BR122024013519A2 - Polipeptídeo de ligação de il-17a, proteína de fusão ou conjugado, complexo, polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo, e, composição - Google Patents

Polipeptídeo de ligação de il-17a, proteína de fusão ou conjugado, complexo, polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo, e, composição Download PDF

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POLIPEPTÍDEO DE LIGAÇÃO DE IL-17A, PROTEÍNA DE FUSÃO OU CONJUGADO, COMPLEXO, POLINUCLEOTÍDEO QUE CODIFICA UM POLIPEPTÍDEO, E, COMPOSIÇÃO A presente revelação refere-se a uma classe de polipeptídeos projetados que tem uma afinidade de ligação para interleucina-17A (IL-17A), e provê um polipeptídeo de ligação de IL-17A compreendendo a sequência EX2DX4AX6X7EIX10X11LPNL X16X17X18QX20X21AFIX25 X26LX28X29. Também é revelada o uso de tal polipeptídeo de ligação de interleucina-17A como um agente diagnóstico, prognóstico e/ou terapêutico.

Description

[001] A presente revelação refere-se a uma classe de polipeptídeos de engenharia tendo uma afinidade de ligação para interleucina-17A (a seguir referida como IL-17A). A presente revelação também se refere ao uso de tal polipeptídeo de ligação de interleucina-17A como um agente diagnóstico, prognóstico e/ou terapêutico.
HISTÓRICO DA INVENÇÃO
[002] A família da interleucina-17 (IL-17) é uma família da citocina pró-inflamatória que contribui para a patogênese de várias doenças inflamatórias. Uma fonte principal de IL-17 é uma linhagem de células T conhecidas como células T auxiliares 17 (células Th17 ), que são distintas dos clássicos subconjuntos de célula Th1 e Th2. Os resultados dos estudos nos modelos de camundongo e em humanos identificaram um papel fundamental de células IL-17 e Th17 na patogênese de inflamação e autoimunidade, bem como na defesa do hospedeiro contra certos patógenos. Com base nessas observações, as células IL-17 e Th17 são consideradas como alvos interessantes para o tratamento de várias doenças inflamatórias crônicas tais como psoríase, artrite reumatoide (RA), espondilite anquilosante (AS), lúpus eritematoso sistêmico (SLE) e esclerose múltipla (MS) (Miossec e Kolls, 2012, Nat Rev Drug Discov 11:763-7).
[003] A citocina IL-17A homodimérica ligada ao dissulfeto é um membro da família IL-17, que também inclui IL- 17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E e IL-17F. Dentro da família, IL- 17A e IL-17F mostram a homologia de sequência de aminoácido mais alta entre si (50%) e elas se ligam aos mesmos receptores: IL-17 receptor A (IL-17RA) e IL-17 receptor C (IL-17RC). Além disso, IL-17A pode ser expressa com IL-17F como um heterodímero. Embora IL-17A e IL-17F compartilhem a homologia de sequência de aminoácido, elas realizam funções distintas. IL-17A está envolvida no desenvolvimento de autoimunidade, inflamação e tumores e também desempenham papéis importantes na defesa do hospedeiro contra infecções bacterianas e fúngicas. IL-17F, por outro lado, está principalmente envolvida nos mecanismos de defesa do hospedeiro da mucosa (Iwakura et al, 2011, Immunity 34:149-62).
[004] Quando IL-17A é secretada, ela promove a produção de uma variedade de citocinas pró-inflamatórias, quimiocinas, peptídeos antimicrobianos e metaloproteinases (MMPs) de fibroblasto, células endoteliais e epiteliais. Uma ação importante de IL-17A é induzir granulopoiese e recrutamente de neutrófilo para locais inflamatórios. Entretanto, se não controlada, essa reação pode levar à inflamação crônica com destruição do tecido e neovascularização (Iwakura et al. 2008, Immunol Rev 226:57-79; Reynolds et al. 2010, Cytokine Growth Factor Rev 21:413-23). IL-17A é central na patogênese de psoríase, uma doença de pele inflamatória crônica comum que afeta cerca de 2,5% da população mundial (revisado em Chiricozzi e Krueger, 2013, Expert Opin. Investig. Drugs 22(8):993-1005). Estudos nos pacientes com RA mostraram que as células positivas de IL-17A estão presentes na sinóvia inflamada. Em um modelo de camundongo de RA, as pontuações clínicas foram severamente agravadas pela administração de IL-17A através de transferência de gene intra articular (Lubberts et al. 2002, Inflamm Res 51:102-4). Por outro lado, a inibição de IL-17A com anticorpos monoclonais contra o ligante ou o receptor protegido contra o desenvolvimento e consequências de artrite (Lubberts et al. 2004, Arthritis Rheum 50:650-9). Nos pacientes com MS, o gene de IL-17A é relatado para ser superexpresso (Lock et al. 2002, Nat Med 8:500-8) e as células IL-17A e Th17 foram claramente implicadas no modelo de camundongo de encefalite autoimune experimental (Cua et al. 2003, Nature 421:744-8; Uyttenhove e Van Snick 2006, Eur J Immunol 36:2868-74). Os níveis aumentados de IL-17A mostraram ser clinicamente correlacionados com várias doenças oculares inflamatórias, tais como uveíte, esclerite e doença do olho seco (DED) em paciente que sofrem de artrite (Kang et al. 2011, J Korean Med Sci 26:938-44). Estudos recentes mostraram células positivas de IL-17 e IFNY nos espécimes clínicos de aterosclerose coronária sugerindo um efeito local na disfunção do vaso (Eid et al. 2009, J Cardiothorac Surg 4:58). IL-17A também pode ser de interesse na doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD). O número de células positivas de IL-17A é aumentado nos tecidos do pulmão de pacientes com COPD (Chu et al. 2011, Int Immunopharmacol 11:1780-8; Di Stefano et al. 2009, Clin Exp Immunol 157:31624). Camundongos deficientes de IL-17RA são resistentes ao desenvolvimento de enfisema em um modelo de camundongo de COPD enquanto a superexpressão de IL-17A acelera o desenvolvimento de enfisema sugerindo que IL-17A é suficiente para mediar essa resposta (Chen et al. 2011, PLoS One 6:e20333; Shan et al. 2012, Sci Transl Med 4:117ra9). Assim, o envolvimento de IL- 17A em várias doenças autoimunes e inflamatórias diferentes sugere uma ampla aplicabilidade de terapêutico visando IL-17A.
[005] A segmentação de IL-17A ou seus receptores é a maneira mais direta de bloquear as funções mediadas por IL-17A. Vários biológicos que neutralizam a sinalização de IL- 17A estão agora em desenvolvimento clínico, incluindo os anticorpos monoclonais anti-IL-17A secukinumabe e ixekizumabe (Patel et al, 2013, Ann Rheum Dis 72 Suppl 2:ii116-23). Secukinumabe foi aprovado para o tratamento de psoríase e é atualmente investigado para o tratamento de artrite psoriática (PsA) e AS. Ixekizumabe está atualmente em ensaios clínicos para psoríase, PsA e RA. O bloqueio de sinalização mediada por receptor de IL-17 também está sob investigação na clínica, incluindo o anticorpo anti-IL-17RA monoclonal humano brodalumabe para o tratamento de psoríase, RA e asma (Hu et al. 2011, Ann N Y Acad Sci 1217:60-76). Assim, a eficácia clínica de inibição de IL-17A foi provada em diferentes doenças, notavelmente em psoríase e o perfil de segurança, incluindo dados de fase II e fase III data, mostra boa tolerabilidade para inibidores de IL-17A (Genovese et al. 2010, Arthritis Rheum 62:929-39 e Hueber et al. 2010, Sci Transl Med 2:52ra72).
[006] A natureza imprevisível e crônica de psoríase e outras doenças inflamatórias, bem como uma alta necessidade médica insatisfeita, garante o desenvolvimento de novos modos de tratamento.
[007] Uma vez que a taxa de penetração do tecido está negativamente associada com o tamanho da molécula, uma molécula de anticorpo relativamente larga inerentemente tem distribuição de tecido e capacidade de penetração ruins. Além disso, embora os anticorpos sejam amplamente usados em uma variedade de contextos de rotina devido à alta afinidade e especificidade para uma multidão de antígenos possíveis, tais como para fins analíticos, de purificação, diagnósticos e terapêuticos, eles ainda sofrem de diversas desvantagens. Tais desvantagens incluem a necessidade de sistemas complexos de expressão de mamífero, tendências de agregação, solubilidade limitada, necessidade para formar e estavelmente manter as ligações de dissulfeto e o risco de respostas imune indesejadas.
[008] Assim, o uso de anticorpos monoclonais não é sempre ideal para a terapia, e há necessidade contínua para provisão de agentes com uma alta afinidade para IL-17A. Também é de grande interesse a provisão de usos de tais moléculas no tratamento, diagnóstico e prognóstico de doença.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[009] É um objetivo da presente revelação prover novos agentes de ligação de IL-17A, que poderiam, por exemplo, ser usados para aplicações de diagnóstico, de prognóstico e terapêuticas.
[0010] É um objetivo da presente revelação prover novos agentes de ligação de IL-17A, que podem ser usados como domínios nas proteínas de fusão compreendendo um ou mais domínios adicionais tendo funções similares ou outras.
[0011] É um objetivo da presente revelação prover uma molécula que permite terapia eficaz visando várias formas de doença inflamatória e autoimune enquanto alivia as desvantagens mencionadas acima e outras das terapias atuais.
[0012] É um objetivo adicional da presente revelação prover uma molécula adequada para aplicações de prognóstico e diagnóstico.
[0013] Esses e outros objetivos que estão evidentes para o técnico no assunto da presente revelação são atendidos por diferentes aspectos da invenção conforme reivindicado nas reivindicações anexas e conforme geralmente revelado aqui.
[0014] Assim, no primeiro aspecto da revelação, é fornecido um polipeptídeo de ligação de IL-17A, compreendendo um motivo de ligação de IL-17A BM, cujo motivo consiste em uma sequência de aminoácido selecionada dentre: i)EX2DX4AX6X7EIX10X11LPNL X16X17X18QX20X21AFIX25 X26LX28X29 em que, independentemente um do outro, X2 é selecionado dentre A, H, M e Y; X4 é selecionado dentre A, D, E, F, K, L, M, N, Q, R, S e Y; X6 é selecionado dentre A, Q e W; X7 é selecionado dentre F, I, L, M, V, W e Y; X10 é selecionado dentre A e W; X11 é selecionado dentre A, D, E, F, G, L, M, N, Q, S, T e Y; X16 é selecionado dentre N e T; X17 é selecionado dentre H, W e Y; X18 é selecionado dentre A, D, E, H e V; X20 é selecionado dentre A, G, Q, S e W; X21 é selecionado dentre A, D, E, F, H, K, N, R, T, V, W e Y; X25 é selecionado dentre A, D, E, G, H, I, L, M, N, Q, R, S, T e V; X26 é selecionado dentre K e S; X28 é selecionado dentre I, L, N e R; ande X29 é selecionado dentre D e R;i) uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 89% de identidade para a sequência definida em i).
[0015] A definição acima de uma classe de sequência relacionada, os polipeptídeos de ligação de IL-17A são baseados em uma análise estatística de diversas variantes de polipeptídeo aleatórias de uma estrutura principal, que foram selecionadas para sua interação com IL-17A em diversos experimentos de seleção diferentes. O motivo de ligação de IL- 17A identificado, ou “BM”, corresponde à região de ligação alvo da estrutura principal, cuja região constitui duas hélices alfa dentro de um domínio de proteína do pacote de três helicoidais. Na estrutura principal, os resíduos de aminoácido variados das duas hélices do BM constituem uma superfície de ligação para interação com a parte Fc constante de anticorpos. Na presente revelação, a variação aleatória de resíduos de superfície de ligação e seleção subsequente de variante substituíram a capacidade de interação Fc com uma capacidade para interação com IL-17A.
[0016] Como o técnico no assunto perceberá, a função de qualquer polipeptídeo, tal como a capacidade de ligação de IL-17A do polipeptídeo da presente revelação, depende da estrutura terciária do polipeptídeo. Portanto, é possível fazer mudanças menores para a sequência de aminoácidos em um polipeptídeo sem afetar a função deste. Assim, a revelação engloba variantes modificadas do polipeptídeo de ligação de IL-17A, as quais são de modo que as características de ligação de IL-17A são retidas.
[0017] Dessa maneira, também englobado pela presente revelação está um polipeptídeo de ligação de IL-17A compreendendo uma sequência de aminoácido com 89% ou mais de identidade para um polipeptídeo como definido em i). Em algumas realizações, o polipeptídeo pode compreender uma sequência que é pelo menos 93%, tal como pelo menos 96% idêntico a um polipeptídeo como definido em i). Por exemplo, é possível que um resíduo de aminoácido que pertence a um certo agrupamento funcional de resíduos de aminoácido (por exemplo, hidrofóbico, hidrofílico, polar, etc.) poderia ser trocado para outro resíduo de aminoácido do mesmo grupo funcional.
[0018] Em algumas realizações, tais mudanças podem ser feitas em qualquer posição da sequência do polipeptídeo de ligação de IL-17A como revelado aqui. Em outras realizações, tais mudanças podem ser feitas apenas nas posições não variáveis, também indicadas resíduos de aminoácido de estrutura. Em tais casos, as mudanças não são permitidas nas posições variáveis, isto é, posições indicadas com um “X” na sequência i).
[0019] O termo “% de identidade”, como usado em todo o relatório descritivo, pode, por exemplo, ser calculado como segue. A sequência de consulta é alinhada à sequência alvo usando o algoritmo de CLUSTAL W (Thompson et al, Nucleic Acids Research, 22: 4673-4680 (1994)). Uma comparação é feita sobre a janela que corresponde à mais curta das sequências alinhadas. A mais curta das sequências alinhadas pode, em alguns casos, ser a sequência alvo. Em outros casos, a sequência de consulta pode constituir a mais curta das sequências alinhadas. Os resíduos de aminoácido em cada posição são comparados e a porcentagem de posições na sequência de consulta que têm correspondências idênticas na sequência alvo é relatada como % de identidade.
[0020] Em uma realização particular de acordo com o primeiro aspecto, é fornecido um polipeptídeo como definido acima, em que, na sequência i), X2 é selecionado dentre A, H e M; X4 é selecionado dentre A, D, E, F, L, M, N, Q, R e Y; X11 é selecionado dentre A, D, E, F, G, L, M, N, S, T e Y; X18 é selecionado dentre A, D, E e V; X20 é selecionado dentre A, G, Q e W; X21 é selecionado dentre E, F, H, N, R, T, V, W e Y; X25 é selecionado dentre A, D, E, G, H, I, L, N, Q, R, S, T e V; e X28 é selecionado dentre I, N e R.
[0021] Em outra realização particular de acordo com o primeiro aspecto, é provido um polipeptídeo como definido no parágrafo imediatamente acima, em que, além disso, na sequência i), X16 é T; X17 é W; X21 é selecionado dentre E, F, H, W, T e Y; X25 é selecionado dentre A, D, E, G, H, I, L, N, Q, R, S e T; X26 é K; e X29 é D.
[0022] “Xn” e “Xm” são usados aqui para indicar aminoácidos nas posições n e m na sequência i) como definido acima, em que n e m são números inteiros indicando a posição de um aminoácido dentro da sequência i) como contado a partir do terminal N. Por exemplo, X3 e X7 indicam os aminoácidos nas posições três e sete, respectivamente, da extremidade do terminal N da sequência i).
[0023] Nas realizações de acordo com o primeiro aspecto, são providos polipeptídeos em que Xn na sequência i) é independentemente selecionado de um grupo de possíveis resíduos como listado na Tabela 1. O técnico no assunto apreciará que Xn pode ser selecionado de qualquer um dos grupos listados de possíveis resíduos e que essa seleção é independente da seleção de aminoácidos em Xm, em que n^m. Assim, qualquer um dos possíveis resíduos listados na posição Xn na Tabela 1 pode ser independentemente combinado com qualquer um dos possíveis resíduos listados de qualquer outra posição variável na Tabela 1.
[0024] O técnico no assunto apreciará que a Tabela 1 deve ser lida da seguinte maneira: em uma realização de acordo com o primeiro aspecto, é provido um polipeptídeo em que o resíduo de aminoácido “Xn” na sequência i) é selecionado dentre “possíveis resíduos”. Assim, a Tabela 1 revela várias realizações específicas e individualizadas do primeiro aspecto da presente revelação. Por exemplo, em uma realização de acordo com o primeiro aspecto, é provido um polipeptídeo em que X4 na sequência i) é selecionado dentre A, D, E, F, L, N, Q, R e Y, e em outra realização de acordo com o primeiro aspecto, é provido um polipeptídeo em que X4 na sequência i) é selecionado dentre D, E, N e Y. Para evitar dúvidas, as realizações listadas podem ser livremente combinadas ainda em outras realizações. Por exemplo, uma dessa realização combinada é um polipeptídeo em que X4 é selecionado dentre D, E, F, N, Q, R e Y, enquanto X7 é selecionado dentre F, V e W, e X18 é selecionado dentre A, D, E e H, e assim por diante. TABELA 1
[0025] Em uma realização mais específica que define uma subclasse de polipeptídeos de ligação de IL-17A, a sequência i) cumpre pelo menos seis das onze condições I-XI: I. X2 é A; II. X4 é selecionado dentre D, E e Q; III. X6 é A; IV. X7 é selecionado dentre F e V;V. X16 é T; VI. X17 é W; VII. X18 é selecionado dentre A e D; VIII. X20 é W; IX. X26 é K; X. X28 é R; e XI. X29 é D.
[0026] Em alguns exemplos de um polipeptídeo de ligação de IL-17A de acordo com o primeiro aspecto, a sequência i) cumpre pelo menos sete das onze condições I-XI. Mais especificamente, a sequência i) pode cumprir pelo menos oito das onze condições I-XI, tais como pelo menos nove das onze condições I-XI, tais como pelo menos dez das onze condições IXI, tal como todas das onze condições I-XI.
[0027] Em algumas realizações de um polipeptídeo de ligação de IL-17A de acordo com o primeiro aspecto, X2X6, X2X10 ou X6X10 é AA. Em algumas realizações, X2X17, X2X20, X6X17, X6X20, X10X17 ou X10X20 é AW. Em algumas realizações, X2X28, X6X28 ou X10X28 é AR. Em algumas realizações, X17X28 ou X20X28 é WR. Em algumas realizações, X17X20 é WW.
[0028] Conforme descrito em detalhes na seção experimental a seguir, a seleção das variantes do polipeptídeo de ligação de IL-17A levou à identificação de várias sequências de motivo de ligação (BM) de IL-17A individual. Essas sequências constituem realizações individuais de sequência i), de acordo com esse aspecto. As sequências de motivos de ligação de IL-17A individual correspondem às posições de aminoácido 8 a 36 no SEQ ID NO: 1 a 1216 apresentado na Figura 1. Por isso, em uma realização do polipeptídeo de ligação de IL-17A de acordo com esse aspecto, a sequência i) corresponde à sequência da posição 8 para a posição 36 em uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1 a 1216. Em uma realização, a sequência i) corresponde à sequência da posição 8 para a posição 36 em uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1 a 66, 1200, 1206 e 1214. Em uma realização, a sequência i) corresponde à sequência da posição 8 para a posição 36 em uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1 a 66. Em uma realização, a sequência i) corresponde à sequência da posição 8 para a posição 36 em uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1 a 35. Em uma realização, a sequência i) corresponde à sequência da posição 8 para a posição 36 em uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1 a 27. Em uma realização, a sequência i) corresponde à sequência da posição 8 para a posição 36 em uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1 a 10. Em uma realização, a sequência i) corresponde à sequência da posição 8 para a posição 36 em uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1 a 7. Em uma realização, sequência i) corresponde à sequência da posição 8 para a posição 36 em uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1 a 4. Em uma realização, a sequência i) corresponde à sequência da posição 8 para a posição 36 no SEQ ID NO: 1.
[0029] Em algumas realizações da presente revelação, o BM como definido acima, “forma parte de” um domínio de proteína de pacote de três hélices. Isso significa que a sequência do BM é “inserida” dentro ou “enxertada” na sequência do domínio de pacote de três hélices original, de modo que o BM substitui um motivo estrutural similar no domínio original. Por exemplo, sem querer ficar limitado pela teoria,pensa-se que o BM constitui duas das três hélices de um pacote de três hélices, e pode, portanto, substituir tal motivo de duas hélices dentro de qualquer pacote de três hélices. Como o técnico no assunto perceberá, a substituição de duas hélices do domínio de pacote de três hélices pelas duas hélices do BM deve ser realizada de modo a não afetar a estrutura básica do polipeptídeo. Isto é, o dobramento geral do suporte principal Cα do polipeptídeo de acordo com essa realização da invenção é substancialmente o mesmo daquele do domínio de proteína de pacote de três hélices do qual forma uma parte, por exemplo, tendo os mesmos elementos de estrutura secundária na mesma ordem, etc. Assim, um BM de acordo com a revelação “forma parte” de um domínio de pacote de três hélices se o polipeptídeo de acordo com essa realização do aspecto tiver a mesma dobra como o domínio original, implicando que as propriedades estruturais básicas são compartilhadas, aquelas propriedades, por exemplo, resultando nos espectros de CD similares. O técnico no assunto está ciente de outros parâmetros que são relevantes.
[0030] Nas realizações particulares, o motivo de ligação (BM) de IL-17A faz, assim, parte de um domínio de proteína de pacote de três hélices. Por exemplo, o BM pode essencialmente constituir duas hélices alfa com um circuito interligante, dentro do dito domínio de proteína de pacote de três hélices. Nas realizações particulares, o dito domínio de proteína de pacote de três hélices é selecionado dentre os domínios de proteínas receptoras bacterianas. Os exemplos não limitantes de tais domínios são os cinco diferentes domínios de três hélices de Proteína A de Staphylococcus aureus, tal como domínio B, e seus derivados. Em algumas realizações, o domínio de proteína de pacote de três hélices é uma variante da proteína Z, que é derivada do domínio B da Proteína A estafilocócica.
[0031] Em algumas realizações onde o Polipeptídeo de ligação de IL-17A como revelado aqui faz parte de um domínio de proteína de pacote de três hélices, o polipeptídeo de ligação de IL-17A pode compreender um módulo de ligação de sequência de aminoácido (BMod) selecionado dentre: K-[BM]-DPSQS XaXbLLXc EAKKL XdXeXfQ; em que [BM] é um motivo de ligação de IL-17A como definido aqui, contanto que X29 seja D; Xa é selecionado dentre A e S; Xb é selecionado dentre N e E; Xc é selecionado dentre A, S e C; Xd é selecionado dentre E, N e S; Xe é selecionado dentre D, E e S; Xf é selecionado dentre A e S; e uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 85% de identidade para uma sequência definida por iii).
[0032] Pode ser benéfico em algumas realizações que os ditos polipeptídeos exibam alta estabilidade estrutural, tal como resistência às modificações químicas, mudanças nas condições físicas e proteólise, durante produção ou armazenamento, bem como in vivo. Assim, em outras realizações onde o polipeptídeo de ligação de IL-17A como revelado aqui faz parte de um domínio de proteína de pacote de três hélices, o polipeptídeo de ligação de IL-17A pode compreender um módulo de ligação de sequência de aminoácido (BMod) selecionado dentre:i) K-[BM]-QPEQS XaXbLLXc EAKKL XdXeXfQ, em que [BM] é um motivo de ligação de IL-17A como definido aqui, contanto que X29 seja R; Xa é selecionado dentre A e S; Xb é selecionado dentre N e E; Xc é selecionado dentre A, S e C; Xd é selecionado dentre E, N e S; Xe é selecionado dentre D, E e S; Xf é selecionado dentre A e S; e 1) uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 85% de identidade para uma sequência definida por v).
[0033] Conforme discutido acima, os polipeptídeos que compreendem mudanças menores como comparado à sequência de aminoácidos acima, cujas mudanças não afetam amplamente a estrutura terciária ou função do polipeptídeo, também estão dentro do escopo da presente revelação. Assim, em algumas realizações, as sequências iv e vi) têm pelo menos 87%, tal como pelo menos 89%, tal como pelo menos 91%, tal como pelo menos 93%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 97% de identidade para uma sequência definida por iii) ou v), respectivamente.
[0034] Em uma realização, Xa na sequência iii) ou v) é A.
[0035] Em uma realização, Xa na sequência iii) ou v) é S.
[0036] Em uma realização, Xb na sequência iii) ou v) é N.
[0037] Em uma realização, Xb na sequência iii) ou v) é E.
[0038] Em uma realização, Xc na sequência iii ) ou v) é A.
[0039] Em uma realização, Xc na sequência iii ) ou v) é S.
[0040] Em uma realização, Xc na sequência iii ) ou v) é C.
[0041] Em uma realização, Xd na sequência iii ) ou v) é E.
[0042] Em uma realização, Xd na sequência iii ) ou v) é N.
[0043] Em uma realização, Xd na sequência iii ) ou v) é S.
[0044] Em uma realização, Xe na sequência iii ) ou v) é D.
[0045] Em uma realização, Xe na sequência iii ) ou v) é E.
[0046] Em uma realização, Xe na sequência iii ) ou v) é S.
[0047] Em uma realização, XdXe na sequência iii) ou v) é selecionado dentre EE, ES, SD, SE e SS.
[0048] Em uma realização, XdXe na sequência iii) ou v) é ES.
[0049] Em uma realização, XdXe na sequência iii) ou v) é SE.
[0050] Em uma realização, XdXe na sequência iii) ou v) é SD.
[0051] Em uma realização, Xf na sequência iii ) ou v) é A.
[0052] Em uma realização, Xf na sequência iii ) ou v) é S.
[0053] Em uma realização, na sequência iii) ou v), Xa é A; Xb é N; Xc é A e Xf é A.
[0054] Em uma realização, na sequência iii) ou v), Xa é S; Xb é E; Xc é A e Xf é A.
[0055] Em uma realização, na sequência iii) ou v), Xa é A; Xb é N; Xc é C e Xf é A.
[0056] Em uma realização, na sequência iii) ou v), Xa é S; Xb é E; Xc é S e Xf é S.
[0057] Em uma realização, na sequência iii) ou v), Xa é S; Xb é E; Xc é S e Xf é A.
[0058] Em uma realização, na sequência iii) ou v), Xa é S; Xb é E; Xc é A e Xf é S.
[0059] Em uma realização, na sequência iii) ou v), Xa é S; Xb é E; Xc é C e Xf é S.
[0060] Em uma realização, na sequência iii) ou v), Xa é A; Xb é N; Xc é A; XdXe é ND e Xf é A.
[0061] Em uma realização, na sequência iii) ou v), Xa é S; Xb é E; Xc é A; XdXe é ND e Xf é A.
[0062] Em uma realização, na sequência iii) ou v), Xa é A; Xb é N; Xc é C; XdXe é ND e Xf é A.
[0063] Em uma realização, na sequência iii) ou v), Xa é S; Xb é E; Xc é S; XdXe é ND e Xf é S.
[0064] Em uma realização, na sequência iii) ou v), Xa é S; Xb é E; Xc é S; XdXe é ND e Xf é A.
[0065] Em uma realização, na sequência iii) ou v), Xa é S; Xb é E; Xc é C; XdXe é ND e Xf é S.
[0066] Em uma realização, na sequência iii) ou v), Xa é A; Xb é N; Xc é A; XdXe é SE e Xf é A.
[0067] Em uma realização, na sequência iii) ou v), Xa é S; Xb é E; Xc é A; XdXe é SE e Xf é A.
[0068] Em uma realização, na sequência iii) ou v), Xa é A; Xb é N; Xc é C; XdXe é SE e Xf é A.
[0069] Em uma realização, na sequência iii) ou v), Xa é S; Xb é E; Xc é S; XdXe é SE e Xf é S.
[0070] Em uma realização, na sequência iii) ou v), Xa é S; Xb é E; Xc é A; XdXe é SE e Xf é S.
[0071] Em uma realização, na sequência iii) ou v), Xa é S; Xb é E; Xc é C; XdXe é SE e Xf é S.
[0072] Em uma realização, na sequência iii) ou v), Xa é A; Xb é N; Xc é A; XdXe é ES e Xf é A.
[0073] Em uma realização, na sequência iii) ou v), Xa é S; Xb é E; Xc é A; XdXe é ES e Xf é A.
[0074] Em uma realização, na sequência iii) ou v), Xa é A; Xb é N; Xc é C; XdXe é ES e Xf é A.
[0075] Em uma realização, na sequência iii) ou v), Xa é S; Xb é E; Xc é S; XdXe é ES e Xf é S.
[0076] Em uma realização, na sequência iii) ou v), Xa é S; Xb é E; Xc é C; XdXe é ES e Xf é S.
[0077] Em uma realização, na sequência iii) ou v), Xa é A; Xb é N; Xc é A; XdXe é SD e Xf é A.
[0078] Em uma realização, na sequência iii) ou v), Xa é S; Xb é E; Xc é A; XdXe é SD e Xf é A.
[0079] Em uma realização, na sequência iii) ou v), Xa é A; Xb é N; Xc é C; XdXe é SD e Xf é A.
[0080] Em uma realização, na sequência iii) ou v), Xa é S; Xb é E; Xc é S; XdXe é SD e Xf é S.
[0081] Em uma realização, na sequência iii) ou v), Xa é S; Xb é E; Xc é A; XdXe é SD e Xf é S.
[0082] Em uma realização, na sequência iii) ou v), Xa é S; Xb é E; Xc é C; XdXe é SD e Xf é S.
[0083] Em ainda uma realização adicional, a sequência iii) corresponde à sequência da posição 7 para a posição 55 em uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1 a 1216. Em uma realização, a sequência iii) corresponde à sequência da posição 7 para a posição 55 em uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1 a 66, 1200, 1206 e 1214. Em uma realização, a sequência iii) corresponde à sequência da posição 7 para a posição 55 em uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1 a 66. Em uma realização, a sequência iii) corresponde à sequência da posição 7 para a posição 55 em uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1 a 35. Em outra realização, a sequência iii) corresponda à sequência da posição 7 para a posição 55 em uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1 a 27. Em uma realização, a sequência iii) corresponde à sequência da posição 7 para a posição 55 em uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1 a 10. Em ainda outra realização, a sequência iii) corresponde à sequência da posição 7 para a posição 55 em uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1 a 7. Em uma realização, a sequência iii) corresponde à sequência da posição 7 para a posição 55 em uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1 a 4 e em outra realização, a sequência iii) corresponde à sequência da posição 7 para a posição 55 em SEQ ID NO: 1.
[0084] Também, em uma realização adicional, é provido um polipeptídeo de ligação de IL-17A, que compreende uma sequência de aminoácido selecionada dentre: vii) YA-[BMod]-AP; em que [BMod] é um módulo de ligação de IL-17A como definido acima; e viii) uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 86% de identidade para uma sequência definida por vii).
[0085] Em uma realização adicional alternativa, é provido um polipeptídeo de ligação de IL-17A, que compreende uma sequência de aminoácido selecionada dentre: ix) FA-[BMod]-AP; em que [BMod] é um módulo de ligação de IL-17A como definido cima; e x) uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 86% identidade para uma sequência definida por ix).
[0086] Alternativamente, é provido um polipeptídeo de ligação de IL-17A, que compreende uma sequência de aminoácido selecionada dentre: xi) FN-[BMod]-AP; em que [BMod] é um módulo de ligação de IL-17A como definido acima; e xii) uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 86% de identidade para uma sequência definida por xi).
[0087] Como discutido acima, os polipeptídeos que compreendem mudanças menores como comparado à sequência de aminoácidos acima sem afetar amplamente a estrutura terciária e a sua função se enquadram dentro do escopo da presente revelação. Assim, em algumas realizações, os polipeptídeos de ligação de IL-17A, como definido acima, podem, por exemplo, ter uma sequência que seja pelo menos 88%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 92%, tal como pelo menos 94%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 98% idêntica a uma sequência definida por vii), ix) ou xi).
[0088] Em algumas realizações, o motivo de ligação de IL-17A pode fazer parte de um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácido selecionada dentre: SEQ ID NO 1250 ADNNFNK-[BM]-DPSQSANLLSEAKKLNESQAPK; 1251 ADNKFNK-[BM]-DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK; 1252 ADNKFNK-[BM]-DPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK; 1253 ADAQQNNFNK-[BM]-DPSQSTNVLGEAKKLNESQAPK; 1254 AQHDE-[BM]-DPSQSANVLGEAQKLNDSQAPK; 1255 VDNKFNK-[BM]-DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK; 1256 AEAKYAK-[BM]-DPSESSELLSEAKKLNKSQAPK; 1257 VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNDAQAPK; 1258 VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNDSQAPK; 1259 AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK; 1260 AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAP; 1261 AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDAQAPK; 1262 AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDAQAP; 1263 AEAKFAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK; 1264 AEAKFAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAP; 1265 AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNDAQAPK; 1266 AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK; 1267 AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSESQAP; 1268 AEAKFAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK; 1269 AEAKFAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSESQAP; 1270 AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLSEAQAPK; 1271 AEAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLSESQAPK; 1272 AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLESSQAPK; 1273 AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLESSQAP; 1274 AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLESAQAPK; 1275 AEAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLESSQAPK;1276 AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSDSQAPK; 1277 AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSDSQAP; 1278 AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLSDSQAPK; 1279 AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLSDAQAPK; 1280 AEAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLSDSQAPK; 1281 VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK; 1282 VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK; 1283 VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLSEAQAPK; 1284 VDAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLSESQAPK; 1285 VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLESSQAPK; 1286 VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLESAQAPK; 1287 VDAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLESSQAPK; 1288 VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSDSQAPK; 1289 VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLSDSQAPK; 1290 VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLSDAQAPK; 1291 VDAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLSDSQAPK; 1292 VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNKAQAPK; 1293 AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNKAQAPK; e 1294 ADAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK; em que [BM] é um motivo de ligação de IL-17A como definido acima.
[0089] Em uma realização, o polipeptídeo de ligação de IL-17A compreende uma sequência de aminoácido selecionada dentre: xiii)VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK; em que [BM] é um motivo de ligação de IL-17A como definido acima; e xiv) uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 86% de identidade para a sequência definida em xiii).
