CN106457066A - 用于分离不饱和分子的色谱材料 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及从混合物中分离相关化合物，特别是不饱和的相关化合物（一种或多种）的方法。使用具有用于各种不同模式的色谱法的含有第一取代基和第二取代基的色谱固定相材料的柱分离该化合物。第一取代基在色谱条件下使随时间经过的化合物保留变化最小化。第二取代基通过并入一个或多个芳烃、多环芳烃、杂环芳烃或多杂环芳烃基团来色谱上和选择性地保留该化合物，各基团任选被脂族基团取代。

Description

用于分离不饱和分子的色谱材料
相关申请的交叉引用
本申请要求2014年3月1日提交的美国专利申请No. 14/194,686的优先权，其全文经此引用并入本文。
发明领域
本公开大体上涉及用于分离不饱和分子的色谱材料。本公开在各种实施方案中更特别涉及用于正相色谱法、高压液相色谱法、溶剂化气相色谱法、超临界流体色谱法、亚临界流体色谱法、基于二氧化碳的色谱法、亲水相互作用液相色谱法和疏水相互作用液相色谱法的色谱材料，其在表现出有助于分离不饱和分子的总体保留的同时减轻或避免保留漂移或变化，还涉及相应的装置、试剂盒、制造方法和使用方法。
发明背景
色谱法是用于分离混合物的一组实验室技术的统称术语。将该混合物溶解在流动相中，以携带其经过固定相。该混合物的各种成分以不同速度行进，以使它们分离。该分离基于在流动相和固定相之间的差异分配。化合物的分配系数的细微差异导致在固定相上的差异保留，由此改变该分离。色谱法可用于分离结构上相关的化合物，如区域异构体、手性、非对映体等。一些技术，包括SFC已知特别可用于分离结构上相关的维生素、天然产物和化学材料。但是，色谱技术通常不足以分离所有结构上相关的化合物。例如，相关维生素的关键对（critical pair）（例如D2和D3，K1和K2）难以分离/解析。
用于流体或液相色谱法的填充材料可大致分成两类：有机材料（例如聚二乙烯基苯）和无机材料（例如二氧化硅）。许多有机材料对强碱性和强酸性流动相化学稳定，以致可灵活选择流动相组成和pH。但是，有机色谱材料会产生具有低效率的柱，特别是对低分子量分析物而言。许多有机色谱材料不仅缺乏典型色谱二氧化硅的机械强度，还在流动相的组成改变时收缩和溶胀。
二氧化硅广泛用于高效液相色谱法（HPLC）、超高效液相色谱法（UHPLC）和超临界流体色谱法（SFC）。一些应用使用已用有机官能团，如十八烷基（C18）、辛基（C8）、苯基、氨基、氰基等表面衍生化的二氧化硅。作为用于HPLC的固定相，这些填充材料可产生具有高效率并且没有表现出收缩或溶胀迹象的柱。
杂化材料可提供对使用基于二氧化硅的填充材料时出现的某些色谱问题的解决方案。杂化材料可提供改进，包括改进的高和低pH稳定性、机械稳定性、在pH 7下使用时的峰形、效率、保留性和合意的色谱选择性。
但是，传统杂化材料和二氧化硅材料在其它应用中可能存在潜在问题。一个问题是在低pH下使用时对碱的差峰形，这可以不利地影响在低pH下使用时的载荷能力和峰容量。另一问题是在将柱暴露于流动相pH的反复变化（例如从pH 10到3反复变换）之后酸性和碱性分析物保留时间的变化（被称作“漂移”）。
另一问题是保留漂移或变化，例如在具有少量水（例如少于5%，少于1%）的色谱模式中。例如，在标准SFC条件下对基于二氧化硅和有机-无机杂化物（例如可获自WatersTechnologies Corporation, Milford MA的BEH Technology™材料）的色谱相（键合和未键合的）都观察到保留漂移或变化。其它SFC固定相也可表现出类似的保留漂移或变化。
发明概述
在各种方面和实施方案中，本公开提供用于正相色谱法、高压液相色谱法、溶剂化气相色谱法、超临界流体色谱法、亚临界流体色谱法、基于二氧化碳的色谱法、亲水相互作用液相色谱法和疏水相互作用液相色谱法的色谱材料，其在表现出有助于分离不饱和分子的总体保留的同时减轻或避免保留漂移或变化，还提供相应的装置、试剂盒、制造方法和使用方法。
本公开包括各种附加优点，包括但不限于，通过选择/设计化学改性来选择/设计选择性的能力。
在一个实施方案中，本公开涉及一种从混合物中分离相关化合物的方法，所述方法包括提供含有相关化合物的混合物，将一部分所述混合物引入具有色谱柱的色谱系统，和从所述柱中洗脱分离的相关化合物，其中所述柱具有固定相，其具有下列结构(i)：
[X](W)a(Q)b(T)c　　(i)
其中X是含有二氧化硅、金属氧化物、无机-有机杂化材料、一组嵌段共聚物或其组合的色谱基底，W选自氢和羟基，其中W键合到X的表面上，Q是在具有低水浓度的色谱条件下使随时间经过的分析物保留变化最小化的第一取代基，T是色谱上保留分析物的第二取代基，其中T具有一个或多个芳烃、多环芳烃、杂环芳烃或多杂环芳烃基团，各基团任选被脂族基团取代；且b和c是正数，0.05 ≤ (b/c) ≤ 100，且a ≥ 0。
在一些实施方案中，Q具有下列结构(ii)：
其中n1是1-30的整数，n2是1-30的整数，R1、R2、R3和R4各自独立地选自氢、羟基、氟、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、低级烷基、保护或脱保护醇和两性离子，Z是(a) 具有式(B1)x(R5)y(R6)zSi-的表面连接基团，其中x是1-3的整数，y是0-2的整数，z是0-2的整数，且x+y+z = 3，R5和R6各自独立地选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、取代或未取代芳基、环烷基、支链烷基、低级烷基、保护或脱保护醇、两性离子基团和硅氧烷键，且B1是硅氧烷键，或(b) 通过直接碳-碳键形成或通过杂原子、酯、醚、硫醚、胺、酰胺、酰亚胺、脲、碳酸酯、氨基甲酸酯、杂环、三唑或聚氨酯（urethane）键与表面有机官能杂化基团的连接（attachment），或(c) 没有共价连接到所述材料的表面上的吸附表面基团，Y是嵌入的极性官能团、键或脂族基团，且A选自亲水端基、可官能化基团、氢、羟基、氟、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、低级烷基和可极化基团。
在一些实施方案中，T具有下列结构(iii)：
其中m1是1-30的整数，m2是1-30的整数，m3是1-3的整数，R7、R8、R9和R10各自独立地选自氢、羟基、氟、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、低级烷基、保护或脱保护醇、两性离子、芳烃基团和杂环芳烃基团，Z是(a) 具有式(B1)x(R5)y(R6)zSi-的表面连接基团，其中x是1-3的整数，y是0-2的整数，z是0-2的整数，且x+y+z = 3，R5和R6各自独立地选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、取代或未取代芳基、环烷基、支链烷基、低级烷基、保护或脱保护醇、两性离子基团和硅氧烷键，且B1是硅氧烷键，(b) 通过直接碳-碳键形成或通过杂原子、酯、醚、硫醚、胺、酰胺、酰亚胺、脲、碳酸酯、氨基甲酸酯、杂环、三唑或聚氨酯键与表面有机官能杂化基团的连接，或(c) 没有共价连接到所述材料的表面上的吸附表面基团，Y是嵌入的极性官能团、键或脂族基团，D选自键、N、O、S、–(CH2)0-12–N–R11R12、–(CH2)0-12–O–R11、–(CH2)0-12–S–R11、–(CH2)0-12–N–(CH2)0-12–R11R12、–(CH2)0-12–O–(CH2)0-12–R11、–(CH2)0-12–S–(CH2)0-12–R11、–(CH2)0-12–S(O)1-2–(CH2)0-12–N–R11R12、–(CH2)0-12–S(O)1-2–(CH2)0-12–O–R11、–(CH2)0-12–S(O)1-2–(CH2)0-12–S–R11；–(CH2)0-12–S(O)1-2–(CH2)0-12–N–(CH2)0-12–R11R12、–(CH2)0-12–S(O)1-2–(CH2)0-12–O–(CH2)0-12–R11和–(CH2)0-12–S(O)1-2–(CH2)0-12–S–(CH2)0-12–R11，R11是第一单环芳族、多环芳族、杂环芳族或多杂环芳族基团，R12是氢、脂族基团或第二单环芳族、多环芳族、杂环芳族或多杂环芳族基团，其中R11和R12任选被脂族基团取代。各种分数的Q、T或两者可以聚合。
