ES2957266T3 - Polipéptido mejorado en cuanto a pureza proteica y afinidad por el antígeno, conjugado del mismo con un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno y método para su preparación - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un polipéptido mejorado en pureza de proteína y en afinidad por un antígeno diana, un conjugado del mismo con un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, y un método de preparación del polipéptido y el conjugado. El polipéptido o su conjugado según la presente invención no sufre glicosilación incluso cuando se produce en una célula eucariota y, por lo tanto, tiene una alta pureza proteica y afinidad por un antígeno diana, mostrando un valor muy alto como reactivo para el diagnóstico o tratamiento de una enfermedad. . (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Polipéptido mejorado en cuanto a pureza proteica y afinidad por el antígeno, conjugado del mismo con un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno y método para su preparación

Campo técnico

La presente solicitud reivindica la prioridad y el beneficio de la solicitud de patente coreana n.° 10-2017-0049732 presentada en la Oficina de Propiedad Intelectual de Corea el 18 de abril de 2017.

La presente divulgación se refiere a un polipéptido mejorado en cuanto a pureza proteica y afinidad por un antígeno, a un complejo del polipéptido con un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, a un método para producir el polipéptido y a un método para producir el complejo. Más específicamente, la presente invención se refiere a un polipéptido y similares, que están mejorados en cuanto a la pureza proteica y la afinidad por un antígeno mediante la sustitución de un resto de aminoácido en una posición específica en la estructura de soporte de un polipéptido conocido para evitar así la glicosilación cuando el polipéptido y similares se expresan en células eucariotas.

Antecedentes de la técnica

Las moléculas de Affibody® son proteínas pequeñas compuestas por 58 restos de aminoácido basados en el dominio Z, que es un sitio de afinidad para IgG en la Proteína A deStaphylococcus aureus.En la secuenciación de proteínas de las moléculas de Affibody, 13 aminoácidos que forman la superficie de unión con IgG pueden unirse a varios antígenos diana dependiendo de la secuencia de aminoácidos de los mismos y pueden disponerse aleatoriamente para construir bibliotecas. De forma similar a lo que ocurre con los anticuerpos, las moléculas de Affibody capaces de unirse a varios antígenos diana pueden seleccionarse a partir de bibliotecas a través de métodos de selección, tales como la presentación en fagos y el sistema de doble híbrido en levadura (Y2H). Recientemente se han desarrollado moléculas de Affibody que se unen específicamente a HER2 y p-amiloide utilizando características de moléculas de Affibody capaces de unirse a antígenos diana (Orlovaet al.2006, Cancer Res., y Gronwallet al.,2007, J. Biotechnol). Dado que las moléculas de Affibody tienen un peso molecular muy pequeño de 6 kDa, las moléculas de Affibody se difunden sistémicamente y se eliminan rápidamente a través de la filtración renal cuando se administran al cuerpo humano. Por lo tanto, las moléculas de Affibody se aplican principalmente a la investigación y el desarrollo de especies de diagnóstico (Goldstein Ret al.,2013, Expert Rev Anticancer Ther). También se han desarrollado moléculas de Affibody en forma de anticuerpos dobles que se unen a la IgG general (Yu Fet al.,2014, MAbs).

La modificación postraducción de proteínas (PTM) se produce en células de criaturas eucariotas, incluidos los seres humanos. Son ejemplos de modificación postraduccional la acetilación, la fosforilación y similares, y dicha modificación postraduccional afecta a la diversidad de proteínas, juega un papel importante en la señalización intracelular y regula la fisiología celular. Una modificación postraduccional anormal de este tipo que se produce en las proteínas intercelulares provoca una diversidad de enfermedades entre las que se incluye el cáncer. Sin embargo, la información de la secuencia de una proteína particular por sí sola hace que sea imposible predecir con precisión si la proteína sufrirá una modificación postraduccional. Por lo tanto, la identificación de proteínas debe ir acompañada de una tarea de verificación, a través de una diversidad de experimentos, de si se produce o no una modificación postraduccional.

En los casos en que una proteína a expresar se expresa en eucariotas, tales como células animales, pero no en procariotas, tales como bacterias, existe la posibilidad de producir proteínas que no tengan las características deseadas mediante tal modificación postraduccional. Por ejemplo, se ha notificado que la aparición de glicosilación, que es un tipo de modificación postraduccional, en una región variable de un anticuerpo, puede disminuir la homogeneidad de los anticuerpos y alterar la unión específica de diana de los mismos (Wright Aet al.,1991, EMBO).

La publicación PCT WO95/19374 divulga estructuras de soporte polipeptídicas basadas en variantes Z de primera generación y la publicación PCT WO2009/080811 divulga estructuras de soporte polipeptídicas basadas en variantes Z de segunda generación.

Sin embargo, los documentos citados no divulgan, enseñan ni sugieren la aparición o no de modificación postraduccional (es decir, glicosilación) como en la presente invención y el efecto de la modificación postraduccional sobre la homogeneidad o la capacidad de unión específica de diana de los polipéptidos como producto resultante, y no reconocen la necesidad de mejora de los mismos.

Ante todo, sigue existiendo la necesidad de mejorar la pureza de proteínas (homogeneidad) y la capacidad de unión específica de diana en los casos de medicamentos que utilizan polipéptidos, en especial, polipéptidos que usan características de unión específicas de diana.

El documento WO 2015/189431 se refiere a un polipéptido que tiene afinidad por la interleucina-6. Yu et al (MAbs. Vol.

6. N.° 6. Taylor & Francis, 2014) se refieren a un híbrido de Affibody-adalimumab que bloquea la secreción de amiloide A sérico desencadenada por IL-6 y TNF combinadosin vivo.Yu (Diss. KTH Royal Institute of Technology, 2015) se refiere a la generación de proteínas de afinidad para aplicaciones biotecnológicas, de diagnóstico y terapéuticas.

Vazquez-Lombardi et al (Drug discovery today 20.10 (2015): 1271-1283) se refieren a desafíos y oportunidades para fármacos con estructura de soporte no procedente de anticuerpos. Frejd y Kim (Experimental & molecular medicine 49.3 (2017): e306-e306) se refieren a moléculas de Affibody como fármacos proteicos modificados por ingeniería genética. Yamaguchi et al (Journal of Biological Chemistry 266.30 (1991): 20434-20439) se refieren a los efectos de la eliminación dirigida de sitios de N-glicosilación en la eritropoyetina humana sobre su producción y propiedades biológicas.

Problema técnico

Los presentes inventores descubrieron que en los casos en los que las moléculas de Affibody®, que son un tipo de estructura de soporte polipeptídica basada en la variante Z, se expresan en células eucariotas, sus características de unión pueden degradarse debido a la presencia de un sitio de modificación postraduccional en una secuencia asociada con la unión a la diana. Los presentes inventores confirmaron a partir de tal hecho que, como resultado de la producción de proteínas Affibody con capacidad de unión específica de antígeno en células animales, la glicosilación en realidad se producía en un sitio de unión a la diana afectando negativamente a la homogeneidad de la proteína y a la unión específica de diana.

Por lo tanto, los presentes inventores se esforzaron por desarrollar una molécula de Affibody que tuviera una secuencia de aminoácidos sin posibilidad de degradar la homogeneidad de la proteína y las características de unión específicas de diana aunque se expresara en eucariotas. Como resultado, los presentes inventores confirmaron que las moléculas de Affibody con modificaciones de aminoácidos (sustituciones) en dos posiciones en la secuencia de aminoácidos de longitud completa de 58 aminoácidos no provocaban glicosilación y tenían una mayor capacidad de unión a un antígeno (especialmente, IL-6).

Sumario de la invención

La invención se define en las reivindicaciones independientes. Los aspectos y realizaciones preferidas adicionales se definen en las reivindicaciones dependientes. Cualquier aspecto, realización y ejemplo de la presente divulgación que no esté dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas no forma parte de la invención y se proporciona meramente con fines ilustrativos.

La invención proporciona un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de la SEQ ID NO: 2 a la SEQ ID NO: 4, en donde el antígeno diana del polipéptido es la interleucina-6 (IL-6).

La invención también proporciona un complejo polipeptídico que comprende: i) el polipéptido de la invención; y ii) un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en donde i) y ii) están unidos entre sí.

La invención proporciona adicionalmente un ácido nucleico que consiste en una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido o el complejo polipeptídico de la invención.

La invención proporciona además un método para producir un polipéptido mejorado en cuanto a pureza proteica y afinidad por un antígeno al prevenir la glicosilación, comprendiendo el método: (a) insertar el ácido nucleico de la invención en un vector de expresión; (b) transformar una célula hospedadora con el vector de expresión; y (c) cultivar la célula hospedadora para obtener un polipéptido.

La invención proporciona también un método para producir un complejo polipeptídico mejorado en cuanto a pureza proteica y afinidad por un antígeno al prevenir la glicosilación, comprendiendo el método: (a) insertar el ácido nucleico de la invención en un vector de expresión; (b) transformar una célula hospedadora, que es una célula eucariota, con el vector de expresión; y (c) cultivar la célula hospedadora para obtener un complejo polipeptídico.

Otros propósitos y ventajas de la presente divulgación serán más obvios cuando se tomen con la siguiente descripción detallada de la invención, las reivindicaciones y los dibujos. Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, las composiciones farmacéuticas y los medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia.

