열로 이루어진 폴리펩티드(애피바디 분자)는 원핵세포를 숙주세포(예컨대 E.coli)로 하여 발현시키는 경우는 물론이고, 진핵세포(예컨대 CHO 세포)를 숙주세포로 하여 발현시키는 경우에도 14번째 아미노산 N과 52번째 아미노산 N의 위치에 번역 후 변형(PTM, post translational modification)의 일종인 글리코실레이션(glycosylation)이 방지되어 폴리펩티드의 순도 및 타겟 항원에 대한 친화성이 향상된다.

본 발명의 종래 기술과 구별되는 장점에 관하여 구체적인 구현예를 통하여 설명한다.

본 발명의 서열목록 제 1 서열의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 진핵세포, 예컨대 HEK293F 세포를 숙주세포로 하여 발현시키면, 서열목록 제 1 서열의 21번째 위치 및 52번째 위치의 아스파라긴(Asn, N)에서 글리코실레이션이 일어난다. 상기 아미노산 위치에서의 글리코실레이션은 IL-6에 대한 본 발명의 폴리펩티드(애피바디)의 결합력을 저하시킨다.

그러나, 본 발명의 일 실시예에 따르면, i) 상기 서열목록 제 1 서열의 아미노산 서열 중 23번째 아미노산인 트레오닌(Thr, T)을 서열목록 제 2 서열 또는 제 4 서열과 같이 아스파라긴(Asn, N)으로 치환하고, ii) 서열목록 제 1 서열의 아미노산 서열 중 54번째 아미노산인 세린(Ser, S)을 서열목록 제 3 서열 또는 제 4 서열과 같이 알라닌(Ala, A)으로 치환시키는 경우, 제 1 서열의 21번째 및 52번째 위치의 아스파라긴에서 일어나는 글리코실레이션이 일어나지 않게 된다.

상기와 같이 서열목록 제 1 서열 대신, 서열목록 제 2 서열 내지 제 4 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 진핵세포에서 생산하는 경우, 글리코실레이션이 방지되어 단백질의 순도(균질성)이 향상된다(도 2 내지 도 4). 나아가, IL-6에 대한 결합능이 향상된다(도 5 내지 7).

따라서, 본 발명의 일 구현예에 따르면 상기 일반식 1 또는 일반식 2의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드는 서열목록 제 2 서열 내지 제 4 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으며, 이 경우 상기 폴리펩티드는 IL-6(interleukin-6)를 타겟 항원으로 하며 이에 대한 친화성이 우수하게 나타난다.

상기 “IL-6(interleukin 6)”는 IL-6으로 약기하며, B세포의 항체생산 세포로의 최종 분화를 유도하는 B세포 자극인자2(BSF-2)로 분리한 분자량 약 210,000의 당단백질을 의미한다. T림프구, B림프구, 대식세포, 섬유아세포 등 여러 세포에서 생산되는 사이토카인(cytokine)으로, 인터페론β2(IFN-β2)와 동일한 분자이다. 면역반응, 조혈계와 신경계 세포의 증식 및 분화, 급성 반응 등에 관여하는 것으로 알려져 있다. 사람의 IL-6은 28개의 신호펩티드를 포함한 212개의 아미노산 잔기, 생쥐 IL-6는 24개의 신호펩티드를 포함한 211개의 아미노산 잔기로 구성되어져 있다. IL-6의 과잉 생산은 여러 가지 면역이상증, 염증성 질환, 림프계 종양의 발증과 깊은 관련이 있는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 i) 상기한 폴리펩티드(애피바디 분자); 및 ii) 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 연결된 폴리펩티드 복합체를 제공한다.

이 경우 상기 폴리펩티드 복합체는 각각의 폴리펩티드 또는 항원 내지 항원 결합 단편의 단량체가 연결된 다량체 형태이다. 상기 본 발명의 폴리펩티드 복합체는 서로 공유결합으로 연결되며, 본 발명의 일 구현예에 따르면 상기 폴리펩티드 복합체는 융합 단백질(fused protein) 또는 컨쥬게이트의 형태로 구현될 수 있다.

본 발명의 일 양태를 표시하기 위해 사용되는 용어 “복합체”는 2 이상의 연관된 폴리펩티드 체인을 지칭하기 위해 사용된 것으로서, 그 중 일 구성요소는 상기 정의된 것과 같은 타겟 항원(예컨대 IL-6 등)에 대해 친화성을 가지는 폴리펩티드(애피바디 분자)이며, 다른 구성요소는 타겟 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편이다. 상기 “복합체”는 공유결합에 의해, 예컨대 2 이상의 폴리펩티드 체인이 재조합 융합 단백질로 발현되는 것을 통해 공유결합에 의해 연결되거나, 또는 화학적 컨쥬게이션에 의해 연결되는, 2 이상의 폴리펩티드를 지칭하기 위해 사용된다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 폴리펩티드 복합체는 서열목록 제 2 서열 내지 제 4 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 IL-6 결합 폴리펩티드, 및 항체 또는 항원 결합 단편의 결합으로 이루어질 수 있다. 상기 폴리펩티드 복합체를 구성하는 상기 IL-6 결합 폴리펩티드(애피바디 분자)는 상기 항체 또는 항원 결합 단편의 중쇄/경쇄 영역의 N-말단 및/또는 C-말단에 융합되어 연결될 수 있다.

예를 들어, 상기 서열목록 제 2 서열 내지 제 4 서열로 이루어진 IL-6 결합 폴리펩티드는 상기 항체 또는 항원 결합 단편의 중쇄의 N-말단에만 연결될 수 있거나, 경쇄의 N-말단에만 연결될 수 있거나, 중쇄의 C-말단에만 연결될 수 있거나, 경쇄의 C-말단에만 연결될 수 있거나, 중쇄의 N-말단 및 C-말단 모두에 연결될 수 있거나, 경쇄의 N-말단 및 C-말단 모두에 연결될 수 있거나, 경쇄의 C-말단 및 중쇄의 N-말단에만 연결될 수 있거나, 또는 중쇄의 C-말단 및 경쇄의 N-말단에만 연결될 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 폴리펩티드 복합체에서 IL-6 결합 폴리펩티드(애피바디 분자), 및 항체 또는 항원 결합 단편은 직접적으로 연결되거나, 또는 링커(예컨대 아미노산 링커)를 통해 간접적으로 연결될 수 있다.

통상의 기술자라면, 융합 단백질의 제작시 보통 융합하고자하는 기능적 일부분(moiety) 사이에 링커를 사용하는 것을 포함할 수 있으며, 서로 다른 특성을 가진 다른 종류의 링커, 예를 들어 유연성 아미노산 링커, 비유연성 링커 및 절단 가능한 아미노산 링커가 있다는 것을 알고 있을 것이다. 링커는 융합단백질의 발현량 증가, 생물학적 활성 향상, 타겟팅을 가능하게 하거나, 약동학을 변경시키기 위한 목적으로, 또는 융합단백질의 안정성을 증가시키고 폴딩을 향상시키기 위해 사용되어 왔다.