在另一实施方案中，本公开涉及从混合物中分离脂质、维生素或多环芳烃的方法。
在另一实施方案中，本公开涉及具有下列结构(i)的色谱固定相：
[X](W)a(Q)b(T)c　　(i)
其中X是含有二氧化硅、金属氧化物、无机-有机杂化材料、一组嵌段共聚物或其组合的色谱基底，W选自氢和羟基，其中W键合到X的表面上，Q是在具有低水浓度的色谱条件下使随时间经过的分析物保留变化最小化的第一取代基，T是色谱上保留分析物的第二取代基，其中T具有一个或多个单环芳族、多环芳族、杂环芳族或多杂环芳族基团，各基团任选被脂族基团取代；且b和c是正数，0.05 ≤ (b/c) ≤ 100，且a ≥ 0。
在另一实施方案中，本公开涉及用于正相色谱法、高压液相色谱法、溶剂化气相色谱法、超临界流体色谱法、亚临界流体色谱法、基于二氧化碳的色谱法、亲水相互作用液相色谱法或疏水相互作用液相色谱法的柱、毛细管柱、整体柱、微流体器件或装置，其包含具有至少一个限定具有入口和出口的室的壁的外壳和布置在其中的具有上述结构，即(i)的固定相，其中所述外壳和固定相适用于正相色谱法、高压液相色谱法、溶剂化气相色谱法、超临界流体色谱法、亚临界流体色谱法、基于二氧化碳的色谱法、亲水相互作用液相色谱法或疏水相互作用液相色谱法。
在另一实施方案中，本公开涉及用于正相色谱法、高压液相色谱法、溶剂化气相色谱法、超临界流体色谱法、亚临界流体色谱法、基于二氧化碳的色谱法、亲水相互作用液相色谱法或疏水相互作用液相色谱法的试剂盒，其包含具有至少一个限定具有入口和出口的室的壁的外壳和布置在其中的具有上述结构，即(i)的固定相，其中所述外壳和固定相适用于正相色谱法、高压液相色谱法、溶剂化气相色谱法、超临界流体色谱法、亚临界流体色谱法、基于二氧化碳的色谱法、亲水相互作用液相色谱法或疏水相互作用液相色谱法；和用所述外壳和固定相实施正相色谱法、高压液相色谱法、溶剂化气相色谱法、超临界流体色谱法、亚临界流体色谱法、基于二氧化碳的色谱法、亲水相互作用液相色谱法或疏水相互作用液相色谱法的说明书。
在另一实施方案中，本公开涉及一种制备具有上述结构，即(i)的固定相的方法，其包括使色谱基底与具有侧反应性基团的硅烷偶联剂反应，使包含一个或多个芳烃、多环芳烃、杂环芳烃或多杂环芳烃基团的第二化学试剂与所述侧反应性基团反应；和中和任何剩余未反应的侧反应性基团，由此制造所述固定相。
在另一实施方案中，本公开涉及一种制备具有上述结构，即(i)的固定相的方法，其包括使具有侧反应性基团的硅烷偶联剂低聚，使芯表面与低聚的硅烷偶联剂反应，使包含一个或多个芳烃、多环芳烃、杂环芳烃或多杂环芳烃基团的第二化学试剂与所述侧反应性基团反应；和中和任何剩余未反应的侧反应性基团，由此制造所述固定相。
在另一实施方案中，本公开涉及一种减轻或防止正相色谱法、高压液相色谱法、溶剂化气相色谱法、超临界流体色谱法、亚临界流体色谱法、基于二氧化碳的色谱法、亲水相互作用液相色谱法或疏水相互作用液相色谱法中的保留漂移的方法，其包括使用包含布置在其中的具有上述结构，即(i)的色谱固定相的色谱装置来色谱分离样品，由此减轻或防止保留漂移。
本公开有利地在表现出特别对不饱和相关分子或化合物有用的总体保留的同时减轻或避免保留漂移或变化。例如，在SFC中，保留漂移或变化可以（在各种其它理论中）归因于在用于SFC的标准CO2/MeOH流动相（和/或用其它醇助溶剂）下粒子上的溶剂可达硅烷醇的烷氧基化。这是一个问题，因为随着柱老化，使用者观察到在他们的SFC系统上获得的色谱变化（例如保留时间），并在将新的未烷氧基化的柱安装在该系统上时，又观察到变化。
在各种方面和实施方案中，本公开通过色谱材料的选择和/或改性来提供对这样的保留漂移或变化和相关问题（例如保留、峰形等）的各种解决方案。例如，本发明包括色谱芯表面的专门官能化（例如用特定官能团及其组合），这基本防止分析物与色谱芯表面之间的色谱相互作用，这保持分析物与色谱材料之间的所需相互作用。
在其它各种方面和实施方案中，本公开涉及具有极大减少的与基质粒子表面的次级相互作用（例如不想要的相互作用、非特异性吸附）的色谱材料。分析物与材料表面的次级相互作用可由于硅烷醇、侧疏水基团和聚合物或杂化主链而发生。
在各种方面和实施方案中，本公开提供许多优点。例如，本公开可提供能以优异的保留、峰容量和峰形解析所有种类的分析物（例如酸性、碱性和中性），特别是不饱和分析物的固定相，对碱的峰形较不重要。在各种实例中，本公开可有效地对相关分析物掩蔽硅烷醇，以产生可预测和稳定的色谱分离。在各种实例中，本公开可有效消除由于不想要的载体表面与分析物相互作用而发生的保留漂移或变化。本公开可尤其有效掩蔽二氧化硅或二氧化硅杂化材料上的硅烷醇，在各种实例中，本公开可在所有分析物种类中改进峰容量和拖尾，尤其是对碱而言。在各种实例中，本公开可避免孔隙堵塞，尽管与低聚硅氧烷键合（例如与多孔二氧化硅材料的传统聚合涂层相比，所述传统聚合涂层会造成孔隙堵塞以极大降低该材料的可用表面积并产生不均匀表面 - 尽管在本公开中促进硅烷低聚，但没有孔隙堵塞或表面积降低的迹象）。
本公开基于其独特的化学和性能特性提供优于现有技术的优点。例如，不饱和化合物的液相分离通常涉及在C18键合相，如ACQUITY UPC2 HSS C18 SB上进行的分离。在该材料上，烷基链是产生高亚甲基/疏水选择性但极小的形状/异构选择性的保留选择因子（retention selector）。本公开提供能够实现亚甲基/疏水选择性和形状/异构选择性两者的保留选择因子。例如，本公开的固定相优异地保留和分离脂溶性维生素、脂质和代谢产物以及提供与C18键合相相比增强的形状/异构选择性。
通过仅用于举例说明目的而非限制性的下列附图和实施例更详细描述本公开。
附图简述
在下列附图和详述的情况下更容易理解本公开。本领域普通技术人员会理解，下列附图不必按比例，而是着重图示本发明的发明概念。
图1显示环氧丙氧丙基三甲氧基硅烷（GPTMS）（图1A）和1-氨基蒽（图1B）的结构。
图2显示未改性色谱表面和GPTMS之间的反应的示意图。
图3显示改性色谱表面和1-氨基蒽之间的反应的示意图。
图4显示与改性剂GPTMS和1-氨基蒽交联的色谱表面的示意图。
图5显示用于制备本公开的色谱固定相的两个可能的合成途径的示意图。
图6显示使用未改性BEH粒子作为固定相和根据本公开改性的BEH粒子洗脱的分析物的保留百分比的图。
图7A和7B显示使用如实施例9中所述的基于1-氨基蒽的固定相的示例性脂质分离。
图8A显示使用如实施例9中所述的基于1-氨基蒽的固定相的C22:0和C20:0的色谱图。
图8B显示使用如实施例9中所述的基于1-氨基蒽的固定相的C16:0、C12:0和C8:0的色谱图。
图9A显示使用如实施例9中所述的基于1-氨基蒽的固定相的C22:0和C20:0的色谱图。
图9B显示使用如实施例9中所述的基于1-氨基蒽的固定相的C16:0、C12:0和C8:0的色谱图。
图10A显示使用如实施例9中所述的基于1-氨基蒽的固定相的C24:1和C22:1的色谱图。
图10B显示使用如实施例9中所述的基于1-氨基蒽的固定相的C20:1、C18:1和C14:1的色谱图。
图11A显示使用如实施例9中所述的基于1-氨基蒽的固定相的C24:1和C22:1的色谱图。
图11B显示使用如实施例9中所述的基于1-氨基蒽的固定相的C20:1、C18:1和C14:1的色谱图。
图12A显示使用如实施例9中所述的基于1-氨基蒽的固定相的C18:0、C18:1和C18:2的色谱图。
图12B显示使用如实施例9中所述的基于1-氨基蒽的固定相的C22:1、C22:2和C22.:6的色谱图。
图13A显示使用如实施例9中所述的基于1-氨基蒽的固定相的C18:0、C18:1和C18:2的色谱图。
图13B显示使用如实施例9中所述的基于1-氨基蒽的固定相的C22:1、C22:2和C22:6的色谱图。