Descripción detallada de la invención

Solución técnica

Como se usa en el presente documento, el término "afinidad" se refiere a una propiedad o capacidad para unirse específicamente a una diana específica. El término se utiliza para indicar la intensidad de la fuerza de unión entre sustancias específicas, por ejemplo, la capacidad de unión entre una enzima y un sustrato o la capacidad de unión entre un anticuerpo y un antígeno, en el campo de la biología como en la presente invención.

Como se usa en el presente documento, el término "aminoácido" se refiere a la unidad constituyente más básica de las moléculas de proteína. En la estructura de los aminoácidos, un grupo amino (-NH<2>) y un grupo carboxilo (-COOH) están unidos a un átomo de carbono, al que se unen hidrógeno y un grupo R.

Como se usa en el presente documento, el término "proteína" se refiere a un material orgánico polimérico que constituye el cuerpo de todos los animales, y la proteína es un cuerpo conectado de numerosos aminoácidos. Hay aproximadamente 20 tipos de aminoácidos naturales, y una cadena larga, no ramificada de aminoácidos unidos entre sí a través de enlaces químicos denominados enlaces peptídicos se conoce como polipéptido. El polipéptido de la presente invención puede prepararse mediante un método de síntesis conocido en la técnica, por ejemplo, un vector de expresión que contiene un ácido nucleico que expresa una proteína se utiliza para transformar células hospedadoras para sintetizar una proteína recombinante, o el polipéptido puede prepararse mediante técnicas de síntesis en fase sólida (Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-54(1963); y Stewart,et al.,Solid Phase Peptide Synthesis, 2a ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)).

Como se usa en el presente documento, el término "glicosilación" es un tipo de modificación postraduccional en las células (eucariotas), y la reacción de glicosilación tiene lugar en el cuerpo de Golgi. La glicosilación se divide en N-glicosilación y O-glicosilación, que son diferentes con respecto al grupo funcional unido. Los procesos en los que un azúcar, tal como la lactosa o la fucosa, se une a una proteína producida en células se denominan colectivamente "glicosilación". En los procesos de glicosilación, se unen glicanos a una proteína y la proteína experimenta un "plegamiento" formando una estructura tridimensional. Tal estructura imparte estabilidad a la proteína de modo que la proteína puede permanecer sin disgregarse durante un largo período de tiempo. Además, los glucanos unidos a la proteína migran hacia el interior de las membranas celulares convirtiéndose la proteína en una proteína de la membrana celular, que a menudo ejerce los mismos efectos que un antígeno. Dicha proteína glicosilada se denomina glicoproteína, y una glicoproteína representativa es un anticuerpo que desempeña un papel importante en una respuesta inmunitaria.

Las ventajas de la presente invención que la distinguen de la técnica anterior se describirán mediante realizaciones específicas.

Cuando el polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 se expresa en células eucariotas, por ejemplo, en células HEK293F, como célula hospedadora, la glicosilación tiene lugar en la asparagina (Asn, N) en las posiciones 21 y 52 en la SEQ ID NO: 1. La glicosilación en las posiciones de aminoácidos degrada la fuerza de unión del polipéptido (molécula de Affibody) a IL-6.

Sin embargo, de acuerdo con un ejemplo descrito en el presente documento, la glicosilación que se produce en la asparagina en las posiciones 21 y 52 en la SEQ ID NO: 1 se evita cuando i) la treonina (Thr, T), que es el aminoácido en la posición 23 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, se sustituye por asparagina (Asn, N) como en la SEQ I<d>NO: 2 o la SEQ ID NO: 4; y ii) la serina (Ser, S), que es el aminoácido en la posición 54 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, se sustituye por alanina (Ala, A) como en la SEQ ID NO: 3 o 4.

En los casos en los que el polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de la SEQ ID NO: 2 a la SEQ ID NO: 4, en lugar de la SEQ ID NO: 1, se produce en células eucariotas, se evita la glicosilación, lo que conduce a una mejora en la pureza de la proteína (homogeneidad) (FIG. 2 a 4). Asimismo, dicho polipéptido tiene una mayor capacidad de unirse a IL-6 (FIG. 5 a 7).

Por lo tanto, de acuerdo con una realización de la presente invención, el polipéptido consiste en la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de la SEQ ID NO: 2 a la SEQ ID NO: 4, en donde el antígeno diana del polipéptido es la interleucina-6 (IL-6) y el polipéptido tiene una excelente afinidad por la IL-6.

La "interleucina 6 (IL-6)" se abrevia como IL-6, y se refiere a una glicoproteína de un peso molecular de aproximadamente 210.000 aislada como factor 2 estimulante de células B (BSF-2) que induce la diferenciación final de las células B en células productoras de anticuerpos. La IL-6 es una citocina, que se produce a partir de una diversidad de células, tales como los linfocitos T, linfocitos B, macrófagos y fibroblastos, y es una molécula similar al interferón p2 (IFN-p2). Se sabe que la IL-6 está implicada en la respuesta inmunitaria, la proliferación y la diferenciación de células hematopoyéticas y del sistema nervioso, respuestas agudas, y similares. La IL-6 humana se compone de 212 restos de aminoácido que contienen 28 péptidos señal, y la IL-6 de ratón se compone de 211 restos de aminoácido que contienen 24 péptidos señal. Se sabe que la producción excesiva de IL-6 está profundamente implicada en la aparición de varios tipos de disfunción inmunitaria, enfermedades inflamatorias y tumores linfáticos.

De acuerdo con otro aspecto más, se proporciona un complejo polipeptídico que incluye: i) el polipéptido de la invención; y ii) un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en donde i) y ii) están unidos entre sí.

En tal caso, el complejo polipeptídico tiene una forma multimérica en la que los respectivos monómeros de un polipéptido y un antígeno o un fragmento de unión a antígeno del mismo están unidos entre sí. Los complejos polipeptídicos de la presente invención están unidos entre sí a través de un enlace covalente. De acuerdo con un aspecto descrito en el presente documento, el complejo polipeptídico puede implementarse en forma de una proteína de fusión o un conjugado.

El término "complejo" se utiliza para designar dos o más cadenas polipeptídicas unidas, de las cuales un componente es un polipéptido (molécula de Affibody) que tiene afinidad por un antígeno diana (p. ej., IL-6) como se ha definido anteriormente y el otro componente es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente al antígeno diana. El "complejo" se utiliza para designar dos o más polipéptidos, que están unidos a través de un enlace covalente, por ejemplo, a través de la expresión de dos o más cadenas polipeptídicas en una proteína de fusión recombinante, o están unidas por conjugación química.

El complejo polipeptídico puede estar formado por la unión de: el polipéptido de unión a IL-6 que consiste en la secuencia de aminoácidos de cualquiera de la SEQ ID NO: 2 a la SEQ ID NO: 4; y un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo. El polipéptido de unión a IL-6 (molécula de Affibody) que constituye el complejo polipeptídico puede fusionarse y unirse al extremo N y/o al extremo C de una región de cadena pesada/cadena ligera del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo.

Por ejemplo, el polipéptido de unión a IL-6 que consiste en la SEQ ID NO: 2 a la SEQ ID NO: 4 puede unirse únicamente al extremo N de la cadena pesada, únicamente al extremo N de la cadena ligera del mismo, únicamente al extremo C de la cadena pesada, únicamente al extremo C de la cadena ligera, tanto al extremo N como al extremo C de la cadena pesada, tanto al extremo N como al extremo C de la cadena ligera, únicamente al extremo C de la cadena ligera y al extremo N de la cadena pesada, o únicamente al extremo C de la cadena pesada y al extremo N de la cadena ligera en el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo.

El polipéptido de unión a IL-6 (molécula de Affibody) y el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo en el complejo polipeptídico pueden estar unidos entre sí directamente, o pueden estar unidos entre sí indirectamente a través de un conector (p. ej., un conector de aminoácidos).

Una persona experta en la materia podría concebir que se puede usar un conector entre restos funcionales que normalmente se fusionarán en la producción de una proteína de fusión y son ejemplos de diferentes tipos de conectores que tienen diferentes características un conector de aminoácidos flexible, un conector no flexible y un conector de aminoácidos escindible. Los conectores se han utilizado con el fin de aumentar los niveles de expresión, mejorar la actividad biológica y permitir el direccionamiento o cambiar la farmacocinética de la proteína de fusión, o para aumentar la estabilidad y mejorar la propiedad de plegamiento de la proteína de fusión.

Por lo tanto, el complejo puede contener además al menos un conector, por ejemplo, al menos un conector seleccionado de conectores de aminoácidos flexibles, conectores no flexibles y conectores de aminoácidos escindibles. El conector puede disponerse entre la molécula de Affibody y el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno del mismo.

El complejo puede contener al menos un aminoácido adicional en el extremo C y/o el extremo N. El resto de aminoácido adicional puede añadirse por separado o colectivamente con el fin de mejorar, por ejemplo, la productividad, purificación, estabilizaciónin vivooin vitro,acoplamiento con el complejo, o detección. Por ejemplo, se puede añadir un resto de cisteína al extremo C y/o al extremo N del complejo. El resto de aminoácido adicional puede proporcionar una "etiqueta" para la purificación o detección del polipéptido y, por ejemplo, puede proporcionar una etiqueta, tal como la etiqueta His6, la etiqueta (HisGlu)3(etiqueta "HEHEHE"), la etiqueta "myc" (c-myc) o la etiqueta "FLAG" para una interacción con un anticuerpo específico para la etiqueta o para cromatografía de afinidad con metales inmovilizados (IMAC) en el caso de la etiqueta His6.

