JP7028557B2 - 新規ポリペプチド - Google Patents
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Description
本願は、インターロイキン-6(以下、IL-6と称する)に対する結合親和性を有する改変されたポリペプチドのクラスに関する。本願はまた、治療剤、予後予測剤及び/又は診断剤としての当該IL-6結合ポリペプチドの使用に関する。
炎症は、例えば病原体及び損傷細胞を破壊する自然免疫系によるサイトカイン駆動応答である。慢性関節リウマチ(RA)及びクローン病などのいくつかの疾患状態では、炎症系の調節が損なわれ、組織損傷を引き起こす。最も研究されている炎症誘発剤の中には、サイトカインであるインターロイキン-6(IL-6)及び腫瘍壊死因子(TNF)がある。IL-6は、B細胞刺激因子2(BSF2)、肝細胞刺激因子(HSF)、ハイブリドーマ増殖因子(HGF)及びインターフェロン-β2(IFNB2)としても知られている。
i)EEX3X4AWX7EIHX11LPNLX16X17X18QX20X21AFIX25X26LX28X29
(式中、互いに独立して、
X3が、A、F、H、K、Q、R、S、W及びYから選択され;
X4が、A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V及びYから選択され;
X7が、F、H、I、K、L、M、N、R、S、T、V、W及びYから選択され;
X11が、A、I、K、L、M、N、R、S、T及びVから選択され;
X16が、N及びTから選択され;
X17が、A、I、T及びV;
X18が、D、E、G、H、K、N、Q、R、S及びTから選択され;
X20が、I、L、M、R、T及びVから選択され;
X21が、A、S、T及びVから選択され;
X25が、I、M、Q、S、T、V及びWから選択され;
X26が、K及びSから選択され;
X28が、F、L、M及びYから選択され;並びに、
X29が、D及びRから選択される)
及び、
ii)i)で定義された配列と少なくとも93%の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択されるアミノ酸配列からなる、IL-6結合ポリペプチドが提供される。
第1の態様による一実施形態では、ポリペプチドが提供され、ここで、配列i)のアミノ酸残基「Xn」は、「可能性のある残基」から選択される。従って、表1は、本願の第1の態様のいくつかの特定の個別化された実施形態を開示する。例えば、第1の態様による一実施形態では、配列i)のX3がA、H、K、Q、R及びYから選択されるポリペプチドが提供され、第1の態様による別の実施形態では、配列i)のX3がA、K、Q、R及びYから選択されるポリペプチドが提供される。疑わしいことを避けるために、列挙された実施形態は、さらに他の実施形態において自由に組み合わせることができる。例えば、そのような組合せ実施形態の1つは、X3がA、K、R及びYから選択され、X4がH及びKから選択され、X11がA、I、L及びTから選択されるポリペプチドである。
X3が、A、H、K、Q、R及びYから選択され;
X4が、A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V及びYから選択され;
X7が、F、H、I、K、L、M、N、R、T、V、W及びYから選択され;
が、A、I、K、L、N、S、T及びVから選択され;
X16が、Tであり;
X17が、A、I、T及びVから選択され;
X18が、D、E、H、K、N、Q、R、S及びTから選択され;
X20が、I、L、M、R及びVから選択され;
X21が、A、S及びVから選択され;
X25が、I、Q、S、T、V及びWから選択され;
X26が、Kであり;
X28が、F、L、M及びYから選択され;並びに、
X29が、Dである、
ポリペプチドが提供される。
I.X3が、K及びRから選択される;
II.X11が、A及びLから選択される;
III.X16が、Tである;
IV.X17が、I及びVから選択される;
V.X18が、D及びEから選択される;
VI.X20が、Mである;
VII.X21が、Aである;
VIII.X25が、S及びTから選択される;
IX.X26が、Kである;
X.X28が、F;並びに
XI.X29が、Dである、
の少なくとも6つを満たす。
iii)K-[BM]-DPSQSXaXbLLXcEAKKLXdXeXfQ
(式中、
[BM]は、本明細書で定義されたIL-6結合モチーフであり、但し、X29は、Dであり;
X aは、A及びSから選択され;
X bは、N及びEから選択され;
X cは、A、S及びCから選択され;
X dは、E、N及びSから選択され;
X eは、D、E及びSから選択され;
X fは、A及びSから選択される);及び、
iv)iii)によって定義される配列と少なくとも91%の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択される。
v)K-[BM]-QPEQSXaXbLLXcEAKKLXdXeXfQ
(式中、
[BM]は、本明細書で定義されたIL-6結合モチーフであり、但し、X29 は、Rであり;
X a は、A及びSから選択され;
X b は、N及びEから選択され;
X c は、A、S及びCから選択され;
X d は、E、N及びSから選択され;
X e は、D、E及びSから選択され;
X f は、A及びSから選択される);及び、
vi)v)によって定義される配列と少なくとも91%の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択される。