[0090] Novamente, os polipeptídeos que compreendem mudanças menores como comparado à sequência de aminoácidos acima sem afetar amplamente a estrutura terciária e a sua função também estão dentro do escopo da presente revelação. Assim, em algumas realizações, os polipeptídeos de ligação de IL-17A, como definido acima, podem, por exemplo, ter uma sequência que seja pelo menos 87%, tal como pelo menos 89%, tal como pelo menos 91%, tal como pelo menos 93%, tal como pelo menos 94%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 98% idêntica à sequência definida por xiii).
[0091] A sequência xiii) em tal polipeptídeo pode ser selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1 a 1216. Em uma realização, a sequência xiii) é selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1 a 66, 1200, 1206 e 1214. Em uma realização, a sequência xiii) é selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1 a 66. Em uma realização, a sequência xiii) é selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1 a 35. Em outra realização, a sequência xiii) é selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1 a 27. Em uma realização, a sequência xiii) é selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1 a 10. Em uma realização, a sequência xiii) é selecionada dentre SEQ ID NO: 1 a 7. Em uma realização, a sequência xiii) é selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1 a 4. Em uma realização, sequência xiii) é SEQ ID NO: 1.
[0092] Em uma realização, o polipeptídeo de ligação de IL-17A compreende uma sequência de aminoácido selecionada dentre: xv) AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK; em que [BM] é um motivo de ligação de IL-17A como definido acima; exvi) uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 86% de identidade para a sequência definida em xv).
[0093] Novamente, os polipeptídeos que compreendem mudanças menores como comparado à sequência de aminoácidos acima sem afetar amplamente a estrutura terciária e a sua função também estão dentro do escopo da presente revelação. Assim, em algumas realizações, os polipeptídeos de ligação de IL-17A, como definido acima, podem, por exemplo, ter uma sequência que seja pelo menos 87%, tal como pelo menos 89%, tal como pelo menos 91%, tal como pelo menos 93%, tal como pelo menos 94%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 98% idêntica à sequência definida por xv).
[0094] A sequência xv) em tal polipeptídeo pode ser selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1217 a 1222. Em uma realização, a sequência xv) é selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1218 a 1222. Em uma realização, a sequência xv) é selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1219 a 1222. Em outra realização, a sequência xv) é selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1219 e SEQ ID NO: 1222. Em uma realização, a sequência xv) é SEQ ID NO: 1219.
[0095] O tamanho pequeno e robustez dos domínios de ligação de IL-17A da presente revelação conferem diversas vantagens sobre as terapias convencionais com base no anticorpo monoclonal. Tais vantagens incluem a possibilidade de administração subcutânea (s.c.) em doses maiores do que os anticorpos, vias de administração alternativas, flexibilidade na formatação para potência superior e ausência de efeitos colaterais mediados por Fc. O tamanho pequeno combinado com potencial para solubilidade muita alta (>100 mg/ml) e estabilidade permite quantidades molares extremas de droga em um pequeno volume para injeções s.c. Para administração sistêmica, isso sugere tratamento ambulatorial “para uso doméstico” usando seringas preenchidas pequenas convenientes ou autoinjetores, com baixo volume e administração bem tolerada de doses. Além disso, a capacidade para altas concentrações molares nas preparações de droga em combinação com a capacidade de reter estabilidade funcional em diversas formulações abre para vias de administração tópica (pele, olho, pulmão). Psoríase, asma, uveíte e síndrome do olho seco são exemplos de indicações onde as vias de administração alternativas poderiam ser especialmente relevantes na doença mediada por IL-17A.
[0096] Os termos “ligação de IL-17A” e “afinidade de ligação para IL-17A” como usado nesse relatório descritivo se referem a uma propriedade de um polipeptídeo que pode ser testado, por exemplo, por ELISA, pelo uso de tecnologia de ressonância de plasmon de superfície (SPR), ou pelo uso do Ensaio de Exclusão Cinética (KinExA®). Por exemplo, conforme descrito nos exemplos abaixo, a afinidade de ligação de IL-17A pode ser testada em um experimento no qual as amostras são capturadas no anticorpo revestido onde placas de ELISA e IL- 17A biotinilada, seguidas por HRP conjugado com estreptavidina, são adicionadas. O substrato de TMB é adicionado e a absorvência a 450 nm é medida usando um leito de placa de multipoço, tal como Victor3 (Perkin Elmer). O técnico no assunto pode então interpretar os resultados obtidos por tais experimentos para estabelecer, pelo menos, uma medida qualitativa da afinidade de ligação do polipeptídeo para IL- 17A. Se uma medida quantitativa for desejada, por exemplo, para determinar o valor de EC50 (a metade da concentração eficaz máxima) para a interação, ELISA também pode ser usada.A resposta dos polipeptídeos contra uma série de diluição de IL-17A biotinilada é medida usando ELISA como descrito acima. O técnico no assunto pode então interpretar os resultados obtidos por tais experimentos e os valores de EC50 podem ser calculados a partir dos resultados usando, por exemplo, GraphPad Prism 5 e regressão não linear.
[0097] A afinidade de ligação de IL-17A também pode ser testada em um experimento no qual IL-17A, ou um fragmento dela, é imobilizado em um chip sensor do instrumento de ressonância de plasmon de superfície (SPR), e a amostra contendo o polipeptídeo a ser testado é passada sobre o chip. Alternativamente, o polipeptídeo a ser testado é imobilizado em um chip sensor do instrumento, e uma amostra contendo IL- 17A, ou um fragmento dela, é passada sobre o chip. O técnico no assunto pode então interpretar os resultados obtidos por tais experimentos para estabelecer pelo menos a medida qualitativa da afinidade de ligação do polipeptídeo para IL- 17A. Se uma medida quantitativa for desejada, por exemplo, para determinar um valor de KD para a interação, os métodos de ressonância de plasmon de superfície também podem ser usados. Os valores de ligação podem, por exemplo, ser definidos em um instrumento Biacore (GE Healthcare) ou instrumento ProteOn XPR 36 (Bio-Rad). IL-17A é adequadamente imobilizada em um chip sensor do instrumento, e as amostras do polipeptídeo, cuja afinidade deve ser determinada, são preparadas por diluição em série e injetadas em ordem aleatória. Os valores de KD podem então ser calculados a partir dos resultados usando, por exemplo, o modelo de ligação de Langmuir 1:1 do software BIAevaluation 4.1, ou outro software adequado, provido pelo fabricante do instrumento.
[0098] Outro método para determinar a afinidade de ligação para IL-17A é o Ensaios de Inclusão Cinética (KinExA®; Sapidyne Instruments Inc, Boise, USA; Darling e Brault, 2004. Assay e Drug Dev Tech 2(6):647-657) para medições da afinidade e cinética de ligação de equilíbrio entre moléculas não modificadas na solução. Para análise de afinidade, a constante de dissociação de equilíbrio, KD, e a taxa de associação, ka, são experimentalmente determinadas, enquanto a taxa de dissociação, kd, pode ser calculada com base na equação kd = KD * ka.
[0099] Uma análise de KD KinExA® requer imobilização de um parceiro de interação (por exemplo, o parceiro de ligação titulado) para uma fase sólida, que é então usada como uma sonda para capturar o outro parceiro de interação (por exemplo, o parceiro de ligação constante) livre na solução, uma vez que o equilíbrio é alcançado. Para cada experimento, uma série de soluções com uma concentração constante de um parceiro de ligação e uma titulação do outro parceiro de ligação são equilibradas. As soluções são então brevemente expostas para a fase sólida e uma porção de parceiro de ligação constante livre é capturada e rotulada com uma molécula secundária fluorescente. O curto tempo de contato com a fase sólida é menor do que o tempo necessário para dissociação do complexo pré-formado na solução, significando que a competição entre a solução e o parceiro de ligação titulada de fase sólida é “cineticamente excluída”. Uma vez que a fase sólida é apenas usada como uma sonda para o parceiro de ligação constante livre em cada amostra, o equilíbrio de solução não é alterado durante as medições. Um valor de KD é calculado a partir de sinais gerados de parceiro de ligação constante livre capturado, que são diretamente proporcionais à concentração do parceiro de ligação constante livre na amostra equilibrada. Os dados podem ser analisados usando o software KinExA® Pro e análise de mínimos quadrados para ajustar as soluções ideais para a KD e a Concentração local de Ligação Ativa (ABC) para uma curva representativa de um modelo relevante estequiométrico, por exemplo, uma interação bimolecular reversível 1:1.
[00100] A determinação de cinética de ligação pode ser feita em um formato similar como a análise de equilíbrio, exceto as medições são coletadas “pré-equilíbrio” e os sinais de ligação são uma função de tempo de concentração total do parceiro de ligação titulado. Há dois métodos que podem ser usados para determinar a ka. O “método direto” detém as concentrações de parceiros de ligação titulados e constantes fixados, e a solução é sondada ao longo do tempo. A quantidade do parceiro de ligação constante livre na solução diminuirá conforme a amostra se move em direção ao equilíbrio. O “método de injetar” detém o tempo de incubação e uma concentração do parceiro fixada, enquanto titula as concentrações do outro parceiro. Conforme a concentração do parceiro de ligação titulado aumenta, a quantidade do parceiro de ligação constante livre diminuirá conforme mais complexos são formados.
[00101] Em uma realização, o polipeptídeo de ligação de IL-17A é capaz de se ligar à IL-17A de modo que o valor de KD da interação seja no máximo 1 x 10-6 M, tal como no máximo 1 x 10-7 M, tal como no máximo 1 x 10-8 M, tal como no máximo 1 x 10-9 M.
[00102] Em uma realização, um polipeptídeo de ligação de IL-17A de acordo com qualquer aspecto revelado aqui é capaz de se ligar a uma molécula de IL-17A selecionada do grupo consistindo em IL-17A humana e IL-17A de murino. Em uma realização, o polipeptídeo de ligação de IL-17A é capaz de se ligar à IL-17A humana. Em uma realização, o polipeptídeo de ligação de IL-17A é capaz de se ligar à IL-17A de murino. Em uma realização, o polipeptídeo de ligação de IL-17A é capaz de se ligar à IL-17A humana e à IL-17A de murino. A respeito disso, a IL-17A humana pode compreender a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 1226, ou um fragmento antigenicamente eficaz dela. Igualmente, a IL-17A de murino pode compreender a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 1227, ou um fragmento antigenicamente eficaz dela.
[00103] O técnico no assunto compreenderá que várias modificações e/ou adições podem ser feitas a um polipeptídeo de ligação de IL-17A de acordo com qualquer aspecto revelado aqui, a fim de adaptar o polipeptídeo a uma aplicação específica sem se afastar do escopo da presente revelação.
[00104] Por exemplo, em uma realização, é provido um polipeptídeo de ligação de IL-17A como descrito aqui, cujo polipeptídeo foi estendido e/ou compreende aminoácidos adicionais no terminal C e/ou terminal N. Tal polipeptídeo deve ser compreendido como um polipeptídeo que tem um ou mais resíduos de aminoácido adicionais na primeira e/ou na última posição na cadeia polipeptídica, isto é, no terminal N e/ou C da sequência i) ou ii). Assim, um polipeptídeo de ligação de IL-17A pode compreender qualquer número adequado de resíduos de aminoácido adicionais, por exemplo, pelo menos um resíduo de aminoácido adicional. Cada resíduo de aminoácido adicional pode individual ou coletivamente ser adicionado a fim de, porexemplo, melhorar e/ou simplificar a produção, purificação, estabilização in vivo ou in vitro, acoplamento ou detecção do polipeptídeo. Tais resíduos de aminoácido adicionais podem compreender um ou mais resíduos de aminoácido adicionados para a finalidade de acoplamento químico. Um exemplo disso é a adição de um resíduo de cisteína. Resíduos de aminoácido adicionais também podem prover um “marcador” para purificação ou detecção do polipeptídeo, tal como um His6 tag, um marcador (HisGlu)3 (“HEHEHE” tag) ou um marcador “myc” (c-myc) ou um marcador “FLAG” para interação com anticorpos específicos para o marcador ou cromatografia de afinidade de metal imobilizado (IMAC) no caso do His6-tag.
[00105] Os aminoácidos adicionais como discutido acima podem ser acoplados ao polipeptídeo de ligação de IL-17A através de conjugação química (usando métodos de química orgânica conhecidos) ou por quaisquer outros meios, tal como expressão do polipeptídeo de ligação de IL-17A como uma proteína de fusão ou unidos em qualquer outra maneira, seja diretamente ou através de um ligante, por exemplo, um ligante de aminoácido.
[00106] Os aminoácidos adicionais, como discutido acima, podem por exemplo compreender um ou mais domínio(s) de polipeptídeo. Um domínio de polipeptídeo adicional pode prover o polipeptídeo de ligação de IL-17A com outra função, tal como, por exemplo, ainda outra função de ligação, uma função enzimática, uma função tóxica, uma função de sinalização fluorescente ou combinações desses.
[00107] Um domínio de polipeptídeo adicional pode, além disso, prover outra porção de ligação de IL-17A com a mesma função de ligação de IL-17A. Assim, em uma realização adicional, é provido um polipeptídeo de ligação de IL-17A em uma forma multimérica. O dito multímero é entendido para compreender pelo menos dois polipeptídeos de ligação de IL-17A como revelado aqui como unidades monoméricas, as sequências de aminoácidos das quais podem ser iguais ou diferentes. As formas multiméricas dos polipeptídeos podem compreender um número de domínios adequados, cada tendo um motivo de ligação de IL-17A, e cada formando um monômero dentro do multímero. Esses domínios podem ter a mesma sequência de aminoácido, mas alternativamente, eles podem ter diferentes sequências de aminoácido. Em outras palavras, o polipeptídeo de ligação de IL-17A da invenção pode formar homo- ou heteromultímeros, por exemplo, homo- ou heterodímeros. Em uma realização, é provido um polipeptídeo de ligação de IL-17A, em que as ditas unidades monoméricas são covalentemente acopladas juntas. Em outra realização, as ditas unidades monoméricas do polipeptídeo de ligação de IL-17A são expressas como uma proteína de fusão. Em uma realização, é provido um polipeptídeo de ligação de IL-17A na forma dimérica.
[00108] Adicionalmente, polipeptídeos ou proteínas de fusão “heterogênicos”, ou conjugados, em que um polipeptídeo de ligação de IL-17A descrito aqui, ou seu multímero, constitui um primeiro domínio, ou a primeira porção, e a segunda ou adicionais porções têm outras funções do que ligação de IL- 17A, também são contemplados e se enquadram dentro do âmbito da presente revelação. A segunda e porção/porções adicionais do polipeptídeo de fusão ou conjugado em tal proteína adequadamente têm uma atividade biológica desejada.
[00109] Assim, em um segundo aspecto da presente revelação, é provida uma proteína de fusão ou um conjugado, compreendendo uma primeira porção consistindo em um polipeptídeo de ligação de IL-17A de acordo com o primeiro aspecto, e uma segunda porção consistindo em um polipeptídeo tendo uma atividade biológica desejada. Em outra realização, a dita proteína de fusão ou conjugado pode adicionalmente compreender porções adicionais, compreendendo atividades biológicas desejadas que podem ser iguais ou diferentes da atividade biológica da segunda porção.
[00110] Exemplos não limitantes de uma atividade biológica desejada compreende uma atividade terapêutica, uma atividade de ligação e uma atividade enzimática.
[00111] Em uma realização, a segunda porção tendo uma atividade biológica desejada é um polipeptídeo terapeuticamente ativo.
[00112] Exemplos não limitantes de polipeptídeos terapeuticamente ativos são biomoléculas, tais como moléculas selecionadas do grupo consistindo em enzimas endógenas humanas, hormônios, fatores de crescimento, quimiocinas e linfocinas. Exemplos não limitantes de citocinas contempladas são IL-2, IL-4, IL-7, IL-10, IL-11, IL-13, IL-21, IL-27, IL- 35, IFNβ e TGFβ. Exemplos não limitantes de quimiocinas contempladas são SDF-1/CXCL12, BCL/BCA-1/CXCL13, CXCL16, HCC1/CCL14, TARC/CCL17, PARC/CCL18, MIP-3β/ELC/CCL19, SLC/CCL21, CCL25/TECK e CCL27/CTACK.
[00113] Exemplos não limitantes de atividades de ligação são atividades de ligação que aumentam a meia-vida in vivo da proteína de fusão ou conjugado. Em uma realização particular, a dita atividade de ligação é uma atividade de ligação de albumina que aumenta a meia-vida in vivo da proteína de fusão ou conjugado. Em uma realização, a dita atividade de ligação de albumina é provida pelo domínio de ligação de albumina de proteína G estreptocócica ou um derivado dessa. Em outra realização particular, a dita atividade de ligação é uma atividade de ligação de FcRn que aumenta a meia-vida in vivo da proteína de fusão ou conjugado.
[00114] Em uma realização, a proteína de fusão ou conjugado desse segundo aspecto compreende dois monômeros do polipeptídeo de ligação de IL-17A do primeiro aspecto, cujas sequências de aminoácido podem ser iguais ou diferentes, ligadas por uma porção de ligação de albumina. Em uma realização específica dessa construção, a proteína de fusão ou conjugado compreende dois monômeros de ligação de IL-17A com uma porção de ligação de albumina entre eles. A dita porção de ligação de albumina pode, por exemplo, ser um domínio de ligação de albumina “GA” de proteína G estreptocócica, tal como “GA3”, ou um derivado dela como descrito em qualquer um dos documentos WO2009/016043, WO2012/004384, WO2014/048977 e WO2015/091957.
[00115] Em uma realização, o formato de tal proteína de fusão ou conjugado é “Z-A-Z”, onde cada “Z” individualmente é um polipeptídeo de ligação de IL-17A como descrito aqui, e “A” é um domínio de ligação de albumina. Em uma realização, tal polipeptídeo de ligação de IL-17A com o formato “Z-A-Z” é capaz de se ligar à IL-17A de modo que o valor de KD da interação é no máximo 1 x 10-10 M, tal como no máximo 1 x 10-11 M, tal como no máximo 1 x 10-12 M, tal como no máximo 1 x 10-13 M. Em uma realização, tal polipeptídeo “Z-A- Z” compreende um sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1233 a 1247, por exemplo, selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1236, 1237 e 1242 a 1247, tal como selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1236, 1244 e 1247 ou o grupo consistindo em SEQ ID NO: 1237, 1244 e 1247. Em uma realização ainda mais específica, o polipeptídeo “Z-A-Z” compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1244 e 1245. Em uma realização, o polipeptídeo “Z-A-Z” compreende SEQ ID NO: 1244.
[00116] Em uma realização, a dita atividade de ligação é ligação a um fator associado à angiogênese. Os exemplos não limitantes de fatores associados à angiogênese incluem fator de crescimento de fibroblasto (FGF), fator de crescimento de fibroblasto 1 (FGF-1), FGF básico, angiogenina 1 (Ang-1), angiogenina 2 (Ang-2), angiopoietina 1 (Angpt-1), angiopoietina 2 (Angpt-2), angiopoietina 3 (Angpt-3), angiopoietina 4 (Angpt-4), tirosina cinase com domínios do tipo imunoglobulina 1 (TIE-1), tirosina cinase com domínios do tipo imunoglobulina 2 (TIE-2), receptor de fator de crescimento endotelial vascular 1 (VEGFR-1), receptor de fator de crescimento endotelial vascular 2 (VEGFR-2), receptor de fator de crescimento endotelial vascular 3 (VEGFR-3), fator de crescimento endotelial vascular A (VEGF-A) , fator de crescimento endotelial vascular B (VEGF-B) , fator de crescimento endotelial vascular C (VEGF-C) , fator de crescimento endotelial vascular D (VEGF-D) , fator de crescimento endotelial vascular E (VEGF-E) , fator de crescimento placentário (PlGF), fator de crescimento transformador β1 (TGF-β1), fator de crescimento transformador β2 (TGF-β2), receptores de fator de crescimento transformador β (tipo I, tipo II e tipo III), matriz metaloproteinase (MMP), MET receptor tirosina cinase (também indicado cMET e receptor de fator de crescimento de hepatócito (HGFR)), membros da família Notch dos receptores e beta-catenina.
[00117] Em uma realização, a dita atividade de ligação está ligando a um fator associado à resposta imune. Exemplos não limitantes de fatores associados à resposta imune incluem: - fatores regulatórios de célula T tal como CD3, CD4, CD6, CD28, receptor de célula T α (TCRα), receptor de célula T β (TCRβ), proteína associada ao linfócito T citotóxico 4 (CTLA-4), e proteína de morte celular programada 1 (PD-1), ligante de morte programada 1 (PD-L1), ligante de morte programada 2 (PD-L2), homólogo B7 3 (B7-H3), homólogo B7 4 (B7-H4), mediador de entrada do vírus da herpes (HVEM)/atenuador de linfócito B e T (BTLA), receptor inibitório exterminador (KIR), gene de ativação de linfócito 3 (LAG3), galectina-9 (Gal9)/mucina-3 de imunoglobulina de célula T (TIM3) e receptores de adenosina/alfa-2 adrenérgicos (A2aR); - fatores de recrutamento de célula NK tal como CD16, produto 2D de gene receptor do tipo lectina de célula exterminadora natural (NKG2D), antígeno associado com função de linfócito 1 (LFA1) e os receptores de citotoxicidade natural NKp30 e NKp40; - fatores associados à inflamação tais como citocinas e seus receptores, incluindo fatores de necrose tumoral (TNF); membros da superfamília de ligante de fator de necrose tumoral (TNFSF) TNFSF11/RANKL, TNFSF12/TWEAK, TNFSF13, TNFSF13B/BAFF/BLys, TNFSF14, TNFSF15; interleucinas (IL) IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-17B, IL- 17C, IL-17D, IL-17E, IL-17F, IL-18, IL-22, IL-23, IL-26, IL- 32, IL33 e IL-34; interferons INFα e INFY; fator de estimulação de colônia de granulócito (GCSF), fator de estimulação de colônia de granulócito (GM-CSF); e quimiocinas inflamatórias e seus receptores, incluindo IL-8/CXCL8, ENA-78/CXCL5, GROα/CXCL1, CTAP- III/CXCL7, IP-10/CXCL10, Mig/CXCL9, PF4/CXCL4, GCP-2/CXCL6, MCP-1/CCL2, MIP-1α/CCL3, MIP-3α/CCL20, RANTES/CCL5, linfotactina/XCL1 e fractalcina/CX3CL1.
[00118] Nas realizações particularmente selecionadas, a atividade de ligação da dita segunda porção está ligando a um alvo selecionado do grupo consistindo em TNF, IL-1β, IL-6, IL-17F e IL-23.
[00119] Em uma realização do primeiro ou segundo aspecto da presente revelação, é provido um polipeptídeo de ligação de IL-17A, proteína de fusão ou conjugado que compreende um agente de modificação de resposta imune. Exemplos não limitantes desses agentes de modificação de resposta imune incluem agentes imunossupressivos ou imunomoduladores ou outros agentes anti-inflamatórios. Por exemplo, um polipeptídeo de ligação de IL-17A, proteína de fusão ou conjugado como descrito aqui pode compreender um agente selecionado do grupo consistindo em drogas antirreumáticas de modificação de doença (DMARDs), tal como sais de ouro, azatioprina, metotrexato e leflunomida; inibidores de calcineurina, tal como ciclosporina A ou FK 506; moduladores de recirculação de linfócito; inibidores de mTOR, tal como rapamicina; uma ascomicina tendo propriedades imunossupressoras; glicocorticoides; corticosteroides; ciclofosfamida; anticorpos monoclonais imunossupressores, por exemplo, anticorpos monoclonais com afinidade para receptores de leucócito tal como MHC, CD2, CD3, CD4, CD7, CD8, CD25, CD28,CD40, CD45, CD58, CD80, CD86 ou seus ligantes; inibidores de molécula de adesão, tais como antagonistas de LFA-1, antagonistas ICAM-1 ou -3, antagonistas VCAM-4 ou antagonistas VLA-4; agentes anti-TNF, tal como etanercept e anticorpos monoclonais para TNF tal como infliximabe e adalimumabe; inibidores de citocinas pro-inflamatórias; bloqueadores de IL- 1 tais como anakinra ou armadilha de IL-1; bloqueadores de IL- 6; inibidores de quimiocina; drogas anti-inflamatórias não esteroidais (NSAIDs) tais como aspirina; e agentes anti- infecciosos e outros agentes de modulação de resposta imune; bem como combinações de qualquer dois ou mais do acima.
[00120] Em uma realização do primeiro ou segundo aspecto da presente revelação, é provido um polipeptídeo de ligação de IL-17A, proteína de fusão ou conjugado que compreende um composto tóxico. Exemplos não limitantes de tais compostos incluem caliqueamicina, maitansinoide, neocarzinostatina, esperamicina, dinemicina, cedarcidina, maduropeptina, doxorrubicina, daunorrubicina, auristatina, cadeia de ricina-A, modecina, exotoxina A Pseudomonas truncada, toxina difteria e gelonina recombinante.
[00121] Recentemente, o progresso considerável foi feito no desenvolvimento de agentes multiespecíficos, tais como anticorpos com a capacidade de se ligar a mais de um antígeno, por exemplo, através de engenharia das regiões de determinação de complementaridade (CDRs) para visar dois antígenos em um único local de combinação de anticorpo (Bostrom et al, 2009, Science 323(5921):1610-1614; Schaefer et al, 2011, Câncer Cell 20(4):472-486), através de construção de anticorpos heterodiméricos usando unidades Fc projetadas (Carter, 2001, J Immunol Métodos 248(1-2):7-15; Schaefer et al, 2011, Proc Natl Acad Sci USA 108(27):11187-11192) e através de fusão genética de unidades de reconhecimento auxiliar para terminais N ou C de cadeias leve ou pesaada de anticorpos de comprimento total (Kanakaraj et al, 2012, MAbs 4(5):600-613; LaFleur et al, 2013, MAbs 5(2):208-218).
[00122] Conforme discutido acima, pode ser benéfico para um polipeptídeo com afinidade para IL-17A como revelado aqui para também exibir afinidade para outro fator, tal como um fator associado à resposta imune, por exemplo, um fator associado à inflamação.
[00123] Assim, em um terceiro aspecto da presente revelação, é provido um complexo que compreende pelo menos um polipeptídeo de ligação de IL-17A como definido aqui e pelo menos um anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno dele.
[00124] Quando usado aqui para indicar o terceiro aspecto da revelação, o termo “complexo” pretende se referir a duas ou mais cadeias polipeptídicas associadas, uma tendo uma afinidade para IL-17A em virtude de seu motivo de ligação de IL-17A como definido acima, e a outra sendo um anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno dele. Essas caderias polipeptídicas podem cada conter diferentes domínios de proteína, como descrito amplamente acima para o polipeptídeo de ligação de IL-17A do primeiro e segundo aspectos, e o complexo de multiproteína resultante pode ter múltiplas funções. “Complexo” pretende se referir a dois ou mais polipeptídeos, como definido aqui, conectados por ligações covalentes, por exemplo, duas ou mais cadeias polipeptídicas conectadas por ligações covalentes através de sua expressão como uma proteína de fusão recombinante ou associada por conjugação química.
[00125] O terceiro aspecto provê um complexo compreendendo um anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno dele. Como é bem conhecido, os anticorpos são moléculas de imunoglobulina capazes de ligação específica a um alvo (um antígeno), tal como um carboidrato, polinucleotídeo, lipídeo, polipeptídeo ou outro, através de pelo menos um local de reconhecimento de antígeno localizado na região variável da molécula de imunoglobulina. Como usado aqui, o termo “anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno dele” englona não apenas anticorpos monoclonais ou policlonais intactos ou de comprimento total, mas também fragmentos de ligação de antígeno dees, tais como Fab, Fab’, F(ab‘)2, Fab3, Fv e suas variantes, proteínas de fusão compreendendo uma ou mais porções de anticorpos, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, minicorpos, triacorpos, tetracorpos, anticorpos lineares, anticorpos de cadeia simples, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) e qualquer outra configuração modificada da molécula de imunglobulina que compreende um local de reconhecimento de antígeno da especificidade requerida, incluindo variantes de glicosilação de anticorpos, varientes de sequência de aminoácido de anticorpos e anticorpos covalentemente modificados. Exemplos adicionais de anticorpos modificados e seus fragmentos de ligação de antígeno incluem nanocorpos, AlbudAbs, DARTs (redirecionamento de afinidade dupla), BiTEs (engatador de célula T biespecífica), TandAbs (diacorpos em tandem), DAFs (Fab de ação dupla), anticorpos dois em um, SMIPs (imunofarmacêuticos modulares pequenos), FynomAbs (fynomeros fundidos aos anticorpos), DVD-Igs (imunoglobulina de domínio variável duplo), CovX-corpos (anticorpos modificados por peptídeo), duocorpos e triomAbs. Essa listagem de variantes de anticorpos e seus fragmentos de ligação de antígeno não deve ser vista como limitante, e o técnico no assunto está ciente de outras variantes adequadas.
[00126] Um anticorpo de comprimento total compreende duas cadeias pesadas e duas cadeias leves. Cada cadeia pesada contém uma região variável de cadeia pesada (VH) e primeira, segundo e terceira regiões constantes (CH1, CH2 e CH3). Cada cadeia leve contém uma região variável de cadeia leve (VL) e uma região constante de cadeia leve (CL). Dependendo da sequência de aminoácido do domínio constante de suas cadeias pesadas, os anticorpos são atribuídos a diferentes classes. Há seis classes principais de anticorpos: IgA, IgD, IgE, IgG, IgM e IgY, e várias dessas podem ser ainda divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. O termo “anticorpo de comprimento total” como usado aqui refere-se a um anticorpo de qualquer classe, tal como IgD, IgE, IgG, IgA, IgM ou IgY (ou qualquer subclasse dele). As estruturas de subunidade e configurações tridimensionais de diferentes classes de anticorpos são bem conhecidas.
[00127] Um “fragmento de ligação de antígeno” é uma porção ou região de uma molécula de anticorpo ou um derivado dela, que retém todo ou uma parte significativa da ligação de antígeno do anticorpo de comprimento total correspondente. Um fragmento de ligação de antígeno pode compreender a região variável de cadeia pesada (VH), a região variável de cadeia leve (VL), ou ambas. Cada uma das VH e VL tipicamente contém três regiões de determinação de complementaridade CDR1, CDR2 e CDR3. As três CDRs em VH ou VL são flanqueadas por regiões estruturais (FR1, FR2, FR3 e FR4).Como brevemente listado acima, os exemplos de fragmentos de ligação de antígeno incluem, entre outros: (1) um fragmento de Fab, que é um fragmento monovalente tendo uma cadeia VL-CL e uma cadeia VH-CH1; (2) um fragmento de Fab’, que é um fragmento de Fab com a região de articulação de cadeia pesada, (3) um fragmento de F(ab')2, que é um dímero de fragmentos de Fab’ unidos pela região de articulação de cadeia pesada, por exemplo, ligada por uma ponte de dissulfeto na região de articulação; (4) um fragmento Fc; (5) um fragmento Fv, que é o fragmento de anticorpo mínimo tendo os domínios de VL e VH de um braço único de um anticorpo; (6) um fragmento de Fv de cadeia simples (scFv), que é uma cadeia polipeptídica única em que os domínios de VH e VL de um scFv são ligados por um ligante peptídico; (7) um (scFv)2, que compreende dois domínios de VH e dois domínios de VL, os quais estão associados através de dois domínios de VH através de pontes de dissulfeto e (8) anticorpos de domínio, os quais podem ser polipeptídeos de domínio variável único de anticorpo (VH ou VL) que especificamente ligam os antígenos.
[00128] Os fragmentos de ligação de antígeno podem ser preparados através de métodos de rotina. Por exemplo, os fragmentos F(ab‘)2 podem ser produzidos por digestão de pepsina de uma molécula de anticorpo de comprimento total, e fragmentos Fab podem ser gerados pela redução de pontos de dissulfeto de fragmentos F(ab')2. Alternativamente, os fragmentos podem ser preparados através de tecnologia recombinante através de expressão dos fragmentos de cadeia leve e pesada em células hospedeiras adequadas (por exemplo, E. coli, levedura, células de mamífero, planta ou inseto) e fazendo-os montar para formar os fragmentos de ligação de antígeno quer in vivo ou in vitro.Um anticorpo de cadeia única pode ser preparado através de tecnologia recombinante através de ligação de uma sequência de nucleotídeo que codifica para uma região variável de cadeia pesada e uma sequência de nucleotídeo que codifica para uma região variável de cadeia leve. Por exemplo, um ligante flexível pode ser incorporado entre as duas regiões variáveis. O técnico no assunto está ciente dos métodos para a preparação tanto dos anticorpos de comprimento total quanto de seus fragmentos de ligação de antígeno.
[00129] Assim, em uma realização, esse aspecto da revelação provê um complexo como definido aqui, em que o dito pelo menos um anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno é selecionado do grupo consistindo em anticorpos de comprimento total, fragmentos Fab, fragmentos Fab’, fragmentos F(ab’)2, fragmentos Fc, fragmentos Fv, fragmentos Fv de caeia simples, (scFv)2 e anticorpos de domínio. Em uma realização, o dito pelo menos um anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno é selecionado dentre anticorpos de comprimento total, fragmentos Fab e fragmentos scFv. Em uma realização particular, o dito pelo menos um anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno é um anticorpo de comprimento total.
[00130] Em uma realização do dito complexo como definido aqui, o anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno é selecionado do grupo consistindo em anticorpos monoclonais, anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos e seus fragmentos de ligação de antígeno.