따라서 본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 복합체는 적어도 하나의 링커, 예컨대 유연성 아미노산 링커, 비유연성 링커 및 절단 가능한 아미노산 링커로부터 선택되는 적어도 하나의 링커를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 가장 구체적인 일 구현예에 따르면, 상기 링커는 상기 애피바디 분자와 상기 항체 또는 항원 결합 단편의 사이에 배열된다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 복합체는 C-말단 및/또는 N-말단에 적어도 하나의 추가적인 아미노산을 포함할 수 있다. 상기의 추가적인 아미노산 잔기는 예를 들어, 생산성, 정제, 생체 내 또는 생체 외에서의 안정화, 복합체의 커플링 또는 검출을 향상시키기 위한 목적으로 개별적 또는 집합적으로 추가될 수 있다. 예컨대 상기 복합체는 상기 복합체의 C-말단 및/또는 N-말단에 시스테인 잔기가 추가될 수 있다. 추가적인 아미노산 잔기는 정제 또는 폴리펩티드의 검출을 위한 “태그(tag)"를 제공할 수도 있으며, 예를 들어 그 태그에 특이적인 항체와의 상호작용을 위한 것이거나, 또는 His₆ 태그의 경우 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC)를 위하여 His₆ 태그, (HisGlu)₃ 태그 (“HEHEHE” tag) 또는 ”myc”(c-myc) 태그 또는 ”FLAG” 태그와 같은 태그를 제공할 수 있다.

상술한 바와 같은 추가적인 아미노산은 본 명세서에서 정의된 i) IL-6 결합 폴리펩티드, ii) IL-6 결합 폴리펩티드와 항체 또는 이의 항원 결합 단편과의 복합체에 화학적 컨쥬게이션, 또는 융합 단백질로서의 i) IL-6 결합 폴리펩티드, ii) IL-6 결합 폴리펩티드와 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 복합체로 발현되거나, 직접적으로 또는 링커(예컨대, 아미노산 링커)를 통해 간접적으로 연결될 수 있다.

본 명세서에서 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 전장 또는 원래 그대로의 폴리클로날 또는 모노클로날 항체뿐만 아니라, 이의 항원 결합 단편들(예를 들어, Fab, Fab′, F(ab′)₂, Fab₃, Fv 및 이의 변이체들), 하나 또는 그 이상의 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 인간화 항체, 키메라 항체, 미니바디, 다이아바디, 트리아바디, 테트라바디, 선형 항체, 단일 체인 항체, 다중특이적 항체(예컨대, 이중특이적 항체), 필요한 특이성의 항원 인식 부위를 포함하는 면역 글로불린 분자의 다른 변형된 배열형태로서 항체의 글리코실화 변이체, 항체의 아미노산 서열 변이체 및 공유결합으로 변형된 항체를 포함한다. 변형된 항체 및 이의 항원 결합 단편의 구체적인 예에는 나노바디, AlbudAbs, DARTs(dual affinity re-targeting), BiTEs(bispecific T-cell engager), TandAbs(tandem diabodies), DAFs(dual acting Fab), two-in-one antibodies, SMIPs(small modular immunopharmaceuticals), FynomAbs(fynomers fused to antibodies), DVD-Igs(dual variable domain immunoglobulin), CovX-bodies(peptide modified antibodies), 듀오바디 및 triomAbs이 포함된다. 이와 같은 항체 및 이의 항원 결합 단편들의 목록은 상기에 한정되는 것은 아니다.

전장 항체는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함한다. 각 중쇄는 중쇄 가변영역(V_H) 및 첫 번째, 두 번째 및 세 번째 불변영역(CH1, CH2 및 CH3)을 포함한다. 각 경쇄는 경쇄 가변영역(V_L) 및 경쇄 불변영역(C_L)을 포함한다. 경쇄의 불변영역의 아미노산 서열에 따라서, 항체는 다른 클래스로 분류될 수 있다. 6개의 주요한 항체 클래스가 있다: IgA, IgD, IgE, IgG, IgM 및 IgY, 및 이들 중 몇 개는 서브클래스로 더 나누어질 수 있는데(isotypes), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2가 있다. 명세서에서 사용되는 용어 “전장 항체”는 어떠한 클래스, 예를 들어 IgD, IgE, IgG, IgA, IgM 또는 IgY (또는 이들의 어떠한 서브 클래스)의 항체를 의미하는 것이다. 항체들의 다른 클래스의 서브유닛 구조 및 3차원 배열형태는 당업자에게 잘 알려져 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 “항원 결합 단편”은 항체 분자, 또는 이의 일부분 또는 부위, 또는 이의 파생물이며, 상응하는 전장 항체의 항원 결합의 모든 또는 중요한 부분을 보유하고 있다. 항원 결합 단편은 중쇄 가변영역(V_H), 경쇄 가변영역(V_L), 또는 둘 모두를 포함할 수 있다. V_H 및 V_L 각각은 전형적으로 상보성 결정 부위 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함한다. VH 또는 VL에서 3개 CDR들은 테두리 부위(framework region, FR1, FR2, FR3 및 FR4)에 의해 둘러싸여 있다.

상술한 바와 같이 항원 결합 단편들은 다음을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다:

(1) Fab 단편, 이는 V_L-C_L 체인 및 V_H-C_H1 체인을 가지는 1가 단편이다; (2) Fab’단편, 이는 중쇄 힌지영역(hinge region)을 가지고 있는 Fab 단편이다; (3) F(ab′)₂ 단편, 이는 중쇄 힌지영역에 의해 연결된, 예를 힌지영역에서의 이황화결합에 의해 연결된 Fab’의 이합체이다; (5) Fv 단편, 이는 항체의 단일 줄기(arm)의 V_L 및 V_H를 가지는 최소한의 항체 단편이다; (6) 단일 체인 Fv(scFv) 단편, 이는 펩티드 링커에 의해 연결된 scFv의 V_H 및 V_L 도메인의 단일 폴리펩티드 체인이다; (7) (scFv)2, 이는 2개 V_H 도메인 및 2개 V_L 도메인을 포함하며, 이들은 이황화결합에 의한 2개 V_H 도메인을 통해 연결되어 있다; 및(8) 도메인 항체, 이는 특이적으로 항원에 결합하는 항체 단일 가변영역(V_H 또는 V_L) 폴리펩티드일 수 있다.

상기 항원 결합 단편들을 당업계에서 사용되는 통상적인 방법으로 제작할 수 있다. 예를 들어, 전장 항체 분자를 펩신 절단함으로써 F(ab′)₂ 단편들을 생산할 수 있으며, F(ab′)₂ 단편의 이황화결합을 환원시킴으로써 Fab 단편을 생성할 수 있다. 또는, 적합한 숙주세포(예컨대. E. coli, yeast, 동물, 식물 또는 곤충 세포)에서 중쇄 및 경쇄 단편들을 발현시키고 생체 내 또는 생체 외에서 이들을 조립해서 원하는 항원 결합 단편이 형성되도록 하는 재조합 기술에 의해 단편들을 제작할 수 있다. 단일 체인 항체의 경우, 중쇄 가변영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 경쇄 가변영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 연결하는 것에 의한 재조합 기술을 통해 제작할 수 있다. 예를 들어, 2개의 가변영역 사이에 유연성 링커를 포함시킬 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 “모노클로날 항체”는 1가의 친화성을 가지는 항체를 나타내며, 모노클로날 항체의 샘플 내에 있는 각 항체 분자가 항원의 동일한 에피토프에 결합하는 것을 의미하는 것이다. 반면에 본 명세서에서 사용된 용어 “폴리클로날 항체”는 특정 항원에 대해 반응하는 항체들의 집합을 의미하며, 집합 내에서 그들은 다른 항체 분자, 예컨대 항원의 서로 다른 에피토프에 반응하는 항체 분자일 수 있다. 폴리클로날 항체의 경우, 일반적으로 적합한 동물에 접종함으로써 생산이 가능하며, 그 동물의 혈청으로부터 분리할 수 있다. 모노클로날 항체의 경우, 특유의 모세포(예를 들어 하이브리도마 세포주)의 클론인 동일한 면역 세포를 이용하여 만들 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어 “인간 항체”는 인간으로부터 얻어지거나 기원하는 항체에 실질적으로 상응하는 가변 및 불변영역을 가지는 항체를 의미한다. 본 명세서에서 사용된 용어 “키메라 항체”는 재조합의 또는 유전적으로 조작된 항체를 나타내며, 예를 들어 마우스 모노클로날 항체로서 서로 다른 종으로부터의 폴리펩티드 또는 도메인을 포함하고 있는 것, 또는 인간 항체로서 항체의 면역원성을 감소시키도록 유도된 것들이 있다. 용어“인간화 항체”는 면역원성을 감소시키기 위하여, 인간에서 자연적으로 생산된 항체 변이체들에 대한 유사성을 증가시키기 위하여 단백질 서열을 변형한 항체로서, 인간이 아닌 종으로부터 기원한 항체들을 의미한다.