一実施形態において、配列iii)又はv)のXaは、Sである。
一実施形態において、配列iii)又はv)のXbは、Nである。
一実施形態において、配列iii)又はv)のXbは、Eである。
一実施形態において、配列iii)又はv)のXcは、Aである。
一実施形態において、配列iii)又はv)のXcは、Sである。
一実施形態において、配列iii)又はv)のXcは、Cである。
一実施形態において、配列iii)又はv)のXdは、Eである。
一実施形態において、配列iii)又はv)のXdは、Nである。
一実施形態において、配列iii)又はv)のXdは、Sである。
一実施形態において、配列iii)又はv)のXeは、Dである。
一実施形態において、配列iii)又はv)のXeは、Eである。
一実施形態において、配列iii)又はv)のXeは、Sである。
一実施形態において、配列iii)又はv)のXdXeは、SEである。
一実施形態において、配列iii)又はv)のXdXeは、SDである。
一実施形態において、配列iii)又はv)のXfは、Aである。
一実施形態において、配列iii)又はv)のXfは、Sである。
一実施形態において、配列iii)又はv)のXaはA;XbはN;XcはC及びXfはAである。
一実施形態において、配列iii)又はv)のXaはS;XbはE;XcはS及びXfはSである。
一実施形態において、配列iii)又はv)のXaはS;XbはE;XcはC及びXfはSである。
一実施形態において、配列iii)又はv)のXaはA;XbはN;XcはA;XdXeはND及びXfはAである。
一実施形態において、配列iii)又はv)のXaはA;XbはN;XcはC;XdXeはND及びXfはAである。
一実施形態において、配列iii)又はv)のXaはS;XbはE;XcはS;XdXeはND及びXfはSである。
一実施形態において、配列iii)又はv)のXaはS;XbはE;XcはC;XdXeはND及びXfはSである。
一実施形態において、配列iii)又はv)のXaはA;XbはN;XcはA;XdXeはSE及びXfはAである。
一実施形態において、配列iii)又はv)のXaはA;XbはN;XcはC;XdXeはSE及びXfはAである。
一実施形態において、配列iii)又はv)のXaはS;XbはE;XcはS;XdXeはSE及びXfはSである。
一実施形態において、配列iii)又はv)のXaはS;XbはE;XcはC;XdXeはSE及びXfはSである。
一実施形態において、配列iii)又はv)のXaはA;XbはN;XcはA;XdXeはSD及びXfはAである。
一実施形態において、配列iii)又はv)のXaはA;XbはN;XcはC;XdXeはSD及びXfはAである。
一実施形態において、配列iii)又はv)のXaはS;XbはE;XcはS;XdXeはSD及びXfはSである。
一実施形態において、配列iii)又はv)のXaはS;XbはE;XcはC;XdXeはSD及びXfはSである。
一実施形態において、配列iii)又はv)のXaはA;XbはN;XcはA;XdXeはES及びXfはAである。
一実施形態において、配列iii)又はv)のXaはA;XbはN;XcはC;XdXeはES及びXfはAである。
一実施形態において、配列iii)又はv)のXaはS;XbはE;XcはS;XdXeはES及びXfはSである。
一実施形態において、配列iii)又はv)のXaはS;XbはE;XcはC;XdXeはES及びXfはSである。
vii)YA-[BMod]-AP;
(式中、[BMod]は、上記定義のIL-6結合モジュールである);及び、
viii)vii)で定義される配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択されるアミノ酸配列を含む、IL-6結合ポリペプチドが提供される。
ix)FN-[BMod]-AP;
(式中、[BMod]は、上記定義のIL-6結合モジュールである);及び、
x)ix)で定義される配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択されるアミノ酸配列を含む、IL-6結合ポリペプチドが提供される。
ADNNFNK-[BM]-DPSQSANLLSEAKKLNESQAPK;
ADNKFNK-[BM]-DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK;
ADNKFNK-[BM]-DPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK;
ADAQQNNFNK-[BM]-DPSQSTNVLGEAKKLNESQAPK;
AQHDE-[BM]-DPSQSANVLGEAQKLNDSQAPK;
VDNKFNK-[BM]-DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK;
AEAKYAK-[BM]-DPSESSELLSEAKKLNKSQAPK;
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNDAQAPK;
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNDSQAPK;
AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;
AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK;
AEAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLSESQAPK;
AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLESSQAPK;
AEAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLESSQAPK;
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK;
VDAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLSESQAPK;
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLESSQAPK;
VDAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLESSQAPK;
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNKAQAPK;及び
AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNKAQAPK
(式中、[BM]は、上記で定義されるIL-6結合モチーフである)
xi)VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;
(式中、[BM]は、上で定義したIL-6結合モチーフである)、及び、
xii)xi)で定義した配列と少なくとも89%の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択されるアミノ酸配列を含む。
xiii)AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;
(式中、[BM]は、上で定義したIL-6結合モチーフである)、及び、
xiv)xiii)で定義した配列と少なくとも89%の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択されるアミノ酸配列を含む。
-保護された反応性側鎖を有する第1の態様のポリペプチドを形成するためのアミノ酸及び/又はアミノ酸誘導体の段階的カップリング、
-ポリペプチドの反応性側鎖からの保護基の除去、及び
-水溶液中でのポリペプチドの折り畳み、
を含んでいる。
-被験体又は被験体から単離されたサンプルを、本明細書に記載のIL-6結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲート又は組成物と接触させる工程、及び
-前記被験体又は前記試料に結合したIL-6結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲート又は組成物の量に対応する値を得る工程、
を含む。
以下の実施例は、インターロイキン6(IL-6)を標的とする新規なZ変異体分子の開発を開示する。ファージライブラリーを用いたファージディスプレイ技術を用いて、Z変異体を得た。本明細書に記載されるIL-6結合ポリペプチドをコードする遺伝子を配列決定し、対応するアミノ酸配列を図1に列挙し、識別子配列番号1~1551で表示した。
IL-6結合Z変異体の選択及びELISAスクリーニング
標的タンパク質、ヒト及びマウスIL-6のビオチン化:No-Weigh EZ-Link Sulfo-NHS-LC(Thermo Scientific、カタログ番号21327)を用いて、製造業者の推奨に従って12×モル過剰で添加して、hIL-6及びmIL-6(Peprotech、各カタログ番号200-06及び216-16)をビオチン化した。反応は室温(RT)で30分間行った。次に、Slide-a-lyzer透析カセット(Thermo Scientific、カタログ番号66333,3,500 MWCO)を用いて、製造元の指示に従って、リン酸緩衝生理食塩水(PBS、10mMリン酸、137mM NaCl、2.68mM KCl、pH7.4)に緩衝液を交換する。
IL-6結合Z変異体のファージディスプレイ選択:個々のクローンを、ビオチン化hIL-6及びmIL-6に対する4サイクルのファージディスプレイ選択の後に調製した。
IL-6結合Z変異体の産生及びインビトロ特性決定
Z変異体のサブクローニング:13のIL-6結合Z変異体のDNA、Z06777(配列番号1503)、Z06779(配列番号1504)、Z06789(配列番号1505)、Z06791(配列番号1506)、Z06792(配列番号1507)、Z06799(配列番号1508)、Z06802(配列番号1509)、Z06805(配列番号1510)、Z06809(配列番号1511)、Z06814(配列番号1512)、Z06829(配列番号1513)、Z06834(配列番号1514)、Z06844(配列番号1515)を、ライブラリーベクターpAY02592から増幅した。標準的な分子生物学技術(別の標的に結合するZ変異体について、国際公開第2009/077175号に本質的に記載されているように)を用いて、N末端His6タグを有する単量体Z変異体分子の構築のサブクローニング戦略を適用した。Z遺伝子フラグメントを発現ベクターpAY01448にサブクローニングして、コードされた配列MGSSHHHHHHLQ-[Z#####]-VDを得た。