图14和15显示使用如实施例9中所述的基于1-氨基蒽的固定相的各种亚麻酸和二十碳二烯酸的色谱图。
图16显示使用如实施例9中所述的基于1-氨基蒽的固定相实现的示例性脂质分离。
图17A显示使用如实施例3和10中所述的基于1-氨基蒽的固定相的各种脂质的色谱图。
图17B显示使用如实施例3和10中所述的基于2-氨甲基吡啶的固定相的各种脂质的色谱图。
图17C显示使用如实施例3和10中所述的基于吡啶的固定相的各种脂质的色谱图。
图17D显示使用如实施例3和10中所述的基于6-氨基喹啉的固定相的各种脂质的色谱图。
图17E显示使用如实施例3和10中所述的基于苯胺的固定相的各种脂质的色谱图。
图17F显示使用如实施例3和10中所述的基于GPTMS的固定相的各种脂质的色谱图。
图17G显示使用如实施例3和10中所述的基于4-正辛基苯胺的固定相的各种脂质的色谱图。
图18A显示使用如实施例3和10中所述的基于1-氨基蒽的固定相的C18:0、C18:1和C18:2的色谱图。
图18B显示使用如实施例3和10中所述的基于1-氨基蒽的固定相的C22:1、C22:2和C22:6的色谱图。
图19A显示使用如实施例3和10中所述的基于2-氨甲基吡啶的固定相的C18:0、C18:1和C18:2的色谱图。
图19B显示使用如实施例3和10中所述的基于2-氨甲基吡啶的固定相的C22:1、C22:2和C22:6的色谱图。
图20A显示使用如实施例3和10中所述的基于吡啶的固定相的C18:0、C18:1和C18:2的色谱图。
图20B显示使用如实施例3和10中所述的基于吡啶的固定相的C22:1、C22:2和C22:6的色谱图。
图21A显示使用如实施例3和10中所述的基于6-氨基喹啉的固定相的C18:0、C18:1和C18:2的色谱图。
图21B显示使用如实施例3和10中所述的基于6-氨基喹啉的固定相的C22:1、C22:2和C22:6的色谱图。
图22A显示使用如实施例3和10中所述的基于苯胺的固定相的C18:0、C18:1和C18:2的色谱图。
图22B显示使用如实施例3和10中所述的基于苯胺的固定相的C22:1、C22:2和C22:6的色谱图。
图23A显示使用如实施例3和10中所述的基于GPTMS的固定相的C18:0、C18:1和C18:2的色谱图。
图23B显示使用如实施例3和10中所述的基于GPTMS的固定相的C22:1、C22:2和C22:6的色谱图。
图24A-24F显示使用如实施例3和10中所述的基于4-正辛基苯胺的固定相的C18:0、C18:1、C18:2、C22:1、C22:2和C22:6的色谱图。
发明详述
在各种方面和实施方案中，本公开提供用于正相色谱法、高压液相色谱法、溶剂化气相色谱法、超临界流体色谱法、亚临界流体色谱法、基于二氧化碳的色谱法、亲水相互作用液相色谱法和疏水相互作用液相色谱法的色谱材料，其在表现出有助于分离不饱和分子的总体保留的同时减轻或避免保留漂移或变化，还提供相应的装置、试剂盒、制造方法和使用方法。在一些实施方案中，本公开还提供难以分离的结构相关化合物，如关键对的保留和分离。
本公开有利地在表现出有用的总体保留的同时减轻或避免保留漂移或变化。例如，在SFC中，保留漂移或变化可以（在各种其它理论中）归因于在用于SFC的标准CO2/MeOH流动相（和/或用其它醇助溶剂）下粒子上的溶剂可达硅烷醇的烷氧基化。这是一个问题，因为随着柱老化，使用者观察到在他们的SFC系统上获得的色谱变化（例如保留时间），并在将新的未烷氧基化的柱安装在该系统上时，又观察到变化。
在各种方面和实施方案中，本公开通过色谱材料的选择性改性和/或不饱和相关化合物的混合物的解析来提供对这样的保留漂移或变化和相关问题（例如保留、峰形等）的各种解决方案。
定义
在各种方面和实施方案中，本发明用于减轻或防止保留漂移或变化。“保留漂移”或“保留变化”可包括色谱运行或实验之间的不合意的洗脱时间差异（例如在运行1中，峰x在时间y洗脱，但在运行1+n中，峰x在时间z洗脱）。因此，保留漂移或变化会造成不合意的效应，包括实验噪音、不可再现性或失败。因此，在广义上，减轻或防止保留漂移或变化包括在该色谱实验提供色谱可接受的结果的程度上解决或抵消色谱运行之间的不合意的洗脱时间差异。
在一些实施方案中，减轻或防止保留漂移或变化不是绝对值或恒定值。例如，在仍实现色谱可接受的结果的同时可发生的保留漂移或变化的量可取决于给定实验中可接受的误差或方差、样品的复杂性（例如峰的数量和/或分离）而变化。在仍实现色谱可接受的结果的同时可发生的保留漂移或变化的量可取决于给定实验的持续时间或所需可再现性而变化（例如如果需要在更大数量的运行上的可再现性，运行之间的可允许保留漂移或变化可以更小）。因此，应清楚的是，减轻或防止保留漂移或变化不一定意味着绝对消除保留漂移或变化。
在一些实施方案中，可以量化减轻或防止保留漂移或变化。例如，可以对单峰测量保留漂移或变化，或得出一组峰的平均值。可以在给定时期或运行数量上测量保留漂移或变化。可以相对于标准值、起始值或在两个或更多个给定运行之间测量保留漂移或变化。
此外，可以通过标准化试验量化保留漂移或变化。例如，可以通过取用由第3、10或30天色谱试验测得的平均绝对峰保留与在第1天色谱试验时测得的平均绝对峰保留的百分比差异来计算平均%保留变化。对于试验的每天，可以在一组试验条件下平衡该柱，接着多次注入第一试验混合物，然后在第二组条件下平衡，接着多次注入第二试验混合物。
根据这一标准化试验，减轻或防止保留漂移或变化可包括经30天≤ 5%、经30天≤4%、经30天≤ 3%、经30天≤ 2%、经30天≤ 1%、经10天≤ 5%、经10天≤ 4%、经10天≤ 3%、经10天≤ 2%、经10天≤ 1%、经3天≤ 5%、经3天≤ 4%、经3天≤ 3%、经3天≤ 2%、经3天≤ 1%、经30次运行≤ 5%、经30次运行≤ 4%、经30次运行≤ 3%、经30次运行≤ 2%、经30次运行≤1%、经10次运行≤ 5%、经10次运行≤ 4%、经10次运行≤ 3%、经10次运行≤ 2%、经10次运行≤ 1%、经3次运行≤ 5%、经3次运行≤ 4%、经3次运行≤ 3%、经3次运行≤ 2%或经3次运行≤ 1%的保留漂移或变化。
在另一些实施方案中，减轻或防止保留漂移或变化可包含经31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1天（或运行）≤ 5.0、4.9、4.8、4.7、4.6、4.5、4.4、4.3、4.2、4.1、4.0、3.9、3.8、3.7、3.6、3.5、3.4、3.3、3.2、3.1、3.0、2.9、2.8、2.7、2.6、2.5、2.4、2.3、2.2、2.1、2.0、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1%的保留漂移或变化。
“高纯度”或“高纯色谱材料”包括由高纯前体制成的材料。在某些方面中，高纯材料具有降低的金属污染和/或不缩减的色谱性质，包括但不限于，表面硅烷醇的酸性和表面的不均匀性。
“色谱表面”包括提供样品的色谱分离的表面。在某些方面中，该色谱表面是多孔的。在一些方面中，色谱表面可以是粒子、表面多孔材料或整料的表面。在某些方面中，该色谱表面由在色谱分离过程中组合使用的一种或多种粒子、表面多孔材料或整料的表面构成。在另一些方面中，该色谱表面是无孔的。
“可离子化改性剂”包括带有供电子或吸电子基团的官能团。在某些方面中，可离子化改性剂含有一个或多个羧酸基、氨基、亚氨基、酰氨基、吡啶基、咪唑基、脲基、亚硫酰-脲基或氨基硅烷基或其组合。在另一些方面中，该可离子化改性剂含有带有氮或磷原子的基团，所述原子具有自由电子孤对。在某些方面中，该可离子化改性剂共价连接到材料表面上并具有可离子化基团。在一些情况下，其通过表面杂化基团的化学改性连接到色谱材料上。
“疏水表面基团”包括在色谱表面上表现出疏水性的表面基团。在某些方面中，疏水基团可以是氮键合相，如C4至C18键合相。在另一些方面中，疏水表面基团可含有嵌入的极性基团以使该疏水表面的外部保持疏水性。在一些情况下，其通过表面杂化基团的化学改性连接到色谱材料上。在另一些情况下，该疏水基团可以是C4-C30嵌入的极性、手性、苯基烷基或五氟苯基键合的涂层。