[00131] O termo “anticorpos monoclonais” como usado aqui refere-se a anticorpos tendo afinidade monovalente, significando que cada molécula de anticorpo em uma amostra do anticorpo monoclonal se liga ao mesmo epitopo no antígeno, enquanto o termo “anticorpos policlonais” como usado aqui refere-se a uma coleção de anticorpos que reage contra um antígeno específico, mas em cuja coleção pode haver diferentes moléculas de anticorpo, por exemplo, identificando diferentes epitopos no antígeno. Os anticorpos policlonais são tipicamente produzidos pela inoculação de um mamífero adequado e são puirificados a partir do soro do mamífero. Os anticorpos monoclonais são feitos por células imune idênticas que são clones de uma única célula parental (por exemplo, uma linhagem de célula de hibridoma). O termo “anticorpo humano” como usado aqui refere-se a anticorpos que têm regiões variáveis e constantes que correspondem substancialmente, ou derivadas de anticorpos obtidos de indivíduos humanos. O termo “anticorpos quiméricos” como usado aqui, refere-se a anticorpos recombinantes ou geneticamente projetados, tais como, por exemplo, anticorpos monoclonais de camundongo, que contêm polipeptídeos ou domínios de uma espécie diferente, por exemplo, humano, introduzidos para reduzir a imunogenicidade dos anticorpos. O termo “anticorpos humanizados” refere-se a anticorpos de espécie não humana cujas sequências de proteína foram modificadas para aumentar sua similaridade às variantes de anticorpo produzidas naturalmente em humanos, a fim de reduzir a imunogenicidade.
[00132] Pode ser benéfico para um complexo como definido aqui, além de ser capaz de ligar a IL-17A, direcionar pelo menos um antígeno adicional, tal como um antígeno selecionado do grupo consistindo em um antígeno associado com distúrbio relacionado á angiogênese e um antígeno associado com a resposta imune. Em uma realização, o dito antígeno adicional está associado com angiogênese. Em uma realização, o dito antígeno adicional está associado com a resposta imune.
[00133] Em uma realização, o antígeno está associado com angiogênese e é selecionado do grupo consistindo em fator de crescimento de fibroblasto (FGF), fator de crescimento de fibroblasto 1 (FGF-1), FGF básico, angiogenina 1 (Ang-1), angiogenina 2 (Ang-2), angiopoietina 1 (Angpt-1), angiopoietina 2 (Angpt-2), angiopoietina 3 (Angpt-3), angiopoietina 4 (Angpt-4), tirosina cinase com domínios do tipo imunoglobulina 1 (TIE-1), tirosina cinase com domínios do tipo imunoglobulina 2 (TIE-2), receptor de fator de crescimento endotelial vascular 1 (VEGFR-1), receptor de fator de crescimento endotelial vascular 2 (VEGFR-2), receptor de fator de crescimento endotelial vascular 3 (VEGFR-3), fator de crescimento endotelial vascular A (VEGF-A) , fator de crescimento endotelial vascular B (VEGF-B) , fator de crescimento endotelial vascular C (VEGF-C) , fator de crescimento endotelial vascular D (VEGF-D) , fator de crescimento endotelial vascular E (VEGF-E) , fator de crescimento placentário (PlGF), fator de crescimento transformador β1 (TGF-β1), fator de crescimento transformador β2 (TGF-β2), receptores de fator de crescimento transformador β (tipo I, tipo II e tipo III), matriz metaloproteinase (MMP), receptor tirosina cinase MET (também indicado cMET e receptor de fator de crescimento de hepatócito (HGFR)), membros da família Notch de receptores e beta-catenina. Em uma realização, o dito anticorpo ou seu fragmento é selecionado do grupo consistindo em AMG 780, AMG 386, MEDI-3617, nesvacumabe, CVX241, bevacizumabe, ranibizumabe, VGX100, CVX-241, ABP 215, PF-06439535, fresolimumabe, metelimumabe, onartuzumabe, emibetuzumabe e tarextumabe.
[00134] Em uma realização, o antígeno está associado com a resposta imune ou um distúrbio do sistema imunológico, e é selecionado do grupo consistindo em: - - fatores regulatórios de célula T tais como CD3, CD4, CD6, CD28, receptor de célula T α (TCRα), receptor de célula T β (TCRβ), proteína associada ao linfócito T citotóxico 4 (CTLA-4), e proteína de morte celular programada 1 (PD-1), ligante de morte programada 1 (PD-L1), ligante de morte programada 2 (PD-L2), homólogo B7 3 (B7-H3), homólogo B7 4 (B7-H4), mediador de entrada do vírus da herpes (HVEM)/atenuador de linfócito B e T (BTLA), receptor inibitório exterminador (KIR), gene de ativação de linfócito 3 (LAG3), galectina-9 (Gal9)/mucina-3 de imunoglobulina de célula T (TIM3) e receptores de adenosina/alfa-2 adrenérgicos (A2aR); - - fatores de recrutamento de célula NK tais como CD16, produto 2D de gene receptor do tipo lectina de célula exterminadora natural (NKG2D), antígeno associado à função de linfócito 1 (LFA1) e os receptores de citotoxicidade natural NKp30 e NKp40; - - fatores associados à inflamação tais como: - citocinas e seus receptores, incluindo fatores de necrose tumoral (TNF); membros da superfamília de ligante de fator de necrose tumoral tumor (TNFSF) TNFSF11/RANKL, TNFSF12/TWEAK, TNFSF13, TNFSF13B/BAFF/BLys, TNFSF14, TNFSF15; interleucinas (IL) IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-5, IL-6, IL-10, IL- 12, IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E, IL-17F, IL-18, IL-22, IL- 23, IL-26, IL-32, IL33 e IL-34; interferons INFα e INFY; fator de estimulação de colônia de granulócito (GCSF), fator de estimulação de colônia de granulócito (GM-CSF); e - quimiocinas inflamatórias e seus receptores, incluindo IL-8/CXCL8, ENA-78/CXCL5, GROα/CXCL1, CTAP- III/CXCL7, IP-10/CXCL10, Mig/CXCL9, PF4/CXCL4, GCP-2/CXCL6, MCP-1/CCL2, MIP-1α/CCL3, MIP-3α/CCL20, RANTES/CCL5, linfotactina/XCL1 e fractalcina/CX3CL1.
[00135] Em uma realização, o antígeno é selecionado do grupo consistindo em TNF, IL-1β, IL-6, IL-17F e IL-23.
[00136] Em uma realização, o dito anticorpo ou seu fragmento é selecionado do grupo consistindo em visilizumabe, otelixizumabe, ipilimumabe, tremelimumabe, pembrolizumabe, nivolumabe, pidilizumabe, MPDL3280A, MEDI-4736, MPDL3280A e lirilumabe, e seus fragmentos de ligação de antígeno.
[00137] Em uma realização particular, o dito antígeno é TNF. Em uma realização, o dito anticorpo ou seu fragmento é selecionado do grupo consistindo em adalimumabe, infliximabe, golimumabe, certolimumabe pegol, e seu fragmentos de ligação de antígeno. Em outra realização, o dito anticorpo ou seu fragment é um anticorpo de comprimento total selecionado do grupo consistindo em adalimumabe, infliximabe, golimumabe e certolimumabe pegol. Em uma realização particular, o dito anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno é adalimumabe ou um fragmento de ligação de antígeno dele, por exemplo adalimumabe de comprimento total.
[00138] O complexo como descrito aqui pode, por exemplo, estar presente na forma de uma proteína de fusão ou um conjugado. Assim, o dito pelo menos um polipeptídeo de ligação de IL-17A e o dito pelo menos um anticorpo, ou seu fragmento de ligação de antígeno, pode ser acoplado por meio de conjugação química (usando métodos de química orgânica conhecidos) ou por quaisquer outros meios, tais como expressão do complexo como uma proteína de fusão ou unidos em qualquer outra maneira, seja diretamente ou através de um ligante, por exemplo, um ligante de aminoácido.
[00139] Assim, em uma realização, é provido um complexo como definido aqui, em que o dito complexo é uma proteína de fusão ou um conjugado. Em uma realização, o dito complexo é uma proteína de fusão. Em outra realização, o dito complexo é um conjugado. Em uma realização do dito complexo, o dito polipeptídeo de ligação de IL-17A é anexado ao terminal N ou terminal C da cadeia pesada do dito anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno. Em outra realização, o dito polipeptídeo de ligação de IL-17A é anexado ao terminal N ou terminal C da cadeia leve do dito anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno. Em uma realização, o dito polipeptídeo de ligação de IL-17A é anexado ao terminal N e/ou terminal C da cadeia leve e cadeia pesada do dito anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno. Por exemplo, o polipeptídeo de ligação de IL-17A pode ser anexado apenas ao terminal N da(s) cadeia(s) pesada(s), apenas ao terminal N da(s) cadeia(s) leve(s), apenas ao terminal C da(s) cadeia(s) pesada(s), apenas ao terminal C da(s) cadeia(s) leve(s), tanto o terminal N quanto o terminal C da(s) cadeia(s) pesada(s), tanto o terminal N quanto o terminal C da(s) cadeia(s) leve(s), apenas ao terminal C da(s) cadeia(s) leve(s) e ao terminal N da(s) cadeia(s) pesada(s), apenas ao terminal C da(s) cadeia(s) pesada(s) e ao terminal N da(s) cadeia(s) leve(s), do dito anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno.
[00140] Conforme o técnico no assunto compreende, a construção de uma proteína de fusão frequentemente envolve o uso de ligantes entre porções funcionais a serem fundidas. O técnico no assunto está ciente dos diferentes tipos de ligantes com diferentes propriedades, tais como ligantes de aminoácido flexíveis, ligantes de aminoácido rígido e ligantes cliváveis de aminoácido. Os ligantes foram usados, por exemplo, para aumentar a estabilidade ou melhorar o dobramento das proteínas de fusão, para aumentar a expressão, melhorar a atividade, afinidade e/ou ligação biológica, possibilitar o direcionamento e alterar a farmacocinética das proteínas de fusão. Assim, em uma realização, o polipeptídeo de ligação de IL-17A, proteína de fusão, conjugado ou complexo como definido aqui ainda compreende pelo menos um ligante. O ligante pode, por exemplo, ser selecionado do grupo consistindo em ligantes flexíveis de aminoácido, ligantes rígidos de aminoácido e ligantes cliváveis de aminoácido. Alternativamente, o ligante pode ser um ligante não peptídico. Em uma realização de uma proteína de fusão ou conjugado como revelado aqui, o dito ligante está disposta entre uma primeira porção consistindo em um polipeptídeo de ligação de IL-17A como definido aqui e uma segunda porção consistindo em um polipeptídeo tendo uma atividade biológica desejada. Em uma realização de um complexo como revelado aqui, o dito ligante está disposto entre o dito polipeptídeo de ligação de IL-17A e o dito anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno. O técnico no assunto apreciará que a presença do ligante disposto em quaisquer dos contextos mencionados acima não exclui a presença de ligantes adicionais no mesmo contexto ou qualquer outro.
[00141] Os ligantes flexíveis são frequentemente usados quando os domínios unidos requerem um certo grau de movimento ou interação, e podem ser particularmente úteis em algumas realizações do polipeptídeo de ligação de IL-17A, proteína de fusão, conjugado ou complexo como definido aqui. Tais ligantes são geralmente compostos de aminoácidos pequenos, não polares (por exemplo, G) ou polares (por exemplo, S ou T). Alguns ligantes flexíveis primariamente consistem em trechos de resíduos G e S, por exemplo (GGGGS)p e (SSSSG)p. Ajustar o número de cópia “p” permite a otimização do ligante a fim de alcançar separação apropriada entre as porções funcionais ou para manter a interação interporção necessária. Além dos ligantes G e S, outros ligantes flexíveis são conhecidos na técnica, tal como ligantes G e S contendo resíduos de aminoácido adicional, tal como T, A, K e E, para manter flexibilidade, bem como resíduos de aminoácido polar para melhorar a solubilidade.
[00142] Em uma realização, o dito ligante é um ligante flexível compreendendo resíduos de glicina (G), serina (S) e/ou treonina (T). Em uma realização, o dito ligante compreende uma sequência com uma fórmula geral selecionada de (GnSm)p e (SnGm)p, em que, independentemente, n = 1 a 7, m = 0 a 7, n + m < 8 e p = 1-10. Em uma realização, n = 1 a 5. Em uma realização, m = 0 a 5. Em uma realização, p = 1 a 5. Em uma realização mais específica, n = 4, m = 1 e p = 1-4.
[00143] Em uma realização, o dito ligante compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo em G4S, (G4S)2, (G4S)3 e (G4S)4.
[00144] Em uma realização, o dito ligante compreende uma sequência com a fórmula geral GT(GnSm)p, em que, independentemente, n = 1 a 7, m = 0 a 7, n + m < 8 e p = 1 a 10. Em uma realização, n = 1 a 5. Em uma realização, m = 0 a 5. Em uma realização, p = 1 a 5. Em uma realização mais específica, n = 4, m = 1 e p = 1 a 4. Assim, em uma realização em que n = 4, o dito ligante compreende GT(G4S)p. Em uma realização específica, n = 4 e p = 1, de modo que ligante compreende GTG4S. Em uma realização, o dito ligante compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo em GT(G4S)pTS, GT(G4S)pPR e GT(G4S)pPK.
[00145] Em uma realização, o dito ligante compreende uma sequência com a fórmula geral GAP(GnSm)p, em que, independentemente, n = 1 a 7, m = 0 a 7, n + m < 8 e p = 1 a 10. Em uma realização, n = 1 a 5. Em uma realização, m = 0 a 5. Em uma realização, p = 1 a 5. Em uma realização mais específica, n = 4, m = 1 e p = 1-4. Assim, em uma realização em que n = 4, o dito ligante compreende GAP(G4S)p. Em uma realização específica, n = 4 e p = 1, de modo que o dito ligante compreende GAPG4S. Em uma realização, o dito ligante compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo em GAP(G4S)pTS, GAP(G4S)pPR e GAP(G4S)pPK.
[00146] Em uma realização, o dito ligante compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo em KL(G4S)p, LQ(G4S)p e YV(G4S)pPK. Em uma realização, o dito ligante compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo em S4G, (S4G)3, (S4G)4 e (S4G)8. Em uma realização, o dito ligante compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo em VDGS, ASGS e VEGS. Em uma realização específica, o dito ligante compreende ASGS.
[00147] Com relação à descrição acima das proteínas de fusão, conjugados ou complexos incorporando um polipeptídeo de ligação de IL-17A de acordo com a revelação, deve ser notado que a designação da primeira, segunda e adicionais porções é feita por razões de clareza para distinguir entre polipeptídeo de ligação de IL-17A ou polipeptídeos de acordo com a invenção por um lado, e porções que exibem outras funções por outro lado. Essas designações não são designadas para se referir à ordem atual dos diferentes domínios na cadeia polipeptídica da proteína de fusão, conjugado ou complexo. Assim, por exemplo, a dita primeira porção pode, sem restrição, aparecer na extremidade do terminal N, no meio, ou na extremidade do terminal C da proteína de fusão, conjugado ou complexo.
[00148] A revelação engloba, além disso, polipeptídeos nos quais o polipeptídeo de ligação de IL-17A de acordo com o primeiro aspecto, o polipeptídeo de ligação de IL-17A como compreendido em uma proteína de fusão ou conjugado de acordo com o segundo aspecto ou em um complexo de acordo com o terceiro aspecto, compreende ainda um rótulo, tal como um rótulo selecionado do grupo consistindo em corantes fluorescentes e metais, corantes cromóforos, compostos quimioluminescentes e proteínas bioluminescentes, enzimas, radionuclídeos e partículas. Tais rótulos podem, por exemplo, ser usados para detecção do polipeptídeo.
[00149] Nas realizações onde o Polipeptídeo de ligação de IL-17A rotulados compreende um polipeptídeo de ligação de IL-17A de acordo com o primeiro aspecto da revelação e um rótulo, esse polipeptídeo rotulado pode ser usado para rotulagem indireta de células de expressão de IL-17A, tal como células de cânceres associados à inflamação. Exemplos não limitantes de cânceres associados à inflamação incluem cânceres gástricos, cânceres colorretais, cânceres de pulmão de célula não pequena, carcinomas hepatocelulares e adenocarcinomas (Wu et al., 2014 Tumour Biol. 35(6):5347-56; Wu et al., 2012 PLoS One 7(12); Zhang et al. 2012 Asian Pac J Câncer Prev 13(8):3955-60; Liu et al., 2011 Biochem Biophys Res Commun.407(2):348-54).
[00150] Em outras realizações, o polipeptídeo de ligação de IL-17A rotulado está presente como uma porção em uma proteína de fusão, conjugado ou complexo também compreendendo uma segunda e possível porção adicional tendo uma atividade biológica desejada. O rótulo pode, em alguns casos, ser acoplado apenas ao polipeptídeo de ligação de IL- 17A, e em alguns casos tanto para o polipeptídeo de ligação de IL-17A quanto para a segunda porção da proteína de fusão ou conjugado e/ou o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do complexo. Além disso, também pode ser possível que o rótulo pode ser acoplado a uma segunda porção, ou anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno apenas e não à porção de ligação de IL-17A. Por isso, em ainda outra realização, é provido um polipeptídeo de ligação de IL-17A compreendendo uma segunda porção, em que o dito rótulo é acoplado à segunda porção apenas. Em outra realização, é provido um complexo como definido aqui, em que o dito rótulo é acoplado ao anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno apenas.
[00151] Em uma realização, o dito polipeptídeo de ligação de IL-17A, proteína de fusão, conjugado ou complexo como descrito aqui compreende um ambiente quelante provido por um quelante poliaminopolicarboxilato conjugado ao polipeptídeo de ligação de IL-17A através de um grupo tiol de um resíduo de cisteína ou um grupo amina de um resíduo de lisina.
[00152] Nas realizações onde o polipeptídeo de ligação de IL-17A, proteína de fusão, conjugado ou complexo é radiomarcado, tal como um polipeptídeo radiomarcado pode compreender um radionuclídeo. Uma maioria de radionuclídeos tem uma natureza metálica e os metais são tipicamente incapazes de formar ligações covalentes estáveis com elementos apresentados nas proteínas e peptídeos. Por essa razão, a rotulagem das proteínas e peptídeos com metais radioativos é realizada com o uso de quelantes, isto é, ligantes multidentatos, que formam compostos não covalentes, chamados quelatos, com os íons de metal. Em uma realização do polipeptídeo de ligação de IL-17A, proteína de fusão, conjugado ou complexo, a incorporação de um radionuclídeo é possibilitada através da provisão de um ambiente quelante, através do qual o radionuclídeo pode ser coordenado, quelado ou complexado para o polipeptídeo.
[00153] Um exemplo de um quelante é o tipo de poliaminopolicarboxilato de quelante. Duas classes de tais quelantes de poliaminopolicarboxilato podem ser distinguidos: quelantes macrocícliso e acíclicos.
[00154] Em uma realização, o polipeptídeo de ligação de IL-17A, proteína de fusão ou conjugado compreende um ambiente quelante provido por um quelante de poliaminopolicarboxilato conjugado ao polipeptídeo de ligação de IL-17A através do grupo tiol de um resíduo de cisteína ou um grupo amina epsilon de um resíduo de lisina.
[00155] Os quelantes macrocíclicos mais comumente usados para radioisótopos de índio, gálio, ítrio, bismuto, radioactinídeos e radiolantanídeos são diferentes derivados de DOTA (ácido 1,4,7,10-tetra-azaciclododecano-1,4,7,10-tetra- acético). Em uma realização, um ambiente quelante do polipeptídeo de IL-17A, proteína de fusão, conjugado ou complexo é provido por DOTA ou um derivado dele. Mais especificamente, em uma realização, os polipeptídeos quelantes englobados pela presente revelação são obtidos pela reação o derivado DOTA ácido 1,4,7,10-tetra-azaciclododecano-1,4,7- tris-acético-10-maleimidoetilacetamida (maleimidomonoamida- DOTA) com o dito polipeptídeo.
[00156] Adicionalmente, o ácido 1,4,7- triazaciclononano-1,4,7-triacético (NOTA) e seus derivados podem ser usados como quelantes. Por isso, em uma realização, é provido um polipeptídeo de ligação de IL-17A, proteína de fusão, conjugado ou complexo, em que o quelante de poliaminopolicarboxilato é ácido 1,4,7-triazaciclononano- 1,4,7-triacético ou um derivado do mesmo.
[00157] Os quelantes de poliaminopolicarboxilato acíclicos mais comumente usados são diferentes derivados de DTPA (ácido dietilenotriamina-penta-acético). Por isso, polipeptídeos que têm um ambiente quelante provido pela ácido dietilenotriaminapenta-acético ou seus derivados também estão englobados pela presente revelação.
[00158] Em uma realização, o dito polipeptídeo de ligação de IL-17A, proteína de fusão, conjugado ou complexo como descrito aqui compreende ainda uma ou mais porções de polietileno glicol (PEG), por exemplo, a fim de melhorar as propriedades farmacocinéticas da molécula.
[00159] Em um quarto aspecto da presente revelação, é provido um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de ligação de IL-17A ou uma proteína de fusão como descrito aqui; um vetor de expressão compreendendo o dito polinucleotídeo; e uma célula hospedeira compreendendo o dito vetor de expressão.
[00160] Também englobado por essa revelação está um método de produção de um polipeptídeo ou proteína de fusão como descrito acima, compreendendo cultivar a dita célula hospedeira sob condições permissivas de expressão do dito polipeptídeo de seu vetor de expressão e isolando o polipeptídeo.
[00161] O polipeptídeo de ligação de IL-17A da presente revelação pode alternativamente ser produzido por síntese de peptídeo não biológico usando aminoácidos e/ou derivados de aminoácido tendo cadeias laterais reativas protegidas, a síntese de peptídeo não biológico compreendendo - acoplamento passa a passo dos aminoácidos e/ou os derivados de aminoácido para formar um polipeptídeo de acordo com o primeiro aspecto tendo cadeias laterais reativas protegidas, - remoção dos grupos de proteção das cadeias laterais reativas do polipeptídeo, e - dobramento do polipeptídeo em solução aquosa.
[00162] Deve ser entendido que o polipeptídeo de ligação de IL-17A de acordo com a presente revelação pode ser útil como um agente terapêutico, diagnóstico ou prognóstico em seu direito próprio ou como um meio para direcionar outros agentes terapêuticos ou diagnósticos, com, por exemplo, efeitos diretos ou indiretos na IL-17A. Um efeito terapêutico direto pode, por exemplo, ser realizado pela inibição da sinalização de IL-17A, tal como pelo bloqueio de IL-17A de ligação de um ou mais de seus receptores.
[00163] Em outro aspecto, é provida uma composição que compreende um polipeptídeo de ligação de IL-17A, proteína de fusão, conjugado ou complexo como descrito aqui e pelo menos um excipiente ou transportador farmaceuticamente aceitável. Em uma realização, a dita composição compreende adicionalmente pelo menos um agente ativo adicional, tal como pelo menos dois agentes ativos adicionais, tais como pelo menos três agentes ativos adicionais. Exemplos não limitantes de agentes ativos adicionais que podem ser úteis em tal composição são os polipeptídeos terapeuticamente ativos, agentes de modificação de resposta imune e compostos tóxicos descritos aqui.
[00164] O técnico no assunto apreciará que o dito polipeptídeo de ligação de IL-17A, proteína de fusão, conjugado ou complexo, ou uma composição farmacêutica compreendendo um polipeptídeo de ligação de anti-IL-17A, proteína de fusão, conjugado ou complexo como descrito aqui pode ser administrado a um indivíduo usando técnicas de administração padrão, tais como incluindo administração oral, tópica, intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, pulmonar, transdérmica, intramuscular, intranasal, bucal, sublingual ou supositório. Assim, em uma realização é provido um polipeptídeo de ligação de IL-17A, proteína de fusão, conjugado ou complexo ou uma composição farmacêutica como descrito aqui para administração oral, tópica, intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, pulmonar, transdérmica, intramuscular, intranasal, bucal, sublingual ou supositório. Em uma realização particular é provido um polipeptídeo de ligação de IL-17A, proteína de fusão, conjugado ou complexo ou uma composição farmacêutica como descrito aqui para administração oral. Em outra realização particular, é provido um polipeptídeo de ligação de IL-17A, proteína de fusão, conjugado ou complexo ou uma composição farmacêutica como descrito aqui para administração tópica, tal como administração tópica no olho.
[00165] IL-17A também pode servir como um marcador valioso para diagnóstico e prognóstico de determinados cânceres, tais como cânceres associados à inflamação, por exemplo, cânceres gástricos, cânceres de pulmão de célula não pequena, carcinomas hepatocelulares e adenocarcinomas. Por exemplo, IL-17 foi ligado ao prognóstico e baixa sobrevivência em pacientes que sofrem de carcinoma colorretal e carcinoma hepatocelular.
[00166] Por isso, em outro aspecto da presente revelação, é provido um polipeptídeo de ligação de IL-17A, proteína de fusão, conjugado, complexo ou composição como descrito aqui para uso como um medicamento, um agente diagnóstico ou um agente prognóstico.
[00167] Em uma realização, é provido um polipeptídeo de ligação de IL-17A, proteína de fusão, conjugado, complexo ou composição como descrito aqui, para uso como um medicamento para modular a função de IL-17A in vivo. Como usado aqui, o termo “modular” refere-se à alteração da atividade, tal como renderização do hipomorfo de função de IL- 17A, parcialmente inibindo ou totalmente inibindo a função de IL-17A.
[00168] Exemplos não limitantes de condições ou doenças associadas à IL-17A, em que os polipeptídeos de ligação de IL-17A podem ser úteis para tratamento, prognóstico e/ou diagnóstico incluem artrite, tal como artrite reumatoide, artrite crônica progressiva, artrite deformante e doenças reumáticas, doenças que envolvem a perda óssea, dor inflamatória, espondiloartropatias incluindo espondilite anquilosante, síndrome de Reiter, artrite reativa, artrite psoriática, artrite enteropática, artrite reumatoide pauciarticular, artrite reumatoide poliarticular, artrite reumatoide de início sistêmico, osteoartrite; condições de hipersensibilidade, tal como hipersensibilidade (incluindo tanto hipersensibilidade das vias aéreas e hipersensibilidade dérmica), alergias e respostas à exposição de alérgeno; condições ou doenças gastrointestionais, tal como doença inlamatória intestinal autoimune (incluindo, por exemplo, colite ulcerativa, doença de Crohn e Síndrome do Intestino Irritável), doença celíaca (sprue idiopático), abscessos e adesões intraperitoneais, esclerose biliar primária, colangite esclerosante, hepatite autoimune, hepatite viral, hepatite ativa crônica e gastrite associada à Helicobacter pylori; condições e doenças oftálmicas, tal como oftalmopatia endócrina, doença de Graves, uveíte (anterior e posterior), ceratoconjuntivite seca (doença do olho seco), ceratoconjuntivite vernal, ceratite estromal herpética e doença do olho seco; condições e doença nefrológica, tal como glomerulonefrite (com e sem síndrome nefrótica, por exemplo, incluindo síndrome nefrótica idiopática ou nefropatia de mudança mínima); condições e doença aguda, tal como reações inflamatórias agudas e hiperagudas, choque séptico (por exemplo, choque endotóxico e síndrome do desconforto respiratório do adulto), meningite, pneumonia, queimaduras graves, infecções agudas, septicemia, acidente vascular encefálico e isquemia; caquexia (síndrome do desperdício), tal como caquexia associada com liberação de TNF mórbida, caquexia consequente de infecção, caquexia associada com câncer, caquexia associada com disfunção do órgão e caquexia relacionada à AIDS; condições e doenças relacionadas ao osso, tais como doenças de metabolismo ósseo incluindo osteoartrite, osteoporose, artrites inflamatórias, perda óssea tal como perda óssea relacionada à idade, doença periodontal, afrouxamento dos implantes ósseos e erosão óssea; condições e doenças juvenis, tais como artrite reumatoide juvenil, artrite reumatoide juvenil pauciarticular, artrite reumatoide juvenil poliarticular, artrite reumatoide juvenil de início sistêmico, espondilite anquilosante juvenil, artrite enteropática juvenil, artrite reativa juvenil, síndrome de Reiter juvenil, Síndrome de SEA (Síndrome de Soronegatividade, Entesopatia, Artropatia), dermatomiosite juvenil, artrite psoriática juvenil, escleroderma juvenil, lúpus eritematoso sistêmico juvenil e vasculite juvenil; vasculite incluindo vasculite de vasos grandes, tais como polimialgia reumática, arterite de Takayasu e arterite temporal, vasculite de vasos médios, tais como doença de Buerger, vasculite cutânea, doença de Kawasaki e Poliarterite nodosa, vasculite de vasos pequenos, tais como síndrome de Behçet, síndrome de Churg-Strauss, vasculite cutânea, púrpura de Henoch-Schonlein, poliangiite microscópica, granulomatose de Wegener e vasculite de Golfer, vasculite de vasos variáveis e arterite; condições ou doenças dermatológicas, tais como psoríase, psoríase em placa, psoríase gutata, psoríase inversa, psoríase pustular, psoríase eritrodérmica, dermatite e dermatite atópica; condições e doenças pulmonares, tais como das vias aéreas obstrutivas ou inflamatórias, asma, bronquite, COPD, pneumoconiose, enfisema pulmonar, reações inflamatórias agudas e hiperagudas, fibrose pulmonar intersticial, inflamação das vias aéreas e asma brônquica; condições e doenças metabólicas, tais como aterosclerose, dislipidemia e diabetes melitus Tipo I; bem como outras condições e doenças autoimunes sistêmicas, tais como lúpus eritematoso sistêmico (SLE), nefrite lúpica, policondrite, miastenia gravis, síndrome de Steven-Johnson, tumores, miosite, dermatomiosite, adult-onset Still’s doença, polimialgia reumática, sarcoidose, escleroderma, esclerose, esclerose sistêmica, síndrome de Sjogren, esclerose múltipla (EM), doença de Guillain-Barré, doença de Addison e fenômeno de Raynaud.
[00169] Os polipeptídeos de ligação de IL-17A como revelado aqui podem, além disso, ser úteis para o tratamento de receptores de transplantes de coração, pulmão, coração- pulmão combinado, fígado, rim, pele ou córnea, incluindo rejeição de aloenxerto, ou rejeição de xenoenxerto, e para a prevenção de doença de enxerto versus hospedeiro, tal como após transplante de medula óssea e arteriosclerose associada ao transplante de órgão.
[00170] Os polipeptídeos de ligação de IL-17A como revelado aqui podem, além disso, ser úteis para o tratamento, diagnóstico ou prognóstico de cânceres associados à inflamação. O termo “câncer” como usado aqui refere-se a doenças tumorais e/ou câncer, tal como cânceres metastáticos ou invasivos, por exemplo, câncer de pulmão, câncer de pulmão de célula não pequena (NSCL), câncer de pulmão de célula bronquioloalveolar, câncer ósseo, câncer pancreático, câncer de pele, câncer da cabeça ou pescoço, melanoma cutâneo ou intraocular, câncer retal, câncer da região anal, câncer de estômago, câncer gástrico, câncer de cólon, câncer colorretal, câncer dos intestinos delgados, câncer esofágico, câncer de fígado, câncer de pâncreas, câncer de mama, câncer ovariano, câncer uterino, carcinoma das trompas de falópio, carcinoma do endométrio, carcinoma do colo do útero, carcinoma da vagina, carcinoma da vulva, Doença de Hodgkin, câncer do sistema endócrino, câncer da glândula tireoide, câncer da glândula da paratireoide, câncer da glândula adrenal, sarcoma do tecido macio, câncer da uretra, câncer do pênis, câncer da próstata, câncer de bexiga, câncer do rim ou ureter, carcinoma de célula renal, carcinoma da pélvis renal, mesotelioma, carcinoma hepatocelular, câncer biliar, neoplasmas do sistema nervoso central (CNS), tumores do eixo espinhal, glioma do tronco cerebral, glioblastoma multiforme, astrocitomas, schwannomas, ependimonas, meduloblastomas, meningiomas, carcinomas de célula escamosa, adenoma pituitário, adenocarcinomas, linfoma, leucemia linfocítica ou câncer de origem desconhecida ou outra condição associada à IL-17A hiperplásica ou neoplásica, incluindo versões refratárias de quaisquer dos cânceres acima ou uma combinação de um ou mais dos cânceres acima ou doenças hiperproliferativas.
[00171] Exemplos não limitantes de cânceres associados à inflamação incluem cânceres gástricos, cânceres colorretais, cânceres de pulmão de célula não pequena, carcinomas hepatocelulares e adenocarcinomas.
[00172] Em uma realização, é provido um polipeptídeo de ligação de IL-17A, proteína de fusão, conjugado, complexo ou composição para uso no tratamento, diagnóstico ou prognóstico de uma condição associada à IL-17A, tal como uma condição selecionada do grupo consistindo em doenças inflamatórias, doenças autoimunes e câncer, tal como doenças inflamatórias e doenças autoimunes. Em uma realização, a dita condição é selecionada do grupo consistindo em condições inflamatórias, condições alérgicas, reações de hipersensibilidade, doenças autoimunes, infecções graves e rejeições de transplante.
[00173] Em uma realização particular, a dita condição associada à IL-17A é selecionada do grupo consistindo em artrite reumatoide, espondilite4 anquilosante, artrite psoriática, esclerose múltipla, lúpus eritematoso sistêmico, uveíte e doença do olho seco.
[00174] Em uma realização ainda mais particular, a dita condição associada à IL-17A é psoríase.
[00175] Em outra realização, a dita condição associada à IL-17A é um câncer associado à inflamação, tal como um câncer selecionado do grupo consistindo em cânceres gástricos, cânceres colorretais, cânceres de pulmão de célula não pequena, carcinomas hepatocelulares e adenocarcinomas.
[00176] Em um aspecto relacionado, é provido um método de detecção de IL-17A, compreendendo prover uma amostra suspeita de conter IL-17A, colocando a dita amostra em contato com um polipeptídeo de ligação de IL-17A, proteína de fusão, conjugado, complexo ou composição como descrito aqui, e detectando a ligação do polipeptídeo de ligação de IL-17A, proteína de fusão, conjugado, complexo ou composição para indicar a presença de IL-17A na amostra. Em uma realização, o dito método compreende ainda uma etapa de lavagem intermediária para remover polipeptídeo não ligado, proteína de fusão, conjugado, complexo ou composição, após colocar a amostra em contato.
[00177] Em uma realização, o dito método é um método de diagnóstico ou prognóstico, para determinar a presença de IL-17A em um indivíduo, o método compreendendo as etapas: colocação do indivíduo, ou de uma amostra isolada do indivíduo, em contato com um polipeptídeo de ligação de IL- 17A, proteína de fusão, conjugado, complexo ou composição como descrito aqui, e obtenção de um valor correspondendo à quantidade do polipeptídeo de ligação de IL-17A, proteína de fusão, conjugado, complexo ou composição que tenha ligado no dito indivíduo ou na dita amostra.