본 발명에서 정의된 복합체는 IL-6 결합 폴리펩티드 및 항체 또는 항원 결합단편으로 이루어진 것이므로, IL-6에 결합할 수 있을 뿐만 아니라, 적어도 하나의 추가적인 항원에 특이적으로 결합할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 추가적인 항원은 면역 시스템의 질병 또는 질환과 연관되어 있는 항원일 수 있다. 또 다른 구현예의 경우, 상기 추가적인 항원은 암과 연관되어 있다. 따라서 일 구현예의 경우, 본 발명에서 정의된 복합체를 제공하며, 이 경우 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 추가적인 항원, 예를 들어 면역 시스템의 질병 또는 질환과 연관되거나 암과 연관된 항원에 대해 친화성을 가진다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, IL-6 관련 질환과 연관된 항원뿐만 아니라, IL-6 관련 질환과 연관된 항원들도 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 폴리펩티드 복합체가 특이적으로 결합할 수 있는 추가적인 항원은 안지오제닌(angiogenin 2, Ang-2), 혈관표피성장인자(vascular endothelial growth factor), 종양괴사인자(tumor necrosis factor), 종양괴사인자 리간드 및 슈퍼패밀리 멤버 TNFSF11, TNFSF13, TNFSF13B, TNFSF14, TNFSF15, 인슐린-유사 성장인자(insulin-like growth factor), 인터류킨 1α, 인터류킨 1β, 인터류킨 10, 인터류킨 17A, 인터류킨 12, 인터류킨 23, 인터류킨 33, 과립대식세포집락자극인자(granulocyte macrophage colony-stimulating factor), 과립구집락자극인자(granulocyte colony-stimulating factor), 지질다당류(lipopolysaccharide), 톨-유사수용체(toll-like receptor 4), 신경성장인자(nerve growth factor), 케모카인 C-C 모티프 리간드(chemokine C-C motif ligand) 19, 케모카인 C-C 모티프 리간드 21, 케모카인 C-X-C 모티프 리간드 4 및 IFN-α로 구성되는 그룹으로부터 선택될 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 구체적인 구현예에 따르면, 상기 ii) 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열목록 제 5 서열의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 이 경우 타겟 항원은 TNF-α이다.

또한, 상기 i)의 폴리펩티드와 ii) 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 특이적으로 결합하는 타겟 항원은 서로 동일한 항원일 수 있고, 서로 다른 항원일 수 있다.

상기 i)의 폴리펩티드와 ii) 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 타겟 항원이 서로 동일한 항원인 경우에는 이의 폴리펩티드 복합체는 해당 항원에 대한 향상된 친화성을 나타내며, 상기 i)의 폴리펩티드와 ii) 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 타겟 항원이 서로 다른 항원인 경우에는 2 종류 이상의 항원에 대하여 특이적으로 결합이 가능한 다중특이성을 가질 수 있으므로 추가적인 항원에 대한 타겟팅이 가능하여 유용하다.

본 발명의 일 구현예에 따르면 상기 폴리펩티드 복합체는 융합 단백질(fused protein) 또는 컨쥬게이트의 형태로 구현될 수 있다.

따라서 상기 폴리펩티드(애피바디 분자) 및 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 화학적 컨쥬게이션(유기 화학 방법으로 알려진) 또는 다른 수단(예를 들어, 복합체를 융합 단백질로서 발현하거나, 직접적으로 또는 링커(예컨대, 아미노산 링커)를 통하여 간접적으로 연결될 수 있다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 폴리펩티드 복합체의 i) 폴리펩티드와 ii) 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 적어도 하나의 링커로 연결된다.

이 경우 상기 링커는 일반식 (GnSm)p 또는 (SmGn)p로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다:

여기에서 상기 n, m 및 p는 독립적으로,

n은 1 내지 7의 정수이고;

m은 0 내지 7의 정수이며;

n과 m의 합은 8이하의 정수이고; 및

p는 1 내지 7의 정수이다.

본 발명의 다른 구체적인 구현예에 따르면, 상기 링커는 n = 1 내지 5이고, m = 0 내지 5이다. 보다 구체적인 구현예의 경우, n = 4이고, m = 1이다. 보다 더 구체적인 구현예의 경우, 상기 링커는 (GGGGS)₃ 이다. 또 다른 구현예의 경우, 상기 링커는 GGGGS이다. 또 다른 구체적인 구현예의 경우, 상기 링커는 VDGS이다. 또 다른 구체적인 구현예의 경우, 상기 링커는 ASGS이다.

후술할 내용 중 TNF는 상술한 추가적인 항원의 실례 중 하나로 사용한 것이며, 따라서 범위를 한정하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 따라서 하기의 친화성을 측정하는 방법은, 어떤 다른 적합한 추가적인 항원에 대한 항체의 친화성을 측정하는데 사용될 수 있으며 반드시 아래 기재된 방법에 한정되는 것은 아니며, 통상의 기술자가 사용가능한 다양한 방법을 사용할 수 있다.

본 명세서의 용어 “IL-6 결합”,”IL-6에 대한 결합 친화성”, “TNF 결합” 및 “TNF에 대한 결합 친화성”은, 예컨대 ELISA 또는 SPR(surface plasmon resonance)에 의해 테스트될 수 있는, 폴리펩티드 또는 본 명세서에 정의된 복합체의 특성을 의미하는 것이다. 예를 들어 본 발명의 폴리펩티드 샘플을 항체-코팅된 ELISA 플레이트에 포획하고 비오틴화 된 IL-6(또는 바이오틴화된 TNF)를 첨가하고, 스트렙타아비딘 컨쥬게이티드 HRP를 첨가하는 실험을 통해 결합 친화성을 테스트할 수 있다. 멀티-well 플레이트 리더기(예컨대, Victor3 (Perkin Elmer))를 이용하여, TMB 기질을 첨가하고 450 nm에서의 흡광도를 측정한다. 통상의 기술자라면, IL-6(또는 TNF)에 대한 복합체의 결합 친화성의 정성적 측정을 설정하기 위한 그와 같은 실험을 통해 얻어진 결과를 해석할 수 있을 것이다. 만약 정량적 측정을 고안하려는 경우, 예를 들어 상호작용에 대한 EC₅₀ 값을 결정하려는 경우, ELISA를 사용할 수 있다. 상술한 바와 같이 ELISA를 이용하여, 비오틴화된 IL-6(또는 비오틴화된 TNF)을 연속적으로 희석한 것에 대한 폴리펩티드의 반응을 측정한다. 통상의 기술자라면, 그러한 실험에 의해 얻어진 결과를 해석하고, 그 결과로부터, 예를 들어 GraphPad Prism 5 및 비선형회귀를 이용하여, EC₅₀ 값을 계산할 수 있을 것이다.