Los aminoácidos adicionales descritos anteriormente pueden unirse a i) el polipéptido de unión a IL-6 y ii) el complejo del polipéptido de unión a IL-6 y el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo definido en el presente documento por medio de conjugación química, a través de la expresión de i) el polipéptido de unión a IL-6 y ii) el complejo del polipéptido de unión a IL-6 y el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo como una proteína de fusión, bien directa o indirectamente a través de un conector (p. ej., conector de aminoácidos).

Como se usa en el presente documento, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo abarca no solo anticuerpos policlonales o monoclonales de longitud completa o intactos, sino también fragmentos de unión a antígeno de los mismos (p. ej., Fab, Fab', F(ab')<2>, Fab3, Fv y variantes de los mismos), proteínas de fusión que contienen una o más porciones de anticuerpo, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, minicuerpos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, anticuerpos lineales, anticuerpos monocatenarios, anticuerpos multiespecíficos (p. ej., anticuerpos biespecíficos) y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprenda un sitio de reconocimiento de antígeno de la especificidad requerida, incluyendo las variantes de glicosilación de anticuerpos, variantes de secuencia de aminoácidos de anticuerpos y anticuerpos modificados covalentemente. Los ejemplos específicos de los anticuerpos modificados y fragmentos de unión a antígeno de los mismos incluyen nanocuerpos, AlbudAb, DART (redireccionamiento de doble afinidad), BiTE (acoplador de células T biespecífico), TandAb (diacuerpos en tándem), DAF (Fab de doble acción), anticuerpos dos en uno, SMIP (productos inmunofarmacéuticos modulares pequeños), FynomAb (moléculas de fynomer fusionadas con anticuerpos), DVD-Ig (inmunoglobulina de dominio variable doble), CovX-cuerpos (anticuerpos modificados con péptidos), duocuerpos y triomAb. Esta lista de tales anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos no se limita a ellos.

Un anticuerpo de longitud completa contiene dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. Cada cadena pesada contiene una región variable de cadena pesada (V<h>) y una primera, segunda y tercera regiones constantes (C<h>1, C<h>2 y Ch3). Cada cadena ligera contiene una región variable de cadena ligera (Vl) y una región constante de cadena ligera (Cl). Los anticuerpos se pueden dividir en diferentes clases de acuerdo con la secuencia de aminoácidos de la región constante de la cadena ligera. Hay seis clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG, IgM e IgY. Aparte de estas, algunas pueden dividirse además en subclases (isotipos), p. ej., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Como se usa en el presente documento, la expresión "anticuerpo de longitud completa" se refiere a un anticuerpo de cualquier clase, tal como IgD, IgE, IgG, IgA, IgM o IgY (o cualquier subclase de las mismas). Las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de anticuerpos son bien conocidas para el experto en la materia.

Como se usa en el presente documento, la expresión "fragmento de unión a antígeno" es una molécula de anticuerpo, una porción o región del mismo, o un derivado del mismo, que conserva la totalidad o una parte significativa de la unión al antígeno del anticuerpo de longitud completa correspondiente. El fragmento de unión al antígeno puede contener la región variable de cadena pesada (V<h>), la región variable de cadena ligera (V<l>) o ambas. Cada una de las V<h>y V<l>típicamente contiene regiones determinantes de la complementariedad CDR1, CDR2 y CDR3. Los tres CDR en la V<h>o V<l>están flanqueadas por regiones marco (FR1, FR2, FR3 y FR4).

Como se ha descrito anteriormente, los ejemplos de fragmentos de unión a antígeno incluyen, pero sin limitación:

(1) un fragmento Fab, que es un fragmento monovalente que tiene una cadena Vl-Cl y una cadena Vh-Ch1; (2) un fragmento Fab', que es un fragmento Fab con la región bisagra de cadena pesada; (3) un fragmento F(ab')2, que es un dímero de fragmentos Fab' unidos por la región bisagra de cadena pesada, por ejemplo, unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (5) un fragmento Fv, que es el fragmento de anticuerpo mínimo que tiene los dominios Vl y Vh de un solo brazo de un anticuerpo; (6) un fragmento Fv monocatenario (scFv), que es una sola cadena polipeptídica en la que los dominios V<h>y V<l>de un scFv están unidos por un conector peptídico; (7) un (scFv)<2>, que contiene dos dominios Vh y dos dominios Vl, que están asociados a través de los dos dominios Vh mediante puentes disulfuro; y (8) anticuerpos de dominio, que pueden ser polipéptidos de dominio variable único de anticuerpo (Vh o Vl) que se unen específicamente a antígenos.

Los fragmentos de unión a antígeno se pueden preparar mediante métodos de rutina utilizados en la técnica. Por ejemplo, los fragmentos F(ab')2se pueden producir mediante digestión con pepsina de una molécula de anticuerpo de longitud completa, y los fragmentos Fab se pueden producir mediante reducción de los puentes disulfuro de los fragmentos F(ab')2. Como alternativa, los fragmentos se pueden preparar mediante tecnología recombinante expresando los fragmentos de cadena ligera y pesada en células hospedadoras adecuadas (p. ej., célulasE. coli,de levadura, de mamífero, vegetal o de insecto) y ensamblándolos para formar los fragmentos de unión a antígeno deseadosin vivooin vitro.Un anticuerpo monocatenario se puede preparar mediante tecnología recombinante uniendo una secuencia de nucleótidos que codifica una región variable de cadena pesada y una secuencia de nucleótidos que codifica una región variable de cadena ligera. Por ejemplo, se puede incorporar un conector flexible entre las dos regiones variables.

Como se usa en el presente documento, la expresión "anticuerpos monoclonales" se refiere a anticuerpos que tienen afinidad monovalente, lo que significa que cada molécula de anticuerpo en una muestra del anticuerpo monoclonal se une al mismo epítopo en el antígeno. Por otro lado, la expresión "anticuerpos policlonales", como se usa en el presente documento, se refiere a una colección de anticuerpos que reaccionan contra un antígeno específico, pero en la colección, tales anticuerpos pueden ser diferentes moléculas de anticuerpo que, por ejemplo, reaccionan con diferentes epítopos en el antígeno. Los anticuerpos policlonales se pueden producir habitualmente mediante la inoculación de un animal adecuado y se pueden aislar del suero del animal. Los anticuerpos monoclonales se producen por células inmunitarias idénticas, que son clones de una única célula progenitora (por ejemplo, una línea celular de hibridoma). Como se usa en el presente documento, la expresión "anticuerpo humano" se refiere a un anticuerpo que tiene regiones variables y constantes que corresponden sustancialmente a un anticuerpo obtenido u originado en seres humanos. Como se usa en el presente documento, la expresión "anticuerpos quiméricos" se refiere a anticuerpos recombinantes o modificados genéticamente, por ejemplo, anticuerpos monoclonales de ratón, que contienen polipéptidos o dominios de diferentes especies, o anticuerpos humanos, que se introducen para reducir la inmunogenicidad de los anticuerpos. La expresión "anticuerpos humanizados" se refiere a anticuerpos de especies no humanas, cuyas secuencias de proteínas se han modificado para aumentar su similitud con las variantes de anticuerpos producidas de forma natural en seres humanos, para reducir la inmunogenicidad.

Dado que el complejo descrito en el presente documento está compuesto por el polipéptido de unión a IL-6 y el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, el complejo no solo puede unirse a IL-6, sino que también puede unirse específicamente al menos a un antígeno adicional.

El antígeno adicional puede estar asociado con una enfermedad o trastorno del sistema inmunitario. Como alternativa, el antígeno adicional puede estar asociado con cáncer. Por lo tanto, en un aspecto, se proporciona el complejo descrito en el presente documento, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo tiene afinidad por un antígeno adicional, por ejemplo, un antígeno asociado con una enfermedad o trastorno del sistema inmunitario, o asociado con cáncer.

El antígeno adicional puede incluir antígenos asociados con enfermedades relacionadas con IL-6 así como antígenos asociados con enfermedades relacionadas con IL-6. De acuerdo con otro aspecto más, el antígeno adicional al que se puede unir específicamente el complejo polipeptídico puede seleccionarse del grupo que consiste en angiogenina 2 (Ang-2), factor de crecimiento del endotelio vascular, factor de necrosis tumoral, ligandos del factor de necrosis tumoral, miembros de la superfamilia de TNF-α, TNFSF11, TNFSF13, TNFSF13B, TNFSF14 y TNFSF15, factor de crecimiento similar a la insulina, interleucina la, interleucina lp, interleucina 10, interleucina 17A, interleucina 12, interleucina 23, interleucina 33, factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos, factor estimulante de colonias de granulocitos, lipopolisacárido, receptor 4 de tipo toll, factor de crecimiento nervioso, ligando 19 de motivo C-C de quimiocina, ligando 21 de motivo C-C de quimiocina, ligando 4 de motivo C-C de quimiocina e IFN-a, aunque no de forma limitativa.

De acuerdo con un aspecto descrito en el presente documento, ii) el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo puede contener la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y, en tal caso, el antígeno diana del mismo es TNF-α.

Además, los antígenos diana a los que se unen específicamente i) el polipéptido y ii) el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo pueden ser antígenos idénticos o antígenos diferentes.