[00178] Em uma realização, o dito método compreende ainda uma etapa de lavagem intermediária para remover o polipeptídeo não ligado, proteína de fusão, conjugado, complexo ou composição, após colocar em contato o indivíduo ou amostra e antes da obtenção de um valor.
[00179] Em uma realização, o dito método compreende ainda uma etapa de comparação do dito valor para uma referência. A dita referência pode ser marcada por um valor numérico, um limiar ou um indicador visual, por exemplo, com base em uma reação de cor. O técnico no assunto apreciará que diferentes maneiras de comparação para uma referência são conhecidas na técnica e podem ser adequadas para uso.
[00180] Em uma realização de tal método, o dito indivíduo é um indivíduo mamífero, tal como um indivíduo humano.
[00181] Em uma realização, o dito método é realizado in vivo.
[00182] Em uma realização, o dito método é realizado in vitro.
[00183] Em um aspecto relacionado, é provido um método de tratamento de uma condição associada à IL-17A, compreendendo administrar a um indivíduo em necessidade respectiva uma quantidade eficaz de um polipeptídeo de ligação de IL-17A, proteína de fusão, conjugado, complexo ou composição como descrito aqui. Em uma realização mais específica do dito método, o polipeptídeo de ligação de IL-17A, proteína de fusão, conjugado, complexo ou composição como descrito aqui modula a função de IL-17A in vivo.
[00184] Em uma realização, a dita condição associada à IL-17A é selecionada do grupo consistindo em doenças inflamatórias, doenças autoimunes e câncer, tal como um grupo consistindo em doenças inflamatórias e doenças autoimunes. Em uma realização particular do dito aspecto, a condição associada à IL-17A é selecionada do grupo consistindo em condições inflamatórias, condições alérgicas, reações de hipersensibilidade, doenças autoimunes, infecções graves e rejeições de transplante. Em uma realização, a dita condição associada à IL-17A é selecionada do grupo consistindo em artrite reumatoide, espondilite anquilosante, artrite psoriática, psoríase, esclerose múltipla, lúpus eritematoso sistêmico, uveíte e doença do olho seco. Em uma realização mais específica, a dita condição associada à IL-17A é psoríase. Em outra realização, a dita condição associada à IL-17A é câncer, tal como um câncer selecionado do grupo consistindo em cânceres gástricos, cânceres colorretais, cânceres de pulmão de célula não pequena, carcinomas hepatocelulares e adenocarcinomas.
[00185] Pode ser benéfico administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo de ligação de IL-17A, proteína de fusão, conjugado, complexo ou composição como descrito aqui com pelo menos uma segunda substância medicamentosa, tal como um agente de modificação de resposta imune, composto tóxico ou um agente anticâncer.
[00186] Como usado aqui, o termo “co-adminstração” engloba adminstração concomitante e administração na sequência. Assim, em uma realização, é provido um método como definido acima, compreendendo ainda co-administração de um agente de modulação de resposta imune. Em outra realização, é provido um método como definido acima, compreendendo ainda co- administração de um agente anti-inflamatório adicional. Em outra realização, é provido um método como definido acima, compreendendo ainda a co-administração de um composto tóxico. Em outra realização, é provido um método como definido acima, compreendendo ainda a co-administração de um agente anticâncer.
[00187] Exemplos não limitantes de agentes de modulação de resposta imune e compostos tóxicos são dados acima. Exemplos não limitantes de agentes anticâncer incluem agentes selecionados do grupo consistindo em auristatina, antraciclina, caliqueamicina, combretastatina, doxorrubicina, duocarmicina, o anti-tumorantibiótico CC-1065, ecteinsascidina, geldanamicina, maitansinoide, metotrexato, micotoxina, taxol, ricina, bouganina, gelonina, pseudomonas exotoxina 38 (PE38), toxina da difteria (DT), e seus análogos, e seus derivados e suas combinações. Um técnico no assunto apreciaria que os exemplos não limitantes de agentes citotóxicos incluem todas as possíveis variantes dos ditos agentes, por exemplo, o agente auristatina inclui, por exemplo, auristatina E, auristatina F, auristatina PE e seus derivados.
[00188] Enquanto a invenção tem sido descrita com referência a vários aspectos e realizações exemplares, será entendido pelos técnicos no assunto que várias mudanças podem ser feitas e equivalente podem ser substituídos por seus elementos sem se afastar do escopo da invenção. Além disso, muitas modificações podem ser feitas para adaptar uma situação particular ou molécula aos ensinamentos da invenção sem se afastar do seu escopo essencial. Portanto, é destinado que a invenção não seja limitada a nenhuma realização particular contemplada, mas que a invenção incluirá todas as realizações que se enquadram dentro do escopo das reivindicações anexas.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[00189] A Figura 1 é uma listagem das sequências de aminoácido dos exemplos de polipeptídeos de ligação de IL- 17A da presente revelação (SEQ ID NO: 1-1222), um polipeptídeo de controle (SEQ ID NO: 1223), os polipeptídeos de ligação de albumina PP013 (SEQ ID NO: 1224) e PEP07843 (SEQ ID NO: 1225) bem como as sequências de aminoácido da IL-17A humana (SEQ ID NO: 1226), IL-17A de murino (SEQ ID NO: 1227), IL-17A de macaco cinomolgo (SEQ ID NO: 1229), IL-17A de macaco rhesus (SEQ ID NO: 1230) e IL-17F humana (SEQ ID NO: 1228) usadas para seleção, truagem e/ou caracterização para ilustração da invenção. Nos polipeptídeos de ligação de IL-17A da presente revelação, os motivos de ligação de IL-17A deduzidos (BMs) se estendem do 8 ao resíduo 36 em cada sequência. As sequências de aminoácido dos 49 resíduos de aminoácido de polipeptídeos longos (BMod) previstas para constituir o pacote de três hélices completas dentro de cada uma dessas variantes Z se estendem do resíduo 7 ao resíduo 55.
[00190] A Figura 2 mostra inibição de produção de IL-6 induzida por IL-17A avaliada pelo ensaio de NHDF descrito no Exemplo 3. (A) His6-Z06260 (diamantes abertos), His6-Z06282 (quadrados abertos) e His6-Z06455 (círculos abertos) foram titulados em um meio contendo IL-17A. (B) Z06260-ABD (diamantes fechados), His6-Z06282 (quadrados abertos), Z06282-ABD (quadrados preenchidos), His6-Z06455 (círculos abertos) e Z06455-ABD (círculos preenchidos) foram titulados em um meio contendo IL-17A e HSA.
[00191] A Figura 3 mostra a capacidade de ligação de IL-17A de um conjunto de variantes Z da primeira e segunda biblioteca de maturação ensaiada por ELISA como descrito no Exemplo 8. Os resultados são exibidos como porcentagem da capacidade de ligação comparados à variante de ligação de IL- 17A Z10241 (SEQ ID NO: 11).
[00192] A Figura 4 mostra o resultado de ligação da análise de especificidade realizada em um instrumento Biacore como descrito no Exemplo 8. Os sensorgramas foram obtidos pela injeção de 20 nM das variantes Z His6-tagged Z10508 (SEQ ID NO: 2) (A), Z10532 (SEQ ID NO: 1) (B) e Z15167 (SEQ ID NO: 4) (C) sobre IL-17A humana (preta), IL-17A/F humana (cinza escuro) e IL-17F humana (cinza claro), respectivamente, imobilizado na superfície de um chip CM5.
[00193] A Figura 5 mostra inibição de produção de IL-6 induzida por IL-17A para uma seleção de variantes Z originando da primeira seleção de maturação (curvas sólidas) comparada a um aglutinante da seleção primária (curva quebrada) ensaiada como descrito no Exemplo 8. Todos os aglutinantes inibiram IL-17A em uma maneira dependente de dose e os aglutinantes maturados tiveram um aumento na capacidade de bloqueio comparado ao aglutinante primário.
[00194] A Figura 6 mostra a ligação de IL-17A humana (cinza) e IL-17A de cinomolgo (preta) para (A) ZAZ3363 (SEQ ID NO: 1244), (B) ZAZ3364 (SEQ ID NO: 1245) e (C) ZAZ3365 (SEQ ID NO: 1246), analisada em um instrumento Biacore como descrito no Exemplo 11. As curvas resultantes, das quais as respostas de uma superfície em branco foram subtraídas, correspondem às injeções da respectiva proteína IL-17A nas concentrações 2,5, 10 e 40 nM.
[00195] A Figura 7 mostra inibição de produção de IL-6 induzida por IL-17A no ensaio de NHDF descrito no Exemplo 14. A Figura 7A mostra uma eficácia inibitória superior com o polipeptídeo Z-ABD-Z dimérico ZAZ3220 (SEQ ID NO: 1236; linha preta sólida) comparado à variante Z monomérica correspondente Z10241 (SEQ ID NO: 11; linha preta pontilhada). A Figura 7B mostra uma avaliação de diferentes comprimentos do ligante entre as porções Z e ABD nos polipeptídeos Z-ABD-Z que compreendem a variante Z Z06282 (SEQ ID NO: 1206). Os polipeptídeos Z-ABD-Z ZAZ3174 (SEQ ID NO: 1233), ZAZ3176 (SEQ ID NO: 1235), ZAZ3234 (SEQ ID NO: 1238), ZAZ3235 (SEQ ID NO: 1239), ZAZ3236 (SEQ ID NO: 1240) e ZAZ3237 (SEQ ID NO: 1241) com vários números de repetições de G4S, ou ligantes mínimos, em cada lado do ABD foram comparados.
[00196] A Figura 8 mostra inibição dependente de dose pelos polipeptídeos Z-ABD-Z no modelo KC induzido por hIL-17A descrito no Exemplo 15. (A) A inibição completa da produção de KC por ZAZ3174 (SEQ ID NO: 1233) foi obtida em uma dose de 2,5 mg/kg. (B) A inibição completa da produção de KC por ZAZ3220 (SEQ ID NO: 1236) foi obtida em uma dose de 0,4 mg/kg. As doses indicadas no eixo x são dadas em mg/kg e a dose pmol correspondentes. Os números acima da barra indicam a inibição por cento em cada grupo de dose; 72% de inibição foram obtidos com 0,1 mg/kg de ZAZ3220. LOQ = limite de quantificação.
[00197] A Figura 9 mostra os perfis farmacocinéticos dos polipeptídeos Z-ABD-Z (A) ZAZ3220 (SEQ ID NO: 1236) e (B) ZAZ3363 (SEQ ID NO: 1244), após uma administração simples i.v. (linha preta) ou s.c. (linha cinza quebrada) para ratos SD como descrito no Exemplo 16. As concentrações médias do soro versus tempo são exibidas.
[00198] A Figura 10 mostra o resultado de administração tópica nos olhos de coelhos realizada como descrito no Exemplo 17. A captação de variante Z Z10199 (SEQ ID NO: 1217) e o polipeptídeo Z-ABD-Z ZAZ3174 (SEQ ID NO: 1233) foi demonstrada tanto um humor aquoso quanto humor vítreo, enquanto o anticorpo IgG de controle não penetrou no olho.
[00199] A Figura 11 mostra a atividade de ZAZ3363 (SEQ ID NO: 1244) formulada em OAF1 e OAF2, respectivamente, em comparação à formulação em PBS, e analisada no ensaio de NHDF descrito no Exemplo 18. A) OAF1 (círculos preenchidos), PBS (cruzes) e OAF1 sem ZAZ3363 (diamantes abertos). B) OAF2 (triângulos abertos), PBS (cruzes) e OAF2 sem ZAZ3363 (diamantes abertos).
[00200] A Figura 12 mostra o perfil farmacocinético de administração intraduodenal de ZAZ3363 formulado em OAF1 (círculos preenchidos), OAF2 (triângulos abertos) e PBS (cruzes) realizados como descrito no Exemplo 18.
[00201] A Figura 13 mostra a avaliação dos complexos HCAda-Z14253 e LCAda-Z14253 no ensaio de NHDF descrito no Exemplo 19. (A) Esquemático dos complexos HCAda-Z14253 (esquerda) e LCAda-Z14253 (direita). (B) Inibição de produção de IL-6 induzida por IL-17A. (C) Inibição de produção de IL-8 induzida por TNF. (D) Inibição de TNF e produção de IL-8 induzida por IL-17A. Z04726-ABD é um controle negative, incluído em todos os três ensaios.
[00202] A Figura 14 mostra os perfis farmacocinéticos do polipeptídeo Z-ABD-Z ZAZ3363 (SEQ ID NO: 1244) nos macacos cinomolgos após administração i.v. de 20 mg/kg (preta) ou 40 mg/kg (cinza) no dia 1, 4, 7 e 10 como descrito no Exemplo 20. As concentrações médias do plasma versus tempo são mostradas após análise de (A) a primeira injeção no dia 1 e (B) a quarta injeção no dia 10. As barras de erro representam o desvio padrão.
[00203] A Figura 15 mostra os perfis farmacocinéticos do polipeptídeo Z-ABD-Z ZAZ3363 (SEQ ID NO: 1244) nos cães da raça Beagle individuais após administração oral. 150 mg de ZAZ3363 foram administrados como cápsulas revestidas entéricas no dia 0.
EXEMPLOS SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[00204] Os Exemplos a seguir revelam o desenvolvimento das novas moléculas variantes Z direcionadas à interleucina 17A (IL-17A) com base na tecnologia de exibição de fago. Os polipeptídeos de ligação de IL-17A descritos aqui foram sequenciados e suas sequências de aminoácido são listadas na Figura 1 com os identificadores de sequência SEQ ID NO: 1 a 1222. Os Exemplos descrevem adicionalmente a caracterização dos polipeptídeos de ligação de IL-17A e funcionalidade in vitro e in vivo dos ditos polipeptídeos.
EXEMPLO 1 SELEÇÃO E TRIAGEM DAS VARIANTES Z DE LIGAÇÃO DE IL- 17A MATERIAIS E MÉTODOS
[00205] Biotinilação da proteína alvo: IL-17A humana (hIL-17A Peprotech cat. n° 200-17; SEQ ID NO: 1226) e IL-17A de murino (mIL-17A Peprotech cat. n° 210-17; SEQ ID NO: 1227) foram biotiniladas de acordo com as recomendações do fabricante à temperatura ambiente (TA) por 30 min usando EZ- Link Sulfo-NHS-LC-Biotina Sem Peso (Thermo Scentific, cat. n° 21327) em um excesso molar de 20 x . A troca de tampão subsequente para solução salina tamponada de fosfato (PBS, fosfato a 10 mM, NaCl a 137 mM, KCl a 2,68 mM, pH 7,4) foi realizada usando um cassete de diálise (Slide-a-lyzer 3.5 K, 3500 MWCO, Thermo Scentific, cat. n° 66333), de acordo com as instruções do fabricante.
[00206] Seleção de exibição de fago de variante Z de ligação de IL-17A: Uma biblioteca de variante aleatórias de proteína Z exibida no bacteriófago, construída no fagemídeo pAY02592 essencialmente como descrito em Gronwall et al. (2007) J Biotechnol, 128:162-183, foi usada para selecionar s variantes Z de ligação de IL-17A. Nessa biblioteca, um domínio de ligação de albumina (abreviado ABD e correspondendo ao GA3 de proteína G da cepa G148 Streptococcus) é usado como parceiro de fusão para as variantes Z. A biblioteca é indicada Zlib006Naive.II e tem um tamanho de 1.5 x 1010 de membros da biblioteca (variantes Z). As células E. coli RRIΔM15 (Rüther et al., (1982) Nucleic Acids Res 10:5765-5772) de um estoquede glicerol contendo a biblioteca de fagemídeo Zlib006Naive.II, foram inoculadas em 20 l de um meio livre de prolina definido [3 g/l de KH2PO4, 2 g/l de K2HPO4, 0,02 g/l de uracila, 6,7 g/l de YNB (Base de Nitrogênio de Levedura Difco™ sem aminoácidos, Becton Dickinson), 5,5 g/l de glicose monoidratada, 0,3 g/l de L-alanina, 0,24 g/l de monocloridrato de L-arginina, 0.11 g/l de L-asparagina monoidratada, 0,1 g/l de L-cisteína, 0.3 g/l de ácido L-glutâmico, 0,1 g/l de L- glutamina, 0,2 g/l de glicina, 0,05 g/l de L-histidina, 0,1 g/l de L-isoleucina, 0,1 g/l de L-leucina, 0,25 g/l de monocloridrato de L-lisina, 0,1 g/l de L-metionina, 0,2 g/l de L-fenilalanina, 0,3 g/l de L-serina, 0,2 g/l de L-treonina, 0,1 g/l de L-triptofano, 0,05 g/l de L-tirosina, 0,1 g/l de L- valina], suplementado com 100 μg/ml de ampicilina. Os cultivos foram cultivados a 37°C em um fermentador (Belach Bioteknik, BR20). Quando as células alcançaram uma densidade óptica a 600 nm (OD600) de 0,75, aproximadamente 2,6 l do cultivo foram infectados usando um excesso molar de 10 x de fago auxiliar M13K07 (New England Biolabs, cat. n° N0315S). As células foram incubadas por 30 min, em que o fermentador foi preenchido até 20 l com meio de cultivo [2,5 g/l de (NH4)2SO4; 5,0 g/l de Extrato de Levedura (Merck 1.03753.0500); 25 g/l de Peptona (Scharlau 07-119); 2 g/l de K2HPO4; 3 g/l de KH2PO4; 1,25 g/l de NaaC6H5O? • 2 H2O; 0,1 ml/l de agente antiespumante Breox FMT30] suplementado com 100 μM de isopropil-β-D-1- tiogalactopiranosídeo (IPTG) para indução de expressão e com 50 μg/ml de ampicilina, 12,5 μg/ml de carbenicilina, 25 μg/ml de canamicina, 35 ml/l de MgSO4 a 1,217 M e 10 ml de uma solução de oligoelemento [FeCl3 a 129 mM; ZnSO4 a 36,7 mM; CuSO4 a 10,6 mM; MnSO4 a 78,1 mM; CaCl2 a 94,1 mM, dissolvida em HCl a 1,2 M]. Um cultivo alimentado por lote limitado a glicose foi iniciado onde uma solução de 600 g/l foi alimentada para o reator (15 g/h no começo, 40 g/h no final da fermentação após 17 h). Através da adição automática de 25% de NH4OH, o pH foi controlado em 7. O ar foi suplementado (10 l/min) e o agitador foi ajustado para manter o nível de oxigênio dissolvido acima de 30%. As células no cultivo foram removidas por filtração de fluxo tangencial.
[00207] As partículas de fago foram precipitadas do sobrenadante duas vezes em PEG/NaCl (polietileno glicol/cloreto de sódio), filtradas e dissolvidas em PBS e glicerol como descrito em Gronwall et al., supra. Os estoques de fago foram armazenados a -80°C antes do uso.
[00208] As seleções contra hIL-17A biotinilada (b- hIL-17A) ou mIL-17A biotinilada (b-mIL-17A) foram realizadas em quatro ciclos divididos em seis trilhas diferentes (Tabela 2). A preparação de estoque de fago, procedimento de seleção e amplificação de fago entre ciclos de seleção foram realizados essencialmente como descrito no documento WO2009/077175 para seleção contra outro alvo com as exceções a seguir. Exceção 1: PBS suplementado com 3% de albumina de soro bovino (BSA, Sigma, cat. n° A3059) e 0,1% de Tween20 (Acros Organics, cat. n° 233362500) foi usado como tampão de seleção. Exceção 2: pré- seleção foi realizada nos ciclos 1 a 3 ou incubação do estoque de fago com Dynabeads® M-280 Estreptavidina (esferas SA, Invitrogen, cat. n° 11206D). Exceção 3: todos os tubos e esferas usados nas seleções foram pré-bloqueados com PBS suplementado com 5% de BSA e 0,1% de Tween20. Exceção 4: as seleções foram realizadas em solução à RT e o tempo para seleção foi de 200 min no primeiro ciclo e 120 min nos ciclosseguintes. Exceção 5: essa foi seguida pela captura de complexos de fago alvo nas esferas SA usando 1 mg de esferas por 6,4 μg de b-hIL-17A ou b-mIL-17A. Exceção 6: cepa E. coli de células XL1-Blue (Agilent Technologies, cat. n° 200268) cultivada no meio suplementado 10 μg/ml de tetraciclina (exceção 7) foi usada para infecção. Exceção 8: placas de extrato de levedura de triptona (15 g/l de ágar, 10 g/l de água de triptona (Merck), 5 g/l de extrato de levedura, 3 g/l de NaCl, 2% de glicose) suplementadas com 0,1 g/l de ampicilina e 0,01 g/l de tetraciclina foram usadas para disseminação das bactérias. Exceção 9: um excesso de 10 x de fago auxiliar M13K07 comparado às bactérias foi deixada infectar as bactérias de fase log.
[00209] Uma visão geral da estratégia de seleção, descrevendo um aumento de estringência nos ciclos subsequentes obtidos usando uma concentração alvo diminuída e um aumento no número de lavagens, é mostrado na Tabela 2. Tabela 2: Visão geral da seleção de uma biblioteca primária
[00210] A faixa 1 foi dividida no segundo para os quartos ciclos, resultando em um total de quarto faixas (1-1 a 1-4) no ciclo 2, cinco faixas (1-1-1 a 1-4-2) no ciclo 3 e seis faixas (1-1-1-1 a 1-4-2-1) no ciclo 4. O número de partículas de fago usado para seleções foi de cerca de 2000 vezes o número de partículas de fago eluídas no ciclo anterior, mas uma quantidade mais alta foi usada nas faixas de seleção 1-1, 1-1-1 e 1-1-1-1.
[00211] As lavagens foram realizadas por 1 min usando PBST a 0,1% (PBS suplementado com 0,1% de Tween-20), e a eluição foi realizada como descrito no documento WO2009/077175.
[00212] Produção de variantes Z para ELISA: As variantes Z foram produzidas por inoculação de colônias únicas das seleções em 1 ml de meio TSB-YE suplementado com 100 μg/ml de ampicilina e IPTG a 0,1 mM em placas de poço profundo (Nunc, cat. n° 278752). As placas foram incubadas por 18 a 24 h a 37°C. As células foram peletizadas por centrifugação, ressuspensas em 400 μl de PBST a 0,05% e congeladas a -80°C para liberar a fração periplásmica das células. As amostras congeladas foram descongeladas em um banho de água e o procedimento de congelamento/descongelamento foi repetido seis vezes. 400 μl de PBST a 0,05% foram adicionados às amostras congeladas e as células foram peletizadas por centrifugação.
[00213] O sobrenadante final do extrato periplásmico contido nas variantes Z como fusões com ABD, expressas como AQHDEALE-[Z#####]-VDYV-[ABD]-YVPG (Gronwall et al., supra). Z##### refere-se a 58 variantes Z de resíduo de aminoácido.
[00214] Triagem de ELISA de variantes Z: A ligação de variantes Z para IL-17A humana foi analisada em ensaios de ELISA. As placas de ELISA de 96 poços de meia-área (Costar, cat. n° 3690) foram revestidas a 4°C durante a noite com 2 μg/ml de um anticorpo de cabra anti-ABD (produzido em casa) diluídos no tampão de revestimento (carbonato de sódio a 50 mM, pH 9.6; Sigma, cat. n° C3041). A solução de anticorpo foi derramada e os poços foram lavados em água e bloqueados com 100 μl de PBSC (PBS suplementado com 0,5% de caseína) por 1 a 3 h à RT. A solução de bloqueio foi descartada e 50 μl de soluções periplásmicas foram adicionados aos poços e incubados por 1,5 h à RT sob agitação lenta. Como um controle em branco, PBST a 0,05% fopi adicionado em vez da amostra periplásmica. Os sobrenadantes foram derramados e os poços foram lavados 4 vezes com PBST a 0,05%. Em seguida, 50 μl de b-hIL-17A em uma concentração de 6,5 nM em PBSC foram adicionados em cada poço. As placas foram incubadas por 1,5 h à RT seguida por lavagens como descrito acima. HRP conjugado por estreptavidina (Thermo Scientific, cat. n° N100) diluiu 1:30.000 em PBSC, foi adicionado aos poços e as placas foram incubadas por 1 h. Após lavagem como descrito acima, 50 μl de substrato TMB ImmunoPure (Thermo Scientific, cat. n° 34021) foram adicionados aos poços e as placas foram tratadas de acordo com as recomendações do fabricante. A absorvência a 450 nm foi medida usando um leito de placa multipoço Victor3 (Perkin Elmer).
[00215] Sequenciamento: Em paralelo com a triagem de ELISA, todos os clones foram escolhidos para sequenciamento. Os fragmentos de PCR foram amplificados de colônias simples, sequenciados e analisados essencialmente como descrito no documento WO2009/077175.
RESULTADOS
[00216] Seleção de exibição de fago de variantes Z de ligação de IL-17A: Clones individuais foram obtidos após quatro ciclos de seleções de exibição de fago contra b-hIL-17A e b-mIL-17A.
[00217] Triagem de ELISA de variantes Z: Os clones obtidos após quatro ciclos de seleção foram expandidos em placas de 96 poços e examinados para atividade de ligação de hIL-17A em ELISA. 42 variantes Z foram encontradas para dar uma resposta de 4 x do controle em branco ou mais alto (0,43 a 3,2 AU) contra hIL-17A em uma concentração de 6,5 nM. Nenhuma resposta foi obtida para o controle em branco.
[00218] Sequenciamento: O sequenciamento foi realizado para clones obtidos após quatro ciclos de seleção. A cada variante foi dado um número de identificação único #####, e as variantes individuais são referidas como Z#####. As sequências de aminoácido dos 58 resíduos de aminoácido de variantes Z de comprimento são listadas na Figura 1 e na listagem de sequência como SEQ ID NO: 1200 a 1216. O motivo de ligação de IL-17As deduzido se estende do resíduo 8 para o resíduo 36 em cada sequência. As sequências de aminoácido dos 49 resíduos de aminoácido de polipeptídeos de comprimento previstos para constituir o pacote de três hélices completo dentro de cada uma dessas variantes Z se estendem do resíduo 7 para o resíduo 55.
EXEMPLO 2 PRODUÇÃO DE VARIANTES Z DE LIGAÇÃO DE IL-17A MONOMÉRICA
[00219] Esse Exemplo descreve o procedimento geral para subclonagem e produção de variantes Z His-tagged e variantes Z em fusão com ABD, que são usadas ao longo dos experimentos de caracterização abaixo.
MATERIAIS E MÉTODOS
[00220] Subclonagem de variantes Z com um His-tag: O DNA da respectiva variante Z foi amplificado a partir do vetor de biblioteca pAY02592. Uma estratégia de subclonagem para construção de moléculas de variante Z monomérica com His6 tag de terminal N foi aplicada usando técnicas de biologia molecular padrão (essencialmente como descrito no documento WO2009/077175 para variantes Z que se ligam a outro alvo). Os fragmentos de gene Z foram subclonados no vetor de expressão pAY01448 resultando na sequência MGSSHHHHHHLQ-[Z#####]-VD codificada.
[00221] Subclonagem de variantes Z em fusão com ABD: O DNA da respectiva variante Z foi amplificado a partir do vetor de biblioteca pAY02592. Uma PCR foi realizada usando pares de iniciador adequados e os fragmentos de gene resultante foram clivados com enzimas de restrição PstI e AccI e ligados no vetor de expressão pAY03362 digeridos com as mesmas enzimas, resultando em uma proteína de fusão ABD, em que a variante ABD é PP013 (SEQID NO:1224). Os construtos codificados pelos vetores de expressão foram MGSSLQ-[Z#####]-VDSS-PP013.
[00222] Cultivo: As células E. coli BL21(DE3) (Novagen) foram transformadas com plasmídeos contendo o fragmento de gene de cada variante Z de ligação de IL-17A respectiva e cultivadas a 37°C em 800 ou 1000 ml de meio TSB- YE suplementado com 50 μg/ml de canamicina. A fim de induzir a expressão de proteína, IPTG foi adicionado a uma concentração final de 0,2 mM a OD600 = 2 e o cultivo foi incubado a 37°C por mais 5 h. As células foram colhidas por centrifugação.
[00223] Purificação de variants Z de ligação de IL-17A com um His6-tag: Aproximadamente de 2 a 5 g de cada pélete de célula foram ressuspensos em 30 ml de tampão de ligação (fosfato de sódio a 20 mM, NaCl a 0,5 M, imidazol a 20 mM, pH 7,4) suplementados com Benzonase® (Merck) para uma concentração de 15 U/ml. Após ruptura celular, o detrito de célula foi removido por centrifugação e cada sobrenadante foi aplicado em uma coluna de His GraviTrap IMAC a 1 ml (GE Healthcare). Os contaminantes foram removidos por lavagem com tampão de lavagem (fosfato de sódio a 20 mM, NaCl a 0,5 M, imidazol a 60 mM, pH 7,4 e as variantes Z de ligação de IL-17A foram subsequentemente eluídas com tampão de eluição (fosfato de sódio a 20 mM, NaCl a 0,5 M, imidazol a 500 mM, pH 7,4).
[00224] Purificação de variantes Z de ligação de IL-17A em fusão com ABD: Aproximadamente 1 a 2 g de cada pélete de célula foram ressuspensos em 30 ml de tampão TST (Tris-HCl a 25 mM, EDTA a 1 mM, NaCl a 200 mM, 0,05% de Tween20, pH 8,0) suplementado com Benzonase® (Merck). Após interrupção de célula por sonicação e clarificação por centrifugação, cada sobrenadante foi aplicado em uma coluna de fluxo de gravidade com 1 ml de agarose imobilizada com um ligante anti-ABD (produzido em casa). Após lavagem com tampão TST e NH4Ac a 5 mM tampão de pH 5,5, as variantes Z fundidas com ABD foram eluídas com HAc a 0,1 M. Para frações eluídas na etapa de purificação de cromatografia de afinidade de agarose anti-ABD, acetonitrila (ACN) foi adicionada em uma concentração final de 10% e a amostra foi carregada na coluna 15RPC Resource de 1 ml (GE Healthcare), previamente equilibrada com solvente A de RPC (0,1% de TFA, 10% de ACN, 90% de água). Após lavar a coluna com solvente A de RPC, as proteínas ligadas foram eluídas com um gradiente linear de 0 a 50% de solvente B de RPC (0,1% de TFA, 80% de ACN, 20% de água) para 20 ml. As frações contendo variantes Z fundidas com ABD puras foram identificadas por análise de SDS-PAGE e agrupadas. Após a purificação de RPC, o tampão do grupo foi trocado para PBS (KCl a 2,68 mM, NaCl a 137 mM, KH2PO4 a 1,47 mM, Na2HPO4 a 8,1 mM, pH 7,4) usando colunas de PD-10 (GE Healthcare). Finalmente, as variantes Z fundidas com ABD foram purificadas em colunas vermelhas EndoTrap® de 1 ml (Hyglos) para garantir baixo teor de endotoxina.
[00225] As concentrações de proteína foram determinadas pela medição da absorvência a 280 nm, usando um espectrofotômetro NanoDrop® ND-1000 e o coeficiente de extinção da respectiva proteína. A pureza foi analisada por SDS-PAGE tingida com Azul de Coomassie e a identidade de cada variante Z purificada foi confirmada usando análise de LC/MS.
RESULTADOS
[00226] Cultivo e purificação: As variantes Z de ligação de IL-17A com um His6-tag bem como as variantes Z fundidas em seu terminal C para ABD, foram expressas como produtos de gene solúveis em E. coli. A quantidade de proteína purificada de aproximadamente 1 a 5 g de pélete bacteriana foi determinada espectrofotometricamente pela medição da absorvência a 280 nm e variou de aproximadamente 5 mg a 20 mg para as variantes Z de ligação de IL-17A diferente. A análise de SDS-PAGE de cada preparação de proteína final mostrou que essas continham predominantemente a variante Z de ligação de IL-17A. A identidade correta e peso molecular de cada variante Z foram confirmados por análise de HPLC-MS.
EXEMPLO 3 AVALIAÇÃO DE HABILIDADE DE BLOQUEIO DE VARIANTES Z DE LIGAÇÃO DE IL-17A PRIMÁRIA
[00227] Os fibroblastos dérmicos humanos normais (NHDF) produzem IL-6 mediante estimulação com IL-17A (Chang e Dong 2007, Cell Research 17:435-440) e a quantidade de IL-6 liberada para o sobrenadante está correlacionada à concentração de IL-17A adicionada. Assim, o bloqueio de IL-17A leva a uma redução de IL-6 no sobrenadante que pode ser quantificada. Nesse Exemplo, o ensaio foi usado para avaliar a habilidade de bloqueio das variantes Z de ligação de IL-17A Z06260 (SEQ ID NO: 1200), Z06282 (SEQ ID NO: 1206) e Z06455 (SEQ ID NO: 1214), sozinha ou em fusão com ABD (PP013; SEQ ID NO: 1224).
MATERIAIS E MÉTODOS
[00228] Ensaio de NHDF com variantes Z His6-tagged: As células de NHDF (Lonza, cat. n° CC-2511) foram cultivadas em meio basal de fibroblasto (Lonza, cat. n° CC-3132) fornecido com fatores de promoção de crescimento (Lonza, cat. n° CC5034). Um dia antes do experimento, 105 de células foram semeadas em 100 μl por poço em placas de cultura de 96 poços (Greiner, cat. n° 655180). No dia do experimento, as diluições das variantes Z específicas de IL-17A His6-Z06260, His6-Z06282 e His6-Z06455 foram preparadas em uma placa de 96 poços separada. As variantes Z foram tituladas em três etapas de 3130 nM a 0,2 nM em meio contendo hIL-17A a 0,031 nM. Uma curva padrão de hIL-17A também foi preparada (0,002-31 nM) bem como controles contendo meio com hIL-17A a 0,031 nM ou meio sozinho. O meio na placa com as células de NHDF cultivadas durante a noite foi descartado. As amostras de teste, amostras de curva padrão e controles foram transferidos para a placa contendo célula. As células de NHDF foram estimuladas de 18 a 24 h a 37°C e o teor de IL-6 nos sobrenadantes foi subsequentemente quantificado usando o ELISA específico de IL-6 descrito abaixo.