IL-6 결합 친화성과 또는 추가적인 항원(예컨대 TNF)에 대한 결합 친화성은 SPR(surface plasmon resonance) 실험을 통하여 측정할 수도 있다. IL-6(또는TNF), 또는 이의 단편을 SPR 기기의 센서 칩 위에 고정하고, 테스트하려는 복합체를 포함하고 있는 샘플을 칩 위로 통과시킨다. 또는, 테스트하려는 복합체를 기기의 센서 칩 위에 고정하고, IL-6(또는 TNF)나 이의 단편을 포함하고 있는 샘플을 칩 위로 통과시킬 수도 있다. 통상의 기술자라면, IL-6(또는 TNF)에 대한 복합체의 결합 친화성의 최소한의 정성적 측정을 설정하기 위한 그와 같은 실험을 통해 얻어진 결과를 해석할 수 있을 것이다. 만약 정량적 측정을 고안하려는 경우, 예를 들어 상호작용에 대한 KD 값을 결정하려는 경우, SPR을 사용할 수 있다. 결합 값은, 예컨대 Biacore(GE Healthcare) 또는 ProteOn XPR 36(Bio-Rad)와 같은 기기로부터 정의할 수 있다. IL-6(또는 TNF)를 기기의 센서 칩 상에 적합하게 고정화하고, 친화성이 결정된 복합체의 샘플을 연속적으로 희석한 것에 의해 준비한 다음, 랜덤 순서로 주입한다. 통상의 기술자는 예컨대 BIAevaluation 4.1 소프트웨어의 1:1 Langmuir 결합 모델 또는 기기제조사가 제공하는 다른 적합한 소프트웨어를 이용하여, 상기한 결과로부터 KD 값을 계산할 수 있을 것이다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 상기 폴리펩티드 복합체의 일 구성요소인 항체 또는 항원 결합 단편은 서열목록 제 5 서열의 아미노산 서열로 이루어진 항체일 수 있다. 이 경우, 본 발명의 상기 폴리펩티드 복합체는 IL-6 외에 TNF-α에 추가적으로 결합 친화성을 가진다.

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기한 일반식 1 또는 일반 식 2로 표시되며 특정 위치의 아미노산 잔기가 치환되어 순도 및 항원 친화성이 향상된 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 핵산을 제공한다.

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 폴리펩티드와 항원 또는 항원 결합 단편이 연결되어 형성된 폴리펩티드 복합체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 핵산을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 상기 i) 폴리펩티드 또는 ii) 상기 폴리펩티드와 임의의 타겟 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편으로 이루어진 폴리펩티드 복합체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은, 상기 폴리펩티드와 폴리펩티드 복합체를 구성하는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열인 것으로 족하며, 어느 특정 뉴클레오티드 서열에 한정되지 않는다는 것은 당업자에게 자명하다.

이는 뉴클레오티드 서열의 변이가 발생하더라도 변이된 뉴클레오티드 서열을 단백질로 발현하면 단백질 서열에서 변화를 가져오지 않는 경우도 있기 때문이다. 이를 코돈의 축퇴성이라고 한다. 따라서 상기 뉴클레오티드 서열은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈 (예를 들어, 코돈의 축퇴성에 의해, 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

본 명세서에서 용어 "핵산(nucleic acids)"은 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오티드는 자연의 뉴클레오티드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 상기 서열목록 제 2 서열 내지 제 4 서열의 아미노산 서열을 코딩하는 본 발명의 핵산 분자는 이와 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인(align)하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60% 이상의 상동성, 보다 구체적으로는 70% 이상의 상동성, 보다 더 구체적으로는 80% 이상의 상동성, 보다 더욱더 구체적으로는 90% 이상의 상동성, 가장 구체적으로는 95% 이상의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트(alignment) 방법은 당업계에 공지되어있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 구체적으로는, 본 발명은 ClustalX 및 NJ(neighbor-joining) 알고리즘을 이용한다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST; Altschul, et al., J. Mol. Biol. 215:403-10(1990))은 NBCI(National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn and tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST에서 접속가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.

또한, 본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 글리코실레이션이 방지되어 단백질의 순도 및 항원에 대한 친화성이 향상된 폴리펩티드의 제조방법을 제공한다:

(a) 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 발현벡터에 삽입시키는 단계;

(b) 상기 발현벡터를 숙주세포에 형질전환시키는 단계; 및

(c) 상기 숙주세포를 배양하여 폴리펩티드를 수득하는 단계.

또한, 본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 글리코실레이션이 방지되어 단백질의 순도 및 항원에 대한 친화성이 향상된 폴리펩티드 복합체의 제조방법을 제공한다:

(a) 상기 폴리펩티드(애피바디 분자)와 항체 또는 항원 결합 단편이 연결된 복합체를 코딩하는 핵산을 발현벡터에 삽입시키는 단계;

(b) 상기 발현벡터를 진핵세포인 숙주세포에 형질전환시키는 단계; 및

(c) 상기 숙주세포를 배양하여 폴리펩티드 복합체를 수득하는 단계.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 발현 벡터는 (a) 서열목록 제 2 서열 내지 제 4 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열 등, i) 폴리폽티드(애피바디 분자) 또는 ii) 상기 폴리펩티드와 항체 또는 항원결합 단편의 복합체을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 삽입되는 벡터로서; (b) 상기 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 결합(operatively linked)되어 있고 숙주세포에서 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; 및 (c) 숙주세포에서 작용하여 RNA 분자의 3’-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널 서열을 포함하는 숙주세포 발현용 재조합 벡터이다.

본 명세서에서 용어 "작동적으로 결합(operatively linked)"은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독(translation)을 조절하게 된다.

본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, pL^λ 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 E. coli가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위(Yanofsky, C., J. Bacteriol., 158:1018-1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터(pL^λ 프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet., 14:399-445(1980))가 조절 부위로서 이용될 수 있다.

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예: pSK349, pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지(예: λgt·λ4B, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

본 발명의 벡터는 그로부터 발현되는 폴리펩티드의 정제를 용이하게 하기 위하여, 다른 서열과 융합될 수 도 있다. 융합되는 서열은 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다. 상기 정제를 위한 추가적인 서열 때문에, 숙주에서 발현된 단백질은 친화성 크로마토그래피를 통하여 신속하고, 용이하게 정제된다.

본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

선택적으로, 상기 벡터는 리포터 분자(예: 루시퍼라아제 및 -글루쿠로니다아제)를 코딩하는 유전자를 추가적으로 운반할 수 있다.

본 발명의 벡터를 안정하게 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어있는 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli Origami2, E. coli JM109, E. coli BL21(DE3), E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110와 같은 E.coli 균주, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 이스트(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포 및 동물 세포(예컨대, CHO 세포주(Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 상기 벡터를 형질전환시키는 숙주세포는 HEK293F이다.

본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법(Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 숙주 세포 내로 주입할 수 있다.

본 발명에서 숙주세포 내로 주입된 재조합 벡터는 숙주 세포 내에서 재조합된 상기의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체를 발현할 수 있으며, 이러한 경우에는 다량의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체를 얻게 된다. 예를 들어, 상기 발현 벡터가 lac 프로모터를 포함하는 경우에는 숙주 세포에 IPTG를 처리하여 유전자 발현을 유도할 수 있다.