“色谱芯”包括形成本公开的材料的内部的色谱材料，包括但不限于如本文中定义的有机材料，如二氧化硅或杂化材料，其为粒子、整料或另一合适的结构的形式。在某些方面中，色谱芯的表面代表如本文中定义的色谱表面，或代表被如本文中定义的色谱表面包围的材料。色谱表面材料可以可辨认出离散或不同转变的方式布置在或键合到或退火到色谱芯上或可以与色谱芯的表面共混的方式结合到色谱芯上以导致材料渐变并且没有离散的内芯表面。在某些实施方案中，色谱表面材料可以与色谱芯的材料相同或不同并可表现出与色谱芯不同的物理或物理化学性质，包括但不限于，孔隙体积、表面积、平均孔隙直径、碳含量或水解pH稳定性。
“杂化”，包括“杂化无机/有机材料”，包括基于无机的结构，其中有机官能团整合到内部或“骨架”无机结构以及杂化材料表面中。该杂化材料的无机部分可以是例如氧化铝、二氧化硅、钛、铈或锆或它们的氧化物，或陶瓷材料。“杂化”包括基于无机的结构，其中有机官能团整合到内部或“骨架”无机结构以及杂化材料表面中。如上所述，示例性杂化材料显示在美国专利Nos. 4,017,528、6,528,167、6,686,035和7,175,913中，它们的内容全文经此引用并入本文。
术语“脂环族基团”包括三个或更多个碳原子的闭环结构。脂环族基团包括环烷烃或环烷（其是饱和环烃）、环烯烃（其是不饱和的，具有两个或更多个双键）和具有三键的环乙炔。它们不包括芳族基团。环烷烃的实例包括环丙烷、环己烷和环戊烷。环烯烃的实例包括环戊二烯、环己二烯和环辛四烯。脂环族基团还包括稠环结构和取代的脂环族基团，如烷基取代的脂环族基团。在脂环族基团的情况下，这样的取代基可进一步包括低级烷基、低级烯基、低级烷氧基、低级烷硫基、低级烷基氨基、低级烷基羧基、硝基、羟基、-CF3、-CN等。
术语“脂族基团”包括以通常具有1至24个碳原子的直链或支链为特征的有机化合物。脂族基团包括烷基、烯基和炔基。在复杂结构中，该链可以是支链或交联的。在一些实施方案中，该脂族基团可包括具有2至24个碳原子，或4至22个碳原子，或6至20个碳原子，或8至18个碳原子，或10至16个碳原子，或12至14个碳原子，或这些数值的任何组合，如大约6至12个碳原子或10至14个碳原子的链。烷基包括具有一个或多个碳原子的饱和烃，包括直链烷基和支链烷基。这样的烃部分可以在一个或多个碳上被例如卤素、羟基、硫醇、氨基、烷氧基、烷基羧基、烷硫基或硝基取代。除非另行规定碳数，本文所用的“低级脂族”是指如上文定义但具有1至6个碳原子的脂族基团（例如低级烷基、低级烯基、低级炔基）。这样的低级脂族基团，例如低级烷基的代表是甲基、乙基、正丙基、异丙基、2-氯丙基、正丁基、仲丁基、2-氨基丁基、异丁基、叔丁基、3-硫戊基等。本文所用的术语“硝基”是指-NO2；术语“卤素”是指-F、-Cl、-Br或-I；术语“硫醇”是指SH；且术语“羟基”是指-OH。因此，本文所用的术语“烷基氨基”是指具有连接到其上的氨基的如上定义的烷基。合适的烷基氨基包括具有1至大约12个碳原子，优选1至大约6个碳原子的基团。术语“烷硫基”是指具有连接到其上的巯基的如上定义的烷基。合适的烷硫基包括具有1至大约12个碳原子，优选1至大约6个碳原子的基团。本文所用的术语“烷基羧基”是指具有连接到其上的羧基的如上定义的烷基。本文所用的术语“烷氧基”是指具有连接到其上的氧原子的如上定义的烷基。代表性的烷氧基包括具有1至大约12个碳原子，优选1至大约6个碳原子的基团，例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、叔丁氧基等。术语“烯基”和“炔基”是指类似于烷基但分别含有至少一个双键或三键的不饱和脂族基团。合适的烯基和炔基包括具有2至大约12个碳原子，优选1至大约6个碳原子的基团。
术语“烷基”包括饱和脂族基团，包括直链烷基、支链烷基、环烷基（脂环族）、烷基取代的环烷基和环烷基取代的烷基。在某些实施方案中，直链或支链烷基在其主链中具有30个或更少碳原子，例如对直链而言C1-C30或对支链而言C3-C30。在某些实施方案中，直链或支链烷基在其主链中具有20个或更少碳原子，例如对直链而言C1-C20或对支链而言C3-C20，更优选18或更少。同样地，优选环烷基在其环结构中具有4-10个碳原子，更优选在环结构中具有4-7个碳原子。术语“低级烷基”是指在链中具有1至6个碳的烷基和在环结构中具有3至6个碳的环烷基。
此外，本公开通篇所用的术语“烷基”（包括“低级烷基”）包括“未取代烷基”和“取代烷基”，后者是指在烃主链的一个或多个碳上具有替代氢的取代基的烷基部分。这样的取代基可包括，例如，卤素、羟基、烷基羰氧基、芳基羰氧基、烷氧基羰氧基、芳氧基羰氧基、羧酸酯、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、硫烷基羰基、烷氧基、磷酸酯、膦酸根合（phosphonato）、次膦酸根合（phosphinato）、氰基、氨基（包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基和烷基芳基氨基）、酰氨基（包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨甲酰基和脲基）、脒基、亚氨基、巯基、烷硫基、芳硫基、硫代羧酸酯、硫酸酯、磺酸根合（sulfonato）、氨磺酰基、磺酰氨基、硝基、三氟甲基、氰基、叠氮基、杂环基、芳烷基或芳族或杂芳族部分。本领域技术人员会理解，如果适当，在烃链上取代的部分本身可以被取代。环烷基可进一步例如被上述取代基取代。“芳烷基”部分是被例如具有1至3个分开或稠合的环和6至大约18个碳环原子的芳基取代的烷基，例如苯基甲基（苄基）。
本文所用的术语“氨基”是指式-NRaRb的未取代或取代部分，其中Ra和Rb各自独立地为氢、烷基、芳基或杂环基，或Ra和Rb与它们连接的氮原子一起形成在环中具有3至8个原子的环状部分。因此，除非另行说明，术语“氨基”包括环状氨基部分，如哌啶基或吡咯烷基。“氨基取代的氨基”是指其中Ra和Rb的至少一个进一步被氨基取代的氨基。
术语“芳族基团”包括含有一个或多个环的不饱和环烃。术语“单环芳族”包括含有一个环的不饱和环烃。术语“多环芳族”包括含有两个或更多个环的不饱和环烃。芳族基团包括5-和6-元单环基团，其可包括0至4个杂原子，例如呋喃、吡咯、吡咯啉、噁唑、噻唑、咪唑、咪唑啉、吡唑、吡唑啉、吡唑烷、异噁唑、异噻唑、苯、吡啶、哒嗪、嘧啶、吡嗪、三嗪、噻吩等。该芳环可以在一个或多个环位置被例如卤素、低级烷基、低级烯基、低级烷氧基、低级烷硫基、低级烷基氨基、低级烷基羧基、硝基、羟基、-CF3、-CN等取代。芳族基团包括5-和6-元多环基团，其可包括0至8个杂原子，例如茚、中氮茚（indolinzine）、吲哚、异吲哚、吲哚啉、吲唑、苯并咪唑、苯并噻唑、萘、喹嗪、喹啉、异喹啉、噌啉、酞嗪、喹唑啉、喹喔啉、1,8-萘啶、奎宁环、芴、咔唑、蒽、吖啶、吩嗪（phanazine）、吩噻嗪、吩噁嗪、芘等。多环芳基包括稠合芳基。
术语“芳基”包括5-和6-元单环芳基，其可包括0至4个杂原子，例如未取代或取代的苯、吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、噁唑、噻唑、三唑、吡唑、吡啶、吡嗪、哒嗪和嘧啶等。芳基还包括多环稠合芳基，如萘基、喹啉基、吲哚基等。该芳环可以在一个或多个环位置被例如如上文对烷基所述的取代基取代。合适的芳基包括未取代和取代的苯基。本文所用的术语“芳氧基”是指具有连接到其上的氧原子的如上定义的芳基。本文所用的术语“芳烷氧基”是指具有连接到其上的氧原子的如上定义的芳烷基。合适的芳烷氧基具有1至3个分开或稠合的环和6至大约18个碳环原子，例如O-苄基。
术语“陶瓷前体”意在包括导致形成陶瓷材料的任何化合物。
术语“手性部分”意在包括能够手性或立体选择性合成的任何官能团。手性部分包括，但不限于，具有至少一个手性中心的取代基、天然和非天然氨基酸、肽和蛋白质、衍生化纤维素、大环抗生素、环糊精、冠醚和金属配合物。