[00229] Ensaio de NHDF com His6-tagged e variantes Z fundidas com ABD: As células de NHDF foram preparadas como descrito acima, No dia do experimento, as diluições dos construtos da variante Z específica de IL-17A His6-Z06282, His6-Z06455, Z06260-ABD, Z06282-ABD e Z06455-ABD foram preparadas em uma placa de 96 poços separada. Os construtos de variante Z foram titulados em quatro etapas de 780 nM a 0,2 nM em meio contendo IL-17A a 0,031 nM e HSA a 8 μM. A preparação de uma curva de IL-17A padrão e controles, bem como análise a jusante, foi realizada como descrito acima.
[00230] IL-6 ELISA: As placas de meia área de 96 poços (Costar, cat. n° 3690) foram revestidas com o anticorpo monoclonal anti-IL-6 MAB206 (R&D systems) em uma concentração de 4 μg/ml em PBS (50 μl/poço) e incubadas durante a noite a 4°C. No dia seguinte, as placas foram enxaguadas duas vezes com água de torneira e bloqueadas com PBS + 2% de BSA (Sigma) por 2 h. Uma IL-6 padrão (R&D systems, cat. n° 206-IL-50), titulada em uma série de diluição de 2 vezes (0,2 a 50 ng/ml) e sobrenadantes da placa de ensaio de célula foram adicionados às placas de ELISA revestidas (50 μl/poço) e incubados por 1,5 h à RT. As placas foram lavadas 4 vezes em uma lavadora automática de ELISA e 0,25 μg/ml (50 μl/poço) de anticorpo policlonal anti-IL-6 biotinilado (R&D systems, BAF206) foi adicionado. Após incubação por 1 h, a placa foi lavada e 50 μl de estreptavidina-HRP (Thermo Fisher, cat. n° N100) diluída 8000 vezes foram adicionados em cada poço. Após mais uma hora de incubação e subsequente lavagem, a placa foi desenvolvida com 50 μl de TMB (Thermo Fisher, cat. n° 34021) por poço e as reações foram interrompidas com 50 μl de H2SO4 a 2M. A absorvência a 450 nm foi medida em um leitor de placa de 96 poços (Victor3) e a concentração de IL-6 em cada amostra foi calculada. Os resultados são apresentados como a porcentagem de produção máxima de IL-6, calculados como: RESULTADOS
[00231] Os resultados do primeiro ensaio de NHDF mostraram que todas as três variantes Z His6-Z06260, His6- Z06282 e His6-Z06455 bloquearam a produção de IL-6 induzida por IL-17A em uma maneia dependente de dose (Figura 2A). Os valores de IC50 foram de aproximadamente 40 a 140 nM.
[00232] O ensaio de NHDF foi repetido com as mesmas variantes Z fundidas com ABD bem como inclusão de HSA no ensaio para verificar a ligação retida para o antígeno ao imitar as condições in vivo. In vivo, ABD se ligará à albumina e transmitirá meia-vida de circulação mais longa. Os resultados mostraram que todos os três aglutinantes em fusão com ABD bloquearam a produção de IL-6 induzida por IL-17A igualmente bem ou menor que as variantes Z His6-tagged (Figura 2B). Os valores de IC50 do segundo ensaio são resumidos na Tabela 3.Tabela 3: Valores de IC50 para variantes Z primárias bloqueando a produção de IL-6 induzida por IL-17A na presença de HSA
EXEMPLO 4 PROJETO E CONSTRUÇÃO DE UMA PRIMEIRA BIBLIOTECA MATURADA DE VARIANTES Z DE LIGAÇÃO DE IL-17A
[00233] Nesse Exemplo, uma biblioteca maturada foi projetada e construída. A biblioteca foi usada para seleção de outras variantes Z de ligação de IL-17A. Espera-se que as seleções de bibliotecas maturadas resultem usualmente em aglutinantes com afinidade aumentada (Orlova et al., (2006) Cancer Res 66(8):4339-48). Nesse estudo, os ligantes de cadeia única randomizados foram gerados usando síntese de DNA de grupo dividido, possibilitando a incorporação de códons definidos em posições desejadas na síntese. MATERIAIS E MÉTODOS
[00234] Projeto de biblioteca: A biblioteca foi baseada nas sequências das variantes Z de ligação de IL-17A identificadas como descrito no Exemplo 1. Na nova biblioteca, 13 posições variáveis na estrutura molecular Z foram inclinadas em direção a certos resíduos de aminoácido, de acordo com uma estratégia com base nas sequências de variante Z definidas no SEQ ID NO: 1200 a 1216. Um ligante de DNA foi gerado usando síntese dividida em grupo contendo as seguintes 147 sequências bp ordenadas de DNA 2.0 (Menlo Park, CA, USA): 5’- AA ATA AAT CTC GAG GTA GAT GCC AAA TAC GCC AAA GAA NNN NNN NNN GCG NNN NNN GAG ATC NNN NNN TTA CCT AAC TTA ACC NNN NNN CAA NNN NNN GCC TTC ATC NNN AAA TTA NNN GAT GAC CCA AGC CAG AGC TCA TTA TTT A-3’ (SEQ ID NO: 1248; códons randomizados são indicados NNN), compreendendo uma sequência de codificação para uma hélice parcialmente randomizada 1 e 2 na sequência de aminoácido correspondente, flanqueada pelos locais de restrição para XhoI e SacI. As distribuições teóricas de resíduos de aminoácido na nova biblioteca incluindo 13 posições Z variáveis (9, 10, 11, 13, 14, 17, 18, 24, 25, 27, 28, 32 e 35) na estrutura molecular Z são dadas na Tabela 4. O tamanho da biblioteca teórica resultante é de 6,1 x 109 variantes. Tabela 4: Projeto de biblioteca, primeira maturação
[00235] Construção de biblioteca: A biblioteca foi amplificada usando polimerase AmpliTaq Gold (Applied Biosystems, cat. n° 4311816) durante 12 ciclos de PCR, e os produtos agrupados foram purificados com o Kit de Purificaçãode PCR QIAquick (QIAGEN, cat. n° 28106), de acordo com as recomendações do fabricante. O grupo purificado de fragmentos de biblioteca randomizada foi sugerido com enzimas de restrição XhoI e SacI-HF (New England Biolabs, cat. n° R0146L e cat. n° R3156M, respectivamente) e concentrado usando o Kit de Purificação de PCR QIAquick. Subsequentemente, o produto foi submetido à eletroforese de gel usando um gel de agarose de 2,5% preparativo (Nuisieve GTC agarose, Cambrex, Invitrogen) e purificado a partir do dito gel usando Kit de Extração de Gel QIAGEN (QIAGEN, cat. n° 28706), de acordo com as recomendações do fabricante.
[00236] O vetor fagemídeo pAY02592 (essencialmente como pAffil descrito em Gronwall et al., supra) foi restrito com as mesmas enzimas, purificado usando extração de fenol/clorofórmio e precipitação de etanol. Os fragmentos restritos e o vetor restrito foram ligados em uma razão molar de 5:1 com DNA ligase T4 (Fermentas, cat. n° EL0011) por 2 h à RT, seguido pela incubação durante a noite a 4°C. O DNA ligado foi recuperado por extração de fenol/clorofórmio e precipitação de fenol, seguido pela dissolução em Tris-HCl a 10 mM, pH 8,5. Assim, a biblioteca resultante no vetor pAY02592 codificou as variantes Z cada fundida em um domínio de ligação de albumina (ABD) derivado de Proteína G estreptocócica.
[00237] As reações de ligação (aproximadamente 160 ng de DNA/transformação) foram eletroporadas em células ER2738 E. coli eletrocompetente (Lucigen, Middleton, WI, EUA, 50 μl). Imediatamente após eletroporação, aproximadamente 1 ml de meio de recuperação (fornecido com células ER2738 E. coli) foi adicionado. As células transformadas foram incubadas a 37°C por 60 minutos. As amostras foram tiradas para titulação e para determinação do número de transformantes. As células foram agrupadas depois disso e cultivas durante a noite a 37°C em 1 l de meio de TSB-YE, suplementado com 2% de glicose, 10 μg/ml de tetraciclina e 100 μg/ml de ampicilina. As células foram peletizadas por 15 min a 4.000 g e ressuspensas em uma solução de PBS/glicerol (aproximadamente 40% de glicerol). As células foram aliquotadas e armazenadas a -80°C. Os clones da biblioteca de variantes Z foram sequenciados a fim de verificar o teor e para avaliar o resultado da biblioteca construída em frente ao projeto da biblioteca. O sequenciamento foi realizado como descrito no Exemplo 1 e a distribuição de aminoácido foi verificada.
[00238] Preparação de estoque de fago: O estoque de fago contend a biblioteca de fagemídeo foi preparada em um fermentador de 20 l (Belach Bioteknik). As células de um estoque de glicerol contendo uma biblioteca de fagemídeo foram inoculadas em 10 l de TSB-YE suplementado com 1 g/l de glicose, 100 mg/l de ampicilina e 10 mg/l de tetraciclina. Quando as células alcançaram uma densidade óptica a 600 nm (OD600) de 0,52, aproximadamente 1,7 l do cultivo foi infectado usando um excesso molar de 5 x do fago auxiliar M13K07. As células foram incubadas por 30 min, no qual o fermentador foi preenchido até 10 l com meio de fermentação complexo [2,5 g/l (NH4)2SO4; 5,0 g/l de extrato de levedura; 30 g/l de triptona, 2 g/l de K2HPO4; 3 g/l de KH2PO4, 1,25 g/l; Na3C6H5O7 • 2 H2O; agente antiespumante Breox FMT30 0,1 ml/l]. Os componentes a seguir foram adicionados: 10 ml de carbenicilina 25 mg/ml; 5 ml de canamicina 50 mg/ml; 1 ml de IPTG a 1 M; 17,5 ml/l de MgSO4 a 1,217 M e 5 ml de uma solução de oligoelemento [FeCl3 a 129 mM; ZnSO4 a 36,7 mM; CuSO4 a 10,6 mM; MnSO4 a 78,1 mM; CaCl2 a 94,1mM, dissolvido em HCl a 1,2 M]. Um cultivo alimentado por lote limitado por glicose foi iniciado onde uma solução de glicose de 600 g/l foi alimentada para o reator (3,5 g/h no início, 37,5 g/h após 20 h continuando até o fim do cultivo). Através da adição automática de 25% de NH4OH, o pH foi controlado em pH 7. O ar foi suplementado (5 l/min) e o agitador foi fixado em 500 rpm. Após 24 h de cultivo alimentado por lote, a OD600 foi de 19,4. As células no cultivo foram peletizadas por centrifugação em 15.900 g. As partículas de fago foram precipitadas do sobrenadante duas vezes em PEG/NaCl, filtradas e dissolvidas em PBS e glicerol como descrito no Exemplo 1. Os estoques de fago foram armazenados a -80°C até uso em seleção. RESULTADOS
[00239] Construção de Biblioteca: A nova biblioteca foi projetada com base em um conjunto de variantes Z de ligação de IL-17A com propriedades de ligação verificadas (Exemplo 1 e 3). O tamanho teórico da biblioteca projetada foi de 6,1 x 109 variantes Z. O tamanho atual da biblioteca, determinado pela titulação após transformação para células ER2738 E. coli, foi de 4,5 x 109 transformantes.
[00240] A qualidade da biblioteca foi testada por sequenciamento de 96 transformantes e pela comparação de suas sequências reais com o projeto teórico. Os teores da biblioteca real comparados à biblioteca projetada foram mostrados satisfatórios. Uma biblioteca maturada de aglutinantes potenciais para IL-17A foi assim construída com sucesso.
EXEMPLO 5 SELEÇÃO, TRIAGEM E CARACTERIZAÇÃO DE VARIANTES Z DA PRIMEIRA BIBLIOTECA MATURADA MATERIAIS E MÉTODOS
[00241] Seleção de exibição de fago de variantes Z de ligação de IL-17A: As proteínas alvo hIL-17A e mIL-17A foram biotiniladas como descrito no Exemplo 1. As seleções de exibição de fago, usando a nova biblioteca de moléculas de variante Z construídas como descrito no Exemplo 4, foram realizadas em quatro ciclos contra hIL-17A e mIL-17A essencialmente como descrito no Exemplo 1, com as seguintes exceções. Exceção 1: PBST 0,1% foi usado como tampão de seleção. Na seleção, soro bovino fetal (FCS, Gibco, cat. n° 10108-165) e albumina de soro humana (HSA, Albucult, Novozymes, cat. n° 230-005) foram adicionados ao tampão de seleção para uma concentração final de 10% e 1,5 μM, respectivamente. Exceção 2: uma etapa de pré-seleção foi realizada no ciclo 1 pela incubação do estoque de fago com esferas de SA. Exceção 3: todos os tubos e esferas usados na seleçção foram pré- bloqueados com PBS suplementado com 3% de BSA e 0,1% de Tween20. Exceção 4: o tempo para seleção foi de 140, 70, 60 e 50 min nos ciclos 1, 2, 3 e 4, respectivamente.
[00242] Uma visão geral da estratégia de seleção, descrevendo um estringência aumentada em ciclos subsequentes obtidos pelo uso de uma concetração alvo reduzida e um número de lavagens aumentado, é mostrada na Tabela 5. Tabela 5: Visão geral da seleção da primeira biblioteca maturada
[00243] As faixas 1 a 3 no ciclo 1 foram divididas no segundo até o quarto ciclos, resultando em um total de seis faixas (1-1 a 3-3) no ciclo 2, seis faixas (1-1-1 a 3-3-1) no ciclo 3 e 24 faixas (1-1-1-1a a 3-3-1-2b) no ciclo 4. As lavagens foram realizadas usando PBST 0,1% por 1 min. Entretanto, para a faixa 1-3 no ciclo 3, uma das lavagens durou 10 minutos.
[00244] Após a última lavagem no ciclo 4, os complexos de fago alvo nas esferas de SA de todas as faixas foram divididos em duas partes iguais. As partículas de fago ligadas da primeira parte foram imediatamente eluídas, enquanto a segunda parte foi submetida a uma lavagem durante a noite antes da eluição das partículas de fago. As partículas de fago ligadas foram eluídas usando dois procedimentos diferentes: 1) com glicina-HCl, pH 2,2, como no Exemplo 1, ou 2) 500 μl de fosfato de sódio a 100 mM, cloreto de sódio a 150 mM, pH 5,5 e neutralização com 500 μl de PBS.
[00245] Amplificação de partículas de fago: A amplificação das partículas de fago entre o ciclo de seleção 1 e 2 foi realizada essencialmente como descrito no Exemplo 1, com as três exceções a seguir. Exceção 1: E. coli ER2738 foi usada para amplificação de fago. Exceção 2: fago auxiliar M13K07 foi usado em excesso de 5 x. Exceção 3: a amplificação das partículas de fago entre os ciclos de seleção 2 e 4 foi realizada da seguinte maneira: após infecção de fase log E. coli ER2738 com partículas de fago, TSB suplementado com 2% de glicose, 10 μg/ml de tetraciclina e 100 μg/ml de ampicilina foram adicionados e seguidos pela incubação com rotação por 30 minutos a 37°C. Em seguida, as bactérias foram infectadas com fago auxiliar M13K07. As bactérias infectadas foram peletizadas por centrifugação, ressuspensas em meio TSB-YE suplementado com IPTG a 100 μM, 25 μg/ml de canamicina e 100 μg/ml de ampicilina, e cultivadas durante a noite a 30°C. As culturas durante a noite foram centrifugadas e as partículas de fago no sobrenadante foram precipitadas duas vezes com tampão de PEG/NaCl. Por último, os fagos foram ressuspensos no tampão de seleção antes de entrar no próximo ciclo de seleção.
[00246] No ciclo de seleção final, as bactérias de fase log foram infectadas com eluato e diluídas antes da disseminção nas placas de TBAB (30 g/l de base de ágar de sangue triptose, Oxoid cat. n° CMO233B) suplementado com 0,2 g/l de ampicilina a fim de formar colônias simples para serem usadas na triagem por ELISA.
[00247] Sequenciamento de aglutinantes potenciais: Os clones individuais das diferentes faixas de seleção foram escolhidos para sequenciamento. A amplificação de fragmentos de gene e a análise de sequência de fragmentos de gene foram realizadas essencialmente como descrito no Exemplo 1.
[00248] Triagem por ELISA de variantes Z: As colônias simples contendo variantes Z (expressas como proteínas de fusão com ABD de variante Z como descrito no Exemplo 1) foram aleatoriamente escolhidas a partir dos clones selecionados da biblioteca maturada, e cultivadas em cultivos essencialmente como descrito no Exemplo 1. A preparação dos sobrenadantes periplásmicos e triagens de ELISA também foram realizadas essencialmente como descrito no Exemplo 1 com as duas exceções a seguir. Exceção 1: hIL-17A biotinilada foi usada em uma concentração de 0,4 nM. Exceção 2: a fração periplásmica da variante Z Z06282 (SEQ ID NO: 1206) da seleção primária foi usada como um controle positivo.
[00249] Análise de EC50 das variantes Z: Uma seleção de variantes Z de ligação de IL-17A foi submetida a uma análise de resposta contra uma série de diluição de b-hIL- 17A usando ELISA como descrito acima. A proteína alvo biotinilada foi adicionada em uma concentração de 6 nM e diluída passo a passo 1:3 até 8 pM. Como um controle de fundo, as variantes Z também foram ensaiadas sem proteína alvo adicionada. As amostras de periplasma contendo o aglutinante de IL-17A primário Z06282 (SEQ ID NO: 1206) foram incluídas como um controle positivo. Os dados foram analisados usando GraphPad Prism 5 e regressão não linear, e valores de EC50 (a metade da concentração máxima eficaz) foram calculados. RESULTADOS
[00250] Seleção de exibição de fago de variantes Z de ligação de IL-17A maturada: A seleção foi realizada em um total de 24 faixas paralelas contendo quatro ciclos cada. As diferentes faixas de seleção diferiram na concentração alvo, origem de espécie alvo (IL-17A humana ou IL-17A de murino), tempo de seleção, condições de lavagem e o pH do tampão de eluição. Os clones que se original das faixas de seleção usando apenas IL-17 humana e eluição em pH 2,2 foram mostrados para ter o melhor desempenho na tela ELISA.
[00251] Sequenciamento: Os clones aleatoriamente escolhidos foram sequenciados. Cada variante Z individual foi dada um número de identificação, Z#####, como descrito no Exemplo 1. No total, 932 novas moléculas de variante Z únicas foram identificadas. Para as 494 variantes de melhor desempenho na tela ELISA abaixo, as sequências de aminoácido dos 58 resíduos de aminoácido de variantes Z de comprimento são listadas na Figura 1 como SEQ ID NO: 1 a 3, SEQ ID NO: 11 a 16, SEQ ID NO: 28 a 31, SEQ ID NO: 36 a 63 e SEQ ID NO: 67 a 519. O motivo de ligação de IL-17As deduzido se estende do resíduo 8 para o resíduo 36 em cada sequência. As sequências de aminoácido dps 49 resíduos de aminoácido de polipeptídeos de comprimento previstos para constituir o pacote de três hélices completo dentro de cada uma dessas variantes Z se estendem do reíduo 7 para o resíduo 55.
[00252] Triagem por ELISA das variantes Z: Os clones obtidos após quatro ciclos de seleção foram produzidos em placas de 96 poços e triados para atividade de ligação de IL-17A humana usando ELISA. Todos os clones aleatoriamente escolhidos foram analisados. 494 das 932 variantes Z únicas foram encontradas para dar uma resposta de 2 x do controle em branco ou mais alto (0,15 a 2,0 AU) contra hIL-17A em uma concentração de 0,4 nM. Os sinais positivos foram mostrados para clones que se originam de todas as faixas de seleção. Os controles em branco tiveram absorvências de 0,055 a 0,075 AU.
[00253] Análise de EC50 de variantes Z: Um subconjunto de variantes Z foi selecionado com base no resultado do experimento de triagem por ELISA descrito acima (absorvência sobre 1.25 AU) ou com base na variação na sequência de aminoácido, e submetido a uma titulação alvo no formato ELISA. As amostras de periplasma foram incubadas com uma diluição em série de b-hIL-17A variando de 6 nM a 8 pM. Uma amostra de periplasma contendo Z06282 (SEQ ID NO: 1206) identificada na seleção primária foi incluída como um controle positivo. Os valores obtidos foram analisados e os valores de EC50 respectivos foram calculados (Tabela 6). Tabela 6: Valores de EC50 calculados da análise de titulação de ELISA
EXEMPLO 6 PROJETO E CONSTRUÇÃO DE UMA SEGUNDA BIBLIOTECA MATURADA DE VARIANTES Z DE LIGAÇÃO DE IL-17A
[00254] Nesse Exemplo, uma segunda biblioteca maturada foi construída essencialmente como descrito no Exemplo 4. A biblioteca foi usada para seleções de variantes Z de ligação de IL-17A adicional. MATERIAIS E MÉTODOS
[00255] Projeto de Biblioteca: A biblioteca foi baseada nas sequências de variantes Z de ligação de IL-17A selecionadas e caracterizadas no Exemplo 5. Na nova biblioteca, as 13 posições na estrutura molecular Z que variaram na biblioteca de maturação descrita nos Exemplos 4 e 5 foram inclinadas em direção a certos resíduos de aminoácido, de acordo com uma estratégia com base nas sequências de variante Z das 37 variantes de desempenho superior na análise de EC50 (Tabela 6). Um ligante de DNA foi gerado usado síntese de grupo dividido e ordenado do DNA 2.0. Ele continha os 147 bp a seguir, que codificam a hélice parcialmente randomizada 1 e 2 da sequência de aminoácido: 5’- AA ATA AAT CTC GAG GTA GAT GCC/GCA AAA TAC GCC AAA GAA/GAG NNN NNN NNN GCG NNN NNN GAG ATC/ATT NNN NNN TTA/CTG CCT/CCC AAC TTA/CTC ACC NNN NNN CAA/CAG NNN NNN GCC TTC ATC NNN AAA TTA NNN GAT GAC CCA AGC CAG AGC TCA TTA TTT A -3’ (SEQ ID NO: 1249; códons randomizados são indicados NNN) flanquados por locais de restrição XhoI e SacI. As distribuições teóricas de resíduos de aminoácido na nova biblioteca, incluindo seis posições de aminoácido variáveis (11, 14, 18, 25, 28 e 32) e sete posições de aminoácido constantes (9, 10, 13, 17, 24, 27 e 35) na estrutura molecular Z são dadas na Tabela 7. O tamanho da biblioteca teórica resultante é de 3,9 x 106 variantes.
[00256] Construção de Biblioteca: A biblioteca foi construída essencialmente como descrito no Exemplo 4 com a exceção a seguir: as células foram cultivadas durante a noite em 0,5 l de meio TSB-YE, suplementado com 2 % de glicose, 10 μg/ml de tetraciclina e 100 μg/ml de ampicilina.
[00257] Preparação de estoque de fago: Estoque de fago contendo a biblioteca de fagemídeo foi preparado nos frascos de agitação. As células de um estoque de gliceril contendo a biblioteca de fagemídeo foram inoculadas em 0,5 l de meio TSB-YE, suplementado com 2 % de glicose, 10 μg/ml de tetraciclina e 100 μg/ml de ampicilina. Os cultivos foram cultivados a 37°C até OD600 alcançar 0,6 e então aproximadamente 83 ml do cultivo foram infectados usando um excesso molar de 5 x de fago auxiliar M13K07 e incubados por 40 min a 37°C. As células no cultivo foram peletizadas por centrifugação, dissolvidas em meio TSB-YE, suplementado com 100 μg/ml de ampicilina, 25 μg/ml de canamicina e IPTG a 0,1 mM e cultivadas a 30 °C por 18 h. Após cultivo, as células foram peletizadas por centrifugação a 4.000 g e as partículas de fago restantes no meio foram então precipitadas duas vezes em PEG/NaCl, filtradas e dissolvidas em PBS e glicerol como descrito no Exemplo 1. Os estoques de fago foram armazenados a -80°C até uso na seleção. Tabela 7: Projeto de Biblioteca, segunda maturação RESULTADOS
[00258] Construção de Biblioteca: A nova biblioteca foi projetada com base em um conjunto de variantes Z de ligação de IL-17A com propriedades de ligação verificadas (Exemplo 5). O tamanho teórico da biblioteca projetada foi de 3,9 x 106 variantes Z. O tamanho real da biblioteca, determinada pela titulação após transformação em células ER2738 E. coli., foi de 1,4 x 109 transformantes.
[00259] A qualidade da biblioteca foi testada pelo sequenciamento de 96 transformantes e pela comparação de suas sequências reais com o projeto teórico. Os teores da biblioteca real comparada com a biblioteca projetada foram mostrados satisfatórios. Uma biblioteca maturada de aglutinantes potenciais para IL-17A foi assim construída com sucesso.
EXEMPLO 7 SELEÇÃO, TRIAGEM E CARACTERIZAÇÃO DE VARIANTES Z DA SEGUNDA BIBLIOTECA MATURADAMATERIAIS E MÉTODOS
[00260] Seleção de exibição de fago de variantes Z de ligação de IL-17A: A proteína alvo hIL-17A foi biotinilada como descrito no Exemplo 1. As seleções de exibição de fago, usando a segunda biblioteca maturada de moléculas de variante Z construídas como descrito no Exemplo 6, foram realizadas contra hIL-17A essencialmente como descrito no Exemplo 5 com as seguintes exceções. Exceção 1: as seleções foram realizadas na solução ou na fase sólida à RT. Exceção 2: o tempo para seleção foi de 60 min, 10 min ou 1 min no ciclo 1 e 30 min, 4 min ou 10 seg nos ciclos 2, 3 e 4. A seleção na solução foi seguida pela captura de complexos de fago alvo nas esferas de SA como descrito no Exemplo 1. Exceção 3: durante a seleção na fase sólida, o alvo foi capturado nas esferas de SA antes da seleção.
[00261] Uma visão geral da estratégia de seleção, resumindo as diferenças entre seleção na solução e seleção na fase sólida, bem como a estringência aumentada em ciclos subsequentes obtidos pelo uso de uma concentração alvo reduzida e u número de lavagens aumentada, é mostrada na Tabela 8.
[00262] As faixas 1-6 no ciclo 1 foram divididas no segundo ao quarto ciclos, resultando no total de sete faixas (1-1 a 6-1) no ciclo 2, oito faixas (1-1-1 a 6-1-1) no ciclo 3 e 16 faixas (1-1-1-1 a 6-1-1-1) no ciclo 4. As lavagens foram realizadas usando PBST a 0,1 % durante 1 min. Entretanto, uma das lavagens durou 15 min nas faixas 2-1-1, 3-1-1 e 5-1-1 no ciclo 3.
[00263] Após a última lavagem no ciclo 4, os complexos de fago alvo nas esferas de SA de cinco das faixas tracks (1-1-1-1, 1-2-1-2, 3-1-1-1, 4-1-1-1 e 5-1-1-2) foram divididos em duas partes iguais. As partículas de fago ligadas a partir da primeira parte foram imediatamente eluídas, enquanto a segunda parte foi submetida a uma lavagem durante aproximadamente 65 h antes da eluição das partículas de fago. O fago ligado foi eluído usando glicina-HCl, pH 2,2, como descrito no Exemplo 1.
[00264] A amplificação das partículas de fago de ciclos de seleção foi realizada essencialmente conforme descrito no Exemplo 1. Tabela 8: Visão geral da seleção da segunda biblioteca maturada
[00265] Sequenciamento de aglutinantes potenciais: Clones individuais das diferentes trilhas de seleção foram escolhidos para sequenciamento. A amplificação e a análise de sequência dos fragmentos de gene foram executadas essencialmente como descrito no Exemplo 1.
[00266] Triagem por ELISA das variantes Z: As únicas colônias que contêm variantes Z (expressas como proteínas de fusão com ABD da variante Z como descrito no Exemplo 1) foram escolhidas aleatoriamente dos clones selecionados da segunda biblioteca maturada de IL-17A e cultivadas em cultivos como descrito no Exemplo 1. A preparação dos sobrenadantes periplásmicos e as triagens por ELISA foram executadas essencialmente como descrito no Exemplo 1, com as duas exceções a seguir. Exceção 1: hIL-17A biotinilada foi usada em uma concentração de 0,2 ou 0,33 nM. Exceção 2: a fração periplásmica de Z10241 da variante Z (SEQ ID NO: 11), identificada nas seleções da primeira biblioteca maturada, foi usada como um controle positivo e o controle em branco foi criado trocando a etapa periplásmica pela adição de PBST 0,05 %.
[00267] Análise de EC50 das variantes Z: Uma seleção de variantes Z de ligação de IL-17A foi submetida a uma análise da resposta contra uma série de diluições de b- hIL-17A usando ELISA como descrito no Exemplo 5. A proteína biotinilada foi adicionada a uma concentração de 10 nM e diluída 1:2, oito vezes, em etapas seguidas por uma diluição 1:5 até 8 pM. Como um controle de base, as variantes Z foram também ensaiadas sem proteína-alvo adicionada. Uma amostra do periplasma que contém a variante Z previamente maturada Z10241 (SEQ ID NO: 11) foi incluída como controle positivo. Os dados foram analisados usando GraphPad Prism 5 e regressão não linear e foram calculados os valores de EC50. RESULTADOS
[00268] Seleção de exibição de fago das variantes Z de ligação de IL-17A de uma segunda biblioteca maturada: A seleção foi executada em um total de 16 trilhas paralelas contendo quatro ciclos cada. As trilhas de seleção diferiram em concentração alvo, tempo de seleção, condições de lavagem e se a seleção foi executada em solução ou em fase sólida.
[00269] Sequenciamento: Os clones aleatoriamente escolhidos foram sequenciados. Cada variante Z individual foi atribuída com um número de identificação, Z#####, como descrito no Exemplo 1. No total, 759 novas moléculas de variante Z únicas foram identificadas.
[00270] Para as 704 variantes com melhor desempenho na triagem por ELISA abaixo, a sequência de aminoácidos dos 58 resíduos de aminoácido de comprimento das variantes Z é apresentada na Figura 1 e na listagem de sequências como SEQ ID NO: 5 a 10, SEQ ID NO: 17 a 27, SEQ ID NO: 32 a 35, SEQ ID NO: 64 a 66 e SEQ ID NO: 520 a 1199. O motivo de ligação de IL-17As se estende do resíduo 8 ao resíduo 36 em cada sequência. A sequência de aminoácidos dos 49 resíduos de aminoácido de comprimento dos polipeptídeos preditos constitui o pacote completo de três hélices dentro de cada uma dessas variantes Z se estende do resíduo 7 ao resíduo 55.
[00271] Triagem por ELISA das variantes Z: Os clones obtidos após quatro ciclos de seleção foram produzidos em placas de 96 poços e triados para atividade de ligação de hIL-17A usando ELISA. Todos os clones aleatoriamente escolhidos foram analisados. 704 das 759 únicas variantes Z foram constatados dar uma resposta de 2 x os controles em branco ou mais alto (0,22 a 2,2 AU) contra hIL-17A a uma concentração de 0,2 ou 0,33 nM. Os sinais positivos foram colhidos para os clones que originam de todas as trilhas de seleção. A resposta média dos controles em branco foi 0,11 AU, com base em um conjunto representativo de placas.
[00272] Análise de EC50 das variantes Z: Um subconjunto de variantes Z de ligação de IL-17A foi selecionado com base no resultado no experimento de ELISA descrito acima (variantes Z com absorvências na resposta do controle positivo Z10241, SEQ ID NO: 11) e submetido a uma titulação alvo no formato ELISA como descrito no Exemplo 5. Os valores obtidos foram analisados e seus respectivos valores de EC50 foramcalculados (Tabela 9). Tabela 9: Valores de EC50 calculados a partir da análise de titulação de ELISA
EXEMPLO 8 CARACTERIZAÇÃO IN VITRO DE UM SUBCONJUNTO DE VARIANTES Z MATURADAS DE LIGAÇÃO DE IL-17A MATERIAIS E MÉTODOS
[00273] Subclonagem e produção das variantes Z com um marcador His6 N-terminal foi executada como descrito no Exemplo 2. Uma variante adicional, His6-Z15167 (SEQ ID NO: 4), foi criada através de mutagênese loco-dirigida de His6-Z10532 (SEQ ID NO: 1) resultando na substituição de D na posição 25 por A. A produção de His6-Z15167 foi executada como descrito acima para as outras variantes Z.
[00274] Análise por espectroscopia de dicroismo circular (CD) : As variantes Z marcadas com His6 purificadas foram diluídas a 0,5 mg/ml em PBS. Para cada variante Z diluída, um espectro de CD a 250 a 195 nm foi obtido a 20°C. Além disso, uma medição de temperatura variável (VTM) foi executada para determinar a temperatura de fusão (Tm). Na VTM, a absorbância foi medida a 221 nm enquanto que a temperatura foi elevada de 20 para 90°C, com um declive de temperatura de 5°C/min. Um espectro de CD novo foi obtido a 20°C após o procedimento de aquecimento a fim de estudar a habilidade de redobramento das variantes Z. As medições de CD foram executadas em um espectropolarímetro Jasco J-810 (Jasco Scandinavia AB) utilizando-se uma célula com um comprimento de trajetória óptica de 1 mm.
[00275] Triagem por ELISA de ligação de IL-17: placas de meia área de 96 poços (Costar, 3690) foram revestidas durante a noite a 4°C com hIL-17A a 1 μg/ml em PBS em um volume de 50 μl/poço. No dia da análise, a placa foi enxaguada duas vezes em água de torneira e depois bloqueada com PBS + 2 % BSA (Sigma) por 2 h. Z10241 (SEQ ID NO: 11) foi usado como um padrão e titulado em uma série de diluição de 3 vezes (300 a 0,005 ng/ml) e as outras variantes Z foram acrescentadas em quatro diluições diferentes à placa ELISA revestida (50 μl/poço) e incubadas por 1,5 h em RT. A placa foi lavada 4 vezes em uma lavadora ELISA automatizada e 2 μg/ml (50 μl/poço) de um anticorpo anti-Z de cabra foram adicionados. Após incubação de 1 hora, a placa foi lavada e 50 μl de IgG-HRP de anticabra (DAKO) diluídos 5000 vezes foram adicionados por poço. A placa foi desenvolvida após mais 1 h de incubação, lavada com 50 μl de TMB (Thermo Fisher, 34021) por poço e a reação foi parada com 50 μl de 2 M de H2SO4. As placas foram lidas em uma leitora de multimarcação (Victor3, Perkin Elmer).