형질전환된 숙주세포의 배양은 공지된 숙주세포 배양 방법 또는 이를 변형한 방법으로 행할 수 있다. 예를 들어, 숙주세포가 대장균(E.coli)인 경우 형질전환 숙주세포의 배양을 위한 배지는 대장균이 효율적으로 이용할 수 있는 탄소원, 질소원, 무기염 등을 포함한다면 천연 배지 또는 합성 배지를 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 탄소원은 글루코오스, 프럭토오스, 수크로오스와 같은 탄수화물; 녹말, 녹말의 가수분해물; 아세트산 및 프로피온산과 같은 유기산; 에탄올, 프로판올, 글리세롤과 같은 알코올 등을 포함한다. 질소원은 암모니아; 염화암모늄, 암모늄설페이트, 암모늄아세테이트 및 암모늄포스페이트와 같은 무기산 또는 유기산의 암모늄염; 펩톤, 고기추출물(meat extract), 이스트추출물, 옥수수 침지액, 카제인 가수분해물, 대두추출물, 대두가수분해물; 다양한 발효된 세포 및 이들의 분해물 등을 포함한다. 무기염은 포타슘디하이드로젠 포스페이트, 다이포타슘하이드로젠 포스페이트, 마그네슘 포스페이트, 마그네슘 설페이트, 소디엄 클로라이드, 망간 설페이트, 구리 설페이트, 칼슘 카보네이트 등을 포함한다.

상기 배양은 통상적으로 진탕배양 또는 회전기에 의한 회전에 의한 것과 같은 호기성 조건하에서 행한다. 배양 온도는 바람직하게는 10 내지 40℃의 범위에서 행하고, 배양시간은 일반적으로 5 시간 내지 7 일간 행한다. 배지의 pH는 배양 중에서 바람직하게는 3.0 내지 9.0의 범위를 유지한다. 배지의 pH는 무기 또는 유기산, 알칼리 용액, 우레아, 칼슘 카보네이트, 암모니아 등으로 조절할 수 있다. 배양 중에는 필요한 경우 재조합 벡터의 유지 및 발현을 위해 암피실린, 스트렙토마이신, 클로람페니콜, 카나마이신 및 테트라사이클린과 같은 항생제를 첨가할 수 있다. 유도(induction) 가능한 프로모터를 갖는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포를 배양하는 경우 필요하다면 배지에 적합한 유도제(inducer)를 첨가할 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터가 lac 프로모터를 함유하는 경우 IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)를 첨가하고, trp 프로모터를 포함하는 경우 인돌아크릴산(indoleacrylic acid)을 배지에 첨가할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 진핵세포 내에서 생산되어도 글리코실레이션이 방지되어 단백질의 순도 및 IL-6에 대한 친화성이 향상되는 폴리펩티드(애피바디 분자)를 제공한다.

(b) 본 발명은 상기의 폴리펩티드(애피바디 분자)와 임의의 타겟 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편으로 이루어져 단백질의 순도 및 IL-6에 대한 친화성이 향상된 폴리펩티드 복합체를 제공한다.

(c) 본 발명은 상기의 폴리펩티드(애피바디 분자) 및 상기 폴리펩티드와 항체 또는 항원 결합 단편으로 이루어진 폴리펩티드 복합체의 제조방법을 제공한다.

상기 본 발명의 폴리펩티드 또는 이의 복합체는 진핵세포에서 생산될 경우에도 글리코실레이션이 발생하지 않으므로 생산되는 단백질의 순도가 높고 타겟 항원에 대한 친화성이 높아 질병의 진단 또는 치료용 시약으로서의 가치가 매우 높다.

도 1은 본 발명의 글리코실레이션이 발생하지 않도록 돌연변이를 유도하기 위하여 사용되는 발현벡터(pcDNA3.3 벡터, invitrogen, cat. #. K8300-01)의 벡터맵을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 IL-6에 대한 친화성을 가진 폴리펩티드(애피바디)가 항체의 경쇄사슬의 N-말단에 연결된 폴리펩티드 복합체(이중항체)의 순도를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 IL-6에 대한 친화성을 가진 폴리펩티드(애피바디)가 항체의 경쇄사슬의 C-말단에 연결된 폴리펩티드 복합체(이중항체)의 순도를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 IL-6에 대한 친화성을 가진 폴리펩티드(애피바디)가 항체의 중쇄사슬의 N-말단에 연결된 폴리펩티드 복합체(이중항체)의 순도를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 IL-6에 대한 친화성을 가진 폴리펩티드(애피바디)가 항체의 경쇄사슬의 N-말단에 연결된 폴리펩티드 복합체(이중항체)의 타겟 항원(TNF-α, IL-6)에 대한 결합능을 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 IL-6에 대한 친화성을 가진 폴리펩티드(애피바디)가 항체의 경쇄사슬의 C-말단에 연결된 폴리펩티드 복합체(이중항체)의 타겟 항원(TNF-α, IL-6)에 대한 결합능을 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 폴리펩티드 복합체(이중항체)의 타겟 항원(TNF-α, IL-6)에 대한 EC₅₀를 나타낸 도이다.
상기 도 2 내지 도 7 및 본 명세서에서, NL5는 아달리무맙 항체의 경쇄(light chain)의 N-말단에 5개의 아미노산으로 이루어진 링커(GGGGS)로 애피바디 서열을 연결한 이중항체를 의미하고, CL5는 아달리무맙 항체의 경쇄의 C-말단에 5개의 아미노산으로 이루어진 링커(GGGGS)로 애피바디 서열을 연결한 이중항체를 의미하며, 상기 NH5는 아달리무맙 항체의 중쇄(heavy chain)의 N-말단에 5개의 아미노산으로 이루어진 링커(GGGGS)로 애피바디 서열을 연결한 이중항체임을 의미한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 동물세포 발현 시 애피바디 단백질의 글리코실레이션 발생

서열목록 제1서열의 아미노산 서열로 이루어진, IL-6에 특이적으로 결합하는 애피바디 단백질을, TNF에 대한 항체(아달리무맙, adalimumab; 서열목록 제 5 서열의 중쇄 및 제 6 서열의 경쇄를 포함)와 유전적으로 결합한 이중항체를 동물세포(HEK293F 세포)에서 생산하자 글리코실레이션이 발생하여 이중항체 단백질의 분자량이 일정하지 않고 여러 개의 밴드로 나타남을 확인하였다(도 2-4의 Lane 1 Parent 참조). 상기 서열목록 제1서열의 아미노산 서열로 이루어진 애피바디 단백질의 1차 서열을 분석한 결과, 21번째와 52번째 아미노산 위치의 아스파라긴(Asn, N)에서 글리코실레이션이 발생할 가능성이 예측되었다(Eisenhaber B & Eisenhaber F, 2010, Methods Mol Biol.).

다음으로, 본 발명자들은 상기 애피바디와 아달리무맙 항체의 결합 물질에서 관찰되는 글리코실레이션이 애피바디 단백질 상에서 일어나는 것인지 확인하기 위하여 글리코실레이션이 될 수 있는 부위를 변형한 변형체를 개발하였다.

상기 애피바디 서열에서 글리코실레이션 발생 가능성을 제거하기 위하여, 표 1의 PCR 프라이머를 이용해 오버래핑 PCR(overlapping PCR) 방법으로 23번째 트레오닌(Threonine, T)을 아스파라긴(Asparagine, N)으로 치환하고, 54번째 세린(Serine, S)을 알라닌(Alanine, A)으로 치환한 변이체를 제작하였다. 이를 통하여 아래와 같이 변이 이중항체 3종(SM1, SM2, DM1)을 제작하였다.

단일 돌연변이(Single mutation) 유발을 위해 주형(template)으로 도 1의 pcDNA3.3 벡터(invitrogen, cat. #. K8300-01)에 항-인간 TNF-α와 IL-6 이중항체가 삽입된 parent DNA를 사용하였고 다음과 같은 조건으로 오버래핑 PCR(overlapping PCR)을 진행하였다.