培養及び精製:N末端His6タグを用いて構築された13のIL-6結合Z変異体(配列番号1503~1515)を大腸菌で産生させた。280nmでの吸光度を測定することによって分光光度的に決定した、約2~5gの細菌ペレット由来のIMAC精製タンパク質の量は、異なるIL-6結合Z変異体について約10mg~20mgの範囲であった。ABD変異体PP013(配列番号1554)に融合された5つのZ変異体、約2.5gの細菌ペレットから2mg~12mgが得られた。各最終タンパク質調製物のSDS-PAGE分析は、これらが主にIL-6結合Z変異体を含有することを示した。各IL-6結合Z変異体の正確な同一性及び分子量を、HPLC-MS分析によって確認した。
IL-6結合Z変異体の第一の成熟したライブラリーの設計及び構築
ライブラリー設計:ライブラリーは、実施例1及び2に記載のIL-6結合Z変異体の配列の選択に基づいた。新しいライブラリーでは、Z分子骨格中の12の可変位置は、特定のアミノ酸残基にバイアスを有し、1つの位置は、配列番号1503~1551に定義されたZ変異体配列に基づく戦略に従って、一定に保たれた。スプリットプール合成を使用して、147bpのDNAリンカーを生成し、Z変異体アミノ酸配列の部分的に無作為化されたヘリックス1及び2をコードした。従って、制限部位XhoI及びSacIに隣接する5’-AA ATA AAT CTC GAG GTA GAT GCC AAA TAC GCC AAA GAA NNN NNN NNN GCG TGG NNN GAG ATC NNN NNN CTG CCT AAC CTC ACC NNN NNN CAA NNN NNN GCC TTC ATC NNN AAA TTA NNN GAT GAC CCA AGC CAG AGC TCA TTA TTT A-3’(配列番号1560;NNNと表示したランダム化コドン)は、DNA2.0(Menlo Park、CA、USA)に注文した。Z分子骨格における12の可変Z位置(9,10,11,14,17,18,24,25,27,28,32及び35)を含む新しいライブラリー中のアミノ酸残基の理論的分布を表6に示す。結果として得られる理論上のライブラリーサイズは、3.6×109変異体である。
ライブラリー構築:新しいライブラリーは、結合特性が確認されたIL-6結合Z変異体のセット(実施例1及び2)に基づいて設計された。設計されたライブラリーの理論上のサイズは、3.6×109個のZ変異体であった。大腸菌ER2738細胞への形質転換後の滴定によって決定されたライブラリーの実際のサイズは、3.5×109個の形質転換体であった。
第一の成熟したライブラリーからのZ変異体の選択、スクリーニング及び特徴付け
成熟IL-6結合Z変異体のファージディスプレイ選択:標的タンパク質hIL-6(R&D Systems、カタログ番号206-IL/CF)及びmIL-6(Abnova、カタログ番号P4346116)は、実施例1に記載のようにビオチン化した。実施例3に記載のZ変異体分子の新規ライブラリーを用いたファージディスプレイ選択は、以下の例外を除いて、本質的には実施例1に記載されるように、hIL-6及びmIL-6に対して4サイクルで実施した。選択時に、ウシ胎仔血清(FCS、Gibco、カタログ番号10108-165)及びヒト血清アルブミン(HSA、Albucult、Novozymes、カタログ番号230-005)を選択緩衝液に最終濃度10%及び1.5μMになるように添加した。選択に用いた全ての試験管及びビーズを、3%BSAを補充した0.1%のPBSTで予備ブロッキングした。サイクル1Aでは、SA-ビーズとファージストックのインキュベーションによって予備選択工程を実施した。全てのトラックに対し、サイクル1で選択容量は2mlであった。ファージ-標的複合体の捕捉のために、4μgのビオチン化hIL-6又はmIL-6あたり1mgのビーズを使用した。
成熟したIL-6結合Z変異体のファージディスプレイ選択:各4サイクルを含む完全に並列の12トラックで選択した。異なる選択トラックは、標的濃度、標的型(hIL-6又はmIL-6)、選択時間、洗浄条件及び溶出緩衝液のpHを変えた。
IL-6結合Z変異体の第2成熟ライブラリーの設計及び構築
ライブラリー設計:ライブラリーは、実施例4に記載のヒトIL-6結合Z変異体の配列の選択に主に基づいた。新しいライブラリーでは、Z分子骨格中の13の可変位置は、主に第1の成熟からのZ変異体、すなわち、配列番号7、配列番号15~89及び配列番号151~871で定義された配列に基づく戦略に従って、特定のアミノ酸残基にバイアスを有した。無作為の二本鎖リンカーは、後に構築される二本鎖DNAの連結及び制限を用いて、トリヌクレオチド構築阻害の無作為セットの組み込みを可能にするColibra(商標)技術によって生成された。二本鎖DNAのライブラリーであり、制限部位XhoI及びSacIに隣接するZ変異体アミノ酸配列の部分的にランダム化されたヘリックス1及び2をコードする、5’-AA ATA AAT CTC GAG GTA GAT GCC AAA TAC GCC AAA GAA NNN NNN NNN GCT NNN NNN GAG ATC NNN NNN CTG CCG AAC CTG ACC NNN NNN CAG NNN NNN GCC TTC ATC NNN AAA TTA NNN GAT GAC CCA AGC CAG AGC TCA TTA TTT A-3’(配列番号1561;ランダム化コドンをNNNと表示する)をIsogenica(Essex、UK)から注文された。Z分子骨格中に8つの可変アミノ酸位置(10,11,14,18,24,25,27及び32)及び5つの定常アミノ酸位置(9,13,17,28及び35)を含む、新規ライブラリー中のアミノ酸残基の理論的分布は、表10に示す。得られた理論上のライブラリーサイズは、2.6×107変異体であった。