[00276] Análise cinética de Biacore: As constantes cinéticas (kon e koff) e as afinidades (KD) para IL-17A humana foram determinadas para 27 variantes Z marcadas com His6. A hIL-17A foi imobilizada na célula de fluxo na camada de dextrana carboxilada de uma superfície de chip CM5 (GE Healthcare, cat. n° BR100012). A imobilização foi executada usando acoplamento químico de amina de acordo com o protocolo do fabricante e usando HBS-EP (0,01 M de HEPES pH 7,4, 0,15 M de NaCl, 3 mM de EDTA, 0,005 % v/v de tensoativo P20, GE Healthcare, cat. n° BR100188) como tampão de corrida. Uma superfície de célula de fluxo no chip foi ativada e desativada para uso como controle durante injeções de analito. No experimento cinético, HBS-EP era usado como tampão de corrida e a taxa de fluxo era 50 μl/min. Os analitos, isto é, as variantes Z, eram cada diluídos em tampão de HBS-EP a concentrações finais de 100 nM, 20 nM e 4 nM e injetou para 4 min, seguidos por dissociação em tampão de corrida por 8 min. Após 8 min de dissociação, as superfícies foram regeneradas com duas injeções de HCl a 10 mM. As constantes cinéticas foram calculadas a partir dos sensorgramas usando o modelo Langmuir 1:1 do software BiaEvaluation 4.1 (GE Healthcare).
[00277] Análise da Especificidade de Ligação por Biacore: As interações de três variantes Z de ligação de IL- 17A marcadas com His6 (Z10508 (SEQ ID NO: 2), Z10532 (SEQ ID NO: 1) e Z15167 (SEQ ID NO: 4)) com hIL-17A (SEQ ID NO: 1226), hIL-17F (SEQ ID NO: 1228; R&D Systems, cat. n° 1335-IL/CF) e o heterodímero de IL-17A/F humana (R&D Systems, cat. n° 5194- IL-025/CF) foram analisadas em um instrumento Biacore 2000. As três variantes de IL-17 diferentes foram imobilizadas nas células de fluxo na camada de dextrana carboxilada de uma superfície de chip CM5. A imobilização foi executada usando acoplamento químico de amina de acordo com o protocolo do fabricante e usando HBS-EP como tampão de corrida. Uma superfície da célula de fluxo no chip foi ativada e desativada para uso como controle durante as injeções de analito. No experimento de ligação, HBS-EP foi usado como tampão de corrida e a taxa de fluxo foi de 50 μl/min. Os analitos, isto é, as variantes Z, cada um foi diluído em tampão de corrida de HBS- EP para concentrações finais de 4, 20, 100 e 500 nM e injetados por 4 min. Após 15 min de dissociação, as superfícies foram regeneradas com quatro injeções de 10 mM de HCl. Os resultados foram analisados usando o software BiaEvaluation.
[00278] Bloqueio da produção de IL-6 induzida por IL-17A no ensaio de NHDF: O ensaio de NHDF e a quantificação pelo ensaio ELISA específico para IL-6 foi executado essencialmente como descrito no Exemplo 3. Em resumo, no dia antes do experimento, 5000 células foram semeadas por poço em placas de cultura de 96 poços de meia área em 100 μl. No dia antes do experimento, as diluições de 36 variantes Z específicas para IL-17A foram preparadas em uma placa de 96 poços separada. As variantes Z foram tituladas em etapas de três vezes de 4690 nM a 0,08 nM em um meio contendo 0,9 nM de hIL-17A. Uma curva padrão de hIL-17A (6,2 a 0,0001 nM) foi preparada, como também controles contendo meio com 0,9 nM de hIL-17A ou meio sozinho. RESULTADOS
[00279] Análise de CD: Os espectros de CD determinados para as variantes Z de ligação de IL-17A com um marcador de His6 mostraram que cada tinha uma estrutura α- helicoidal a 20°C. Os resultados das medições de temperatura variável, nas quais as temperaturas de fundição (Tm) foram determinadas, estão mostrados na Tabela 10. Dobramento reversível foi visto para todas as variantes Z de ligação de IL-17A ao sobrepor os espectros medidos antes e após aquecer para 90°C.
[00280] Análise da capacidade de ligação de IL-17A por ELISA: Moléculas das variantes Z marcadas com Hise purificadas do primeiro e do segundo ciclos de maturação foram triadas para sua capacidade de ligar IL-17A em um ensaio de ELISA. Os resultados estão mostrados na Figura 3, como porcentagem da capacidade de ligação, comparada à variante Z10241.
[00281] Análise cinética por Biacore: As interações das 28 variantes Z de ligação de IL-17A marcadas com His6 com hIL-17A foram analisadas em um instrumento Biacore injetando várias concentrações das variantes Z em uma superfície contendo IL-17A imobilizada. Um sumário dos parâmetros cinéticos (KD, ka (kon ) e kd (koff)) para a ligação das variantes Z a hIL-17A usando um modelo de interação 1:1 é dado na Tabela 11. Tabela 10: Temperaturas de fusão (Tm)
[00429] Análise da especificidade de ligação de Biacore: A ligação das três variantes Z de ligação de IL-17A marcadas com His6 (Z10508, Z10532 e Z15167) para hIL-17A, hIL- 17F e hIL-17A/F foi testada em um instrumento Biacore injetando as variantes Z em superfícies que contêm as variantes IL-17. Os níveis de imobilização dos ligantes nas superfícies foram 657 RU, 977 RU e 770 RU de IL-17A, IL-17F e IL-17A/F, respectivamente. Todas as variantes Z testadas mostraram ligação a IL-17A humana e ligação mais fraca a IL-17A/F, enquanto que nenhuma ligação a IL-17F pôde ser detectada. As curvas resultantes, das quais as respostas de uma superfície em branco foram subtraídas, estão exibidas na Figura 4. Z15167 mostrou a curva de associação mais rápida a IL-17A humano.
[00430] Bloqueio da produção de IL-6 induzida por IL-17A no ensaio de NHDF: As variantes Z marcadas com Hise purificadas do primeiro e do segundo ciclos de maturação foram triadas para sua capacidade de bloquear a produção de IL-6 induzida por IL-17A no ensaio de NHDF. Os resultados do ensaio de NHDF mostraram que todos os aglutinantes amadurecidos testados tiveram um aumento da capacidade de bloqueio específica para IL-17A comparado ao aglutinante primário His6- Z06282. Um gráfico ilustrando os perfis de inibição típicos de uma seleção de aglutinantes da primeira biblioteca de maturação é mostrado na Figura 5, e os valores de IC50 calculados para todos os aglutinantes analisados estão mostrados na Tabela 12. Tabela 11: Parâmetros cinéticos para ligação das variantes Z a hIL-17A A Tabela 12: Valores de IC50 para as variantes Z maturadas
EXEMPLO 9 PRODUÇÃO DE POLIPEPTÍDEOS DE Z-ABD-Z DE LIGAÇÃO DE IL-17
[00431] IL-17A é uma citocina homodimérica que possui dois sítios de ligação do receptor. Especulou-se que um polipeptídeo que compreende duas metades de uma variante Z de ligação de IL-17A da presente revelação bloquearia IL-17A mais eficientemente que um polipeptídeo que compreende uma tal porção. Este Exemplo descreve o procedimento geral para subclonagem e produção dos polipeptídeos que compreende duas variantes Z em fusão com a variante do domínio de ligação de albumina PP013 (SEQ ID NO: 1224) no formato geral Z-[L1]-ABD- [L2]-Z onde [L1] e [L2] são ligantes que separam as metades Z e ABD.MATERIAIS E MÉTODOS
[00432] Subclonagem dos polipeptídeos de Z-[L1]- ABD-[L2]-Z com diferentes comprimentos de ligantes [L1] e [L2] : O DNA de Z06282 (SEQ ID NO: 1206), Z10241 (SEQ ID NO: 11) e Z10532 (SEQ ID NO: 1) foi amplificado do vetor de biblioteca pAY02592 por PCR usando DNA polimerase Pfu Turbo (Agilent Technologies, cat. n° 600254) com pares de iniciador adequados. Os construtos de Z-[L1]-ABD-[L2]-Z foram gerados pela ligação de DNA que codifica cada porção no vetor de expressão pET26b(+) (Novagen, Madison, WI) em três etapas de clonagem subsequentes usando-se T4 DNA ligase (Fermentas, cat. n° EL0011). O DNA que codifica as três metades foi separado pelo DNA que codifica os ligantes hibridados com número diferente de repetições de (GGGGS)n, flanqueados pelos sítios de enzima de restrição. Os construtos codificados pelos vetores de expressão foram Z#####-[GAP-(G4S)n-TS]-PP013-[GT-(G4S)n-PR]-Z#####, onde cada n individualmente é 1 a 4, e como ainda especificado na Tabela 13. Tabela 13: Variantes Z diméricas fundidas a ABD por meio de diferentes comprimentos [L1] e [L2]
[00433] Sítios de restrição (I) a (IV) no DNA que codifica Z#####-[(I)-(G4S)n-(II)]-PP013-[(III)-(G4S)n-(IV)]- Z##### são cliváveis com as enzimas de restrição AscI (I), SpeI (II), KpnI (III) e SacII (IV), respectivamente.
[00434] Subclonagem dos polipeptídeos de Z-[L1]- ABD-[L2]-Z com um mínimo ligante [L1] : DNA que codifica as variantes Z diméricas adicionais compreendendo Z06282 (SEQ ID NO: 1206) mas com um ligante mínimo [L1] foi gerado utilizando- se técnicas padrões de biologia molecular. Os construtos codificados pelos vetores de expressão foram Z06282-VDGS- PP013-GT-(G4S)n-PR-Z06282 e como ainda especificado na Tabela 14.
[00435] Os genes que codificam Z12876 (SEQ ID NO: 1218), Z14253 (SEQ ID NO: 1219), Z14254 (SEQ ID NO: 1220) e Z14255 (SEQ ID NO: 1221) (correspondendo a Z10241 (SEQ ID NO: 11), Z10532 (SEQ ID NO: 1), Z10508 (SEQ ID NO: 2) e Z10863 (SEQ ID NO: 3), respectivamente, mas iniciando com os resíduos de aminoácido AE em vez de VD) foram amplificados por PCR usando Pfu DNA polimerase de Turbo com pares de iniciador adequados. Os construtos de Z-[L1]-ABD-[L2]-Z foram gerados mediante ligação de cada fragmento no vetor de expressão pET26b(+) em três etapas de clonagem subsequentes usando T4 DNA ligase. O DNA que codifica as três metades foi separado através dos ligantes adicionalmente modificados por mutagênese dirigida utilizando-se as técnicas padrões de biologia molecular. Os construtos codificados pelos vetores de expressão foram Z####-[VDGS]-PP013-[GT-G4S-PK]-Z#### e Z#####- [ASGS]-PP013-[GT-G4S]-Z#####, e como ainda especificou na Tabela 14. Tabela 14: Variantes Z diméricas fundidas a ABD por meio de um mínimo ligante [L1] Δ: deleção do resíduo de aminoácido indicado
[00436] Cultivo: As células BL21(DE3) de E. coli (Novagen) foram transformadas com os plasmídeos contendo o fragmento de gene de cada respectivo polipeptídeo de Z-ABD-Z e cultivadas a 37°C em 800 ou 1000 ml de meio TSB-YE suplementado com 50 μg/ml de canamicina. Para induzir a expressão de proteína, IPTG foi acrescentado a uma concentração final de 0,2 mM a OD600 = 2 e o cultivo foi incubado a 37°C por mais 5 h. As células foram colhidas através de centrifugação.
[00437] Purificação de polipeptídeos de Z-ABD-Z de ligação de IL-17A: Péletes celulares foram ressuspensos em tampão de TST (25 mM de Tris-HCl, 1 mM de EDTA, 200 mM de NaCl, 0,05 % de Tween 20, pH 8,0) suplementado com Benzonase® (Merck). Após rompimento da célula através de sonicação e clarificação por meio de centrifugação, cada sobrenadante foi aplicado sobre uma coluna acondicionada com agarose e imobilizada com um ligante anti-ABD (produzido no local). Após lavar com tampão TST e 5 mM de tampão NH4Ac pH 5,5, os polipeptídeos de Z-ABD-Z foram eluídos com 0,1 M de HAc. Acetonitrila (ACN) foi acrescentada às frações eluídas a uma concentração final de 10 % e as amostras foram carregadas nas colunas 15RPC SOURCE (GE Healthcare), previamente balanceadas com solvente RPC A (0,1 % de TFA, 10 % de ACN, 90 % de água). Após lavagem da coluna com solvente RPC A, as proteínas ligadasforam eluídas com um gradiente linear do solvente RPC A para o solvente RPC B (0,1 % de TFA, 80 % de ACN, 20 % de água). As frações que contêm os polipeptídeos de Z-ABD-Z puros foram identificadas por análise de SDS-PAGE e agrupadas. Após a purificação de RPC, o tampão do fundo geral foi trocado para PBS (2,68 mM de KCl, 137 mM de NaCl, 1,47 mM de KH2PO4, 8,1 mM de Na2HPO4, pH 7,4) usando-se as colunas Sephadex G-25 (GE Healthcare). Por fim, as variantes Z-ABD-Z foram purificadas em colunas vermelhas de EndoTrap® (Hyglos) para assegurar baixo teor de endotoxina.
[00438] Concentrações de proteína foram determinadas medindo a absorbância a 280 nm, usando um espectrofotômetro NanoDrop® ND-1000 e o coeficiente de extinção da respectiva proteína. Pureza foi analisada por tingimento de SDS-PAGE com Coomassie Blue, e a identidade de cada variante de Z-ABD-Z purificada foi confirmada por análise de HPLC-MS. RESULTADOS
[00439] Cultivo e purificação: As variantes Z de ligação de IL-17A em fusão com ABD foram expressas como produtos de gene solúveis em E. coli. Análise de SDS-PAGE de cada preparação de proteína final mostrou que estas predominantemente continham o polipeptídeo de Z-ABD-Z de ligação de IL-17A desejado. A identidade correta e o peso molecular de cada polipeptídeo de Z-ABD-Z foram confirmados por análise de HPLC-MS.
EXEMPLO 10 SOLUBILIDADE DOS POLIPEPTÍDEOS DE Z-ABD-Z
[00440] A solubilidade de três polipeptídeos de Z- ABD-Z em tampão fisiológico foi investigada por concentrações sucessivas das amostras com o uso de ultrafiltração, seguido por medições da concentração por leituras de absorbância a 280 nm e inspeção visual das amostras. MATERIAIS E MÉTODOS
[00441] Os polipeptídeos de Z-ABD-Z ZAZ3363 (SEQ ID NO: 1244), ZAZ3364 (SEQ ID NO: 1245) e ZAZ3422 (SEQ ID NO: 1247) foram diluídos em PBS, pH 7,4, para 2,5 mg/ml. 12 unidades de filtro centrífugo Amicon Ultra com um corte de 3 kDa (Millipore, cat. n° UFC800324) foram pré-enxaguados com PBS através de centrifugação a 4000 g por 10 min em uma centrífuga de rotor de caçamba móvel. Os concentradores foram esvaziados, e 4 ml de cada polipeptídeo de Z-ABD-Z foram acrescentados a um primeiro grupo de três unidades de filtro centrífugo diferentes. A centrifugação foi executada a 4000 g, 20°C, por 13 a 16 min, resultando em aproximadamente 1 ml de concentrado. Uma amostra de 20 μl foi removida de cada concentrado (amostra de UF 1) para análise adicional e o resto dos volumes da amostra foi transferido para um segundo conjunto de três unidades de filtro centrífugo. A centrifugação e a remoção da amostra foram repetidas três vezes com tempos de giro de 8 a 10 min, 7 min e 13 min, respectivamente, (as amostras de UF 2, 3 e 4, respectivamente). Foram executadas leituras de absorbância usando um Espectrofotômetro NanoDrop® ND-1000 e diluindo as amostras de UF 1 a 4 em PBS 3, 6, 12 e 24 vezes, respectivamente. As concentrações foram calculadas usando o coeficiente de extinção teórico 1 Abs280=0,612 mg/ml (o mesmo para todos os três polipeptídeos de Z-ABD-Z). Leituras de absorbância dos filtrados não diluídos foram também realizadas. RESULTADOS
[00442] As concentrações determinadas pelas leituras de absorbância a 280 nm após cada etapa centrífuga estão mostradas na Tabela 15. Nenhum agregado foi detectado por inspeção visual dos concentrados. Desse modo, a solubilidade de ZAZ3363, ZAZ3364 e ZAZ3422 foi determinada ser pelo menos 60 mg/ml em PBS, pH 7,4. Leituras de absorbância dos filtrados não diluídos mostraram concentrações muito próximas a 0 mg/ml. Tabela 15: Concentração após concentração sucessiva das amostras de Z-ABD-Z
EXEMPLO 11 ANÁLISE DE ESPÉCIES CRUZADAS DE LIGAÇÃO POR BIACORE MATERIAIS E MÉTODOS
[00443] A interação dos polipeptídeos de Z-ABD-Z ZAZ3363 (SEQ ID NO: 1244), ZAZ3364 (SEQ ID NO: 1245) e ZAZ3365 (SEQ ID NO: 1246) com hIL-17A e IL-17A de macaco cinomolgo (cIL-17A, SEQ ID NO: 1229; Evitria, ordem usual) como também a interação de ZAZ3220 (SEQ ID NO: 1236) com hIL-17A e IL-17A de macaco reso (rmIL-17-A, SEQ ID NO: 1230; Cusabio, cat. n° CSB-EP011597MOV) foram analisadas em um Biacore 2000. HSA foi imobilizado na célula de fluxo na camada de dextrana carboxilada de uma superfície de chip CM5. A imobilização foi executada usando acoplamento químico de amina de acordo com o protocolo do fabricante e usando HBS-EP como tampão de corrida. Os níveis de imobilização de HSA nas superfícies foram 953 RU (usado para ZAZ3363, ZAZ3364 e ZAZ3365) e 493 RU (usado para ZAZ3220), respectivamente. Uma superfície de célula de fluxo no chip foi ativada e desativada para uso como controle durante as injeções de analito. Nos experimentos de ligação, HBS-EP foi usado como tampão de corrida e a taxa de fluxo foi de 30 μl/min. ZAZ3363, ZAZ3364 e ZAZ3365 foram diluídos em tampão de corrida de HBS-EP para uma concentração final de 200 nM e injetados por 5 min, seguido por injeções das variantes de IL- 17A. ZAZ3220 foi diluído em tampão de corrida de HBS-EP para uma concentração final de 500 nM e injetado por 4 min seguido por injeções das variantes de IL-17A. hIL-17A e cIL-17A cada uma foi diluída em tampão de corrida de HBS-EP para concentrações finais de 2,5, 10 e 40 nM e injetadas por 5 min em superfícies com ZAZ3363, ZAZ3364 e ZAZ3365 capturadas em HSA. Após 10 min de dissociação, a superfície foi regenerada com duas injeções de 10 mM de HCl. hIL-17A e rmIL-17A foram diluídos em tampão de corrida de HBS-EP para concentrações finais de 0,1, 0,3, 0,9, 2,7 e 8,1 nM e 2,7, 8,1, 24,3, 72 e 216 nM, respectivamente, e injetados por 6 min nas superfícies com ZAZ3220 capturado em HSA. Após 5 min de dissociação, a superfície foi regenerada com duas injeções de 10 mM de HCl. Os resultados foram analisados usando o software BiaEvaluation. RESULTADOS
[00444] Ligação de hIL-17A e cIL-17A a ZAZ3363, ZAZ3364 e ZAZ3365, hIL-17A e rmIL-17A a ZAZ3220 foram testados em um instrumento Biacore injetando os polipeptídeos de Z-ABD- Z em uma superfície que contém HSA seguido por injeções das variantes de IL-17A. Todas as variantes Z testadas mostraram ligação às variantes de IL-17A testadas, isto é, ZAZ3363, ZAZ3364 e ZAZ3365 mostraram ligação a IL-17A humana e de macaco cinomolgo (Figura 6) e ZAZ3220 a IL-17A humana e de macaco reso.
EXEMPLO 12 ANÁLISE DE ESPECIFICIDDE DE LIGAÇÃO POR BIACORE
[00445] Nesse Exemplo, as especificidades de dois polipeptídeos Z-ABD-Z foram testadas pela análise de sua interação potencial com um conjunto de proteínas da família de IL-17, com outras interlecuinas e com outras proteínas de plasma abundantes. O mesmo conjunto de proteínas de analito também foram analisadas por sua interação potencial com a variante de ABD PEP07843. MATERIAIS E MÉTODOS
[00446] A interação de ZAZ3363 (SEQ ID NO: 1244) ou ZAZ3422 (SEQ ID NO: 1247) com painéis de 24 ou 12 proteínas diferentes (especificadas na Tabela 16), respectivamente, foi analisada em um instrumento Biacore 2000. HSA e a variante de ABD PEP07843 (SEQ ID NO: 1225, correspondendo a PP013 (SEQ ID NO: 1224) com uma extensão de terminal N de GSS) foram imobilizados em uma superfície de CM5 e uma superfície em branco foi preparada como descrito no Exemplo 11. Os níveis de imobilização de ligante nas superfícies foram 1315 RU e 99 RU de HSA e PEP07843, respectivamente, para o chip usado nas corridas ZAZ3363, e 791 RU e 100 RU de HSA e PEP07843, respectivamente, para o chip usado nas corridas ZAZ3422. No experimento de ligação, HBS-EP foi usado como tampão de execução e a taxa de fluxo foi de 30 μl/min. ZAZ3363 e ZAZ3422 foram diluídos em HBS-EP ou HBS-EP suplementado com NaCl a 500 mM para uma concentração final de 200 nM e injetados por 7 min seguido pelas injeções dos analitos. Os analitos, isto é, os painéis de 24 ou 12 proteínas diferentes, foram cada diluídosem HBS-EP ou HBS-EP suplementado com NaCl a 500 mM para concentrações finais de 0,4 a 250 nM e injetadas por 5 min. Após 7 (ZAZ3363) ou 10 (ZAZ3422) min de dissociação, as supefícies foram regenradas com quatro (ZAZ3363) ou cinco (ZAZ3422) injeções de NaOH a 10 mM e duas injeções de HCl a 10 mM. Os resultados foram analisados usando o software BiaEvaluation. Tabela 16: Proteínas de analito testadas com ZAZ3363 e ZAZ3422
[00447] Fornecedores: 1Peprotech; 2R&D Systems; proteínas e analito. As únicas interações detectadas para ZAZ3363 e ZAZ3422 foram ligação forte por hIL-17A e ligação mais fraca por hIL-17A/F, como esperada e em linha com os resultados apresentados no Exemplo 8. As proteínas de analito também foram avaliadas para sua interação potencial com a variante de ABD PEP07843, mas não foram detectadas interações. Assim, os polipeptídeos Z-ABD-Z parecem ser altamente específicos. RESULTADOS
[00448] Uma especificidade de ZAZ3363 e ZAZ3422 foi testada em um instrumento Biacore através da investigação de sua interação com 24 ou 12 proteínas de analito, respectivamente. Os polipeptídeos Z-ABD-Z foram injetados sobre as superficies contendo HSA seguido pela injeção das
EXEMPLO 13 MEDIÇÕES CINÉTICAS DE COMPLEXOS DE Z-ABD-Z, IL-17A E HSA USANDO KINEXA®
[00449] As limitações técnicas de SPR para determinar precisamente os parâmetros cinéticos para interações de alta afinidade e a complexidade mais alta de determinação da afinidade entre dois alvos diméricos por SPR justificou o suo de tecnologia de Ensaio de Exclusão Cinética (KinExA®) para adicionalmente analisar a ligação de polipeptídeos Z-ABD-Z no complexo com HSA a IL-17A, bem como a ligação de polipeptídeos Z-ABD-Z sozinhos, ou em complexo com IL-17A, para HSA. O KinExA® mede a afinidade e cinética de ligação de equilíbrio entre moléculas não modificadas na fase de solução (Darling e Brault, 2004. Assay e Drug Dev Tech 2(6):647-657) MATERIAIS E MÉTODOS
[00450] Os polipeptídeos Z-ABD-Z ZAZ3220 (SEQ ID NO: 1236), ZAZ3363 (SEQ ID NO: 1244) e ZAZ3422 (SEQ ID NO: 1247), bem como HSA (Novozymes, cat. n° 230-005), IL-17A humana (Peprotech, cat. n° 200-17), biotinilada (como descrito no Exemplo 1) IL-17A humana, anticorpo anti-HSA monoclonal de camundongo (Abcam, cat. n° 10241) e um anticorpo anti-Z policlonal de cabra produzido em casa foram enviados para Sapidyne Instruments Inc (Boise, Idaho, USA) que realizou as medições e análises de KinExA®.
[00451] Ligação de Z-ABD-Z/HSA para IL-17A: Para determinação da afinidade, isto é, KD, o respectivo polipeptídeo Z-ABD-Z, no complexo com HSA, foi usado como um parceiro de ligação constante (CBP) e IL-17A foi usada como titulante. A análise de dados foi realizada usando o KinExA® Pro software e aplicando uma análise de mínimos quadrados para ajustar as soluções ideais para o KD e a Concentração de Ligação Ativa (ABC) local para uma curva representativa de uma interação bimolecular reversível 1:1.
[00452] Para determinação de ka, a análise de curva de ligação direta, usando a mesma IL-17A imobilizada como o reagente de captura para experrimentos cinéticos como para experimentos de equilíbrio. A quantidade de Z-ABD-Z/HSA livre na amostra foi medida pré-equilíbrio, rendendo pontos de dados que monitorou a diminuição no Z-ABD-Z/HSA livre conforme a amostra se moveu para equilíbrio.
[00453] Ligação de Z-ABD-Z e Z-ABD-Z/IL-17A para HSA: O polipeptídeo Z-ABD-Z ZAZ3363 foi analisado adicionamente para ligação ao na presença ou ausência de IL- 17A. Para determinação de KD, ZAZ3363, livre ou em complexo com IL-17A, foi usado como um parceiro de ligação constante (CBP) e HSA foi usado como titulante. A análise de dados foi realizada usando o software KinExA® Pro como descrito acima.
[00454] Para determinação de ka, a análise de curva de ligação direta foi aplicada, usando o mesmo HSA imobilizado tanto como o reagente de captura para experimentos cinéticos quando para experimentos de equilíbrio. A quantidade de ZAZ3363/IL-17A, na amostra foi medida pré-equilíbrio, rendendo pontos de dados que monitoraram a diminuição na ZAZ3363/IL-17A livre como a amostra movida em direção ao equílibrio. RESULTADOS
[00455] Em um primeiro conjunto de medições de KinExA®, os polipeptídeos Z-ADB-Z ZAZ3220, ZAZ3363 e ZAZ3422, respectivamente, em complexo com HSA mostraram ligar IL-17A com uma afinidade excessivamente alta, com valores de KD na faixa de subpicomolar para femtomolar. Os parâmetros cinéticos calculados ao assumer uma ligação monovalente entre esses polipeptídeos Z-ABD-Z e IL-17A dimérica são mostrados na Tabela 17.
[00456] Em um segundo conjunto de medições de KinExA®, a interação entre ZAZ3363, livre ou em complexo com IL-17A, e HSA foi medida. Os parâmetros cinéticos calculados dessas análises são mostrados na Tabela 18. A afinidade de ZAZ3363 para HSA não foi significativamente afetada pela presença de IL-17A.
[00457] Para resumir, as medições usando a tecnologia KinExA® indicaram uma afinidade excessivamente alta de polipeptídeos Z-ABD-Z para IL-17A. O KD medido de < 0,33 pM é superior às afinidades relatadas para dois dos comparadores clinicamente mais avançados secukinumabe (KD = 122 pM; WO2006/013107 e WO2012/125680) e ixekizumabe (KD= 2 pM; WO2007/070750). Além disso, a ligação simultânea tanto para IL-17A quanto albumina foi demonstrada, isto é, ambas as funções de ligação estão intactas na proteína de fusão Z-ABD- Z. Tabela 17: Parâmetros cinéticos para polipeptídeos Z-ABD-Z que se ligam à IL-17A * 95% de intervalo de confiança ** 95% de intervalo de confiança para KD não foram resolvidos Tabela 18: Parâmetros cinéticos para um polipeptídeo Z-ABD-Z que se liga à HSA * 95% de intervalo de confiança
EXEMPLO 14 CARACTERIZAÇÃO DE POLIPEPTÍDEOS Z-ABD-Z NO ENSAIO DE NHDF MATERIAIS E MÉTODOS
[00458] Bloqueio de Produção de IL-6 induzida por IL-17A no ensaio de NHDF: As células NHDF (Lonza, cat. no. CCcomprimentos de ligante entre as porções Z e ABD (ZAZ3174 (SEQ ID NO: 1233), ZAZ3175 (SEQ ID NO: 1234), ZAZ3176 (SEQ ID NO: 1235), ZAZ3220 (SEQ ID NO: 1236), ZAZ3221 (SEQ ID NO: 1237), ZAZ3234 (SEQ ID NO: 1238), ZAZ3235 (SEQ ID NO: 1239), ZAZ3236 (SEQ ID NO: 1240), ZAZ3237 (SEQ ID NO: 1241), ZAZ3269 (SEQ ID NO: 1242) e ZAZ3270 (SEQ ID NO: 1243)) foram preparadas em uma placa de 96 poços separada. Os polipeptídeos Z-ABD-Z foram titulados em três etapasa de 190 nM a 0,003 nM em meio contendo hIL-17A aq 0,9 nM e HSA a 8 μM. Uma curva padrão de IL-17A também foi preparada (6,2 a 0,0001 nM), bem como controles contendo meio com IL-17A a 0,9 nM ou meio sozinho. O meio na placa com células NHDF cultivadas durante a noite foi descartado e 100 μl/poço da amostra foram transferidos para a placa de célula, que foi colocada em uma incubadora a 37°C por 18 a 24 h. No dia seguinte, o teor de IL-6 nos sobrenadantes foi quantificado usando ELISA específico para IL-6 como descrito no Exemplo 3. Os polipeptídeos Z-ABD-Z adicionais (ZAZ3363 (SEQ ID NO: 1244), ZAZ3364 (SEQ ID NO: 1245), ZAZ3365 (SEQ ID NO: 1246) e ZAZ3422 (SEQ ID NO: 1247)) foram analisados em ensaios de NHDF subsequentes, essencialmente como descrito acima, mas usando uma linhagem de célula NHDF de ATCC (cat. n° PSC-201-012). As habilidades de bloqueio desses polipeptídeos Z-ABD-Z também foram analisadas após incubação dos polipeptídeos a 40°C por 2 e 4 semanas. RESULTADOS
[00459] Os polipeptídeos Z-ABD-Z foram investigados por sua capacidade de bloquear a produção de IL- 6 induzida por IL-17A no ensaio de NHDF. Primeira, foi visto que o formato Z-ABD-Z aumentou a capacidade de bloqueio significativamente comparada ao formato monomérico de His6-Z,como visto na Figura 7A onde as curvas inibitórias para His6- Z10241 e ZAZ3220 (compreendendo Z10241) são exibidas. O formato da curva para ZAZ3220 sugere que o limite de detecção para esse ensaio de célula é alcançado, com um efeito de inibição um para um do ZAZ3220, e é provável que o polipeptídeo Z-ABD- Z tem um efeito inibitório ainda melhor que pode ser apreciado para esse experimento. É contemplado que a potência de ZAZ3220 é aumentada ao limite de ensaio devido ao forte efeito de avidez obtido pela ligação de IL-17A homodimérico. Segundo, uma comparação dos polipeptídeos Z-ABD-Z com diferentes comprimentos de ligante e compreendendo as variantes Z Z06282 (SEQ ID NO: 1206) e Z12876 (SEQ ID NO: 1218) revelou que o comprimento do ligante teve um efeito menor na capacidade de bloqueio. Um conjunto de polipeptídeos Z-ABD-Z compreendendo Z06282 com diferentes comprimentos de ligante é exibido na Figura 7B. Polipeptídeos Z-ABD-Z adicionais, ZAZ3363, ZAZ3364, ZAZ3365 e ZAZ3422, foram analisados em ensaios de NHDF subsequentes, também após incubação dos polipeptídeos Z-ABD-Z a 40°C por duas e quatro semanas. A capacidade inibitória de IL-17A foi retira mesmo após incubação de quatro semanas a 40°C. Os valores de IC50 calculados, refletindo a capacidade de diferentes polipeptídeos Z-ABD-Z para inibir IL-17A, são resumidos na Tabela 19. Esses valores de IC50 são mais de três vezes menores do que as atividades de neutralização de produção de hIL-6 relatada (IC50=2,1±0,1 nM) do anticorpo monoclonal de inibição de IL-17A secukinumabe, AIN457, (WO2006/013107 e WO2012/125680) atualmente no desenvolvimento clínico. Tabela 19: Valores de IC50 calculados dos ensaios de NHDF
EXEMPLO 15 NEUTRALIZAÇÃO IN VIVO DE HIL-17A
[00460] IL-17A humana é capaz de se ligar e estimular o receptor de IL-17 de camundongo, levando à elevação e subsequente secreção de quimiocinas KC (CXCL1) de camundongo. MATERIAIS E MÉTODOS
[00461] Neutralização in vivo de hIL-17A no modelo de camundongo KC: Experimentos de variação de dose foram realizados para identificar a dose ideal de IL-17A humana para indução de KC de camundongo. Esses experimentos revelaram que uma dose de 150 μg/kg de IL-17A humana induziu um nível adequado de KC em soro de camundongo coletado 2 h após administração de IL-17A. ZAZ3174 (SEQ ID NO: 1233) e ZAZ3220 (SEQ ID NO: 1236) foram analisados nesse modelo nas duas ocasiões diferentes. No primeiro experimento, ZAZ3174 foi administrado s.c. aos camundongos em três doses diferentes; 0,25, 2,5 e 25 mg/kg, 9 h antes para uma injeção subcutânea de IL-17A humana. Os camundongos foram sacrificados 2 h após administração de IL-17A humana, e os níveis de KC foram determinados por ELISA usando um kit comercialmente disponível de acordo com a instrução do fabricante (KC Quantikine; R&D Systems, cat n°. D1700). No segundo experimento, ZAZ3220 foi administrado s.c. aos camundongos em três doses diferentes, 0,05, 0,1, 0,4 mg/kg, 9 h antes de uma injeção subcutânea de IL-17A humana. Os camundongos foram sacrificados 2 h após administração de IL-17A humana, e os níveis de KC foram determinados por ELISA como acima. RESULTADOS
[00462] Neutralização in vivo de hIL-17A no modelo de camundongo KC: Os polipeptídeos Z-ABD-Z ensaiados bloqueiam a capacidade de IL-17A humana para estimular o receptor de IL- 17 de camundongo, levando à inibição de uma elevação de KC de camundongo, em uma maneira dependente de dose. ZAZ3174 em uma dose de 2,5 mg/kg sob as condições descritas, bloqueou a indução de KC completamente, como mostrado na Figura 8A. O segundo experiment revelou que o segundo experiment revelou que o polipeptídeo Z-ABD-Z ZAZ3220, compreendendo uma variante Z maturada de afinidade, bloqueou a resposta de KC induzida por IL-17A completamente em uma dose de 0,4 mg/kg (Figura 8B). Isso corresponde a um efeito de bloqueio in vivo aumentado em6 vezes comparado a ZAZ3174. 72 % de inibição foram obtidos com 0,1 mg/kg de ZAZ3220.