术语“嵌入的极性官能团”是提供整体极性部分使得由于屏蔽二氧化硅表面上的未反应硅烷醇基团而降低与碱性样品的相互作用的官能团。嵌入的极性官能团包括，但不限于，如美国专利No. 5,374,755中公开的碳酸酯、酰胺、脲、醚（例如在含碳基团之间的-O-）、硫醚、亚硫酰基、亚砜、磺酰基、硫脲、硫代碳酸酯、硫代氨基甲酸酯、乙二醇、杂环、三唑官能团或氨基甲酸酯官能团，和手性部分。
词语“色谱增强性孔隙几何”包括本公开的材料的孔隙构造的几何，其已被发现增强该材料的色谱分离能力，例如与本领域中的其它色谱介质相比。例如，可以形成、选择或构造几何，并可以使用各种性质和/或因素确定该材料的色谱分离能力是否已“增强”，例如与本领域中已知或常规使用的几何相比。这些因素的实例包括高分离效率、较长柱寿命和高质量传递性质（如例如降低的谱带展宽和良好的峰形所证实）。可以使用业内认可的技术测量或观察这些性质。例如，本多孔无机/有机杂化材料的色谱增强性孔隙几何由于不存在“墨水瓶（ink bottle）”或“贝壳形（shell shaped）”孔隙几何或形态（两者都不合意，因为它们例如降低传质速率，以造成较低效率）而有别于现有技术材料。
在仅含少量微孔的杂化材料中发现色谱增强性孔隙几何。当所有直径大约<34 Å的孔隙构成该材料的比表面积的小于大约110平方米/克时，在杂化材料中实现少量微孔。具有这样低的微孔表面积（MSA）的杂化材料提供色谱增强，包括高分离效率和良好的质量传递性质（如例如降低的谱带展宽和良好的峰形所证实）。微孔表面积（MSA）被定义为是使用BJH法由等温线的吸附分支通过多点氮气吸附分析测定的直径小于或等于34Å的孔隙中的表面积。本文所用的首字母缩略词“MSA”和“MP”可互换使用以表示“微孔表面积”。
术语“官能化基团”包括赋予色谱固定相特定色谱功能的有机官能团。
术语“杂环基团”包括闭环结构，其中该环中的一个或多个原子是非碳元素，例如氮、硫或氧。杂环基团可以是饱和或不饱和的，且杂环基团如吡咯和呋喃可具有芳族性质，即“杂环芳基”。它们包括一个或多个环结构。具有两个或更多个环结构的杂环基团是“多杂环芳基”。这些基团可具有稠环结构，如喹啉和异喹啉。杂环基团的其它实例包括吡啶和嘌呤。杂环基团也可以在一个或多个构成原子处被例如卤素、低级烷基、低级烯基、低级烷氧基、低级烷硫基、低级烷基氨基、低级烷基羧基、硝基、羟基、-CF3、-CN等取代。合适的杂芳族和杂脂环族基团通常具有1至3个分开或稠合的环，每个环3至大约8个成员和一个或多个N、O或S原子，例如香豆素基、喹啉基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、呋喃基、吡咯基、噻吩基、噻唑基、噁唑基、咪唑基、吲哚基、苯并呋喃基、苯并噻唑基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、哌啶基、吗啉基和吡咯烷基。
术语“金属氧化物前体”意在包括含有金属并导致形成金属氧化物，例如氧化铝、二氧化硅、氧化钛、氧化锆的任何化合物。
术语“整料”意在包括填塞成床形式的单粒子集合，其中保持单粒子的形状和形态。有利地使用将粒子粘合在一起的材料填塞粒子。可以使用本领域中公知的任何粘合材料，例如二乙烯基苯、甲基丙烯酸酯、氨基甲酸酯、烯烃、炔烃、胺、酰胺、异氰酸酯或环氧基的线性或交联聚合物，以及有机烷氧基硅烷、四烷氧基硅烷、聚有机烷氧基硅氧烷、聚乙氧基硅氧烷和陶瓷前体的缩合反应。在某些实施方案中，术语“整料”还包括通过其它方法制成的杂化整料，如美国专利No. 7,250,214中详述的杂化整料；由一种或多种含有0-99摩尔%二氧化硅（例如SiO2）的单体的缩合制成的杂化整料；由聚结的多孔无机/有机粒子制成的杂化整料；具有色谱增强性孔隙几何的杂化整料；没有色谱增强性孔隙几何的杂化整料；具有有序孔隙结构的杂化整料；具有非周期性孔隙结构的杂化整料；具有非结晶或无定形分子排序的杂化整料；具有结晶畴或区的杂化整料；具有各种不同的大孔和介孔性质的杂化整料；和各种不同纵横比的杂化整料。在某些实施方案中，术语“整料”还包括无机整料，如G. Guiochon/J. Chromatogr. A 1168 (2007) 101-168中描述的那些。
术语“纳米粒子”是具有至少一个小于大约100纳米的维度，例如小于大约100纳米（0.1毫米）的直径或粒子厚度的微观粒子/颗粒或粉末/纳米粉末的微观成员，其可以是结晶或非晶的。纳米粒子具有不同于并通常优于传统散装材料的性质，包括例如更大的强度、硬度、延性、可烧结性和更大的反应性等。大量科学研究继续致力于测定纳米材料的性质，其中少量已通过许多方法合成（主要作为纳米级粉末），包括胶体沉淀、机械研磨和气相成核和生长。大量综述已经记录纳米相材料中的最新发展并经此引用并入本文：Gleiter, H.(1989) “Nano-crystalline materials,” Prog. Mater. Sci. 33:223-315和Siegel, R.W. (1993) “Synthesis and properties of nano-phase materials,” Mater. Sci. Eng. A168:189-197。在某些实施方案中，纳米粒子包含下列的氧化物或氮化物：碳化硅、铝、金刚石、铈、炭黑、碳纳米管、锆、钡、铈、钴、铜、铕、钆、铁、镍、钐、硅、银、钛、锌、硼及其混合物。在某些实施方案中，本公开的纳米粒子选自金刚石、氧化锆（非晶、单斜晶、四方晶和立方晶形式）、氧化钛（非晶、锐钛矿、板钛矿和金红石形式）、铝（非晶、α和γ形式）和硼氮化物（立方晶型）。在特定实施方案中，本公开的纳米粒子选自纳米金刚石、碳化硅、二氧化钛（锐钛矿形式）、立方硼氮化物和它们的任何组合。此外，在特定实施方案中，该纳米粒子可以是结晶或非晶的。在特定实施方案中，该纳米粒子小于或等于100毫米直径，例如小于或等于50毫米直径，例如小于或等于20毫米直径。
此外，以分散在本公开的复合材料内为特征的纳米粒子意在描述外源添加的纳米粒子。这不同于能够原位形成的纳米粒子或与推定的（putative）纳米粒子具有显著类似性的形成物（formation），其中，例如，大分子结构，如粒子可包含内源生成的这些的聚集体。
术语“基本无序”是指基于x-射线粉末衍射分析缺乏孔隙有序性。具体而言，通过在x-射线衍射图中缺乏在与至少1纳米的d值（或d间距）对应的衍射角的峰确定“基本无序”。
“表面改性剂”通常包括赋予色谱固定相特定色谱功能的有机官能团。该多孔无机/有机杂化材料具有可另外用表面改性剂取代或衍生化的有机基团和硅烷醇基团。
词语“表面改性的”在本文中用于描述具有可另外用表面改性剂取代或衍生化的有机基团和硅烷醇基团的本公开的复合材料。“表面改性剂”包括（通常）赋予色谱固定相特定色谱功能的有机官能团。如本文中公开的表面改性剂例如通过衍生化或涂布和随后交联结合到基材上，以赋予基材该表面改性剂的化学特性。在一个实施方案中，杂化材料的有机基团反应以形成与表面改性剂的有机共价键。该改性剂可通过有机和聚合物化学中公知的许多机制（包括但不限于亲核、亲电子、环加成、自由基、卡宾、氮烯和碳阳离子反应）形成与该材料的有机基团的有机共价键。有机共价键被定义为涉及在有机化学的常见元素，包括但不限于氢、硼、碳、氮、氧、硅、磷、硫和卤素之间形成共价键。此外，碳-硅和碳-氧-硅键被定义为有机共价键，而硅-氧-硅键不被定义为有机共价键。各种合成转化是文献中公知的，参见例如March、J. Advanced Organic Chemistry, 第3版, Wiley, New York, 1985。
本公开的色谱材料可包括包含二氧化硅芯材、金属氧化物芯材、无机-有机杂化材料或一组嵌段共聚物芯材的那些。该芯材可以是如本文中论述的高纯色谱芯组合物。类似地，该色谱芯材可以本文论述的高纯材料的正常（例如非高纯）形式/类似物/同系物。
合适的芯材的实例包括，但不限于，传统色谱二氧化硅材料、金属氧化物材料、无机-有机杂化材料或它们的一组嵌段共聚物、陶瓷、氧化硅、亚氨基氮化硅、氮化硅、氮化硅铝、二亚氨硅和氮氧化硅。合适的芯材的另一些实例（改性或未改性使用）描述在美国公开Nos. 2009/0127177、2007/0135304、2009/0209722、2007/0215547、2007/0141325、2011/0049056、2012/0055860和2012/0273404以及国际公开No. WO2008/103423中，它们全文经此引用并入本文。