ライブラリー構築及びファージストック調製:新規ライブラリーは、結合特性が確認されたIL-6結合Z変異体のセット(実施例4)に基づいて設計された。設計されたライブラリーの理論上のサイズは、2.6×107個の変異体であった。大腸菌ER2738細胞への形質転換後の滴定によって決定されたライブラリーの実際のサイズは、1.8×109個の形質転換体であった。
第2の成熟ライブラリーからのZ変異体の選択、スクリーニング及び特徴付け
成熟したIL-6結合Z変異体の第2のファージディスプレイ選択:実施例4に記載のように、標的タンパク質hIL-6をビオチン化した。実施例5に記載のZ変異体分子の第2の成熟化ライブラリーを用いた、ファージディスプレイ選択は、以下の例外を除いて、本質的に実施例4に記載の通り、hIL-6に対して実施した。全てのトラックに対し、サイクル1で選択容量は4mlであった。サイクル2では、選択トラック1-2及び1-3を1本の共通のチューブで取り扱い、最後の1分間の洗浄後まで分離せず、その後それらを別々に処理した。サイクル4でも、選択トラック1-1-1-1から1-1-1-3、1-1-1-4から1-1-1-6、1-1-2-1から1-1-2-3及び1-1-2-4から1-1-2-6それぞれを共通のチューブに入れ、最後の1分間の洗浄後に3本の別々のチューブに分割した後、表11に要約した異なる洗浄戦略を用いて別々に処理した。実施例1に記載のように、グリシン-HCl、pH2.2を用いて結合したファージ粒子を溶出させた。選択サイクル間のファージ粒子の増幅は、基本的に実施例1に記載したように行った。
成熟したIL-6結合Z変異体の第2のファージディスプレイ選択:各トラックは4つのサイクルを含み、合計17の並行トラックで選択を実施した。選択トラックは、表11に概説されているように、標的濃度、選択時間及び洗浄条件が異なっていた。
IL-6結合Z変異体のサブセットのサブクローニング、生産及び特性決定
Z変異体の発現ベクターへのサブクローニング:14のIL-6結合Z変異体、Z11632(配列番号7)、Z14630(配列番号6)、Z14700(配列番号8)、Z14712(配列番号9)、Z14861(配列番号4)、Z14862(配列番号10)、Z14976(配列番号1)、Z14984(配列番号5)、Z15015(配列番号2)、Z15036(配列番号11)、Z15110(配列番号12)、Z15122(配列番号3)、Z15126(配列番号13)及びZ15142(配列番号14)のDNAは、ベクターpAY02592から増幅した。サブクローニングを実施例2に記載のように実施した。Z遺伝子フラグメントを発現ベクターpAY01448にサブクローニングし、コードされた配列MGSSHHHHHHLQ-[Z#####]-VDを得た。
ProteOn動態分析:6つのHis6タグ化IL-6結合Z変異体とヒトIL-6との相互作用を、異なる固定化Z変異体を含む表面上で様々な濃度のhIL-6を注入することによりProteOn装置で分析した。表面のリガンド固定化レベルは、それぞれ100~220RUであった。1:1相互作用モデルを用いたhIL-6のZ変異体への結合に関する速度論的パラメータ(KD、ka(kon)及びkd(koff))の概要を表13に示す。
ABDとの融合におけるIL-6結合Z変異体のインビボ活性
IL-6標的Z変異体Z06814(配列番号1512)及び無関係の標的に結合する対照Z変異体Z04726(配列番号1535)をクローニングし、実施例2に記載のように、ABD変異体PP013(配列番号1554)と融合させた。Balb/cマウスの4つの群(n=8)に、5μg/kgのhIL-6(R&D Systems)の腹腔内(ip)投与9時間後に、Z06814-ABDを様々な用量(0,0.025,2.5又は25mg/kg体重)を皮下(sc)に注射した。第5群のマウス(n=8)は、25mg/kgのZ04726-ABDを受けた。マウスの2つのさらなる対照群は、それぞれPBS(n=4)及び25mg/kgのZ06814-ABD(n=8)を受けたが、その後IL-6注射はしなかった。20時間後、血液を心穿刺により採取し、血清を採取した。
Z変異体Z06814(配列番号1512)の抗関節炎効果を、IL-6誘発血清アミロイド-A(SAA)タンパク質放出をマウスモデルを用いて、インビボで評価した。4群のマウスに、5μg/kg体重のhIL-6を注射する9時間前に、0、0.025、2.5又は25mg/kg体重のIL-6結合Z06814-ABD融合タンパク質又は25mg/kgの対照Z04726-ABD融合タンパク質を与えた。さらに22時間後、SAAタンパク質のレベルを測定し、異なる群間で比較した。Z06814-ABD無し又は25mg/kgの対照Z04726-ABD融合物を投与していない動物では、血清中のSAAタンパク質レベルは約500~600μg/mlのレベルまで増加した。PBSのみ(及びhIL-6なし)を与えた対照動物は、16~64μg/mlの範囲のレベルを示した。Z06814-ABDを与えられた動物では、有意に低いSAAタンパク質レベルが用量依存的に測定された(図7)。最も高い用量のZ06814-ABD(25mg/kg体重)を与えられた群では、SAAタンパク質レベルは、hIL-6注射されていない動物ほど低かった。
i)EEX3X4AWX7EIHX11LPNLX16X17X18QX20X21AFIX25X26LX28X29
(式中、互いに独立して、
X3が、A、F、H、K、Q、R、S、W及びYから選択され;