Cuando los antígenos diana de i) el polipéptido y ii) el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo son idénticos entre sí, el complejo polipeptídico muestra una afinidad mejorada por el antígeno correspondiente y, cuando los antígenos diana de i) el polipéptido y ii) el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo son diferentes entre sí, el complejo polipeptídico tiene multiespecificidad, o es capaz de unirse específicamente a dos o más tipos de antígenos y, por lo tanto, puede dirigirse a un antígeno adicional y, por lo tanto, dicho complejo polipeptídico es útil.

El complejo polipeptídico puede realizarse en forma de una proteína fusionada o un conjugado.

Por lo tanto, el polipéptido (molécula de Affibody) y el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo pueden unirse mediante conjugación química (usando métodos de química orgánica conocidos) o mediante cualquier otro medio (por ejemplo, mediante la expresión del complejo como una proteína de fusión, directa o indirectamente a través de un conector (p. ej., un conector de aminoácidos)).

De acuerdo con un aspecto descrito en el presente documento, i) el polipéptido y ii) el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo del complejo polipeptídico están unidos entre sí a través de al menos un conector.

En tal caso, el conector puede consistir en una secuencia de aminoácidos representada por la fórmula general (GnSm)p o (SmGn)p,

en donde n, m y p son cada uno, independientemente;

n es un número entero de 1 a 7;

m es un número entero de 0 a 7;

la suma de n y m es un número entero de 8 o menor;

y

p es un número entero de 1 a 7.

De acuerdo con un aspecto descrito en el presente documento, n = 1 a 5 y m = 0 a 5 en el conector. En un aspecto más específico, n = 4 y m = 1. En un aspecto aún más específico, el conector es (GGGGS)3. En otro aspecto más, el conector es GGGGS. En otro aspecto más, el conector es VDGS. En otro aspecto más, el conector es ASGS.

En los siguientes contenidos, el TNF se usa como ejemplo ilustrativo del antígeno adicional como se ha descrito anteriormente y, por lo tanto, no debe considerarse una limitación del alcance. Por lo tanto, el siguiente método para medir la afinidad se puede usar para medir la afinidad de un anticuerpo por cualquier otro antígeno adicional adecuado, y no se limita necesariamente al método descrito a continuación, y una persona experta en la materia puede usar diversos métodos utilizables.

Como se usa en el presente documento, las expresiones "unión a IL-6", "afinidad de unión por IL-6", "unión a TNF" y "afinidad de unión por TNF" se refieren a una propiedad de un polipéptido, o el complejo como se define en el presente documento, que puede ensayarse, por ejemplo, mediante ELISA o resonancia de plasmones superficiales (SPR). Por ejemplo, la afinidad de unión se puede ensayar a través de un experimento en el que las muestras de polipéptido se capturan en placas ELISA recubiertas con anticuerpos y se añade IL-6 biotinilada (o TNF biotinilado), seguido de HRP conjugado con estreptavidina. Mediante el uso de un lector de placas de múltiples pocillos (p. ej., Victor3 (Perkin Elmer)), se añade el sustrato TMB y se mide la absorbancia a 450 nm. Un experto en la materia puede interpretar los resultados obtenidos a través de tales experimentos para establecer una medida cualitativa de la afinidad de unión del complejo por IL-6 (o TNF). Si se desea la medición cuantitativa, por ejemplo, se desea determinar el valor de CE<50>para la interacción, se puede utilizar ELISA. La respuesta del polipéptido frente a una serie de diluciones de IL-6 biotinilada (o TNF biotinilado) se mide usando ELISA como se ha descrito anteriormente. Un experto en la materia interpretaría los resultados obtenidos por dichos experimentos y calcularía los valores de CE50 a partir de los resultados utilizando, por ejemplo, GraphPad Prism 5 y regresión no lineal.

La afinidad de unión a IL-6 o la afinidad por un antígeno adicional (p. ej., TNF) también se puede medir mediante un experimento de resonancia de plasmones superficiales (SPR). Se inmoviliza IL-6 (o TNF) o un fragmento de la misma en un chip sensor de un instrumento de SPR y se deja pasar una muestra que contiene el complejo que se va a ensayar sobre el chip. Como alternativa, el complejo a ensayar se inmoviliza en un chip sensor del instrumento y se deja pasar por el chip una muestra que contiene IL-6 (o TNF) o un fragmento de la misma. Un experto en la materia interpretaría los resultados obtenidos a través de tales experimentos para establecer al menos una medida cualitativa de la afinidad de unión del complejo por IL-6 (o TNF). Si se desea la medición cuantitativa, por ejemplo, si se desea determinar el valor de la KDpara la interacción, se puede utilizar SPR. Los valores vinculantes pueden definirse mediante un instrumento, tal como Biacore (GE Healthcare) o ProteOn XPR 36 (Bio-Rad). La IL-6 (o el TNF) se inmoviliza de manera adecuada en un chip sensor del instrumento y se preparan muestras del complejo con una afinidad determinada por dilución en serie, y después se inyectan en un orden aleatorio. Un experto en la materia calcularía los valores de KDa partir de los resultados usando, por ejemplo, el modelo de unión Langmuir 1:1 del programa informático BIAe Evaluation 4.1 u otro programa informático adecuado proporcionado por el fabricante del instrumento.

El anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que es un componente del complejo polipeptídico descrito en el presente documento, puede ser un anticuerpo que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5. En tal caso, el complejo polipeptídico descrito en el presente documento tiene adicionalmente afinidad de unión por TNF-α además de por IL-6.

En el presente documento se describe una composición farmacéutica que contiene: (a) un polipéptido descrito en el presente documento; y (b) un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En el presente documento también se describe una composición farmacéutica que contiene: (a) un complejo polipeptídico, en el que i) el polipéptido descrito en el presente documento y ii) un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo están unidos entre sí; y (b) un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Las enfermedades que podrían prevenirse o tratarse mediante la composición farmacéutica varían dependiendo del tipo de antígeno al que el polipéptido o el complejo polipeptídico se pueden unir con afinidad. Por ejemplo, cuando el polipéptido o el complejo polipeptídico, que es un principio activo de la composición farmacéutica descrita en el presente documento, tiene afinidad por un antígeno asociado con una enfermedad relacionada con IL-6, la composición farmacéutica descrita en el presente documento puede tratar la enfermedad relacionada con IL-6. La enfermedad relacionada con IL-6 es ilustrativa y, por lo tanto, sería obvio para un experto en la materia que el alcance de la presente divulgación no se limita a ella.

Como se usa en el presente documento, la expresión "enfermedad relacionada con IL-6" se refiere a cualquier trastorno, enfermedad o afección en la que la IL-6 desempeña un papel regulador en la ruta de señalización.

También se describe en el presente documento un complejo o composición para usar en el tratamiento de una enfermedad relacionada con IL-6. Las listas no limitativas de la enfermedad relacionada con IL-6 para cuyo tratamiento pueden ser útiles el complejo o la composición del presente documento incluyen: enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades infecciosas, cáncer, enfermedades neoplásicas, diabetes, enfermedades neurológicas depresivas, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, artritis idiopática juvenil, artritis idiopática juvenil sistémica, vasculitis, artritis psoriásica, psoriasis, espondilitis anquilosante, enfermedades inflamatorias crónicas del intestino, tales como enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa, enfermedad de Graves, enfermedad de Behpet, uveítis, arteritis de células gigantes, esclerosis múltiple, esclerosis sistémica, lupus eritematoso sistémico, polimiositis, polimialgia reumática, asma, enfermedades pulmonares obstructivas crónicas, policondritis recidivante, pancreatitis, peritonitis, nefritis, enfermedad de Kawasaki, síndrome de Sjogren, enfermedad de Still del adulto, cáncer asociado a colitis, cáncer de riñón, cáncer de próstata, linfoma maligno, mieloma múltiple, enfermedad de Castleman, cáncer de mama, cáncer de pulmón, enfermedad de Alzheimer, VIH, diabetes, septicemia, caquexia, síndrome mielodisplásico (MDS), cirrosis hepática, enfermedad de injerto contra huésped, infarto de miocardio, endometriosis y osteoporosis.

La enfermedad puede seleccionarse del grupo que consiste en artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, artritis idiopática juvenil o artritis idiopática juvenil sistémica. En un aspecto específico, la enfermedad es artritis reumatoide.

En otro aspecto más, la enfermedad es una enfermedad inflamatoria crónica del intestino, por ejemplo, enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa.

En otro aspecto más, la enfermedad es cáncer o una enfermedad neoplásica, por ejemplo, cáncer o una enfermedad neoplásica seleccionada del grupo que consiste en cáncer asociado a colitis, cáncer de riñón, cáncer de próstata, linfoma maligno, mieloma múltiple, cáncer de mama y cáncer de pulmón.

En un aspecto particular, la enfermedad incluye malignidad de células B seleccionada del grupo que consiste en leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemia prolinfocítica, tricoleucemia, leucemia linfocítica aguda común (CALLA), leucemia linfoblástica aguda de células nulas, linfoma no Hodgkin, linfoma difuso de linfocitos B grandes (DLBCL), mieloma múltiple, linfoma folicular, linfoma esplénico, linfoma de la zona marginal, linfoma de células del manto, linfoma de células B indolente y linfoma de Hodgkin.

Además, la enfermedad incluye enfermedades autoinmunitarias y enfermedades inflamatorias asociadas con un número y/o activación de células B inapropiado y/o aumentado. Los ejemplos de las enfermedades autoinmunitarias y enfermedades inflamatorias incluyen esclerosis múltiple, artritis reumatoide y lupus eritematoso sistémico (SLE).