EXEMPLO 16 FARMACOCINÉTICA IN VIVO DE POLIPEPTÍDEOS Z-ABD-Z EM RATOS
[00463] Esse Exemplo descreve dois experimentos separados nos quais os parâmetros farmacocinéticos em rato foram determinados para dois polipeptídeos Z-ABD-Z diferentes após injeções subcutâneas (s.c.) e/ou intravenosas (i.v.). MATERIAIS E MÉTODOS
[00464] Em um primeiro experimento, ZAZ3220 (SEQ ID NO: 1236) formulado em PBS foi administrado i.v. (n=3) para ratos machos Sprague Dawley (SD) (Charles River, Alemanha) em uma dose de 1.2 mg/kg correspondendo a 57 nmol/kg. As amostras de sangue foram coletadas da veia da cauda em cada rato em ponto do tempo 0,08, 8, 24, 48, 72, 120, 168, 240, 336, 408 e 504 h após a administração.
[00465] Em um segundo experimento, ZAZ3363 (SEQ ID NO: 1244) formulado em PBS foi administrado i.v. (n=5) ou s.c. (n=6) aos ratos machos SD em uma dose de 1,2 mg/kg correspondendo a 64 nmol/kg. As amostras de sangue foram coletadas da veia da cauda de cada rato em pontos do tempo 0, 0,08, 0,5, 1, 3, 8, 24, 72, 120, 168, 216, 264, 336, 408, 456 e 504 h após administração i.v. ou em pontos do tempo 0, 0,08, 0,5, 1, 3, 8, 24, 72, 120 e 168 h após administração s.c.
[00466] O soro foi preparado das amostras de sangue e armazenado a -20°C até análise. A quantificação de ZAZ3220 e ZAZ3363 no soro de ratos foi realizada usando um PK-ELISA.
[00467] PK-ELISA: placas de metade da área, de 96 poços (50 μl/poço) foram revestidas com 4 μg/poço de Ig anti-Z de cabra (produzida em cada) no tampão de revestimento (Sigma, cat. n° C3041) durante a noite a 4°C. No dia seguinte, as placas foram bloqueadas com PBS + 0,5 % de caseína por 1,5 h. Soro de rato individual, minimamente diluído em 10 x em PBS-caseína + 10 % de grupo de soro de rato (matriz de ensaio) foi adicionado às placas e titulados em série de diluição de 2 vezes. Foi incluído em uma placa o padrão de cada polipeptídeo Z-ABD-Z (titulado entre 300 ng/ml e 3 pg/ml) e em cada placa, quatro controles de cada polipeptídeo Z-ABD-Z diluíram para a concentração dentro da faixa linear do ensaio. Padrão e controles foram diluídos na matriz de ensaio. O padrão, controles e amostras diluídos foram preparados em placas separadas e transferidas para as placas de ELISA revestidas. As placas foram incubadas por 1,5 h à RT seguida por 1,5 h de incubação com uma Ig de coleho de detecção personalizada anti-ABD (4 μg/ml, CUV002) e 1 h de incubação com IgG-HRP anticoelho de asno (Jackson Immunoresearch, cat. n° 711-035-152). A reação foi desenvolvida com TMB (Thermo Fisher) e a reação de desenvolvimento foi interrompida após 15 min com H2SO4 a 2 M. A absorvência foi lida a 450 nm em um leitor de ELISA (Victor3, Perkin Elmer). As concentrações da respectiva variante Z-ABD-Z nas amostras foram calculadas a partir da curva padrão usando GraphPad Prism5 e um ajuste de curva de logística de quatro parâmetros (4-PL).
[00468] Análise farmacocinética: A análise farmacocinética foi baseada na concentração de soro de rato individual versus tempo. A meia-vida terminal (T^) e a biodisponibilidade foi estimada usando Microsoft Excel e GraphPad Prism e aplicando um modelo de dois compartimentos. RESULTADOS
[00469] Os perfis médios de concentração-tempo do soro dos polipeptídeos Z-ABD-Z ZAZ3220 e ZAZ3363 após administração única de 1,2 mg/kg aos ratos SD são mostrados na Figura 9A e Figura 9B, respectivamente, e os parâmetros farmacocinéticos calculados usando uma análise de dois compartimentos são resumidos na Tabela 20. A meia-vida estimada (t^) foi de aproximadamente 49 h tanto para ZAZ3220 quanto para ZAZ3363 após administração i.v. A t^ para ZAZ3363 administrado s.c. foi de 45 h e a biodisponibilidade foi calculada para 45 %. Tabela 20: Parâmetros farmacocinéticos médios de polipeptídeos Z-ABD-Z após uma administração i.v. ou s.c. para ratos SD
[00470] Cmáx: concentração de pico do soro; Tmáx: Tempo para alcançar a concentração de pico do soro; AUC0-t: Área sob a curva de concentração-tempo a partir do tempo zero para a última concentração quantificável; T1/2: Meia-vida; MRT: Tempo de residência médio; CL: Depuração; F: Percentagem de biodisponibilidade absoluta, calculada como F = [(Média de AUCs.c. x Dosei.v.) / (Média de AUCi.v. x Doses.c.)] x 100
EXEMPLO 17 ADMINISTRAÇÃO TÓPICA DE VARIANTE Z NOS OLHOS DE COELHOS
[00471] Administração local no olho é benéfica em distúrbios oftalmológicos, por exemplo, uveíte ou doenças do olho seco. A administração tópica possibilita concentrações de droga locais extremamente altas com um risco mínio de efeitos colaterais sistêmicos. Nesse Exemplo, a possibilidade ára administrar topicamente as moléculas da variante Z nos olhos foi investigada em coelhos. A concentração de uma molécula de variante Z e uma IgG de controle foi medida na câmara anterior (humor aquoso), no humor vítreo e no soro após quatro dosagens tópicas repetidas. MATERIAIS E MÉTODOS
[00472] Produção de variante Z: A variante Z Z10199 (SEQ ID NO: 1217) derivada de Z06282 (SEQ ID NO: 1206) mas começando AE foi subclonada sem nenhum marcador, mas com a adição do terminal C de resíduos de aminoácido VD. A expressão foi realizada essencialmente conforme descrito no Exemplo 2, e a purificação foi realizada por troca de ânion e cromatografia de fase reversa. A amostra foi trocada de tampão para PBS pH 7.2 e as endotoxinas foram removidas usando uma coluna 10 vermelha EndoTrap® (Hyglos).
[00473] Estudo Animal: 48 nmols (1 gota, 50 μl) de Z10199 e ZAZ3174 (SEQ ID NO: 1233), respectivamente, foram administrados topicamente em cada olho dos coelhos (n=2 por molécula) nos pontos do tempo 0, 1, 2 e 3 horas. Um anticorpo de IgG humana de controle (Xolair; Novartis) foi administrado da mesma maneira em dois coelhos diferentes. Como um controle negativo, um coelho foi administrado com PBS apenas. Após cada administração, as pálpebras foram mantidas fechadas durante aproximadamente 30 s para manter a amostra na córnea. Após 4 h, o humor vítreo, humor aquoso e soro foram coletados. As amostras foram centrifugadas para remover restos de tecido e agregados e os níveis de Z10199, ZAZ3174 e anticorpo, respectivamente, foram quantificados por ELISA.
[00474] Quantificação por ELISA: A concentração de Z10199 e ZAZ3174, respectivamente, nas amostras coletadas foi analisada por um ELISA intercalado usando uma imunoglobulina Z antiproteína de cabra policlonal produzida em casa para captura, imunoglobulina Z antiproteína de coelho policlonal produzida em casa como anticorpo primário e IgG-HRP anticoelho de cabra (Dako cat. n° P0448) como anticorpo secundário. A detecção foi realizada através da incubação com ImmunoPure TMB por 15 min à RT e a reação foi interrompida pela adição de H2SO4 a 2 M. A absorção a 450 nm foi medida com o leitor de microplaca Victor3. A concentração de Z10199 foi calculada de uma curva padrão preparada com a mesma molécula e usando GraphPad Prism 5 e uma fórmula de regressão não linear.
[00475] A concentração de IgG nas amostras coletadas foi analisada por um kit ELISA de IgG (Abcam 100547) e realizada como descrito pelo fabricante, usando uma curva padrão provida e análise por regressão não linear como acima. RESULTADOS
[00476] A Figura 10 mostra que tanto Z10199 quanto ZAZ3174 penetraram no olho após administração tópica e estavam presentes no humor vítreo e aquoso em baixas concentrações de nM. Em contraste, o anticorpo de IgG de controle não foi detectado nem no humor vítreo nem no aquoso. As amostras de soro poderiam ser consideradas como negativas tanto para variante Z quanto para IgG. Assim, as moléculas de variante Z da presente revelação podem ser distribuídas por essa via de administração alternativa, a qual não está disponível aos anticorpos, e um efeito local que evita exposição sistêmica pode ser alcançado.
EXEMPLO 18 ANÁLISE FARMACOCINÉTICA DE ADMINISTRAÇÃO DUODENAL DAS FORMULAÇÕES DE ZAZ3363 EM RATO MATERIAIS E MÉTODOS
[00477] Item de teste: ZAZ3363 (SEQ ID NO: 1244) foi formulado em 1) OAF1: quenodesoxicolato de sódio a 0,12 M (Sigma, cat. no. C8261) e propil galato a 0,12 M (Sigma, cat. n° P3130), pH 7,4; 2) OAF2: 50 mg/ml de caprato de sódio (Sigma, cat. n° C4151); ou 3) fosfato de sódio a 50 mM (PBS), pH 7,0, em uma concentração de 50 mg/ml (OAF1 e OAF2) ou 100 mg/ml (PBS).
[00478] Ensaio de célula NHDF: A atividade de ZAZ3363 (SEQ ID NO: 1244) formulada em OAF1, OAF2 ou PBS foi verificada no ensaio de célula NHDF dependente de IL-17 descrito no Exemplo 14.
[00479] Administração duodenal: Os ratos machos Sprague Dawley (Charles River) foram anestesiados com isofluorano, e uma pequena incisão foi feita para localizar o duodeno. Um cateter permanente (R-DUOD, AgnTho’s, Suécia) foi inserido cirurgicamente no duodeno 20 mm a partir de sua origem em uma área de vasculatura mínima. O cateter foi tunelado subcutaneamente nas costas dos animais. A musculatura abdominal foi fechada com suturas, enquanto a incisão na pele do abdômen e local de exteriorização subescapular foi fechado com grampos de ferida de aço inoxidável. Os animais foram deixados em recuperação por 5 a 6 dias antes de serem levados ao estudo. A analgesia pós-operatória foi administrada s.c. antes da cirurgia (carprofeno 5 mg/kg e buprenorfina 0,05 mg/kg). Carprofeno foi administrado uma vez ao dia também nos dias após a cirurgia. As doses adicionais de buprenorfina foram administradas quando necessário. O antibiótico (enrofloxacina 0,3 mg/ml) foi administrado na água potável durante o período de recuperação (3 a 5 dias), bem como durante o experimento. Para mascarar o sabor amargo de enrofloxacina, um pedaço de açúcar foi adicionado em 500 ml de água potável. Para garantir uma permeabilidade mantida, o cateter duodenal foi corado diariamente com água estéril (0,2 a 0,5 ml).
[00480] ZAZ3363 foi administrado diretamente no duodeno em uma dose de 5,4 μmols/kg de peso corporal formulado em OAF1 ou OAF2 (n=2) ou a 10,8 μmols/kg formulado em PBS (n=2) em um volume de 0,5 ml no ponto de tempo zero. As amostras de sangue foram tomadas son anestesia com isoflurano em 1, 3, 8, 24, 72, 120 e 168 h após a administração e o soro foi preparado por procedimentos padrão. A concentração de ZAZ3363 no soro foi medida pelo ELISA PK quantitativo descrito no Exemplo 16, mas titulando o padrão de ZAZ3363 entre 70 e 1 ng/ml.
[00481] Análise farmacocinética: A análise farmacocinética foi baseada na concentração de soro de rato individual versus tempo. A meia-vida terminal (TM e a biodisponibilidade foram estimadas usando Microsoft Excel e GraphPad Prism. RESULTADOS
[00482] Atividade de ZAZ3363 formulado: A atividade de ZAZ3363 formulado em OAF1 e OAF2, respectivamente, foi comparada à formulação em PBS no ensaio de célula NHDF. A Figura 11 mostra as curvas de titulação de OAF1 comparado ao ZAZ3363 formulado com PBS (Figura 11A) e OAF2 comparado ao ZAZ3363 formulado com PBS (Figura 11B). O experimento mostrou que a atividade de ZAZ3363 nas duas formulações era idêntica ao PBS, isto é, a atividade biológica de ZAZ3363 não foi afetada pelos diferentes excipientes.
[00483] Absorção intraduodenal de ZAZ3363: A absorção intestinal de ZAZ3363 formulado com OAF1, OAF2 e PBS foi examinada em um modelo de rato de administração intraduodenal (i.d.). O experimento mostrou uma absorção aumentada com formulações de OAF1 e OAF2 comparado ao PBS (Figura 12). As biodisponibilidades foram 0,2, 0,8 e 0,0007 para OAF1, OAF2 e PBS, respectivamente, como mostrado na Tabela 21. ZAZ3363 formulado com OAF2 mostrou a melhor absorção, um média 1160 vezes melhor comparado à formulação em PBS embora foi vista uma melhor variação individual. A formulação de ZAZ3363 em OAF1 foi em média 260 vezes melhor do que a formulação em PBS. Tabela 21: Biodisponibilidade e T A após administração intraduodenal de ZAZ3363 em três formulações diferentes
EXEMPLO 19 CARACTERIZAÇÃO DE COMPLEXOS ANTI-IL-17A/ANTI-TNF EM ENSAIO DE NHDF MATERIAIS E MÉTODOS
[00484] Produção de complexos e anticorpo de controle: Dois complexos diferentes visando IL-17A e TNF foram construídos, bem como um anticorpo com afinidade para TNF. O anticorpo indicado “Ada”, tendo as mesmas sequências de CDR e especificidade como o anticorpo monoclonal comercialmente disponível, foi construído usando as sequências de cadeia pesada (HC) e cadeia leve (LC) HCAda (SEQ ID NO: 1231) e LCAda (SEQ ID NO: 1232). A IL-17A visando a porção Z14253 da variante Z (SEQ ID NO: 1219) foi geneticamente fundida, através de um ligante de resíduo flexível (GGGGS)3, para os terminais C de HCAda ou LCAda, resultando nos complexos HCAda-Z14253 e LCAda- Z14253, respectivamente. Um esquemático dos complexos construídos é mostrado na Figura 13A. A síntese de gene, clonagem, produção por expressão de gene transitório nas células CHO e a purificação usando cromatografia de afinidade de Proteína A foi realizada por Evitria AG (Suíça).
[00485] Bloqueio de Produção de IL-6 induzida por IL-17A no ensaio de NHDF: O ensaio de NHDF foi realizado essencialmente como descrito no Exemplo 14, titulando as amostras do estudo HCAda-Z14253 e LCAda-Z14253 e seus comparadores em três etapas de 63 nM a 0,003 nM em um meio contendo rhIL-17A a 0,9 nM. Os comparadores foram ZAZ3363 (SEQ ID NO: 1244), o anticorpo anti-TNF Ada, bem como a variante Z de controle negativo Z04726 (SEQ ID NO: 1223; visando taq polymerase) recombinantemente fundida à variante de ABD PP013 (SEQ ID NO: 1224) através de um ligante VDSS (indicado Z04726- PP013), como descrito no Exemplo 2. Uma curva padrão IL-17A também foi preparada (6,2 a 0.0001 nM) bem como controles contendo meio com IL-17A a 0,9 nM ou meio sozinho. O teor de IL-6 nos sobrenadantes foi quantificado usando o ELISA específico de IL-6 descrito no Exemplo 3.
[00486] Bloqueio de produção de IL-8 induzida por TNF ou TNF/IL-17A no ensaio de NHDF: as células NHDF (Lonza, cat. no. CC-2511) foram cultivadas em meio basal de fibroblasto (Lonza, cat. n° CC-3132) fornecido com fatores de promoção de crescimento (Lonza, cat. n° CC-5034). No dia anterior ao experimento, 5000 células por poço foram semeadas em metade da área da placa de cultura de 96 poços (Greiner, cat. n° 675180) em 100 μl. No dia do experimento, as diluições de HCAda—Z14253 e LCAda-Z14253 e os comparadores descritos acima foram preparados em uma placa de 96 poços separada. Os complexos e comparadores foram titulados em três etapas de 5 nM a 0,0007 nM em meio contendo TNF humana a 0,1 nM (R&D Systems, cat. n° 2210-TA/CF) ou uma mistura de rhIL-17A a 0,05 nM e 0,1 nM. Controles contendo meio com TNF a 0,1 nM ou uma mistura de rhIL-17A a 0,05 nM e 0,1 nM ou meio sozinho também foram preparados. O meio na placa com as células NHDF cultivadas durante a noite foi descartado e 100 μl/poço da amostra foram transferidas para a placa de célula. A placa foi colocada em uma incubadora a 37°C por 18 a 24 h. No dia seguinte, o teor de IL-8 nos sobrenadantes foi quantificado usando um ELISA específico de IL-8.
[00487] ELISA de IL-8: IL-8 foi quantificada por um kit ELISA DuoSet (R&D systems, cat. n° DY208) . Metade das placas de área (Costar, cat. no. 3690) foi revestida com o anticorpo de captura anti-IL-8, 4 μg/ml em PBS, 50 μl/poço, durante a noite a 4°C. No dia da análise, a placa foi enxaguada duas vezes em água de torneira e então bloqueada com PBS + 1 % de BSA por 2 h. IL-8 padrão (R&D Systems, cat. n° 890806), titulada em uma série de diluição de 2 vezes (20 a 0,01 ng/ml) e sobrenadantes da placa de ensaio de célula foram adicionadosà placa revestida de ELISA (50 μl/poço) e incubados por 1,5 h à RT. A placa foi Lavada 4 vezes emu ma lavadora automática de ELISA e 20 ng/ml (50 μl/poço) de anticorpo de detecção anti- IL-8 biotinilado foram adicionados. Após mais 1 h de incubação, a placa foi lavada e 50 μl de estreptavidina-HRP (Thermo Fisher, cat. n° N100) diluída 8000 x foram adicionados por poço. A placa foi desenvolvida após mais uma hora de incubação e lavagem, com 50 μl de TMB (Thermo Fisher, cat. no 34021) por poço, e a reação foi interrompida com 50 μl de H2SO4 a 2 M. As absorvências foram lidas em um leitor de multirrótulos (Victor3, Perkin Elmer). RESULTADOS
[00488] Bloqueio de produção de IL-6 induzida por IL-17A no ensaio de NHDF: Os dois complexos HCAda-Z14253 e LCAda- Z14253 foram estudados com relação a sua capacidade para bloquear a produção de IL-6 induzida por IL-17A no ensaio de NHDF. Resultados do ensaio NHDF são apresentados na Figura 13B. Tanto HCAda-Z14253 quanto LCAda-Z14253 tem uma capacidade similar de bloquear IL-17A como ZAZ3363. Conforme esperado, nenhuma inibição foi vista para Ada ou o Z04726-PP013 de controle negativo.
[00489] Bloqueio de produção de IL-8 induzida por TNF ou TNF/IL-17A no ensaio de NHDF: Os dois complexos HCAda- Z14253 e LCAda-Z14253 foram estudados com relação a sua capacidade de bloquear TNF ou uma mistura de produção de IL-8 induzida por TNF/IL-17A no ensaio de NHDF. Os resultados do ensaio de NHDF mostraram que HCAda-Z14253 e LCAda-Z14253 têm perfis inibitórios similares como o anticorpo anti-TNF Ada com relação à capacidade de bloqueio de TNF específico (Figura 13C). Entretanto, HCAda-Z14253 e LCAda-Z14253 tiveram perfis inibitórios superiores comparado a Ada e ZAZ3363 no ensaio de combinação, onde o efeito de bloqueio tanto para TNF quanto para IL-17 foi investigado (Figura 13D).
EXEMPLO 20 FARMACOCINÉTICA IN VIVO DE POLIPEPTÍDEO Z-ABD-Z EM MACACOS
[00490] Esse Exemplo descreve um estudo de dose repetida conduzido durante 10 idas em macacos cinomolgos administrados com o polipeptídeo Z-ABD-Z ZAZ3363. Os resultados foram usdos por estimative da meia-vida de ZAZ3363 em cinomolgos. MATERIAIS E MÉTODOS
[00491] ZAZ3363 (SEQ ID NO: 1244) foi administrado em 20 mg/kg (n=2; 1 macho e 1 fêmea) e 40 mg/kg (n=4; 2 machos e 2 fêmeas) como uma infusão i.v. curta nos dias 1, 4, 7 e 10. As amostras de plasma para determinação de concentração de ZAZ3363 foram coletadas em conexão com a primeira dose no dia 1 (nos pontos de tempo 0 (pré-dose), 5 min, 0,5, 1, 2, 6, 24 e 48 h após administração) e a última dose no dia 10 (nos pontos de tempo 0 (pré-dose), 5 min, 0,5, 1, 2, 6, 24, 48 h, 5, 7, 10, 12, 14 e 21 dias após administração). Quantificação de ZAZ3363 nas amostras de plasma foi executada por LC-MS/MS com base nos peptídeos obtidos após digestão tríptica de ZAZ3363. Os perfis de concentração-tempo foram avaliados usando tanto os métodos não compartimentais com análises separadas para o dia 1 e dia 10 quanto os métodos compartimentais avaliando os dados para o dia 1 e dia 10 combinado para cada animal. RESULTADOS
[00492] Os perfis médios de concentração-tempo de plasma de ZAZ3363 após administração no dia 1 e dia 10 são mostrados na Figura 14A e Figura 14B, respectivamente. Apesar do fato de que ZAZ3363 não foi administrado como uma dose única com avaliação de PK total, os resultados disponíveis após múltipla dosagem permitem uma previsão do perfil de concentração-tempo após doses únicas. As concentrações de plasma reduziram nas duas fases de acordo com um comportamento de dois compartimentos. A t^ da segunda fase estimada a partir desse e um segundo estudo de dose repetida (dados não mostrados) foi de aproximadamente 4 a 7,5 dias, que está de acordo com a t^ relatada para albumina de macaco(Deo et al., 1974, J Nutr 104:858-64). Não foram observadas diferenças de gênero significativas.
EXEMPLO 21 ADMINISTRAÇÃO ORAL DE POLIPEPTÍDEO Z-ABD-Z EM CÃES MATERIAIS E MÉTODOS
[00493] Preparação de cápsulas: ZAZ3363 (SEQ ID NO: 1244) foi formulado em OAF1 (veja Exemplo 18) em uma concentração de 100 mg/ml. A formulação foi liofilizada e preenchida em cápsulas de casca dura revestidas subsequentemente entéricas (realizada por Catalent Pharma Solutions, Beinheim, France). Cada cápsula continha aproximadamente 25 mg de ZAZ3363.
[00494] Estudo Animal: O estudo animal foi realizado em Huntingdon Life Science (Cambridgeshire, Reino Unido). Os cães da raça Beagle em jejum (n=3; indivíduos do sexo feminino) cada recebeu seis cápsulas contendo ZAZ3363 (aproximadamente 150 mg). As amostras de soro foram tiradas a 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24 e 96 h após administração.
[00495] Quantificação: A concentração de ZAZ3363 nas amostras de soro foi quantificada usando um ELISA PK intercalado essencialmente conforme descrito no Exemplo 16, mas usando uma IgG anti-Z monoclonal produzida em casa na primeira etapa de revestimento. RESULTADOS
[00496] As concentrações individuais de soro de cão versus perfis de tempo de ZAZ3363 são mostradas na Figura 15. Os resultados mostraram absorção intestinal de ZAZ3363 em todos os três animais, mas com alguma variação entre os indivíduos. A concentração de soro ZAZ3363 alcançou um máximo de 2 a 30 nM. Uma vez na circulação, os níveis no soro de ZAZ3363 permanecem estáveis pelo menos até 96 h, que é atribuída a interação com albumina de cão da porção de ABD PP013 (SEQ ID NO: 1223) dentro de ZAZ3363. A disponibilidade de PP013 para ligar a albumina do cão foi demonstrada previamente (WO2012/004384).
LISTAGEM DISCRIMINADA DAS REALIZAÇÕES
[0508] 1. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, compreendendo um motivo de ligação de IL-17A BM, cujo motivo consiste em uma sequência de aminoácido selecionada dentre: I0EX2DX4AX6X7EIX10X11LPNL X16X17X18QX20X21AFIX25 X26LX28X29 em que, independentemente um do outro, X2 é selecionado dentre A, H, M e Y; X4 é selecionado dentre A, D, E, F, K, L, M, N, Q, R, S e Y; X6 é selecionado dentre A, Q e W; X7 é selecionado dentre F, I, L, M, V, W e Y; X10 é selecionado dentre A e W;X11 é selecionado dentre A, D, E, F, G, L, M, N, Q, S, T e Y; X16 é selecionado dentre N e T; X17 é selecionado dentre H, W e Y; X18 é selecionado dentre A, D, E, H e V; X20 é selecionado dentre A, G, Q, S e W; X21 é selecionado dentre A, D, E, F, H, K, N, R, T, V, W e Y; X25 é selecionado dentre A, D, E, G, H, I, L, M, N, Q, R, S, T e V; X26 é selecionado dentre K e S; X28 é selecionado dentre I, L, N e R; e X29 é selecionado dentre D e R; e i) uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 89% de identidade para a sequência definida em i).
[0528] 2. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 1, em que, na sequência i), X2 é selecionado dentre A, H e M; X4 é selecionado dentre A, D, E, F, L, M, N, Q, R e Y; X11 é selecionado dentre A, D, E, F, G, L, M, N, S, T e Y; X18 é selecionado dentre A, D, E e V; X20 é selecionado dentre A, G, Q e W; X21 é selecionado dentre E, F, H, N, R, T, V, W e Y; X25 é selecionado dentre A, D, E, G, H, I, L, N, Q, R, S, T e V; e X28 é selecionado dentre I, N e R.
[0529] 3. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 2, em que, na sequência i), X16 é T; X17 é W; X21 é selecionado dentre E, F, H, W, T e Y; X25 é selecionado dentre A, D, E, G, H, I, L, N, Q, R, S e T; X26 é K; e X29 é D.
[0530] 4. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com qualquer item anterior, em que a sequência i) cumpre pelo menos seis das onze condições I-XI: X2 é A; X4 é selecionado dentre D, E e Q; X6 é A; X7 é selecionado dentre F e V; X16 é T; X17 é W; X18 é selecionado dentre A e D; X20 é W; X26 é K; X28 é R; e X29 é D.
[0531] 5. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 4, em que a sequência i) cumpre pelo menos sete das onze condições I-XI.
[0532] 6. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 5, em que a sequência i) cumpre pelo menos oito das onze condições I-XI.
[0533] 7. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 6, em que a sequência i) cumpre pelo menos nove das onze condições I-XI.
[0534] 8. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 7, em que a sequência i) cumpre pelo menos dez das onze condições I-XI.
[0535] 9. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 8, em que a sequência i) cumpre todas as onze condições I-XI.
[0536] 10. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com qualquer item anterior, em que X2X6, X2X10 ou X6X10 é AA.
[0537] 11. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com qualquer item anterior, em que X2X17, X2X20, X6X17, X6X20, X10X17 ou X10X20 é AW.
[0538] 12. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com qualquer item anterior, em que X2X28, X6X28 ou X10X28 é AR.
[0539] 13. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com qualquer item anterior, em que X17X28 ou X20X28 é WR.
[0540] 14. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com qualquer item anterior, em que X17X20 é WW.
[0541] 15. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com qualquer item anterior, em que a sequência i) é a sequência da posição 8 para a posição 36 em uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1-1216.
[0542] 16. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 15, em que sequência i) é a sequência da posição 8 para a posição 36 em uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1-66, 1200, 1206 e 1214.
[0543] 17. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 16, em que a sequência i) é a sequência da posição 8 para a posição 36 em uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1 a 66.
[0544] 18. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 17, em que a sequência i) é a sequência da posição 8 para a posição 36 em uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1 a 35.
[0545] 19. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 18, em que a sequência i) é a sequência da posição 8 para a posição 36 em uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1 a 27.
[0546] 20. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 19, em que a sequência i) é a sequência da posição 8 para a posição 36 em uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1 a 10.
[0547] 21. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 20, em que a sequência i) é a sequência da posição 8 para a posição 36 em uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1 a 7.
[0548] 22. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 21, em que a sequência i) é a sequência da posição 8 para a posição 36 em uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1 a 4.
[0549] 23. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 22, em que a sequência i) é a sequência da posição 8 para a posição 36 no SEQ ID NO: 1.
[0550] 24. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com qualquer item anterior, em que o dito motivo de ligação de IL-17A faz parte de um domínio de proteína de pacote de três hélices.
[0551] 25. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 24, em que o dito motivo de ligação de IL- 17A essencialmente faz parte de duas hélices com um laço de interligação, dentro do dito domínio de proteína de pacote de três hélices.
[0552] 26. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 25, em que o dito domínio de proteína de pacote de três hélices é selecionado dentre domínios receptores bacterianos.
[0553] 27. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 26, em que o dito domínio de proteína de pacote de três hélices é selecionado dentre domínios de proteína A de Staphylococcus aureus ou seus derivados.
[0554] 28. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com qualquer item anterior, que compreende um módulo de ligação de sequência de aminoácido, BMod, selecionado dentre: K-[BM]-DPSQS XaXbLLXc EAKKL XdXeXfQ; em que [BM] é um motivo de ligação de IL-17A como definido em qualquer um dos itens 1 a 23 contanto que X29 seja D; Xa é selecionado dentre A e S; Xb é selecionado dentre N e E; Xc é selecionado dentre A, S e C; Xd é selecionado dentre E, N e S; Xe é selecionado dentre D, E e S; Xf é selecionado dentre A e S; e uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 85% de identidade para uma sequência definida por iii).
[0555] 29. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 27, que compreende um módulo de ligação de sequência de aminoácido, BMod, selecionado dentre: K-[BM]-QPEQS XaXbLLXc EAKKL XdXeXfQ; em que [BM] é um motivo de ligação de IL-17A como definido em qualquer um dos itens 1 a 23 contanto que X29 seja R; Xa é selecionado dentre A e S; Xb é selecionado dentre N e E; Xc é selecionado dentre A, S e C; Xd é selecionado dentre E, N e S; Xe é selecionado dentre D, E e S; Xf é selecionado dentre A e S; e uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 85% de identidade para uma sequência definida por v).
[0556] 30. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 28 ou 29, em que Xa na sequência iii) ou v) é A.
[0557] 31. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 28 ou 29, em que Xa na sequência iii) ou v) é S.
[0558] 32. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com qualquer um dos itens 28 a 31, em que Xb na sequência iii) ou v) é N.
[0559] 33. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com qualquer um dos itens 28 a 31, em que Xb na sequência iii) ou v) é E.
[0560] 34. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com qualquer um dos itens 28 a 33, em que Xc na sequência iii) ou v) é A.
[0561] 35. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com qualquer um dos itens 28 a 33, em que Xc na sequência iii) ou v) é S.
[0562] 36. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com qualquer um dos itens 28 a 33, em que Xc na sequência iii) ou v) é C.
[0563] 37. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com qualquer um dos itens 28 a 36, em que Xd na sequência iii) ou v) é E.
[0564] 38. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com qualquer um dos itens 28 a 36, em que Xd na sequência iii) ou v) é N.
[0565] 39. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com qualquer um dos itens 28 a 36, em que Xd na sequência iii) ou v) é S.
[0566] 40. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com qualquer um dos itens 28 a 39, em que Xe na sequência iii) ou v) é D.
[0567] 41. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com qualquer um dos itens 28 a 39, em que Xe na sequência iii) ou v) é E.
[0568] 42. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com qualquer um dos itens 28 a 39, em que Xe na sequência iii) ou v) é S.
[0569] 43. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com qualquer um dos itens 37 e 39 a 42, em que XdXe na sequência iii) ou v) é selecionado dentre EE, ES, SD, SE e SS.
[0570] 44. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 43, em que XdXe na sequência iii) ou v) é ES.
[0571] 45. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 43, em que XdXe na sequência iii) ou v) é SE.
[0572] 46. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 43, em que XdXe na sequência iii) ou v) é SD.