X4が、A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V及びYから選択され;
X7が、F、H、I、K、L、M、N、R、S、T、V、W及びYから選択され;
X11が、A、I、K、L、M、N、R、S、T及びVから選択され;
X16が、N及びTから選択され;
X17が、A、I、T及びV;
X18が、D、E、G、H、K、N、Q、R、S及びTから選択され;
X20が、I、L、M、R、T及びVから選択され;
X21が、A、S、T及びVから選択され;
X25が、I、M、Q、S、T、V及びWから選択され;
X26が、K及びSから選択され;
X28が、F、L、M及びYから選択され;並びに、
X29が、D及びRから選択される)
及び、
ii)i)で定義された配列と少なくとも93%の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択されるアミノ酸配列からなる、IL-6結合ポリペプチド。
X3が、A、H、K、Q、R及びYから選択され;
X4が、A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V及びYから選択され;
X7が、F、H、I、K、L、M、N、R、T、V、W及びYから選択され;
X11が、A、I、K、L、N、S、T及びVから選択され;
X16が、Tであり;
X17が、A、I、T及びV;
X18が、D、E、H、K、N、Q、R、S及びTから選択され;
X20が、I、L、M、R及びVから選択され;
X21が、A、S及びVから選択され;
X25が、I、Q、S、T、V及びWから選択され;
X26が、Kであり;
X28が、F、L、M及びYから選択され;並びに、
X29が、Dである、
IL-6結合ポリペプチド。
I.X3が、K及びRから選択される;
II.X11が、A及びLから選択される;
III.X16が、Tである;
IV.X17が、I及びVから選択される;
V.X18が、D及びEから選択される;
VI.X20が、Mである;
VII.X21が、Aである;
VIII.X25が、S及びTから選択される;
IX.X26が、Kである;
X.X28が、F;並びに
XI.X29が、Dである、
の少なくとも6つを満たす、項目1又は2に記載のIL-6結合ポリペプチド。
iii)K-[BM]-DPSQSXaXbLLXcEAKKLXdXeXfQ
(式中、
[BM]は、項目1~27のいずれか1項に定義されるIL-6結合モチーフであり、但し、X29 は、Dであり;
Xa は、A及びSから選択され;
Xb は、N及びEから選択され;
Xc は、A、S及びCから選択され;
Xd は、E、N及びSから選択され;
Xe は、D、E及びSから選択され;
Xf は、A及びSから選択される);及び、
iv)iii)によって定義される配列と少なくとも91%の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択される、項目1~31のいずれか1項に記載のIL-6結合ポリペプチド。
v)K-[BM]-QPEQSXaXbLLXcEAKKLXdXeXfQ
(式中、
[BM]は、項目1~27のいずれか1項に定義されるIL-6結合モチーフであり、但し、X29 は、Rであり;
Xa は、A及びSから選択され;
Xb は、N及びEから選択され;
Xc は、A、S及びCから選択され;
Xd は、E、N及びSから選択され;
Xe は、D、E及びSから選択され;
Xf は、A及びSから選択される);及び、
vi)v)によって定義される配列と少なくとも91%の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択される、項目1~31のいずれか1項に記載のIL-6結合ポリペプチド。
vii)YA-[BMod]-AP
(式中、[BMod]は、項目32~48のいずれか1項に定義されるIL-6結合モジュールである);及び、
viii)vii)で定義される配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択されるアミノ酸配列を含む、項目1~48のいずれか1項に記載のIL-6結合ポリペプチド。
ix)FN-[BMod]-AP
(式中、[BMod]は、項目32~48のいずれか1項に定義されるIL-6結合モジュールである);及び、
x)ix)で定義される配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択されるアミノ酸配列を含む、項目1~48のいずれか1項に記載のIL-6結合ポリペプチド。
ADNKFNK-[BM]-DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK;
ADNKFNK-[BM]-DPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK;
ADAQQNNFNK-[BM]-DPSQSTNVLGEAKKLNESQAPK;
AQHDE-[BM]-DPSQSANVLGEAQKLNDSQAPK;
VDNKFNK-[BM]-DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK;
AEAKYAK-[BM]-DPSESSELLSEAKKLNKSQAPK;
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNDAQAPK;
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNDSQAPK;
AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;
AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK;
AEAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLSESQAPK;
AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLESSQAPK;
AEAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLESSQAPK;
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK;
VDAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLSESQAPK;
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLESSQAPK;
VDAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLESSQAPK;
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNKAQAPK;及び
AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNKAQAPK;
(式中、[BM]は、項目1~27のいずれか1項に定義されるIL-6結合モチーフである)
から選択されるアミノ酸配列を含む、項目1~50のいずれか1項に記載のIL-6結合ポリペプチド。
(式中、[BM]は、項目1~27のいずれか1項に定義されたIL-6結合モチーフである)、及び、
xii)xi)で定義された配列と少なくとも89%の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択されるアミノ酸配列を含む、項目1~49のいずれか1項に記載のIL-6結合ポリペプチド。
xiii)AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;
(式中、[BM]は、項目1~27のいずれか1項に定義されたIL-6結合モチーフである)、及び、
xiv)xiii)で定義した配列と少なくとも89%の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択されるアミノ酸配列を含む、IL-6結合ポリペプチド。
-所望の生物学的活性を有するポリペプチドからなる第2の部分、
を含む、融合タンパク質又はコンジュゲート。
-前記発現ベクター由来の前記ポリペプチドの発現を許容する条件下で、項目96に記載の宿主細胞を培養すること、及び
-前記ポリペプチドを単離すること、
を含む、方法。
-被験体又は被験体から単離されたサンプルを、項目1~93のいずれか1項に記載のIL-6結合ポリペプチド、融合タンパク質若しくはコンジュゲート又は項目98~99のいずれか1項に記載の組成物と接触させる工程、及び
-前記被験体又は前記サンプルに結合したIL-6結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲート又は組成物の量に対応する値を得る工程、
を含む、方法。
Claims (24)
- IL-6結合モチーフBMを含む、IL-6結合ポリペプチドであり、前記IL-6結合モチーフが:
i)EX 2 X3X4AWX7EIX 10 X11LPNLX16X17X18QX20X21AFIX25X26LX28X29
(式中、配列i)は、配列番号1~1551からなる群から選択される配列の8位から36位の配列に相当する)
及び、
ii)i)で定義された配列と少なくとも93%の同一性を有するアミノ酸配列、
から選択されるアミノ酸配列からなる、IL-6結合ポリペプチド。 - 前記IL-6結合モチーフが、配列番号1~1551からなる群から選択される配列の8位から36位の配列に相当する配列i)からなる、請求項1に記載のIL-6結合ポリペプチド。
- 前記IL-6結合モチーフが、配列番号1~14及び配列番号1512からなる群から選択される配列の8位から36位の配列に相当する配列i)からなる、請求項2に記載のIL-6結合ポリペプチド。
- 前記IL-6結合モチーフが、配列番号1512の8位から36位の配列に相当する配列i)からなる、請求項3に記載のIL-6結合ポリペプチド。
- 前記IL-6結合モチーフが、3ヘリックスバンドルタンパク質ドメインの一部を形成する、請求項1~4のいずれか1項に記載のIL-6結合ポリペプチド。
- 前記IL-6結合ポリペプチドが、結合モジュールBModを含み、前記結合モジュールBModのアミノ酸配列が:
iii)K-[BM]-DPSQSXaXbLLXcEAKKLXdXeXfQ
(式中、
[BM]は、請求項1~4のいずれか1項に定義されるIL-6結合モチーフであり、但し、X29は、Dであり;
Xaは、A及びSから選択され;
Xbは、N及びEから選択され;
Xcは、A、S及びCから選択され;
Xdは、E、N及びSから選択され;
Xeは、D、E及びSから選択され;
Xfは、A及びSから選択される);及び、
iv)iii)によって定義される配列と少なくとも91%の同一性を有するアミノ酸配列であって、ここで[BM]は、請求項1~4のいずれか1項に定義されるIL-6結合モチーフである、アミノ酸配列、