먼저 23번째 아미노산 트레오닌을 아스파라긴으로 치환하는 돌연변이를 유발하였다. 돌연변이를 유발하고자 하는 23번째 아미노산 트레오닌을 기준으로, N-말단 쪽 DNA 절편을 생성하기 위해서 템플레이트 DNA 50 ng, 10 pmol/μL 농도의 CMV forward 프라이머와 T23N-R 프라이머를 각각 4 μL, 10X pfu polymerase mixture(ELPIS biotech, EBT-1011) 10 μL를 PCR 튜브에 넣어준 다음, 총 반응 부피(total reaction volume)가 50 μL가 되도록 증류수를 첨가한 후, PCR 반응을 진행하였다.

또한, 돌연변이를 유발하고자 하는 23번째 아미노산 트레오닌을 기준으로, C-말단 쪽 DNA 절편은 위와 같은 조건으로 T23N-F와 TK poly reverse 프라이머를 사용하여 생성하였다.

PCR 반응으로 생성된 상기 두 DNA 절편은 아가로즈 겔에 로딩한 후, DNA gel elution kit(iNtRON BIOTECHNOLOGY, cat. #. 17288)을 사용하여 아가로즈 겔로부터 DNA를 분리하였다. 분리된 두 DNA 절편 각각 50 ng을 템플레이트 DNA로 사용하여 10 pmol/μL 농도의 CMV forward와 TK poly reverse 프라이머 4 μL, 10X pfu polymerase mixture (ELPIS, cat. #. EBT-1011) 10 μL를 PCR 튜브에 넣어준 다음, 총 반응부피(total reaction volume)가 50 μL가 되도록 증류수를 첨가한 후 두 DNA 절편을 연결하는 오버래핑 PCR을 진행하여 23번째 트레오닌을 아르기닌으로 치환한 변이체 서열을 제작하였다.

다음으로 54번째 아미노산인 세린(serine)을 알라닌(alanine)으로 치환하는 돌연변이를 유발하였다. 프라이머를 T23N-F와 T23N-R 대신에 S54A-F와 S54A-R로 변경하여 사용한 것을 제외하고는 상기 23번째 아미노산을 치환할 때와 동일한 방법으로 오버래핑 PCR을 수행하였다. 오버래핑된 PCR 산물은 gel elution kit을 사용하여 DNA 정제(clean-up)를 수행하였다.

마지막으로 23번째와 54번째 아미노산을 모두 치환한 이중 돌연변이(double mutation)를 유발하였다. 이중 돌연변이는 상기 54번째 아미노산을 치환한 DNA를 템플레이트로 사용하여 23번째 아미노산을 치환하는 방법으로 진행하였다.

정제된 이중항체 DNA와 pcDNA3.3 벡터를 각각 ClaI (NEB, cat. #. R0197L)과 XhoI (NEB, cat. #. R0146L)을 이용하여 이중 절단(double digestion)한 다음 라이게이션(ligation)하였다.

이러한 방식으로 생성된 TNF-a와 IL-6에 동시 결합하는 변이 이중항체 3종의 애피바디 서열을 표 2에 나타내었다.

표 2에 나타낸 바와 같이, 애피바디 서열의 23번째 아미노산 트레오닌을 아스파라긴으로 치환한 단일 돌연변이(single mutation) 서열과, 54번째 아미노산 세린을 알라닌으로 치환한 단일 돌연변이 서열은 각각 SM1과 SM2로 명명하였으며, 상기 23번째와 54번째 아미노산을 모두 치환한 이중 돌연변이(double mutation) 서열은 DM1으로 명명하여 이후 이중항체의 동물세포발현과 특성분석연구에 사용하였다.

실시예 2: 동물세포를 이용한 3종 변이 이중항체의 생산

상기 실시예 1에서 제작한 변이 서열을 이용한 3종의 이중항체 변이체와 parent 서열의 이중항체는 HEK293F 세포를 이용하여 생산하였다.

먼저 HEK293F 세포를 1x10⁶ cell/mL의 농도로 100 mL의 양으로 키운 다음, 37℃, 8% CO₂, RPM125의 조건으로 진탕 배양(shaking incubation) 하였다.

멸균되어 있는 15 mL 튜브에 배양 배지 5 mL을 넣고, 중쇄사슬과 경쇄사슬이 DNA를 1:2의 비율로 넣고 잘 섞어주어 DNA를 준비하였다. 배양배지와 DNA가 있는 15 mL의 tube 에 PEI (Polysciences, cat. #. 23966)을 넣고, 잘 섞어준 다음 HEK293F 세포에 넣어 주고, 7일간 배양하였다.

배양액으로부터 이중항체를 Protein A resin(GE healthcare, cat. #. 17-5438-03)을 이용하여 정제하고 투석여과(diafiltation) 방법(Satorius, cat. #. VS2002)을 이용하여 버퍼를 교체하였다. 정제된 이중항체는 280 nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. 정제된 이중항체는 12% SDS-PAGE에서 분석하였다.

각 생산된 이중항체의 Parent와 변이체 3종을 비교하였을 때, Affibody 단백질이 항체의 N-말단에 결합된 경우에는 21번째와 52번째 위치의 아스파라긴에서 모두 글리코실레이션이 일어나며, 두 부위를 모두 변형시킨 DM1에서만 글리코실레이션이 일어나지 않았다(도 2 및 도 4).

또한, 애피바디 단백질을 항체의 C-말단에 결합한 경우에는 52번째 아스파라긴에서는 글리코실레이션이 명확하게 일어나는 반면, 21번째 아스파라긴에서는 글리코실레이션이 매우 약하게 일어남을 확인하였다(도 3).

이상의 결과를 통하여 IL-6 결합 애피바디 단백질을 동물세포를 이용하여 생산하는 경우, 애피바디 서열의 21번째와 52번째 위치의 아스파라긴에서 글리코실레이션이 일어나며, 애피바디 서열의 23번째와 54번째 위치의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하는 경우(SM1, SM2 및 DM2) 단백질의 순도가 개선됨을 확인할 수 있었다(도 2 내지 도 4).

실시예 3: 글리코실레이션에 의한 이중항체의 결합력 감소의 확인

애피바디 단백질의 글리코실레이션에 의한 표적 단백질에 대한 결합력 변화를 다음과 같이 분석하였다.

상기 실시예 2에서 제작한 이중항체(parent 및 3종 변이체)의 TNF-a 또는 IL-6에 대한 단독 결합력을 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

먼저 ELISA 플레이트(Corning, cat. #. 3690)에 TNF-a(R&D systems, cat. #. 210-TA-100/CF)를 0.2 μg/mL의 농도로, 또는 IL-6(R&D systems, cat. #. 206-IL-050/CF)를 1 μg/mL의 농도로 웰당 30 μL씩 분주하고, 4℃에서 15시간 이상 반응시켜 고정하였다. 15시간 이후, ELISA 플레이트를 0.05% tween20 PBS로 3회 세척하고, 이중항체를 60 nM부터 1/5씩, 7회 단계별 희석하여 각 30 μL씩 분주한 다음 25℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 이어서 ELISA 플레이트를 3회 세척 후, 항-인간 IgG Fc-HRP(ThermoFisher, cat. #. 31423)를 0.2 μg/mL의 농도로 희석한 후, 각 30 μL 씩 분주한 다음 25℃에서 45 분간 반응시킨 다음, 플레이트를 0.05% tween20 PBS로 100 μL씩 3회 세척하였다. 마지막으로 TMB(SurModics, cat. #. TMBC-1000-01)를 넣어 발색을 유도하였다. TNF-a와의 결합력을 확인하는 플레이트는 3분 후 1N 황산(DUKSAN, cat. #. B8C411)을 넣어 발색을 중단시키고 450 nm에서 흡광도를 측정하였고, IL-6와의 결합력을 확인하는 플레이트는 5분후 1N 황산을 넣어 발색을 중단시키고 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

또한, 상기 실시예 2에서 제작한 이중항체(parent 및 3종 변이체)의 TNF-a 및 IL-6에 대한 이중 결합력을 확인하기 위하여 다음과 같은 시험을 수행하였다.