En otro aspecto más, la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en enfermedad de Alzheimer, VIH, diabetes, septicemia, caquexia, síndrome mielodisplásico (MDS), cirrosis hepática, enfermedad de injerto contra huésped, infarto de miocardio, endometriosis y osteoporosis.

El vehículo farmacéuticamente aceptable contenido en la composición farmacéutica descrita en el presente documento se utiliza habitualmente en el momento de la formulación, y los ejemplos del mismo pueden incluir, pero sin limitación, lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidón, goma arábiga, fosfato de calcio, alginato, gelatina, silicato de calcio, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, celulosa, agua, jarabe, metilcelulosa, hidroxibenzoato de metilo, hidroxibenzoato de propilo, talco, estearato de magnesio y aceite mineral. La composición farmacéutica puede contener adicionalmente, además de los ingredientes anteriores, un lubricante, un agente humectante, un agente edulcorante, un agente saborizante, un emulsionante, un agente de suspensión, un conservante y similares. Los vehículos y preparaciones farmacéuticamente aceptables adecuados se describen en detalle enRemington's Pharmaceutical Sciences(19a ed., 1995).

La preparación farmacéutica puede administrarse por vía oral o parenteral, por ejemplo, inyección intravenosa, inyección subcutánea, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal, inyección intraesternal, inyección intratumoral, administración tópica, administración intranasal, administración intrapulmonar y administración rectal.

La dosis adecuada de la composición farmacéutica que se describe en el presente documento varía dependiendo de factores, tales como el método de formulación, la manera de administración, la edad del paciente, el peso corporal, el género y la morbilidad, la alimentación, el momento de administración, la vía de administración, la tasa de excreción y la sensibilidad de respuesta. Un médico con experiencia normal puede determinar y prescribir fácilmente una dosis eficaz para el tratamiento o la prevención deseados. De acuerdo con un aspecto descrito en el presente documento, la dosis diaria de la composición farmacéutica que se describe en el presente documento puede ser de 0,0001 a 100 mg/kg. Como se usa en el presente documento, la expresión "cantidad farmacéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad suficiente para prevenir o tratar las enfermedades descritas anteriormente.

Como se usa en el presente documento, el término "prevención" se refiere a un tratamiento profiláctico o protector de una enfermedad o un estado patológico. Como se usa en el presente documento, el término "tratamiento" se refiere a una reducción, supresión, mejora o erradicación de un estado patológico.

La composición farmacéutica se puede formular en una forma farmacéutica o se puede preparar en un recipiente multidosis mediante el uso de un vehículo y/o excipiente farmacéuticamente aceptable de acuerdo con un método que puede realizar fácilmente una persona que tiene una experiencia normal en la técnica a la que pertenece la presente invención. Aquí, la formulación puede estar en forma de una solución en un medio oleoso o acuoso, una suspensión, una emulsión, un extracto, una pulverización, un supositorio, un polvo, gránulos, un comprimido o una cápsula, y puede contener adicionalmente un dispersante o un estabilizante.

Dado que la composición farmacéutica descrita en el presente documento contiene el polipéptido descrito anteriormente o el complejo polipeptídico descrito en el presente documento como principio activo, se omiten las descripciones duplicadas para evitar una complicación excesiva de la memoria descriptiva debido a descripciones repetitivas de la misma.

También se describe en el presente documento un método para la prevención o el tratamiento de cánceres o una enfermedad relacionada con la IL-6, incluyendo el método administrar la composición farmacéutica anterior descrita en el presente documento a un sujeto.

Como se usa en el presente documento, el término "administración" o "administrar" se refiere a la administración directa de una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición descrita en el presente documento a un sujeto (individuo) que necesita la composición, formando de este modo la misma cantidad de la misma en el cuerpo del sujeto.

La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" de la composición se refiere al contenido de la composición, que es suficiente para proporcionar un efecto terapéutico o profiláctico a un sujeto al que se va a administrar la composición y, por tanto, el término tiene un significado que abarca "cantidad profilácticamente eficaz". Como se usa en el presente documento, el término "sujeto" incluye, pero sin limitación, un ser humano, ratón, rata, cobaya, perro, gato, caballo, vaca, cerdo, mono, chimpancé, babuino o macaco. Específicamente, el sujeto puede ser un ser humano.

Dado que el método para la prevención o el tratamiento de cánceres o una enfermedad relacionada con la IL-6 descrita en el presente documento incluye la administración de la composición farmacéutica descrita en el presente documento, se omiten las descripciones duplicadas para evitar una complicación excesiva de la memoria descriptiva.

También se describe en el presente documento un ácido nucleico que consiste en una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de la invención.

También se describe en el presente documento un ácido nucleico que consiste en una secuencia de nucleótidos que codifica el complejo polipeptídico formado por la unión del polipéptido y el antígeno o el fragmento de unión al antígeno del mismo.

En un aspecto descrito en el presente documento, sería evidente para un experto en la materia que la secuencia de nucleótidos que codifica i) el polipéptido o ii) el complejo polipeptídico que contiene el polipéptido y el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a cualquier antígeno diana, es una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos que constituye el polipéptido o el complejo polipeptídico, y no se limita a ninguna secuencia de nucleótidos particular.

La razón es que aunque la secuencia de nucleótidos experimente una mutación, es posible que la expresión de la secuencia de nucleótidos mutada en una proteína no provoque un cambio en la secuencia de la proteína. Esto se denomina degeneración de codones. Por lo tanto, la secuencia de nucleótidos incluye secuencias de nucleótidos que contienen codones funcionalmente equivalentes, codones que codifican los mismos aminoácidos (p. ej., debido a la degeneración de codones, siendo seis el número de codones para arginina o serina), o codones que contienen aminoácidos biológicamente equivalentes.

Como se usa en el presente documento, la expresión "ácido nucleico" incluye de manera integral moléculas de ADN (ADNg y ADNc) y moléculas de ARN, y un nucleótido como unidad constituyente básica en la molécula de ácido nucleico incluye nucleótidos de origen natural y análogos con azúcares o bases modificados (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, Nueva York (1980); y Uhlman & Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

Considerando que la mutación descrita anteriormente tiene una actividad biológicamente equivalente, debe considerarse que las moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento que codifican las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 4 también incluyen secuencias que muestran una identidad sustancial con las mismas. La identidad sustancial se refiere a una secuencia que muestra al menos un 60 %, más preferentemente al menos un 70 %, aún más preferentemente al menos un 80 %, aún más preferentemente al menos un 90 % y más específicamente al menos un 95 % de identidad de nucleótidos cuando la secuencia descrita en el presente documento y cualquier otra secuencia se alinean de forma correspondiente tanto como sea posible y la secuencia alineada se analiza utilizando algoritmos comúnmente utilizados en la técnica. En la técnica se conocen métodos de alineamiento para la comparación de secuencias. Se describen varios métodos y algoritmos para el alineamiento en Smith y Waterman,Adv. Appl. Math.2:482(1981); Needleman y Wunsch,J. Mol. Bio.48:443(1970); Pearson y Lipman,Methods in Mol. Biol.24: 307-31(1988); Higgins y Sharp,Gene73:237-44(1988); Higgins y Sharp,CABIOS5:151-3(1989); Corpetet al., Nuc. Acids Res.16:10881-90(1988); Huanget al., Comp. Appl. BioSci.8:155-65(1992); y Pearsonet al., Meth. Mol. Biol.24:307-31 (1994), pero sin limitación a los mismos. Específicamente, se pueden utilizar algoritmos ClustalX y neighbor-joining (NJ). La herramienta básica de búsqueda de alineamiento local del NCBI (BLAST; Altschul,et al., J. Mol. Biol.215:403-10(1990)) está disponible en, por ejemplo, el NBCI (Centro Nacional de Información Biológica), y se puede utilizar en relación con programas de análisis de secuencias, tales como blastp, blasm, blastx, tblastn y tblastx, en Internet.

De acuerdo con un aspecto, se proporciona un método para producir un polipéptido mejorado en cuanto a pureza proteica y afinidad por un antígeno mediante la prevención de la glicosilación, incluyendo el método:

(a) insertar el ácido nucleico de la invención en un vector de expresión;

(b) transformar una célula hospedadora con el vector de expresión; y

(c) cultivar la célula hospedadora para obtener un polipéptido.

De acuerdo con otro aspecto, se proporciona un método para producir un complejo polipeptídico mejorado en cuanto a pureza proteica y afinidad por un antígeno mediante la prevención de la glicosilación, incluyendo el método:

(a) insertar el ácido nucleico de la invención en un vector de expresión;

(b) transformar una célula hospedadora, que es una célula eucariota, con el vector de expresión; y

(c) cultivar la célula hospedadora para obtener un complejo polipeptídico.

De acuerdo con un aspecto descrito en el presente documento, el vector de expresión es un vector recombinante para la expresión de células hospedadoras, en el que (a) se inserta una secuencia de nucleótidos que codifica i) un polipéptido (molécula de Affibody), tal como la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 4 o ii) un complejo del polipéptido y un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, en donde el vector contiene: (b) un promotor, que está unido operativamente a la secuencia de nucleótidos y forma una molécula de ARN en las células hospedadoras; y (c) una secuencia señal de poli A, que actúa sobre las células hospedadoras provocando la poliadenilación del extremo 3' de la molécula de ARN.

Como se usa en el presente documento, la expresión "unido/a operativamente" se refiere a un enlace funcional entre una secuencia de control de la expresión de un ácido nucleico (p. ej., un promotor, una secuencia señal o una matriz de sitios de unión a factores de regulación de la transcripción) y otra secuencia de ácido nucleico, de modo que la secuencia de control controla la transcripción y/o la traducción de la otra secuencia de ácido nucleico.