色谱芯材可以是离散粒子的形式或可以是整料。该色谱芯材可以是任何多孔材料并可购得或可通过已知方法，如例如全文经此引用并入本文的美国专利Nos. 4,017,528、6,528,167、6,686,035和7,175,913中描述的方法制造。在一些实施方案中，该色谱芯材可以是无孔芯。
本领域普通技术人员可以改变色谱表面材料和色谱芯材的组成以提供增强的色谱选择性、增强的柱化学稳定性、增强的柱效率和/或增强的机械强度。类似地，周围材料的组成提供亲水/亲脂平衡（HLB）、表面电荷（例如等电点或硅烷醇pKa）和/或表面官能度的变化以增强色谱分离。此外，在一些实施方案中，该色谱材料的组成也可提供可用于进一步表面改性的表面官能。
本公开的色谱材料的可离子化基团和疏水表面基团可以使用已知方法制备。一些可离子化改性剂可购得。例如，硅烷，包括氨基烷基三烷氧基硅烷、甲基氨基烷基三烷氧基硅烷和吡啶基烷基三烷氧基硅烷可购得。另一些硅烷，如氯丙基烷基三氯硅烷和氯丙基烷基三烷氧基硅烷也可购得。这些可以与咪唑键合和反应以制造咪唑基烷基甲硅烷基表面物类，或与吡啶键合和反应以制造吡啶基烷基甲硅烷基表面物类。另一些酸性改性剂也可购得，包括但不限于，磺丙基三硅烷醇、羧乙基硅烷三醇、2-(甲酯基)乙基甲基二氯硅烷、2-(甲酯基)乙基三氯硅烷、2-(甲酯基)乙基三甲氧基硅烷、n-(三甲氧基甲硅烷基丙基)乙二胺、三乙酸、(2-二乙基磷酰乙基)三乙氧基硅烷、2-(氯磺酰基苯基)乙基三氯硅烷和2-(氯磺酰基苯基)乙基三甲氧基硅烷。
本领域技术人员已知使用常用合成程序，包括格氏反应和氢化硅烷化合成这些类型的硅烷。产物可通过色谱法、重结晶或蒸馏提纯。
其它添加剂，如异氰酸酯也可购得或可由本领域技术人员合成。常见的异氰酸酯形成程序是伯胺与光气或被称作三光气的试剂的反应。
一方面，本公开涉及一种从混合物中分离相关化合物的方法，所述方法包括(a)提供含有相关化合物的混合物；(b) 将一部分所述混合物引入具有色谱柱的色谱系统；和(c) 从所述柱中洗脱分离的相关化合物；其中所述柱具有固定相，其具有下列结构(i)：
[X](W)a(Q)b(T)c　　(i)
其中：
X是含有二氧化硅、金属氧化物、无机-有机杂化材料、一组嵌段共聚物或其组合的色谱基底；
W选自氢和羟基，其中W键合到X的表面上；
Q是在具有低水浓度的色谱条件下使随时间经过的分析物保留变化最小化的第一取代基；
T是色谱上保留分析物的第二取代基，其中T具有一个或多个单环芳族、多环芳族、杂环芳族或多杂环芳族基团，各基团任选被脂族基团取代；且
b和c是正数，0.05 ≤ (b/c) ≤ 100，且a ≥ 0。
在各种实施方案中，可以通过Q和/或T的选择、表面上的Q和/或T的密度或其组合来控制或影响色谱材料的选择性。在一些实施方案中，Q和T在保留相关化合物中起到一定作用。在另一些实施方案中，T选择性保留各不同的相关化合物。
在各种实施方案中，本公开提供一种配体可连接到其上的键合色谱材料。通过本发明的键合方法实现的高密度覆盖率可以比传统SFC材料中现行的硅烷键合化学高2X至3X。高覆盖率和Q和/或T的其它性质的组合可防止表面硅烷醇与分析物的相互作用。
在各种实施方案中，本公开提出键合相的高密度提高保留并防止由分析物与表面硅烷醇的相互作用或其它次级保留机制造成的保留漂移或变化。这些次级和次要选择性组分的消除极大改进峰形和柱峰容量，尤其是对碱性分析物而言。
在各种实施方案中，本公开提出基于偶联化学的两组分体系的使用产生混合表面官能团的均匀覆盖。不同于混合粒子床（其中混合两种单独的具有不同表面化学的粒子），这种材料在各处具有均匀和可预测的表面特征。用这样的材料填充的柱不容易由于柱填充过程中的差粒子混合或粒子类型偏析而发生色谱不稳定。
在各种实施方案中，本公开提供由于使用单一粒子浆料而简化的柱填充。
在各种实施方案中，本公开提供在不使用基于混合或多粒子的床的情况下在单柱中对酸性、中性和碱性分析物具有提高的选择性的色谱填充材料。
在各种实施方案中，本公开提出可容易控制粒子表面上的组分的比率以改变载体的选择性，提供宽范围的色谱分离选项。
在各种实施方案中，本公开提供通过表面反应性基团的聚合或通过在添加选择性配体之前或之后添加交联剂来形成硅烷表面改性剂的交联膜的键合化学。
在另一些实施方案中，本公开的色谱材料是无孔的。在另一实施方案中，本公开的色谱材料在大约1至大约14的pH下；在大约10至大约14的pH下；或在大约1至大约5的pH下水解稳定。
另一方面，本公开提供如本文所述的材料，其中该色谱材料进一步包含分散在色谱表面内的纳米粒子或多于一种纳米粒子的混合物。
在某些实施方案中，该纳米粒子以纳米复合材料的<20重量%、纳米复合材料的<10重量%或纳米复合材料的<5重量%存在。
在另一些实施方案中，该纳米粒子是结晶或非晶的，并可以是碳化硅、铝、金刚石、铈、炭黑、碳纳米管、锆、钡、铈、钴、铜、铕、钆、铁、镍、钐、硅、银、钛、锌、硼、它们的氧化物或它们的氮化物。在特定实施方案中，该纳米粒子是包含一个或多个选自纳米金刚石、碳化硅、二氧化钛和立方氮化硼的部分的物质。在另一些实施方案中，该纳米粒子可以小于或等于200纳米直径，小于或等于100纳米直径，小于或等于50纳米直径，或小于或等于20纳米直径。
在一个或多个实施方案中，Q由下式表示：
其中：
n1是1-30的整数；
n2是1-30的整数；
R1、R2、R3和R4各自独立地选自氢、羟基、氟、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、低级烷基、保护或脱保护醇和两性离子；
Z是
(a) 具有式(B1)x(R5)y(R6)zSi-的表面连接基团，其中x是1-3的整数，y是0-2的整数，z是0-2的整数，且x+y+z = 3；R5和R6各自独立地选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、取代或未取代芳基、环烷基、支链烷基、低级烷基、保护或脱保护醇、两性离子基团和硅氧烷键；且B1是硅氧烷键；
(b) 通过直接碳-碳键形成或通过杂原子、酯、醚、硫醚、胺、酰胺、酰亚胺、脲、碳酸酯、氨基甲酸酯、杂环、三唑或聚氨酯键与表面有机官能杂化基团的连接；或
(c) 没有共价连接到所述材料的表面上的吸附表面基团；
Y是嵌入的极性官能团；且
A选自亲水端基、可官能化基团、氢、羟基、氟、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、低级烷基和可极化基团。
在一个或多个实施方案中，T由下式表示：
其中
m1是1-30的整数；
m2是1-30的整数；
m3是1-3的整数；
R7、R8、R9和R10各自独立地选自氢、羟基、氟、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、低级烷基、保护或脱保护醇、两性离子、芳烃基团和杂环芳烃基团；
Z是
(a) 具有式(B1)x(R5)y(R6)zSi-的表面连接基团，其中x是1-3的整数，y是0-2的整数，z是0-2的整数，且x+y+z = 3；R5和R6各自独立地选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异 丁基、叔丁基、取代或未取代芳基、环烷基、支链烷基、低级烷基、保护或脱保护醇、两性离子基团和硅氧烷键；且B1是硅氧烷键；
(b) 通过直接碳-碳键形成或通过杂原子、酯、醚、硫醚、胺、酰胺、酰亚胺、脲、碳酸酯、氨基甲酸酯、杂环、三唑或聚氨酯键与表面有机官能杂化基团的连接；或
(c) 没有共价连接到所述材料的表面上的吸附表面基团；
Y是嵌入的极性官能团；
D选自键、N、O、S、
–(CH2)0-12–N–R11R12、
–(CH2)0-12–O–R11、
–(CH2)0-12–S–R11、
–(CH2)0-12–N–(CH2)0-12–R11R12、
–(CH2)0-12–O–(CH2)0-12–R11、