먼저 ELISA 플레이트에 TNF-α를 0.2 μg/mL 의 농도로 고정하고 이중항체를 처리한 후 비오틴(biotin)이 융합된 IL-6를 0.1 μg/mL의 농도로 처리하였다. 그 후, 아비딘-HRP(Pierce, cat. #. 29994)를 0.2 ug/mL의 농도로 희석한 후, 각 30 μL 씩 분주하여 반응을 시켜주었다. 25℃에서 45 분간 반응시킨 후 플레이트를 0.05% tween20 PBS로 100 μL씩 3회 세척하고 발색하였다.

결과는 도 5 및 도 6에 나타내었다.

결합능을 확인한 결과, 아달리무맙 항체의 TNF-α에 대한 결합능에는 변화가 없었다(도 5A, 도 6A). 그러나 애피바디의 IL-6에 대한 결합능은 Parent와 SM1에 비하여, SM2과 DM1의 결합능이 상승되었다(도면 5B, 도면 6B). TNF-α 및 IL-6에 대한 이중결합력 역시, Patent와 SM1에 비해 SM2와 DM1의 결합능이 상승되었다(도 5C 및 도 6C).

상기 결과로부터 애피바디의 결합능은 21번째 및 52번째 위치의 아미노산의 글리코실레이션에 의해서 감소되며, 23번째와 54번째 아미노산의 돌연변이를 통한 글리코실레이션 방지에 의해 증가됨을 확인하였다.

이중 항체의 EC50값은 GraphPad Prism6 라는 software를 이용하여 측정하였다. 이중 항체의 TNF-a 또는 IL-6에 대한 단독 결합력을 확인하는 ELISA 실험과 TNF-a 및 IL-6에 대한 이중 결합력을 확인하는 ELISA 실험의 데이터를 이용하여 항체의 농도 대비 O.D 값을 four parameter형식으로 그래프를 만들어, EC50의 값을 산출하였다.

결과는 도 7a 및 도 7b에 나타내었다.

IL-6에 대한 EC50 값은 Parent와 SM1에 비하여, SM2과 DM1의 값이 낮음을 확인하였고, TNF-α 및 IL-6에 대한 EC50 값 역시, Patent와 SM1에 비해 SM2와 DM1의 값이 낮음을 확인하였다. 상기 결과로부터 본 발명의 애피바디 서열에서 23번째 아미노산 잔기 트레오닌(T)을 아스파라긴(N)으로 치환하고, 54번째 아미노산 잔기인 세린(S)을 알라닌(A)로 치환하는 경우, 애피바디 서열의 결합능이 향상됨을 정량적으로 확인하였다(도7 참조).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> AbcClon, Inc <120> A Polypeptide Having Improved Purity Of Protein And Affinity For IL-6, A Complex With An Antibody Or Antigen-binding Fragment Thereof, And A Method For Producing The Same <130> PN160415 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 binding polypeptide <400> 1 Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Glu Gln Arg Ala Trp Arg Glu Ile 1 5 10 15 His Leu Leu Pro Asn Leu Thr Ile Glu Gln Met Ala Ala Phe Ile Trp 20 25 30 Lys Leu Leu Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 2 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 binding polypeptide with improved purity and affinity (SM1) <400> 2 Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Glu Gln Arg Ala Trp Arg Glu Ile 1 5 10 15 His Leu Leu Pro Asn Leu Asn Ile Glu Gln Met Ala Ala Phe Ile Trp 20 25 30 Lys Leu Leu Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 3 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 binding polypeptide with improved purity and affinity (SM2) <400> 3 Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Glu Gln Arg Ala Trp Arg Glu Ile 1 5 10 15 His Leu Leu Pro Asn Leu Thr Ile Glu Gln Met Ala Ala Phe Ile Trp 20 25 30 Lys Leu Leu Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 4 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 binding polypeptide with improved purity and affinity (DM1) <400> 4 Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Glu Gln Arg Ala Trp Arg Glu Ile 1 5 10 15 His Leu Leu Pro Asn Leu Asn Ile Glu Gln Met Ala Ala Phe Ile Trp 20 25 30 Lys Leu Leu Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 5 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Adalimumab heavy chain <400> 5 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 6 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Adalimumab light chain <400> 6 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210