El sistema de vector descrito en el presente documento se puede construir mediante varios métodos conocidos en la técnica, y un método específico del mismo se divulga en Sambrooket al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)).

El vector se puede construir normalmente como un vector para clonación o un vector para expresión. Además, el vector puede construirse utilizando células procariotas o eucariotas como hospedador.

Cuando el vector descrito en el presente documento es un vector de expresión y se utilizan células procariotas como hospedador, el vector generalmente contiene un promotor fuerte capaz de realizar la transcripción (p. ej., el promotor μLA, promotortrp,promotorlac,promotor de T7, promotortac,etc.), un sitio de unión al ribosoma para el inicio de la traducción y una secuencia de terminación de la transcripción/traducción. En los casos en los queE. colise utiliza como célula hospedadora, pueden utilizarse como región de control los sitios del promotor y el operador para la ruta de biosíntesis de triptófano deE. coli(Yanofsky, C., J. Bacteriol., 158:1018-1024 (1984)) y el promotor hacia la izquierda del fago A (promotor μL<λ>, Herskowitz, I. y Hagen, D.,Ann. Rev. Genet.,14: 399-445 (1980)).

Por otra parte, el vector puede construirse mediante la manipulación de plásmidos (p. ej., pSK349, pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, serie pGEX, serie pET y pUC19, etc.), fagos (p. ej., AgtA4B, A-Charon, AAz1 y M13, etc.) o un virus (p. ej., SV40, etc.), que se usan con frecuencia en la técnica.

El vector puede fusionarse con otra secuencia para facilitar la purificación de un polipéptido expresado a partir del mismo. Los ejemplos de la secuencia que se puede utilizar para la fusión incluyen, por ejemplo, glutatión S-transferasa (Pharmacia, EE. UU.), proteína de unión a maltosa (NEB, EE. UU.), FLAG (IBI, EE. UU.) y 6x His (hexahistidina; Quiagen, EE. UU.). Debido a la secuencia adicional para la purificación, la proteína expresada en el hospedador se purifica rápida y fácilmente mediante cromatografía de afinidad.

El vector descrito en el presente documento incluye, como marcador de selección, un gen resistente a antibióticos que normalmente se utiliza en la técnica, y puede incluir genes resistentes a ampicilina, gentamicina, carbenicilina, cloranfenicol, estreptomicina, kanamicina, geneticina, neomicina y tetraciclina.

Por otra parte, cuando el vector descrito en el presente documento es un vector de expresión y se utiliza una célula eucariota como hospedador, puede utilizarse un promotor derivado de un genoma de una célula de mamífero (p. ej., un promotor de metalotioneína) o un promotor derivado de un virus de mamífero (p. ej., promotor tardío de adenovirus, promotor del virus vaccinia 7.5 K, promotor de SV40, promotor de citomegalovirus, promotor tk de HSV), y el vector generalmente tiene una secuencia de poliadenilación como secuencia de terminación de la transcripción.

Opcionalmente, el vector puede suministrar adicionalmente un gen que codifica una molécula indicadora (p. ej., luciferasa y glucuronidasa).

Como célula hospedadora capaz de clonar y expresar de manera estable y continua el vector descrito en el presente documento, se puede usar cualquier célula hospedadora conocida en la técnica, por ejemplo, y los ejemplos de las células hospedadoras incluyen cepas deE. coli,tales comoE. coliOrigami2,E. coliJM109,E. coliBL21 (DE3),E. coliRR1,E. coliLE392,E. coliB,E. coliX 1776 yE. coliW3110, cepas deBacillusspp., tales comoBacillus subtilisyBacillus thuringiensisy cepas de la familiaEnterobacteriaceae,tales comoSalmonella typhimurium, Serratia marcescensy diversas especies dePseudomonas.

Además, en los casos en los que el vector descrito en el presente documento se utiliza para transformar células eucariotas, como células hospedadoras pueden utilizarse levaduras (Saccharomyces cerevisiae),células de insectos y células animales (p. ej., líneas celulares de ovario de hámster chino (CHO) y líneas celulares W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN y MDCK).

De acuerdo con un aspecto descrito en el presente documento, como células hospedadoras transformadas por el vector descrito en el presente documento se utilizan células HEK293F.

Cuando las células hospedadoras son células procariotas, el vector puede suministrarse a las células hospedadoras mediante el método de CaCl2 (Cohen, S.N.et al.,Proc. Natl. Acac. Sci. EE.UU., 9:2110-2114 (1973)), el método de Hanahan (Cohen, S.N.et al.,Proc. Natl. Acac. Sci. EE.UU., 9:2110-2114(1973); y Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580 (1983)), electroporación (Dower, W.J.et al.,Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145 (1988)) y similares. Además, cuando las células hospedadoras son células eucariotas, el vector puede inyectarse en las células hospedadoras mediante microinyección (Capecchi, M.R., Cell, 22:479 (1980)), precipitación de fosfato de calcio (Graham, F. L.et al., Virology, 52:456 (1973)), electroporación (Neumann, E.et al.,EMBO J., 1:841 (1982)), transfección mediada por liposomas (Wong, T.K.et al.,Gene, 10:87 (1980)), tratamiento con DEAE-dextrano (Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190 (1985)), bombardeo de genes (Yanget al.,Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572 (1990)) y similares.

En el presente documento, el vector recombinante inyectado en las células hospedadoras puede expresar el polipéptido o complejo polipeptídico recombinado en las células hospedadoras y, en tal caso, se obtiene una gran cantidad de polipéptidos o complejos polipeptídicos. Por ejemplo, cuando el vector contiene un promotor lac, la expresión génica puede inducirse mediante el tratamiento de las células hospedadoras con IPTG.

Las células hospedadoras transformadas pueden cultivarse mediante un método de cultivo de células hospedadoras conocido o un método modificado del mismo. Por ejemplo, cuando las células hospedadoras sonE. coli,un medio para cultivar células hospedadoras transgénicas puede emplear un medio natural o un medio sintético siempre que dicho medio contenga una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, una sal inorgánica y similares, que puedan utilizarse eficazmente porE. coli.La fuente de carbono utilizable incluye: hidratos de carbono, tales como glucosa, fructosa y sacarosa; almidón, hidrolizados de almidón; ácidos orgánicos, tales como ácido acético y ácido propiónico; y alcoholes, tales como etanol, propanol y glicerol. La fuente de nitrógeno incluye: amoniaco; sales de amonio de ácidos inorgánicos o ácidos orgánicos, tales como sulfato de amonio, acetato de amonio y fosfato de amonio; peptona, extractos de carne, extractos de levadura, líquido macerado de maíz, hidrolizados de caseína, extractos de soja, hidrolizados de soja; y diversas células fermentadas y lisados de las mismas. La sal inorgánica incluye dihidrogenofosfato de potasio, hidrogenofosfato de dipotasio, fosfato de magnesio, sulfato de magnesio, cloruro sódico, sulfato de manganeso, sulfato de cobre, carbonato de calcio y similares.

El cultivo generalmente se lleva a cabo en condiciones aeróbicas mediante, por ejemplo, un cultivo agitado o una rotación por un rotador. La temperatura de cultivo está preferentemente en un intervalo de 10 a 40 °C, y el tiempo de cultivo es generalmente de 5 horas a 7 días. El pH del medio se mantiene preferentemente a 3,0-9,0 durante el cultivo. El pH del medio se puede ajustar con un ácido inorgánico u orgánico, una solución alcalina, urea, carbonato de calcio, amoniaco o similares. Para el mantenimiento y la expresión de vectores recombinantes, si es necesario se pueden añadir antibióticos, tales como ampicilina, estreptomicina, cloranfenicol, kanamicina y tetraciclina durante el cultivo. Cuando se cultivan células hospedadoras transformadas por un vector de expresión recombinante que tiene un promotor inducible, si es necesario se puede añadir un inductor adecuado para el medio. Por ejemplo, se puede añadir isopropil-p-D-tiogalactopiranósido (IPTG) cuando el vector de expresión contiene un promotor lac, y se puede añadir ácido indolacrílico cuando el vector de expresión contiene un promotor trp.

Efectos ventajosos

A continuación se resumen las características y ventajas descritas en el presente documento.

(a) La presente invención proporciona un polipéptido (molécula de Affibody) mejorado en cuanto a pureza proteica y afinidad por IL-6 mediante la prevención de la glicosilación aunque se produzca en células eucariotas.

(b) La presente invención proporciona un complejo polipeptídico mejorado en cuanto a pureza proteica y afinidad por IL-6 al contener el polipéptido (molécula de Affibody) y un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a cualquier antígeno diana.

(c) La presente invención proporciona métodos respectivos para fabricar el polipéptido (molécula de Affibody) y el complejo polipeptídico compuesto por un anticuerpo y un fragmento de unión a antígeno del mismo.

El polipéptido o el complejo del mismo de la presente invención, aunque se produzca en células eucariotas, no causa glicosilación, lo que conduce a una alta pureza en la proteína producida y una alta afinidad por un antígeno diana y, por lo tanto, el polipéptido o el complejo del mismo de la presente invención es muy valioso como reactivo para el diagnóstico o tratamiento de una enfermedad.