–(CH2)0-12–S–(CH2)0-12–R11、
–(CH2)0-12–S(O)1-2–(CH2)0-12–N–R11R12、
–(CH2)0-12–S(O)1-2–(CH2)0-12–O–R11、
–(CH2)0-12–S(O)1-2–(CH2)0-12–S–R11；
–(CH2)0-12–S(O)1-2–(CH2)0-12–N–(CH2)0-12–R11R12、
–(CH2)0-12–S(O)1-2–(CH2)0-12–O–(CH2)0-12–R11和
–(CH2)0-12–S(O)1-2–(CH2)0-12–S–(CH2)0-12–R11，
R11是第一单环芳族、多环芳族、杂环芳族或多杂环芳族基团；且
R12是氢、脂族基团或第二单环芳族、多环芳族、杂环芳族或多杂环芳族基团，其中R11和R12任选被选自脂族基团、卤素、羟基、硫醇、氨基、烷氧基、烷基羧基、烷硫基和硝基的一个或多个基团取代。
在一些实施方案中，R11或R12的第一或第二单环芳族、多环芳族、杂环芳族或多杂环芳族基团可以是具有至少2个芳环的多环芳烃或多杂环芳烃。R11或R12的第一或第二单环芳族、多环芳族、杂环芳族或多杂环芳族基团也可以是具有至少3个芳环的多环芳烃或多杂环芳烃。R11或R12的第一或第二单环芳族、多环芳族、杂环芳族或多杂环芳族基团也可以是具有至少4个芳环的多环芳烃或多杂环芳烃。
在一个实施方案中，R11或R12的第一或第二单环芳族、多环芳族、杂环芳族或多杂环芳族基团选自呋喃、吡咯、吡咯啉、噁唑、噻唑、咪唑、咪唑啉、吡唑、吡唑啉、吡唑烷、异噁唑、异噻唑、苯、吡啶、哒嗪、嘧啶、吡嗪、三嗪、噻吩、茚、中氮茚、吲哚、异吲哚、吲哚啉、吲唑、苯并咪唑、苯并噻唑、萘、喹嗪、喹啉、异喹啉、噌啉、酞嗪、喹唑啉、喹喔啉、1,8-萘啶、奎宁环、芴、咔唑、蒽、吖啶、吩嗪、吩噻嗪、吩噁嗪、芘及其衍生物，其中该基团未取代或任选被脂族基团取代。
在另一些实施方案中，R11或R12的第一或第二单环芳族、多环芳族、杂环芳族或多杂环芳族基团可以被至少一个C1-C24脂族基团取代。特别地，该基团可以被至少一个C2-C22脂族基团、一个C3-C20脂族基团、一个C4-C18脂族基团、一个C5-C16脂族基团、一个C6-C14脂族基团、一个C7-C12脂族基团、一个C8-C10脂族基团或一个前述碳长的任何组合的脂族基团，例如C8-C18脂族基团或如本公开中所述的其它各种尺寸的基团取代。
R11或R12可以是氨基蒽（例如1-氨基蒽、2-氨基蒽或9-氨基蒽）或甲基氨基蒽（例如1-甲基氨基蒽、2-甲基氨基蒽或9-甲基氨基蒽）。该氨基蒽或甲基氨基蒽可以在环结构上被另外一个脂族基团，例如低级烷基取代。在一些实施方案中，该氨基蒽或甲基氨基蒽可具有式(X)-氨基-(Y)-烷基-蒽或(X)-甲基氨基-(Y)-烷基-蒽，其中X是1、2或9且Y是1-10，代表蒽上的碳位置（例如1-氨基-1-甲基-蒽；1-氨基-2-甲基-蒽；1-氨基-3-甲基-蒽；1-氨基-4-甲基-蒽；1-氨基-5-甲基-蒽；1-氨基-6-甲基-蒽；1-氨基-7-甲基-蒽；1-氨基-8-甲基-蒽；1-氨基-9-甲基-蒽；1-氨基-10-甲基-蒽；1-甲基氨基-1-甲基-蒽；1-甲基氨基-2-甲基-蒽；1-甲基氨基-3-甲基-蒽；1-甲基氨基-4-甲基-蒽；1-甲基氨基-5-甲基-蒽；1-甲基氨基-6-甲基-蒽；1-甲基氨基-7-甲基-蒽；1-甲基氨基-8-甲基-蒽；1-甲基氨基-9-甲基-蒽；和1-甲基氨基-10-甲基-蒽等）。
在另一些实施方案中，该氨基蒽或甲基氨基蒽可具有式(X)-氨基-(Y)-烷基-(Z)-烷基-蒽或(X)-甲基氨基-(Y)-烷基-(Z)-烷基-蒽，其中X是1、2或9且Y和Z是1-10，代表蒽上的碳位置，条件是Y和Z不相同（例如1-氨基-1-甲基-2-甲基-蒽；1-氨基-1-甲基-3-甲基-蒽；1-氨基-1-甲基-4-甲基-蒽；1-氨基-1-甲基-5-甲基-蒽；1-氨基-1-甲基-6-甲基-蒽；1-氨基-1-甲基-7-甲基-蒽；1-氨基-1-甲基-8-甲基-蒽；1-氨基-1-甲基-9-甲基-蒽；1-氨基-1-甲基-10-甲基-蒽；等）。该氨基蒽或甲基氨基蒽可以在环结构上被第二极性基团，例如胺（例如1-氨基、4-N,N-二甲基氨基蒽）二取代。
R11或R12可以是萘基胺（例如1-萘基胺或2-萘基胺）或甲基萘基胺（例如1-甲基萘基胺或2-甲基萘基胺）。该萘基胺或甲基萘基胺可以被另外一个脂族基团，例如低级烷基取代。在一些实施方案中，该萘基胺或甲基萘基胺可具有式(X’)-氨基-(Y’)-烷基-萘或(X’)-甲基氨基-(Y’)-烷基-萘，其中X’是1或2且Y’是1-8，代表萘上的碳位置（例如1-氨基-1-甲基-萘；1-氨基-2-甲基-萘；1-氨基-3-甲基-萘；1-氨基-4-甲基-萘；1-氨基-5-甲基-萘；1-氨基-6-甲基-萘；1-氨基-7-甲基-萘；1-氨基-8-甲基-萘；9和10位置不可取代；1-甲基氨基-1-甲基-萘；1-甲基氨基-2-甲基-萘；1-甲基氨基-3-甲基-萘；1-甲基氨基-4-甲基-萘；1-甲基氨基-5-甲基-萘；1-甲基氨基-6-甲基-萘；1-甲基氨基-7-甲基-萘；1-甲基氨基-8-甲基-萘；等）。
在另一些实施方案中，该萘基胺或甲基萘基胺可具有式(X’)-氨基-(Y’)-烷基-(Z’)-烷基-萘或(X’)-甲基氨基-(Y’)-烷基-(Z’)-烷基-萘，其中X’是1或2且Y’和Z’是1-10，代表萘上的碳位置，条件是Y’和Z’不相同（例如1-氨基-1-甲基-2-甲基-萘；1-氨基-1-甲基-3-甲基-萘；1-氨基-1-甲基-4-甲基-萘；1-氨基-1-甲基-5-甲基-萘；1-氨基-1-甲基-6-甲基-萘；1-氨基-1-甲基-7-甲基-萘；1-氨基-1-甲基-8-甲基-萘；等）。
R11或R12可以是氨基菲（例如1-氨基菲、2-氨基菲、3-氨基菲、4-氨基菲或9-氨基菲）或甲基氨基菲（例如1-甲基氨基菲、2-甲基氨基菲、3-甲基氨基菲、4-甲基氨基菲或9-甲基氨基菲）。该氨基菲或甲基氨基菲可以在环结构上被另外一个脂族基团，例如低级烷基取代。在一些实施方案中，该氨基菲或甲基氨基菲可具有式(X’’)-氨基-(Y’’)-烷基-菲或(X’’)-甲基氨基-(Y’’)-烷基-菲，其中X是1、2、3、4或9且Y是1-10，代表菲上的碳位置（例如1-氨基-1-甲基-菲；1-氨基-2-甲基-菲；1-甲基氨基-1-甲基-菲；1-甲基氨基-2-甲基-菲；等）。
在另一些实施方案中，该氨基菲或甲基氨基菲可具有式(X’’)-氨基-(Y’’)-烷基-(Z’’)-烷基-菲或(X’’)-甲基氨基-(Y’’)-烷基-(Z’’)-烷基-菲，其中X是1、2、3、4或9且Y和Z是1-10（不计接合碳），代表菲上的碳位置，条件是Y和Z不相同（例如1-氨基-1-甲基-2-甲基-菲；等）。
类似地，R11或R12可以是氨基芘（例如1-氨基芘、2-氨基芘、3-氨基芘、4-氨基芘或5-氨基芘）或甲基氨基芘（例如1-甲基氨基芘、2-甲基氨基芘、3-甲基氨基芘、4-甲基氨基芘或5-甲基氨基芘）。该氨基芘和甲基氨基芘可以与氨基蒽和甲基氨基蒽类似地被取代。
类似地，R11或R12可以是氨基䓛（例如1-氨基䓛、2-氨基䓛、3-氨基䓛、4-氨基䓛、5-氨基䓛或6-氨基䓛）或甲基氨基䓛（例如1-甲基氨基䓛、2-甲基氨基䓛、3-甲基氨基䓛、4-甲基氨基䓛、5-甲基氨基䓛或6-甲基氨基䓛）。该氨基䓛和甲基氨基䓛可以与氨基蒽和甲基氨基蒽类似地被取代。
在一些实施方案中，T由下列结构之一表示：
其中各E独立地为键或可任选被羟基、氟、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、低级烷基、保护或脱保护醇、两性离子、芳烃基团或杂环芳烃基团取代的低级烷基，且其中Z、Y、R9、m1、m2和D如上定义。
在另一些实施方案中，T由下列结构之一表示：
其中Z、Y、R9、m1、m2和D如上定义。