[0573] 47. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com qualquer um dos itens 28 a 46, em que Xf na sequência iii) ou v) é A.
[0574] 48. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com qualquer um dos itens 28 a 46, em que Xf na sequência iii) ou v) é S.
[0575] 49. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 28 ou 29, em que, na sequência iii) ou v), Xa é A; Xb é N; Xc é A e Xf é A.
[0576] 50. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 28 ou 29, em que, na sequência iii) ou v), Xa é S; Xb é E; Xc é A e Xf é A.
[0577] 51. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 28 ou 29, em que, na sequência iii) ou v), Xa é A; Xb é N; Xc é C e Xf é A.
[0578] 52. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 28 ou 29, em que, na sequência iii) ou v), Xa é S; Xb é E; Xc é S e Xf é S.
[0579] 53. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 28 ou 29, em que, na sequência iii) ou v), Xa é S; Xb é E; Xc é S e Xf é A.
[0580] 54. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 28 ou 29, em que, na sequência iii) ou v), Xa é S; Xb é E; Xc é A e Xf é S.
[0581] 55. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 28 ou 29, em que, na sequência iii) ou v), Xa é S; Xb é E; Xc é C e Xf é S.
[0582] 56. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 49, em que, na sequência iii) ou v), Xa é A; Xb é N; Xc é A; XdXe é ND e Xf é A.
[0583] 57. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 50, em que, na sequência iii) ou v), Xa é S; Xb é E; Xc é A; XdXe é ND e Xf é A.
[0584] 58. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 51, em que, na sequência iii) ou v), Xa é A; Xb é N; Xc é C; XdXe é ND e Xf é A.
[0585] 59. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 52, em que, na sequência iii) ou v), Xa é S; Xb é E; Xc é S; XdXe é ND e Xf é S.
[0586] 60. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 53, em que, na sequência iii) ou v), Xa é S; Xb é E; Xc é S; XdXe é ND e Xf é A.
[0587] 61. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 55, em que, na sequência iii) ou v), Xa é S; Xb é E; Xc é C; XdXe é ND e Xf é S.
[0588] 62. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 49, em que, na sequência iii) ou v), Xa é A; Xb é N; Xc é A; XdXe é SE e Xf é A.
[0589] 63. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 50, em que, na sequência iii) ou v), Xa é S; Xb é E; Xc é A; XdXe é SE e Xf é A.
[0590] 64. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 51, em que, na sequência iii) ou v), Xa é A; Xb é N; Xc é C; XdXe é SE e Xf é A.
[0591] 65. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 52, em que, na sequência iii) ou v), Xa é S; Xb é E; Xc é S; XdXe é SE e Xf é S.
[0592] 66. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 54, em que, na sequência iii) ou v), Xa é S; Xb é E; Xc é A; XdXe é SE e Xf é S.
[0593] 67. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 55, em que, na sequência iii) ou v), Xa é S; Xb é E; Xc é C; XdXe é SE e Xf é S.
[0594] 68. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 49, em que, na sequência iii) ou v), Xa é A; Xb é N; Xc é A; XdXe é ES e Xf é A.
[0595] 69. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 50, em que, na sequência iii) ou v), Xa é S; Xb é E; Xc é A; XdXe é ES e Xf é A.
[0596] 70. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 51, em que, na sequência iii) ou v), Xa é A; Xb é N; Xc é C; XdXe é ES e Xf é A.
[0597] 71. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 52, em que, na sequência iii) ou v), Xa é S; Xb é E; Xc é S; XdXe é ES e Xf é S.
[0598] 72. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 55, em que, na sequência iii) ou v), Xa é S; Xb é E; Xc é C; XdXe é ES e Xf é S.
[0599] 73. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 49, em que, na sequência iii) ou v), Xa é A; Xb é N; Xc é A; XdXe é SD e Xf é A.
[0600] 74. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 50, em que, na sequência iii) ou v), Xa é S; Xb é E; Xc é A; XdXe é SD e Xf é A.
[0601] 75. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 51, em que, na sequência iii) ou v), Xa é A; Xb é N; Xc é C; XdXe é SD e Xf é A.
[0602] 76. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 52, em que, na sequência iii) ou v), Xa é S; Xb é E; Xc é S; XdXe é SD e Xf é S.
[0603] 77. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 54, em que, na sequência iii) ou v), Xa é S; Xb é E; Xc é A; XdXe é SD e Xf é S.
[0604] 78. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 55, em que, na sequência iii) ou v), Xa é S; Xb é E; Xc é C; XdXe é SD e Xf é S.
[0605] 79. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 28, em que a dita sequência iii) é a sequência da posição 7 para a posição 55 em uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1 a 1216.
[0606] 80. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 79, em que a sequência iii) é a sequência da posição 7 para a posição 55 em uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1 a 66, 1200, 1206 e 1214.
[0607] 81. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 80, em que a sequência iii) é a sequência da posição 7 para a posição 55 em uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1 a 66.
[0608] 82. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 81, em que a sequência iii) é a sequência da posição 7 para a posição 55 em uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1 a 35.
[0609] 83. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 82, em que a sequência iii) é a sequência da posição 7 para a posição 55 em uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1 a 27.
[0610] 84. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 83, em que a sequência iii) é a sequência da posição 7 para a posição 55 em uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1 a 10.
[0611] 85. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 84, em que a sequência iii) é a sequência da posição 7 para a posição 55 em uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1 a 7.
[0612] 86. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 85, em que a sequência iii) é a sequência da posição 7 para a posição 55 em uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1 a 4.
[0613] 87. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 86, em que a sequência iii) é a sequência da posição 7 para a posição 55 no SEQ ID NO: 1.
[0614] 88. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com qualquer item anterior, que compreende uma sequência de aminoácido selecionada dentre: vii) YA-[BMod]-AP; em que [BMod] é um módulo de ligação de IL-17A como definido em qualquer um dos itens de 28 a 87; e viii) uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 86% de identidade para uma sequência definida por vii).
[0615] 89. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com qualquer um dos itens de 1 a 87, que compreende uma sequência de aminoácido selecionada dentre: ix) FA-[BMod]-AP;em que [BMod] é um módulo de ligação de IL-17A como definido em qualquer um dos itens de 28 a 87; e x) uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 86% de identidade para uma sequência definida por ix).
[0616] 90. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com qualquer um dos itens de 1 a 87, que compreende uma sequência de aminoácido selecionada dentre: xi) FN-[BMod]-AP; em que [BMod] é um módulo de ligação de IL-17A como definido em qualquer um dos itens de 28 a 87; e xii) uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 86% de identidade para uma sequência definida por xi).
[0617] 91. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com qualquer item anterior, que compreende uma sequência de aminoácido selecionada dentre: ADNNFNK-[BM]-DPSQSANLLSEAKKLNESQAPK; ADNKFNK-[BM]-DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK; ADNKFNK-[BM]-DPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK; ADAQQNNFNK-[BM]-DPSQSTNVLGEAKKLNESQAPK; AQHDE-[BM]-DPSQSANVLGEAQKLNDSQAPK; VDNKFNK-[BM]-DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK; AEAKYAK-[BM]-DPSESSELLSEAKKLNKSQAPK; VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNDAQAPK; VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNDSQAPK; AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK; AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAP; AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDAQAPK; AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDAQAP; AEAKFAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK; AEAKFAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAP;AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNDAQAPK; AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK; AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSESQAP; AEAKFAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK; AEAKFAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSESQAP; AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLSEAQAPK; AEAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLSESQAPK; AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLESSQAPK; AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLESSQAP; AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLESAQAPK; AEAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLESSQAPK; AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSDSQAPK; AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSDSQAP; AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLSDSQAPK; AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLSDAQAPK; AEAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLSDSQAPK; VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK; VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK; VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLSEAQAPK; VDAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLSESQAPK; VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLESSQAPK; VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLESAQAPK; VDAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLESSQAPK; VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSDSQAPK; VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLSDSQAPK; VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLSDAQAPK; VDAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLSDSQAPK; VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNKAQAPK; AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNKAQAPK; e ADAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;em que [BM] é um motivo de ligação de IL-17A como definido em qualquer um dos itens de 1 a 23.
[0618] 92. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com qualquer item anterior, que compreende uma sequência de aminoácido selecionada dentre: xiii) VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK; em que [BM] é um motivo de ligação de IL-17A como definido em qualquer um dos itens de 1 a 23; e xiv) uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 86% de identidade para a sequência definida em xiii).
[0619] 93. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 92, em que a sequência xiii) é selecionada dentre SEQ ID NO: 1 a 1216.
[0620] 94. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 93, em que a sequência xiii) é selecionada dentre SEQ ID NO: 1 a 66, 1200, 1206 e 1214.
[0621] 95. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 94, em que a sequência xiii) é selecionada dentre SEQ ID NO: 1 a 66.
[0622] 96. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 95, em que a sequência xiii) é selecionada dentre SEQ ID NO: 1 a 35.
[0623] 97. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 96, em que a sequência xiii) é selecionada dentre SEQ ID NO: 1 a 27.
[0624] 98. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 97, em que a sequência xiii) é selecionada dentre SEQ ID NO: 1 a 10.
[0625] 99. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 98, em que a sequência xiii) é selecionada dentre SEQ ID NO: 1 a 7.
[0626] 100. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 99, em que a sequência xiii) é selecionada dentre SEQ ID NO: 1 a 4.
[0627] 101. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 100, em que a sequência xiii) é SEQ ID NO: 1.
[0628] 102. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com qualquer um dos itens de 1 a 91, que compreende uma sequência de aminoácido selecionada dentre: xv) AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK; em que [BM] é um motivo de ligação de IL-17A como definido em qualquer um dos itens de 1 a 23; e xvi) uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 86% de identidade para a sequência definida em xv).
[0629] 103. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 102, em que a sequência xv) é selecionada dentre SEQ ID NO: 1217 a 1222.
[0630] 104. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 103, em que a sequência xv) é selecionada dentre SEQ ID NO: 1218 a 1222.
[0631] 105. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 104, em que a sequência xv) é selecionada dentre SEQ ID NO: 1219 a 1222.
[0632] 106. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 105, em que a sequência xv) é selecionada dentre SEQ ID NO: 1219 e SEQ ID NO: 1222.
[0633] 107. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 106, em que a sequência xv) é SEQ ID NO: 1219.
[0634] 108. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com qualquer item anterior, que é capaz de se ligar à IL-17A de modo que o valor de KD da interação é no máximo 1 x 10-6 M, tal como no máximo 1 x 10-7 M, tal como no máximo 1 x 10-8 M, tal como no máximo 1 x 10-9 M.
[0635] 109. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com qualquer item anterior, que é capaz de se ligar a uma molécula de IL-17A selecionada do grupo consistindo em IL- 17A humana e IL-17A de murino.
[0636] 110. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 109, que é capaz de se ligar à IL-17A humana.
[0637] 111. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 109, que é capaz de se ligar à IL-17A de murino.
[0638] 112. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com qualquer um dos itens de 109 a 111, capaz de se ligar à IL-17A humana e à IL-17A de murino.
[0639] 113. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com qualquer um dos itens 109, 110 e 112, em que a dita IL-17A humana compreende a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 1226 ou um fragmento antigenicamente eficaz dessa.
[0640] 114. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com qualquer um dos itens 109, 111 e 112, em que a dita IL-17A de murino compreende a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 1227 ou um fragmento antigenicamente eficaz dessa.
[0641] 115. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com qualquer item anterior que compreende aminoácidos adicionais na extremidade do terminal C e/ou terminal N.
[0642] 116. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 115, em que o(s) dito(s) aminoácido(s) adicional(is) melhora(m) e/ou simplifica(m) a produção, purificação, estabilização in vivo ou in vitro, acoplamento ou detecção do polipeptídeo.
[0643] 117. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com qualquer item anterior na forma multimérica, compreendendo pelo menos duas unidades monoméricas de polipeptídeo de ligação de IL-17A, cujas sequências de aminoácido podem ser iguais ou diferentes.
[0644] 118. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 117, em que as ditas unidades monoméricas de polipeptídeo de ligação de IL-17A são covalentemente acopladas juntas.
[0645] 119. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com o item 118, em que as unidades monoméricas de polipeptídeo de ligação de IL-17A são expressas como uma proteína de fusão.
[0646] 120. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com qualquer um dos itens 117-119, na forma dimérica.
[0647] 121. Proteína de fusão ou conjugado, compreendendo - uma primeira porção consistindo em um polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com qualquer item anterior; e - uma segunda porção consistindo em um polipeptídeo tendo uma atividade biológica desejada.
[0648] 122. Proteína de fusão ou conjugado de acordo com o item 121, em que a dita atividade biológica desejada é uma atividade terapêutica.
[0649] 123. Proteína de fusão ou conjugado de acordo com o item 121, em que a dita atividade biológica desejada é uma atividade de ligação.
[0650] 124. Proteína de fusão ou conjugado de acordo com o item 123, em que a dita atividade de ligação é atividade de ligação de albumina que aumenta a meia-vida in vivo da proteína de fusão ou conjugado.
[0651] 125. Proteína de fusão ou conjugado de acordo com o item 124, compreendendo dois polipeptídeos de ligação de IL-17A, cada como definido em qualquer um dos itens de 1 a 116, com uma porção de ligação de albumina entre eles.
[0652] 126. Proteína de fusão ou conjugado, de acordo com o item 125, que é capaz de se ligar à IL-17A de modo que o valor de KD da interação seja no máximo 1 x 10-10 M, tal como no máximo 1 x 10-11 M, tal como no máximo 1 x 10-12 M, tal como no máximo 1 x 10-13 M.
[0653] 127. Proteína de fusão ou conjugado, de acordo com qualquer um dos itens de 124 a 126, em que a dita segunda porção compreende o domínio de ligação de albumina de proteína G estreptocócica ou um derivado dela.
[0654] 128. Proteína de fusão ou conjugado, de acordo com o item 123, em que a dita atividade de ligação age para inibir uma atividade biológica.
[0655] 129. Proteína de fusão ou conjugado, de acordo com o item 123, em que a dita atividade de ligação age para estimular uma atividade biológica.
[0656] 130. Proteína de fusão ou conjugado, de acordo com o item 121, em que a dita atividade biológica desejada é uma atividade enzimática.
[0657] 131. Proteína de fusão ou conjugado, de acordo com o item 122, em que a segunda porção é um polipeptídeo terapeuticamente ativo.
[0658] 132. Proteína de fusão ou conjugado, de acordo com o item 131, em que a segunda porção é um agente de modificação de resposta imune, por exemplo, um agente anti- inflamatório.
[0659] 133. Proteína de fusão ou conjugado, de acordo com qualquer um dos itens 121 e 122 e 130 a 132, em que a segunda porção é selecionada do grupo consistindo em enzimas endógenas humanas, hormônios, fatores de crescimento, quimiocinas, citocinas e linfocinas, e agonistas, antagonistas e seus inibidores.
[0660] 134. Proteína de fusão ou conjugado, de acordo com o item 131, em que a segunda porção é um composto tóxico.
[0661] 135. Proteína de fusão ou conjugado, de acordo com o item 123, em que a dita atividade de ligação está ligando a um fator associado à resposta imune, por exemplo, um fator associado à inflamação.
[0662] 136. Complexo, compreendendo pelo menos um polipeptídeo de ligação de IL-17A, de acordo com qualquer um dos itens de 1 a 117 ou pelo menos uma proteína de fusão ou conjugado de acordo com qualquer um dos itens de 121 a 135, e pelo menos um anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno dele.
[0663] 137. Complexo, de acordo com o item 136, em que o dito pelo menos um anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno é selecionado do grupo consistindo em anticorpos de comprimento total, fragmentos Fab, fragmentos Fab’, fragmentos F(ab’)2, fragmentos Fc, fragmentos Fv, fragmentos Fv de cadeia simples, (scFv)2 e anticorpos de domínio.
[0664] 138. Complexo, de acordo com o item 137, em que o dito pelo menos um anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno é selecionado do grupo consistindo em anticorpos de comprimento total, fragmentos Fab e fragmentos scFv.
[0665] 139. Complexo, de acordo com o item 138, em que o dito pelo menos um anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno é um anticorpo de comprimento total.
[0666] 140. Complexo, de acordo com qualquer um dos itens de 136 a 139, em que o dito anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno é um anticorpo monoclonal ou um fragmento de ligação de antígeno dele.
[0667] 141. Complexo, de acordo com qualquer um dos itens de 136 a 140, em que o dito anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno é selecionado do grupo consistindo em anticorpos humanos, anticorpos humanizados e anticorpos quiméricos, e seus fragmentos de ligação de antígeno.
[0668] 142. Complexo, de acordo com o item 141, em que o dito anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno é um anticorpo humano ou humanizado, ou um fragmento de ligação de antígeno dele.
[0669] 143. Complexo, de acordo com qualquer um dos itens de 136 a 142, em que o dito anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno tem afinidade para um antígeno, tal como selecionado do grupo consistindo em um antígeno associado com um distúrbio relacionado à angiogênese e um antígeno associado com a resposta imune ou com um distúrbio do sistema imunológico.
[0670] 144. Complexo, de acordo com o item 143, em que o dito antígeno está associado com um distúrbio relacionado á angiogênese.
[0671] 145. Complexo, de acordo com o item 143, em que o dito antígeno está associado com a resposta imune ou com um distúrbio do sistema imunológico, por exemplo, associado com inflamação.
[0672] 146. Complexo, de acordo com qualquer um dos itens de 136 a 145, que é uma proteína de fusão ou um conjugado.
[0673] 147. Complexo, de acordo com qualquer um dos itens de 136 a 146, em que o dito polipeptídeo de ligação de IL-17A está anexado ao terminal N ou terminal C da cadeia pesada do dito anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno.
[0674] 148. Complexo, de acordo com qualquer um dos itens de 136 a 146, em que o dito polipeptídeo de ligação de IL-17A está anexado ao terminal N ou terminal C da cadeia leve do dito anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno.
[0675] 149. Complexo, de acordo com qualquer um dos itens de 136 a 146, em que o dito polipeptídeo de ligação de IL-17A está anexado ao terminal N e/ou terminal C da cadeia leve e cadeia pesada do dito anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno.
[0676] 150. Complexo, de acordo com qualquer um dos itens de 146 a 149, que é uma proteína de fusão.
[0677] 151. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, proteína de fusão, conjugado ou complexo, de acordo com qualquer item anterior, compreendendo adicionalmente pelo menos um ligante, por exemplo, selecionada do grupo consistindo em ligantes não peptídicos, ligantes de aminoácido flexível, ligantes de aminoácido rígido e ligantes de aminoácido clivável.
[0678] 152. Proteína de fusão ou conjugado, de acordo com o item 151, em que o dito ligante está disposto entre a dita primeira porção e a dita segunda porção.
[0679] 153. Complexo, de acordo com o item 151, em que o dito ligante está disposto entre o dito polipeptídeo de ligação de IL-17A e o dito anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno.
[0680] 154. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, proteína de fusão, conjugado ou complexo, de acordo com qualquer um dos itens de 151 a 153, em que o dito ligante é um ligante flexível compreendendo resíduos de aminoácido selecionados do grupo consistindo em glicina, serina e treonina.
[0681] 155. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, proteína de fusão, conjugado ou complexo, de acordo com o item 154, em que o dito ligante compreende uma sequência com uma fórmula geral selecionada dentre (GnSm)p e (SnGm)p, em que, independentemente, n = 1 a 7, m = 0 a 7,n + m < 8 e p = 1 a 10.
[0682] 156. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, proteína de fusão, conjugado ou complexo, de acordo com o item 155, em que n = 1 a 5.
[0683] 157. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, proteína de fusão, conjugado ou complexo, de acordo com qualquer um dos itens 155 a 156, em que m = 0 a 5.
[0684] 158. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, proteína de fusão, conjugado ou complexo, de acordo com qualquer um dos itens de 155 a 157, em que p = 1 a 5.
[0685] 159. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, proteína de fusão, conjugado ou complexo, de acordo com qualquer um dos itens de 156 a 158, em que n = 4, m = 1 e p = 1 a 4.
[0686] 160. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, proteína de fusão, conjugado ou complexo, de acordo com o item 159, em que o dito ligante compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo em G4S, (G4S)2, (G4S)3 e (G4S)4.
[0687] 161. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, proteína de fusão, conjugado ou complexo, de acordo com o item 160, em que o dito ligante compreende uma sequência G4S.
[0688] 162. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, proteína de fusão, conjugado ou complexo, de acordo com qualquer um dos itens de 155 a 159, em que a dita fórmula geral é GT(GnSm)p.
[0689] 163. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, proteína de fusão, conjugado ou complexo, de acordo com o item 162, em que o dito ligante compreende a sequência GTG4S.
[0690] 164. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, proteína de fusão, conjugado ou complexo, de acordo com qualquer item anterior, compreendendo ainda um rótulo.
[0691] 165. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, proteína de fusão, conjugado ou complexo, de acordo com o item 164, em que o dito rótulo é selecionado do grupo consistindo em corantes fluorescentes e metais, corantes cromofóricos, compostos quimioluminescentes, e proteínas bioluminescentes, enzimas, radionuclídeos e partículas.
[0692] 166. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, proteína de fusão, conjugado ou complexo, de acordo com qualquer item anterior, compreendendo um ambiente quelante provido por um quelante de poliaminopolicarboxilato conjugado para o polipeptídeo de ligação de IL-17A através de um grupo tiol de um resíduo de cisteína ou um grupo amina de um resíduo de lisina.
[0693] 167. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, proteína de fusão, conjugado ou complexo, de acordo com qualquer item anterior, compreendendo uma ou mais porções de polietileno glicol.
[0694] 168. Polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens de 1 a 163.
[0695] 169. Vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo de acordo com o item 168.
[0696] 170. Célula hospedeira compreendendo um vetor de expressão de acordo com o item 169.
[0697] 171. Método de produção de um polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens de 1 a 163, compreendendo:- cultivar uma célula hospedeira de acordo com o item 170 sob as condições permissivas de expressão do dito polipeptídeo do dito vetor de expressão, e - isolar o dito polipeptídeo.
[0698] 172. Composição compreendendo um polipeptídeo de ligação de IL-17A, proteína de fusão, conjugado ou complexo, de acordo com qualquer um dos itens de 1 a 167 e pelo menos um excipiente ou transportador farmaceuticamente aceitável.
[0699] 173. Composição, de acordo com o item 172, compreendendo adicionalmente pelo menos um agente ativo adicional, tal como um agente selecionado do grupo consistindo em polipeptídeos terapeuticamente ativos, agentes de modificação de resposta imune, agentes anti-inflamatórios e compostos tóxicos.
[0700] 174. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, proteína de fusão, conjugado ou complexo, de acordo com qualquer um dos itens de 1 a 167 ou uma composição de acordo com qualquer um dos itens 172 e 173 para administração oral, tópica, intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, pulmonar, transdérmica, intramuscular, intranasal, bucal, sublingual ou supositório, tal como para administração oral ou tal como para administração tópica.
[0701] 175. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, proteína de fusão, conjugado ou complexo, de acordo com qualquer um dos itens de 1 a 167 ou uma composição de acordo com qualquer um dos itens 172 e 173 para uso como medicamento, um agente diagnóstico ou um agente prognóstico.
[0702] 176. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, proteína de fusão, conjugado, complexo ou composição para uso, de acordo com o item 175, em que o dito polipeptídeo, proteína de fusão, conjugado, complexo ou composição modula a função de IL-17A in vivo.
[0703] 177. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, proteína de fusão, conjugado, complexo ou composição para uso de acordo com qualquer um dos itens 175 e 176, em que o dito polipeptídeo, proteína de fusão, conjugado, complexo ou composição inibe a sinalização de IL-17A.
[0704] 178. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, proteína de fusão, conjugado, complexo ou composição para uso, de acordo com qualquer um dos itens de 175 a 177, em que o dito polipeptídeo, proteína de fusão, conjugado, complexo ou composição bloqueia a ligação de IL-17A para pelo menos um de seus receptores cognatos.
[0705] 179. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, proteína de fusão, conjugado, complexo ou composição para uso de acordo com qualquer um dos itens 175 a 178no tratamento, diagnóstico ou prognóstico de uma condição associada à IL-17A.
[0706] 180. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, proteína de fusão, conjugado, complexo ou composição para uso de acordo com o item 179, em que a dita condição associada à IL-17A é selecionada do grupo consistindo em doenças inflamatórias, doenças autoimunes e câncer.
[0707] 181. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, proteína de fusão, conjugado, complexo ou composição para uso de acordo com o item 180, em que a dita condição associada à IL-17A é selecionada do grupo consistindo em doenças inflamatórias e doenças autoimunes.
[0708] 182. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, proteína de fusão, conjugado, complexo ou composição para uso de acordo com o item 181, em que a dita condição associada à IL-17A é selecionada do grupo consistindo em condições inflamatórias, condições alérgicas, reações de hipersensibilidade, doenças autoimunes, infecções severas e rejeições de transplante.
[0709] 183. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, proteína de fusão, conjugado, complexo ou composição para uso de acordo com o item 182, em que a dita condição associada à IL-17A é selecionada do grupo consistindo em artrite reumatoide, espondilite anquilosante, artrite psoriática, psoríase, esclerose múltipla, lúpus eritematoso sistêmico, uveíte e doença do olho seco.
[0710] 184. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, proteína de fusão, conjugado, complexo ou composição para uso de acordo com o item 183, em que a dita condição associada à IL-17A é psoríase.
[0711] 185. Polipeptídeo de ligação de IL-17A, proteína de fusão, conjugado ou complexo para uso em prognóstico de acordo com o item 179, em que a dita condição associada à IL-17A é câncer, tal como um câncer selecionada do grupo consistindo em cânceres gástricos, cânceres colorretais, cânceres de pulmão de célula não pequena, carcinomas hepatocelulares e adenocarcinomas.
[0712] 186. Método de detecção de IL-17A, compreendendo prover uma amostra suspeita de conter IL-17A, colocando a dita amostra em contato com um polipeptídeo de ligação de IL-17A, proteína de fusão, conjugado ou complexo de acordo com qualquer um dos itens de 1 a 167 ou uma composição de acordo com qualquer um dos itens 172 e 173, e detectando a ligação do polipeptídeo de ligação de IL-17A, proteína de fusão, conjugado, complexo ou composição para indicar a presença de IL-17A na amostra.
[0713] 187. Método para determinar a presença de IL-17A em um indivíduo, o método compreendendo as etapas: colocação do indivíduo, ou uma amostra isolada do indivíduo, em contato com um polipeptídeo de ligação de IL- 17A, proteína de fusão, conjugado ou complexo de acordo com qualquer um dos itens de 1 a 167 ou uma composição de acordo com qualquer um dos itens 172 e 173, e obtenção de um valor correspondendo à quantidade do polipeptídeo de ligação de IL-17A, proteína de fusão, conjugado, complexo ou composição que tenha se ligado no dito indivíduo ou na dita amostra.
[0714] 188. Método, de acordo com o item 187, compreendendo adicionalmente uma etapa de comparação do dito valor para uma referência.
[0715] 189. Método, de acordo com o item 187 ou 188, em que o dito indivíduo é um indivíduo mamífero, tal como um indivíduo humano.
[0716] 190. Método, de acordo com qualquer um dos itens de 187 a 189, realizado in vivo.
[0717] 191. Método, de acordo com qualquer um dos itens de 187 a 189, realizado in vitro.
[0718] 192. Método de tratamento de uma condição associada à IL-17A, compreendendo administrar a um indivíduo em necessidade respectiva uma quantidade eficaz de um polipeptídeo de ligação de IL-17A, proteína de fusão, conjugado ou complexo de acordo com qualquer um dos itens de 1 a 167 ou uma composição de acordo com qualquer um dos itens 172 e 173.
[0719] 193. Método, de acordo com o item 192, em que a dita condição associada à IL-17A é selecionada do grupo consistindo em doenças inflamatórias, doenças autoimunes e câncer.
[0720] 194. Método, de acordo com o item 193, em que a dita condição associada à IL-17A é selecionada do grupo consistindo em doenças inflamatórias e doenças autoimunes.
[0721] 195. Método, de acordo com o item 194, em que a dita condição associada à IL-17A é selecionada do grupo consistindo em condições inflamatórias, condições alérgicas, reações de hipersensibilidade, doenças autoimunes, infecções graves e rejeições de transplante.
[0722] 196. Método, de acordo com o item 195, em que a dita condição associada à IL-17A é selecionada do grupo consistindo em artrite reumatoide, espondilite anquilosante, artrite psoriática, psoríase, esclerose múltipla, lúpus eritematoso sistêmico, uveíte e doença do olho seco.
[0723] 197. Método, de acordo com o item 196, em que a dita condição associada à IL-17A é psoríase.

Claims (17)

1. POLIPEPTÍDEO DE LIGAÇÃO A IL-17A, caracterizado por compreender um motivo BM de ligação a IL-17A, cujo motivo consiste em uma sequência de aminoácido selecionada dentre: i) EX2DX4AX6X7EIX10X11LPNL X16X17X18QX20X21AFIX25 X26LX28X29 em que, independentemente um do outro, X2 é selecionado dentre A, H, M e Y; X4 é selecionado dentre A, D, E, F, K, L, M, N, Q, R, S e Y; X6 é selecionado dentre A, Q e W; X7 é selecionado dentre F, I, L, M, V, W e Y; X10 é selecionado dentre A e W; X11 é selecionado dentre A, D, E, F, G, L, M, N, Q, S, T e Y; X16 é selecionado dentre N e T; X17 é selecionado dentre H, W e Y; X18 é selecionado dentre A, D, E, H e V; X20 é selecionado dentre A, G, Q, S e W; X21 é selecionado dentre A, D, E, F, H, K, N, R, T, V, W e Y; X25 é selecionado dentre A, D, E, G, H, I, L, M, N, Q, R, S, T e V; X26 é selecionado dentre K e S; X28 é selecionado dentre I, L, N e R; e X29 é selecionado dentre D e R; e ii) uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 89% de identidade para a sequência definida em i).
2. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por, na sequência i), X2 ser selecionado dentre A, H e M; X4 ser selecionado dentre A, D, E, F, L, M, N, Q, R e Y; X11 ser selecionado dentre A, D, E, F, G, L, M, N, S, T e Y; X18 ser selecionado dentre A, D, E e V; X20 ser selecionado dentre A, G, Q e W; X21 ser selecionado dentre E, F, H, N, R, T, V, W e Y; X25 ser selecionado dentre A, D, E, G, H, I, L, N, Q, R, S, T e V; e X28 ser selecionado dentre I, N e R.
3. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por, na sequência i), X16 ser T; X17 ser W; X21 ser selecionado dentre E, F, H, W, T e Y; X25 ser selecionado dentre A, D, E, G, H, I, L, N, Q, R, S e T; X26 ser K; e X29 ser D.
4. POLIPEPTÍDEO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pela sequência i) ser a sequência da posição 8 para a posição 36 em uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1 a 1216.
5. POLIPEPTÍDEO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por compreender um módulo de ligação de sequência de aminoácido, BMod, selecionado dentre: iii) K-[BM]-DPSQS XaXbLLXc EAKKL XdXeXfQ; em que [BM] é um motivo de ligação a IL-17A, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 contanto que X29 seja D; Xa é selecionado dentre A e S; Xb é selecionado dentre N e E; Xc é selecionado dentre A, S e C; Xd é selecionado dentre E, N e S; Xe é selecionado dentre D, E e S; Xf é selecionado dentre A e S; e iv) uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 85% de identidade para uma sequência definida por iii).
6. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pela dita sequência iii) ser a sequência da posição 7 para a posição 55 em uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1 a 1216.
7. POLIPEPTÍDEO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por compreender uma sequência de aminoácido selecionada dentre: vii) YA-[BMod]-AP; em que [BMod] é um módulo de ligação a IL-17A, como definido em qualquer uma das reivindicações 5 e 6; e viii) uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 86% de identidade para uma sequência definida por vii).
8. POLIPEPTÍDEO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada por compreender uma sequência de aminoácido selecionada dentre:xiii) VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK; em que [BM] é um motivo de ligação a IL-17A como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4; e xiv) uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 86% de identidade para a sequência definido em xiii).
9. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pela sequência xiii) ser selecionada dentre SEQ ID NO: 1 a 1216.
10. POLIPEPTÍDEO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por compreender uma sequência de aminoácido selecionada dentre: xv) AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK; em que [BM] é um motivo de ligação a IL-17A como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4; e xvi) uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 86% de identidade para a sequência definida em xv).
11. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pela sequência xv) ser selecionada dentre SEQ ID NO: 1217 a 1222.
12. POLIPEPTÍDEO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado por ser capaz de se ligar à IL-17a, de modo que o valor de KD da interação seja no máximo 1 x 10-6 M, tal como no máximo 1 x 10-7 M, tal como no máximo 1 x 10-8 M, tal como no máximo 1 x 10-9 M.
13. PROTEÍNA DE FUSÃO OU CONJUGADO, caracterizada por compreender: - uma primeira porção consistindo em um polipeptídeo de ligação a IL-17A, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12; e- uma segunda porção consistindo em um polipeptídeo tendo uma atividade biológica desejada.
14. COMPLEXO, caracterizado por compreender pelo menos um polipeptídeo de ligação a IL-17A, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, ou pelo menos uma proteína de fusão ou conjugado, conforme definido na reivindicação 13, e pelo menos um anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno dele.
15. POLINUCLEOTÍDEO QUE CODIFICA UM POLIPEPTÍDEO, caracterizado por ser conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14.
16. COMPOSIÇÃO, caracterizada por compreender um polipeptídeo de ligação a IL-17A, proteína de fusão, conjugado ou complexo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14 e pelo menos um excipiente ou transportador farmaceuticamente aceitável.
17. POLIPEPTÍDEO DE LIGAÇÃO A IL-17A, PROTEÍNA DE FUSÃO, CONJUGADO OU COMPLEXO, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14 ou uma composição, conforme definida na reivindicação 16, caracterizado por ser utilizado como um medicamento, um agente diagnóstico ou um agente prognóstico.
BR122024013519-1A 2015-01-12 2016-01-12 Polipeptídeo de ligação de il-17a, proteína de fusão ou conjugado, complexo, polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo, e, composição BR122024013519A2 (pt)

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