Breve descripción de los dibujos

La FIG. 1 muestra un mapa vectorial del vector de expresión (vector pcDNA3.3, Invitrogen, n.° cat. K8300-01) utilizado para inducir la mutación a fin de prevenir la aparición de glicosilación.

La FIG. 2 muestra la pureza de complejos polipeptídicos (anticuerpos biespecíficos), en los que los polipéptidos (moléculas de Affibody) que tenían afinidad por IL-6 se unieron al extremo N de la cadena ligera de un anticuerpo.

La FIG. 3 muestra la pureza de complejos polipeptídicos (anticuerpos biespecíficos), en los que los polipéptidos (moléculas de Affibody) que tenían afinidad por<i>L-6 se unieron al extremo C de la cadena ligera de un anticuerpo.

La FIG. 4 muestra la pureza de complejos polipeptídicos (anticuerpos biespecíficos), en los que los polipéptidos (moléculas de Affibody) que tenían afinidad por<i>L-6 se unieron al extremo N de la cadena pesada de un anticuerpo.

La FIG. 5 muestra la capacidad de unión de los complejos polipeptídicos (anticuerpos biespecíficos) a antígenos diana (TNF-α e IL-6), teniendo los complejos polipeptídicos los polipéptidos (moléculas de Affibody) que tienen afinidad por IL-6 unidos al extremo N de la cadena ligera de un anticuerpo.

La FIG. 6 muestra la capacidad de unión de los complejos polipeptídicos (anticuerpos biespecíficos) a antígenos diana (TNF-α e IL-6), teniendo los complejos polipeptídicos los polipéptidos (moléculas de Affibody) que tienen afinidad por IL-6 unidos al extremo C de la cadena ligera de un anticuerpo.

La FIG. 7 muestra los valores de CE50 de los complejos polipeptídicos (anticuerpos biespecíficos) frente a antígenos diana (TNF-α e IL-6).

En las FIG. 2 a 7 y en la presente memoria descriptiva, NL5 se refiere al anticuerpo biespecífico en el que la secuencia de Affibody se unió al extremo N de la cadena ligera del anticuerpo adalimumab a través de un conector que consiste en cinco aminoácidos (GGGGS); CL5 se refiere al anticuerpo biespecífico en el que la secuencia de Affibody se unió al extremo C de la cadena ligera del anticuerpo adalimumab a través de un conector que consiste en cinco aminoácidos (GGGGS); y NH5 se refiere al anticuerpo biespecífico en el que la secuencia de Affibody se unió al extremo N de la cadena pesada del anticuerpo adalimumab a través de un conector que consiste en cinco aminoácidos (GGGGS).

Modo para llevar a cabo la invención

En lo sucesivo en el presente documento, la presente invención se describirá con más detalle con referencia a los ejemplos.

Estos ejemplos son solo para ilustrar la presente invención de manera más específica, y será evidente para los expertos en la materia que el alcance de la presente invención no está limitado por estos ejemplos. La invención se define por las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplos

Ejemplo 1: Glicosilación que se produce en la proteína de Affibody tras la expresión en células animales

Dado que los anticuerpos biespecíficos, en los que la proteína de Affibody que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y que se une específicamente a IL-6 está unida genéticamente con un anticuerpo contra TNF (adalimumab; que contiene la cadena pesada de SEQ ID NO: 5 y la cadena ligera de SEQ ID NO: 6), se produjeron en células animales (células HEK293F), se produce glicosilación y, como resultado, los pesos moleculares de las proteínas de los anticuerpos biespecíficos no eran constantes y se mostraban varias bandas (véase el progenitor del Carril 1 en las FIG. 2 a 4). Como resultado del análisis de la secuencia primaria de la proteína de Affibody que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, la posibilidad de glicosilación se predijo en la asparagina (Asn, N) en las posiciones de aminoácidos 21 y 52 (Eisenhaber B & Eisenhaber F, 2010, Methods Mol Biol).

Posteriormente, para investigar si la glicosilación observada en la molécula de Affibody y la sustancia unida al anticuerpo adalimumab se producía en la proteína de Affibody, los presentes inventores desarrollaron variantes resultantes de la mutación de los sitios de glicosilación predichos.

[Tabla 1]

Para eliminar la posibilidad de glicosilación en la secuencia de Affibody, se fabricaron variantes en las que la treonina (T) se sustituye por asparagina (N) en la posición 23 y la serina (S) se sustituye por alanina (A) en la posición 54, mediante PCR solapante utilizando los cebadores de PCR de la Tabla 1. Por medio de esto, se fabricaron tres tipos de variantes de anticuerpos biespecíficos (SM1, SM2 y DM1) como se indica a continuación.

Para la mutagénesis simple, se utilizó el ADN precursor obtenido mediante la inserción de un anticuerpo biespecífico anti-IL-6 y TNF-α humano en el vector pcDNA3.3 (Invitrogen, n.° cat. K8300-01) de la FIG. 1 y se realizó una PCR solapante en las siguientes condiciones.

En primer lugar, se indujo una mutación para sustituir la treonina por asparagina en la posición de aminoácido 23. Para la producción del fragmento de ADN N-terminal basándose en la mutación de la treonina en la posición de aminoácido 23, se pusieron 50 ng de ADN molde, 4 μl de cada uno de los siguientes: cebador T23N-R y cebador directo de CMV a 10 pmol/μl, y 10 μl de la mezcla de polimerasa 10X pfu (ELPIS biotech, EBT-1011) en un tubo de PCR y posteriormente se añadió agua destilada hasta un volumen de reacción total de 50 μl. Después de eso, se realizó la reacción de PCR.

Además, se produjo el fragmento de ADN C-terminal basándose en la mutación de la treonina en la posición de aminoácido 23 usando los cebadores inversos T23N-F y TK poli en las condiciones anteriores.

Los dos fragmentos de ADN producidos a partir de la reacción de PCR se cargaron en gel de agarosa y después se separaron del gel de agarosa utilizando el kit de elución de gel de ADN (iNtRON BIOTECHNOLOGY, n.° cat. 17288). Después de eso, se pusieron 50 ng de cada uno de los dos fragmentos de ADN separados utilizados como ADN molde, 4 μl de cada uno de los siguientes: cebador inverso de TK poli y cebador directo de CMV a 10 μmol/μl y 10 μl de mezcla de polimerasa 10X pfu (ELPIS, n.° cat. EBT-1011) en un tubo de PCR y después se añadió agua destilada hasta un volumen de reacción total de 50 μl. Después de eso, se realizó una PCR solapante para unir los dos fragmentos de ADN para fabricar una secuencia variante en la que la treonina se sustituyó por arginina en la posición 23.

A continuación, se indujo la mutación para sustituir la serina por alanina en la posición del aminoácido 54. Se realizó una PCR solapante con el mismo método que cuando se sustituyó el aminoácido 23, con la excepción de que se usaron S54A-F y S54A-R en lugar de T23N-F y T23N-R como cebadores. El producto de la PCR solapante se sometió a limpieza de<a>D<n>usando el kit de elución de gel.

Por último, se indujo una doble mutación para sustituir los dos aminoácidos en las posiciones 23 y 54. Esta mutagénesis doble se llevó a cabo sustituyendo el aminoácido en la posición 23 en el ADN con el aminoácido 53 sustituido utilizado como molde.

El ADN biespecífico purificado y el vector pcDNA3.3 se digirieron doblemente por Clal (NEB, n.° cat. R0197L) y Xhol (NEB, n.° cat. R0146L), respectivamente, y luego se ligaron.

De esta manera, se obtuvieron variantes de anticuerpos biespecíficos que se unían tanto a TNF-α comoaIL-6. En la Tabla 2 se muestran tres tipos de secuencias de Affibody de las variantes de anticuerpos biespecíficos.

[Tabla 2J

Como se muestra en la Tabla 2, la secuencia de mutación simple en la que la treonina se sustituyó por asparagina en la posición de aminoácido 23 en la secuencia de Affibody y la secuencia de mutación simple en la que la serina se sustituyó por alanina en la posición de aminoácido 54 en la secuencia de Affibody se denominaron SMI y SM2, respectivamente, y la secuencia de mutación doble en la que se sustituyeron los aminoácidos 23 y 54 se denominaron DM1. Por lo tanto, estas secuencias se utilizaron para estudios de expresión de anticuerpos biespecíficos en células animales y caracterización de los mismos.

Ejemplo 2: Producción de tres tipos de variantes de anticuerpos biespecíficos mediante el uso de células animales

Se produjeron los tres tipos de variantes de anticuerpo biespecífico y el anticuerpo biespecífico de la secuencia progenitora, fabricado en el ejemplo 1, usando células HEK293F.

En primer lugar, se cultivaron células HEK293F hasta una cantidad de 100 ml a 1x106 células/ml, y luego se sometieron a incubación con agitación en condiciones de 37 °C, 8 % de CO<2>y RPM125.

A continuación, se pusieron 5 ml de un medio de cultivo en un tubo estéril de 15 ml y se añadieron ADN de cadena pesada y ADN de cadena ligera en una relación de 1:2, seguido de una buena mezcla, para preparar el ADN. Se puso PEI (Polysciences, n.° cat. 23966) en el tubo de 15 ml que contenía el medio de cultivo y ADN, seguido de una buena mezcla, y luego se añadieron células HEK293F, seguido de cultivo durante 7 días.

Los anticuerpos biespecíficos se purificaron del líquido de cultivo usando resina de Proteína A (GE Healthcare, n.° cat.