から選択される、請求項1~5のいずれか1項に記載のIL-6結合ポリペプチド。 - xi)VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;
(式中、[BM]は、請求項1~4のいずれか1項に定義されたIL-6結合モチーフである)、及び、
xii)xi)で定義された配列と少なくとも89%の同一性を有するアミノ酸配列であって、ここで[BM]は、請求項1~4のいずれか1項に定義されるIL-6結合モチーフである、アミノ酸配列、
から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1~6のいずれか1項に記載のIL-6結合ポリペプチド。 - 前記配列xi)が、配列番号1~1551からなる群から選択される、請求項7に記載のIL-6結合ポリペプチド。
- 前記配列xi)が、配列番号1~14及び配列番号1512からなる群から選択される、請求項8に記載のIL-6結合ポリペプチド。
- 前記配列xi)が、配列番号1512である、請求項9に記載のIL-6結合ポリペプチド。
- シス-シグナル伝達経路及び/又はトランス-シグナル伝達経路を介してIL-6依存性シグナル伝達を阻害することができる、請求項1~10のいずれか1項に記載のIL-6結合ポリペプチド。
- 阻害する半最大阻害濃度が、最大で1×10-6M、又は最大で1×10-7、又は最大で1×10-8M、又は最大で1×10-9M、又は最大で1×10-10Mである、請求項11に記載のIL-6結合ポリペプチド。
- IL-6/IL-6Rαとgp130との相互作用を阻害することができる、請求項11又は12に記載のIL-6結合ポリペプチド。
- 相互作用のEC50値が最大で1×10-7M、若しくは最大で1×10-8M、若しくは最大で1×10-9M、若しくは最大で1×10-10Mであるように、又は、相互作用のKD値が最大で1×10-8M、若しくは最大で1×10-9M、若しくは最大で1×10-10MであるようにIL-6に結合することができる、請求項1~13のいずれか1項に記載のIL-6結合ポリペプチド。
- -請求項1~14のいずれか1項に記載のIL-6結合ポリペプチドからなる第1の部分;及び、
-所望の生物学的活性を有するポリペプチドからなる第2の部分、
を含む、融合タンパク質又はコンジュゲート。 - 請求項1~14のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項1~15のいずれか1項に記載のIL-6結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲートと、少なくとも1つの医薬的に許容される賦形剤又は担体とを含む、組成物。
- 薬剤、診断薬又は予後予測薬として使用するための請求項1~15のいずれか1項に記載のIL-6結合ポリペプチド、融合タンパク質若しくはコンジュゲート又は請求項17に記載の組成物。
- 前記ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲート又は組成物が、インビボでIL-6機能を調節する、請求項18に記載の使用のためのIL-6結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲート又は組成物。
- IL-6関連障害の治療、予後予測又は診断における、請求項18又は19のいずれか一項に記載の使用のためのIL-6結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲート又は組成物。
- 前記IL-6関連障害が、炎症性疾患、自己免疫疾患、感染性疾患、癌、糖尿病、神経疾患及びうつ病からなる群から選択される、請求項20に記載の使用のためのIL-6結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲート又は組成物。
- 前記IL-6関連障害が、慢性関節リウマチ、若年性関節リウマチ、若年性特発性関節炎又は全身性若年性特発性関節炎、血管炎、乾癬性関節炎、乾癬、強直性脊椎炎、クローン病及び潰瘍性大腸炎などの慢性炎症性腸疾患;グレーブス病、ベーチェット病、ブドウ膜炎、巨細胞性動脈炎、多発性硬化症、全身性硬化症、全身性エリテマトーデス、多発性筋炎、リウマチ性多発筋痛症、喘息、慢性閉塞性肺疾患、再発性多発軟骨炎、膵炎、腹膜炎、腎炎、川崎病、シェーグレン症候群及び成人スティル病からなる群から選択される、請求項21に記載の使用のためのIL-6結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲート又は組成物。
- 前記IL-6関連障害が、結腸炎関連癌、腎癌、腎臓癌、前立腺癌、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、キャッスルマン病、乳癌及び肺癌からなる群から選択される癌である、請求項21に記載の使用のためのIL-6結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲート又は組成物。
- 前記IL-6関連障害が、アルツハイマー病、HIV、糖尿病、敗血症、悪液質、骨髄異形成症候群(MDS)、肝硬変、移植片対宿主病、心筋梗塞、子宮内膜症及び骨粗鬆症から選択される、請求項21に記載の使用のためのIL-6結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲート又は組成物。
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