Claims

하기 일반식 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 있어서,
i) 하기 일반식 1의 23번째 아미노산 T가 N으로 치환되거나, ii) 하기 일반식 2의 54번째 아미노산 S가 A로 치환되거나, 또는 iii) 하기 일반식 1의 23번째 아미노산 T와, 하기 일반식 2의 54번째 아미노산 S가 각각 N 및 A로 치환되어 진핵세포 내에서 생산시 글리코실레이션(glycosylation)이 방지되어서, 단백질의 순도 및 타겟 항원에 대한 친화성(affinity)이 향상되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드:
일반식 1
VDX₃KX₅X₆KEX₉X₁₀X₁₁AX₁₃X₁₄EIX₁₇X₁₈LPNLTX₂₄X₂₅QX₂₇X₂₈AFIX₃₂X₃₃LX₃₅DDPSQSX₄₂X₄₃LLX₄₆EAKKLNDSQAPK;
상기 일반식 1에서, 각각의 X₃, X₅, X₆, X₉, X₁₀, X₁₁, X₁₃, X₁₄, X₁₇, X₁₈, X₂₄, X₂₅, X₂₇, X₂₈, X₃₂, X₃₃, X₃₅, X₄₂, X₄₃, 및 X₄₆은 독립적인 임의의 아미노산 잔기로서,
X₃은 A 및 N으로부터 선택되고,
X₅는 F 및 Y로부터 선택되며,
X₆은 A 및 N으로부터 선택되고,
X₉는 A, B, C, E, G, H, K, L, M, S, T, V, 및 Q로부터 선택되며,
X₁₀은 A, B, F, G, H, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되고,
X₁₁은 A, B, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, V, W, 및 Y로부터 선택되며,
X₁₃은 C, D, F, G, H, I, L, P, Q, S, T, 및 V로부터 선택되고,
X₁₄는 A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되며,
X₁₇은 A, B, E, F, G, H, I, L, M, P, Q, R, T, V, W, 및 Y로부터 선택되고,
X₁₈은 A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되며,
X₂₄는 A, C, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, 및 W로부터 선택되고,
X₂₅는 A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되며,
X₂₇은 A, C, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, 및 W로부터 선택되고,
X₂₈은 A, B, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, 및 Y로부터 선택되며,
X₃₂는 A, D, F, G, I, L, M, N, Q, R, S, T, V, W로부터 선택되고,
X₃₃은 K, S, 로부터 선택되며,
X₃₅는 A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되고,
X₄₂는 A 및 S로부터 선택되며,
X₄₃은 A, C, 및 S로부터 선택되고,
X₄₆은 D, E, 및 S로부터 선택된다.
하기 일반식 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 있어서,
i) 하기 일반식 1의 23번째 아미노산 T가 N으로 치환되거나, ii) 하기 일반식 2의 54번째 아미노산 S가 A로 치환되거나, 또는 iii) 하기 일반식 1의 23번째 아미노산 T와, 하기 일반식 2의 54번째 아미노산 S가 각각 N 및 A로 치환되어 진핵세포 내에서 생산시 글리코실레이션(glycosylation)이 방지되어서, 단백질의 순도 및 타겟 항원에 대한 친화성(affinity)이 향상되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드:
일반식 2
AEAKYAKEX₉X₁₀X₁₁AIX₁₇X₁₈LPNLTX₂₄X₂₅QX₂₇X₂₈AFIX₃₂X₃₃LX₃₅DDPSQSX₄₂X₄₃LLX₄₆EAKKLNDSQAPK;
상기 일반식 2에서, 각각의 X₉, X₁₀, X₁₁, X₁₃, X₁₄, X₁₇, X₁₈, X₂₄, X₂₅, X₂₇, X₂₈, X₃₂, X₃₃, X₃₅, X₄₂, X₄₃, 및 X₄₆은 독립적인 임의의 아미노산 잔기로서,
X₉는 A, B, C, E, G, H, K, L, M, S, T, V, 및 Q로부터 선택되며,
X₁₀은 A, B, F, G, H, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되고,
X₁₁은 A, B, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, V, W, 및 Y로부터 선택되며,
X₁₃은 C, D, F, G, H, I, L, P, Q, S, T, 및 V로부터 선택되고,
X₁₄는 A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되며,
X₁₇은 A, B, E, F, G, H, I, L, M, P, Q, R, T, V, W, 및 Y로부터 선택되고,
X₁₈은 A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되며,
X₂₄는 A, C, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, 및 W로부터 선택되고,
X₂₅는 A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되며,
X₂₇은 A, C, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, 및 W로부터 선택되고,
X₂₈은 A, B, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, 및 Y로부터 선택되며,
X₃₂는 A, D, F, G, I, L, M, N, Q, R, S, T, V, W로부터 선택되고,
X₃₃은 K, S, 로부터 선택되며,
X₃₅는 A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, 및 Y로부터 선택되고,
X₄₂는 A 및 S로부터 선택되며,
X₄₃은 A, C, 및 S로부터 선택되고,
X₄₆은 D, E, 및 S로부터 선택된다.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 일반식 1의 X₃, X₅, X₆, 및 상기 일반식 1과 일반식 2의 X₃, X₅, X₆, X₉, X₁₀, X₁₁, X₁₃, X₁₄, X₁₇, X₁₈, X₂₄, X₂₅, X₂₇, X₂₈, X₃₂, X₃₃, X₃₅, X₄₂, X₄₃, 및 X₄₆은 독립적인 임의의 아미노산 잔기로서,
X₉는 E, G, 및 M으로부터 선택되고,
X₁₀은 A, F, H, K, Q, R, S, W 및 Y로부터 선택되며,
X₁₁은 A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V 및 Y로부터 선택되고,
X₁₃은 C, D, F, G, H, I, L, P, Q, S, T, 및 V로부터 선택되며,
X₁₄는 F, H, I, K, L, M, N, R, S, T, V, W 및 Y로부터 선택되고;
X₁₇은 A, B, E, F, G, H, I, L, M, P, Q, R, T, V, W, 및 Y로부터 선택되며,
X₁₈은 A, I, K, L, M, N, R, S, T 및 V로부터 선택되고;
X₂₄는 A, I, T 및 V로부터 선택되며,
X₂₅는 D, E, G, H, K, N, Q, R, S 및 T로부터 선택되고;
X₂₇은 I, L, M, R, T 및 V로부터 선택되며;
X₂₈은 A, S, T 및 V로부터 선택되고;
X₃₂는 I, M, Q, S, T, V 및 W로부터 선택되며;
X₃₃은 K, S로부터 선택되고,
X₃₅는 F, L, M, S, V, 및 Y로부터 선택된 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제 2 항에 있어서,
상기 폴리펩티드는 타겟 항원이 IL-6(interleukin-6)이고, 서열목록 제 2 서열 내지 제 4 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
i) 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 폴리펩티드; 및
ii) 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 연결된 폴리펩티드 복합체.
제 5 항에 있어서, 상기 ii) 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 타겟 항원은 안지오제닌(angiogenin 2, Ang-2), 혈관표피성장인자(vascular endothelial growth factor), 종양괴사인자(tumor necrosis factor), TNF-α, TNFSF11, TNFSF13, TNFSF13B, TNFSF14, TNFSF15, 인슐린-유사 성장인자(insulin-like growth factor), 인터류킨 1α, 인터류킨 1β, 인터류킨 10, 인터류킨 17A, 인터류킨 12, 인터류킨 23, 인터류킨 33, 과립대식세포집락자극인자(granulocyte macrophage colony-stimulating factor), 과립구집락자극인자(granulocyte colonystimulating factor), 높은-이동성 그룹 단백질(high-mobility group protein) B1, 지질다당류(lipopolysaccharide), 톨-유사수용체(toll-like receptor 4), 신경성장인자(nerve growth factor), 케모카인 C-C 모티프 리간드(chemokine C-C motif ligand) 19, 케모카인 C-C 모티프 리간드 21, 케모카인 C-X-C 모티프 리간드 4 및 인터페론 알파로 구성되는 군으로부터 선택되는 항원인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 복합체.
제 5 항에 있어서, 상기 ii) 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 타겟 항원은 TNF-α인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 복합체.
제 5 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 아달리무맙(adalimumab), 인플릭시맙(infliximab), 고리무맙(golimumab) 및 서토리주맙 페골(certolizumab pegol), 및 이의 항원 결합 단편으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것, 예를 들어 아달리무맙(adalimumab), 인플릭시맙(infliximab), 고리무맙 (golimumab) 및 서토리주맙 페골(certolizumab pegol)로 이루어진 군으로부터 선택되는 전장 항체인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 복합체.
제 5 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열목록 제 5 서열의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 복합체.
제 5 항에 있어서, 상기 폴리펩티드 복합체의 i) 폴리펩티드와 ii) 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 적어도 하나의 링커로 연결된 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 복합체.
제 10 항에 있어서, 상기 링커는 일반식 (GnSm)p 또는 (SmGn)p로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 복합체:
상기 n, m 및 p는 독립적으로,
n은 1 내지 7의 정수이고;
m은 0 내지 7의 정수이며;
n과 m의 합은 8이하의 정수이고; 및
p는 1 내지 7의 정수이다.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 핵산.
제 5 항의 폴리펩티드 복합체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 핵산.
다음 단계를 포함하는 글리코실레이션이 방지되어 단백질의 순도 및 항원에 대한 친화성이 향상된 폴리펩티드의 제조방법:
(a) 제 12 항의 핵산을 발현벡터에 삽입시키는 단계;
(b) 상기 발현벡터를 숙주세포에 형질전환시키는 단계; 및
(c) 상기 숙주세포를 배양하여 폴리펩티드를 수득하는 단계.
제 14 항에 있어서, 상기 숙주세포는 진핵세포인 것을 특징으로 하는 방법.
다음 단계를 포함하는 글리코실레이션이 방지되어 단백질의 순도 및 항원에 대한 친화성이 향상된 폴리펩티드 복합체의 제조방법:
(a) 제 13 항의 핵산을 발현벡터에 삽입시키는 단계;
(b) 상기 발현벡터를 진핵세포인 숙주세포에 형질전환시키는 단계; 및
(c) 상기 숙주세포를 배양하여 폴리펩티드 복합체를 수득하는 단계.
제 16 항에 있어서, 상기 숙주세포는 진핵세포인 것을 특징으로 하는 방법.