17-5438-03) y el tampón se intercambió mediante diafiltración (Satorius, n.° cat. VS2002). Los anticuerpos biespecíficos purificados se cuantificaron midiendo la absorbancia a una longitud de onda de 280 nm. Los anticuerpos biespecíficos purificados se analizaron en SDS-PAGE al 12 %.

Comparando los anticuerpos biespecíficos producidos, el progenitor y los tres tipos de variantes, se produjo glicosilación en asparagina tanto en la posición 21 como en la 52 cuando la proteína de Affibody se unió al extremo N del anticuerpo, y únicamente no se produjo glicosilación en DM1 en la que los dos sitios estaban mutados (FIG. 2 y 4).

Cuando la proteína de Affibody se unió al extremo C del anticuerpo, se produjo glicosilación definitivamente en la asparagina en la posición 52, mientras que se produjo una glicosilación muy débil en la asparagina en la posición 21 (FIG. 3).

Se pudo confirmar a través de los resultados anteriores que cuando la proteína de Affibody de unión a IL-6 se produjo utilizando células animales, se produjo glicosilación en la asparagina en las posiciones 21 y 52 de la secuencia de Affibody, y la pureza de la proteína mejoró cuando los aminoácidos de las posiciones 23 y 54 de la secuencia de Affibody se sustituyeron por otros aminoácidos (SM1, SM2 y DM2) (FIG. 2 y 4).

Ejemplo 3: Confirmación de la reducción de la fuerza de unión del anticuerpo biespecífico debido a la glicosilación

Se analizó el cambio en la fuerza de unión de la proteína de Affibody a una proteína diana debido a la glicosilación como se indica a continuación.

Para investigar la fuerza de unión de los anticuerpos biespecíficos (progenitor y tres tipos de variantes) fabricados en el Ejemplo 2 a TNF-α oaIL-6 solos, se realizó el siguiente experimento.

En primer lugar, se dispensaron TNF-α (R&D systems, n.° cat. 210-TA-100/CF) a 0,2 μg/ml o IL-6 (R&D systems, n.° cat. 206-IL-050/CF) a 1 μg/ml con 30 μl por pocillo en placas ELISA (Corning, n.° cat. 3690) y se inmovilizaron por incubación a 4 °C durante 15 horas o más. Después de 15 horas, las placas ELISA se lavaron tres veces con tween20 PBS al 0,05 % y los anticuerpos biespecíficos se diluyeron en serie desde 60 nM hasta 1/5 veces siete veces, se dispensaron 30 μl de cada uno y luego se incubaron a 25 °C durante 1 hora. Después de lavar las placas ELISA tres veces, se diluyó anticuerpo anti-IgG Fc humana-HRP (ThermoFisher, n.° cat. 31423) a 0,2 μg /ml y luego se dispensaron 30 μl de cada uno, seguido de incubación a 25 °C durante 45 minutos. A continuación, las placas se lavaron tres veces con 100 μl de tween20 PBS al 0,05 %. Por último, el desarrollo se indujo mediante la adición de TMB (SurModics, n.° cat. TMBC-1000-01). Después de 3 minutos, el desarrollo se detuvo mediante la adición de ácido sulfúrico 1 N (DUKSAN, n.° cat. B8C411) a las placas para investigar la fuerza de unión a TNF-α, y se midió la absorbancia a 450 nm. Después de 5 minutos, el desarrollo se detuvo mediante la adición de ácido sulfúrico 1 N a las placas para investigar la fuerza de unión a IL-6, y se midió la absorbancia a 450 nm.

Para investigar la fuerza de unión doble de los anticuerpos biespecíficos (progenitor y tres tipos de variantes) fabricados en el Ejemplo 2 a TNF-α oaIL-6, se realizó el siguiente experimento.

En primer lugar, se inmovilizó TNF-α a 0,2 μg/ml en placas ELISA y se trató con anticuerpos biespecíficos y después se trató con IL-6 fusionada con biotina a 0,1 μg/ml. Después de eso, se diluyó avidina-HRP (Pierce, n.° cat. 29994) a 0,2 μg/ml y luego se dispensaron 30 μl de cada uno, seguido de incubación. Después de incubar a 25 °C durante 45 minutos, las placas se lavaron tres veces con 100 μl de tween20 PBS al 0,05 % y después se revelaron.

Los resultados se muestran en las FIG. 5 y 6.

Como resultado de la confirmación de la fuerza de unión, la fuerza de unión del anticuerpo adalimumab al TNF-α no cambió (FIG. 5A y 6A). Sin embargo, en cuanto a la fuerza de unión de las moléculas de Affibody a IL-6, la fuerza de unión de SM2 y DM1 aumentó en comparación con la fuerza de unión del progenitor y SM1 (FIG. 5B y 6B). En cuanto a la fuerza de unión doble a TNF-α e IL-6, la fuerza de unión de SM2 y DM1 aumentó en comparación con la del progenitor y SMI (FIG. 5C y 6C).

Se confirmó a partir de los resultados que la fuerza de unión de las moléculas de Affibody se redujo por la glicosilación en los aminoácidos en las posiciones 21 y 52, y aumentó por la prevención de la glicosilación a través de la mutación de los aminoácidos en las posiciones 23 y 54.

Los valores de CE50 de los anticuerpos biespecíficos se midieron usando el programa informático denominado GraphPad Prismp. Se creó un gráfico con respecto al valor de D.O. sobre la concentración de anticuerpos en forma de cuatro parámetros utilizando experimentos ELISA que confirmaron la fuerza de unión de los anticuerpos biespecíficos a TNF-α o IL-6 solos y datos de experimentos ELISA que confirmaron la fuerza de unión doble a TNF-α e IL-6, y luego se calcularon los valores de CE50.

Los resultados se muestran en las FIG. 7a y 7b.

En cuanto al valor de CE50 para IL-6, los valores de SM2 y DM1 fueron menores en comparación con los valores del progenitor y SM1, y en cuanto al valor de CE50 para TNF-α e IL-6, los valores de SM2 y DM1 fueron menores en comparación con los valores del progenitor y SM1. Los resultados anteriores confirmaron cuantitativamente que la fuerza de unión de las secuencias de Affibody mejoró cuando la treonina (T) se sustituyó por asparagina (N) en la posición del resto de aminoácido 23 y la serina (S) se sustituyó por alanina (A) en la posición del resto de aminoácido 54 en la secuencia de Affibody (véase la FIG. 7).

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de la SEQ ID NO: 2 a la SEQ ID NO: 4, en donde el antígeno diana del polipéptido es la interleucina-6 (IL-6).

2. Un complejo polipeptídico que comprende:

i) el polipéptido de la reivindicación 1; y

ii) un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo,

en donde i) y ii) están unidos entre sí.

3. El complejo polipeptídico de la reivindicación 2, en donde un antígeno diana del anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo es un antígeno seleccionado del grupo que consiste en angiogenina 2 (Ang-2), factor de crecimiento endotelial vascular, factor de necrosis tumoral, TNF-α, TNFSF11, TNFSF13, TNFSF13B, TNFSF14, TNFSF15, factor de crecimiento similar a la insulina, interleucina la, interleucina lp, interleucina 10, interleucina 17A, interleucina 12, interleucina 23, interleucina 33, factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos, factor estimulante de colonias de granulocitos, proteína B1 del grupo de alta movilidad, lipopolisacárido, receptor 4 de tipo toll, factor de crecimiento nervioso, ligando 19 de motivo C-C de quimiocina, ligando 21 de motivo C-C de quimiocina, ligando 4 de motivo C-C de quimiocina e interferón alfa.

4. El complejo polipeptídico de la reivindicación 2, en donde un antígeno diana del anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo es TNF-α.

5. El complejo polipeptídico de la reivindicación 2, en donde el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo se selecciona del grupo que consiste en adalimumab, infliximab, golimumab y certolizumab pegol, y fragmentos de unión a antígeno de los mismos.

6. El complejo polipeptídico de la reivindicación 2, en donde el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo es adalimumab que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y 6.

7. El complejo polipeptídico de la reivindicación 2, en donde i) el polipéptido y ii) el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo del complejo polipeptídico están unidos entre sí a través de al menos un conector.

8. El complejo polipeptídico de la reivindicación 7, en donde el conector consiste en una secuencia de aminoácidos representada por la fórmula general (GnSm)p o (SmGn)p,

en donde n, m y p son cada uno, independientemente;

n es un número entero de 1 a 7;

m es un número entero de 0 a 7;

la suma de n y m es un número entero de 8 o menor;

y

p es un número entero de 1 a 7.

9. Un ácido nucleico que consiste en una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de la reivindicación 1.

10. Un ácido nucleico que consiste en una secuencia de nucleótidos que codifica el complejo polipeptídico de la reivindicación 2.

11. Un método para producir un polipéptido mejorado en cuanto a pureza proteica y afinidad por un antígeno mediante la prevención de la glicosilación, comprendiendo el método:

(a) insertar el ácido nucleico de la reivindicación 9 en un vector de expresión;

(b) transformar una célula hospedadora con el vector de expresión; y

(c) cultivar la célula hospedadora para obtener un polipéptido.

12. Un método para producir un complejo polipeptídico mejorado en cuanto a pureza proteica y afinidad por un antígeno mediante la prevención de la glicosilación, comprendiendo el método:

(a) insertar el ácido nucleico de la reivindicación 10 en un vector de expresión;

(b) transformar una célula hospedadora, que es una célula eucariota, con el vector de expresión; y

(c) cultivar la célula hospedadora para obtener un complejo polipeptídico.