在一些实施方案中，b和c是正数，比率0.05 ≤ (b/c) ≤ 100，且a ≥ 0。在一些实施方案中，Q和T不同，而在另一些实施方案中，Q和T相同。Q可包括两个或更多个不同的部分，且T可包括两个或更多个不同的部分。在一些实施方案中，第一、第二、第三、第四和第五分数各自独立地为大约0-100、1-99、5-95、10-90、20-80、30-70、40-60、0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95%。
在一个或多个实施方案中，Q是非极性的。在一些实施方案中，Q包含硼酸酯或硝基官能团。在一些实施方案中，Q由下式之一表示：
其中Z可包括具有式(B1)x(R5)y(R6)zSi-的表面连接基团，其中x是1-3的整数，y是0-2的整数，z是0-2的整数，且x+y+z = 3。R5和R6在每一处可以独立地代表甲基、乙基、正丁基、异 丁基、叔丁基、异丙基、叔己基、取代或未取代芳基、环烷基、支链烷基、低级烷基、保护或脱保护醇或两性离子基团，且B1可代表硅氧烷键。
在另一实施方案中，Z是通过直接碳-碳键形成或通过杂原子、酯、醚、硫醚、胺、酰胺、酰亚胺、脲、碳酸酯、氨基甲酸酯、杂环、三唑或聚氨酯键与表面有机官能杂化基团的连接。在再一实施方案中，Z是没有共价连接到所述材料的表面上的吸附表面基团。
在一些实施方案中，T由下式之一表示：
其中Z可包括具有式(B1)x(R5)y(R6)zSi-的表面连接基团，其中x是1-3的整数，y是0-2的整数，z是0-2的整数，且x+y+z = 3。R5和R6在每一处可以独立地代表甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、取代或未取代芳基、环烷基、支链烷基、低级烷基、保护或脱保护醇、两性离子基团和硅氧烷键，且B1可代表硅氧烷键。在一些实施方案中，Z是通过直接碳-碳键形成或通过杂原子、酯、醚、硫醚、胺、酰胺、酰亚胺、脲、碳酸酯、氨基甲酸酯、杂环、三唑或聚氨酯键与表面有机官能杂化基团的连接。在一些实施方案中，Z是没有共价连接到所述材料的表面上的吸附表面基团。
在一些实施方案中，R11或R12的第一或第二单环芳族、多环芳族、杂环芳族或多杂环芳族基团可以转化成环烯烃。例如，吡啶基团在某些条件下在溶液中可转化成环烯烃。在一些情况下，环烯烃保持足够的不饱和度以从混合物中保留并分离结构上相关的相关化合物（一种或多种）。在特定情况下，含有环烯烃的本公开的固定相可保留、分离和解析与维生素相关的关键对（例如D2和D3，K1和K2）。
Q和T取代基也可以聚合。Q和T取代基可以聚合到各自本身上，例如Q-Q、T-T，或互相聚合，例如Q-T。如图4中所示，聚合可以在表面层面在硅氧烷基团之间和/或在烃取代基之间发生。取代基之间的聚合可产生交联表面涂层或在该表面涂层上的第二涂层，例如也可以聚合或不聚合的取代基或两者的混合物的第二层。Q和T取代基的聚合度可变。例如，第一分数的Q可以键合到X上，且第二分数的Q可以聚合。同样地，第一分数的T可以键合到X上，且第二分数的T可以聚合。在另一实施方案中，第一分数的Q可以键合到X上，第二分数的Q可以聚合，第三分数的T可以键合到X上，且第四分数的T可以聚合。Q和T的聚合部分可以自聚合或互相聚合。
在任何上述方面的一个或多个实施方案中，X是具有在色谱条件下通过色谱流动相进行烷氧基化的芯表面的高纯度色谱材料。X可以是具有在色谱条件下通过色谱流动相进行烷氧基化的芯表面的色谱材料。在一些实施方案中，包括Q的官能团是二醇。包括T的官能团可以是胺、醚、硫醚或其组合。T可包括适用于手性分离的手性官能团，Q可包括适用于手性分离的手性官能团，或T和Q可以都包括适用于手性分离的手性官能团。
在上述方面的一个或多个实施方案中，比率b/c为大约0.05-75、0.05-50、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80或90。在一些实施方案中，X的表面不包括二氧化硅，且b = 0或c = 0。在一些实施方案中，合计表面覆盖率大于大约0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、5、6、7或8微摩尔/平方米。
在上述方面的一些实施方案中，该色谱固定相表现出经30天≤ 5%、经30天≤ 4%、经30天≤ 3%、经30天≤ 2%、经30天≤ 1%、经10天≤ 5%、经10天≤ 4%、经10天≤ 3%、经10天≤ 2%、经10天≤ 1%、经3天≤ 5%、经3天≤ 4%、经3天≤ 3%、经3天≤ 2%、经3天≤ 1%、经30次运行≤ 5%、经30次运行≤ 4%、经30次运行≤ 3%、经30次运行≤ 2%、经30次运行≤1%、经10次运行≤ 5%、经10次运行≤ 4%、经10次运行≤ 3%、经10次运行≤ 2%、经10次运行≤ 1%、经3次运行≤ 5%、经3次运行≤ 4%、经3次运行≤ 3%、经3次运行≤ 2%或经3次运行≤ 1%的保留漂移或变化。
在一些实施方案中，该芯材基本由二氧化硅材料构成。任选地，该芯材基本由有机-无机杂化材料或表面多孔材料构成。在一个或多个实施方案中，该芯材基本由具有杂化表面层的无机材料、具有无机表面层的杂化材料、周围杂化层或具有不同的杂化表面层的杂化材料构成。该固定相材料可任选为多粒子、整料或表面多孔材料的形式。在一些实施方案中，该固定相材料没有色谱增强性孔隙几何，而在另一些实施方案中，该固定相材料具有色谱增强性孔隙几何。该固定相材料可以是球形材料、非球形材料（例如包括环圈、多面体）的形式。在某些实施方案中，该固定相材料具有高度球形的芯形态、杆形的芯形态、弯杆形的芯形态、环圈形的芯形态；或哑铃形的芯形态。在某些实施方案中，该固定相材料具有高度球形、杆形、弯杆形、环圈形或哑铃形的形态的混合物。
在一些实施方案中，该固定相材料具有大约25至1100平方米/克、大约150至750平方米/克或大约300至500平方米/克的表面积。在一些实施方案中，该固定相材料具有大约0.2至2.0立方厘米/克或大约0.7至1.5立方厘米/克的孔隙体积。在一些实施方案中，该固定相材料具有小于大约105平方米/克、小于大约80平方米/克或小于大约50平方米/克的微孔表面积。该固定相材料可具有大约20至1500 Å、大约50至1000 Å、大约60至750 Å或大约65至200 Å的平均孔径。在一些实施方案中，所述多粒子具有大约0.2至100微米、大约0.5至10微米或大约1.5至5微米的尺寸。
在一个或多个实施方案中，X包括二氧化硅芯，c = 0，且Q具有≥ 2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.5、4.0、4.5或5微摩尔/平方米的合计表面覆盖率；或X包括非二氧化硅芯或二氧化硅-有机杂化芯，c = 0，且Q具有≥ 0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5或5微摩尔/平方米的合计表面覆盖率；或b > 0，c > 0，且Q具有≥ 0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5或5微摩尔/平方米的合计表面覆盖率。
在另一些实施方案中，Q具有≥ 0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2.0微摩尔/平方米的合计表面覆盖率。在另一些实施方案中，T具有≥ 0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0或3.5微摩尔/平方米的合计表面覆盖率。T也可具有大约0.1至大约4.0微摩尔/平方米，或大约0.2至大约3.9微摩尔/平方米，或大约0.3至大约3.8微摩尔/平方米，或大约0.4至大约3.7微摩尔/平方米，或大约0.5至大约3.6微摩尔/平方米，或大约1.0至大约3.5微摩尔/平方米，或大约1.2至大约3.0微摩尔/平方米，或数值的任何组合，如大约3.0至大约4.0微摩尔/平方米的合计表面覆盖率。
在另一些实施方案中，Q和T的总合计覆盖率≥ 0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.5、6.0或6.5微摩尔/平方米。
该色谱固定相可用于正相色谱法、高压液相色谱法、溶剂化气相色谱法、超临界流体色谱法、亚临界流体色谱法、基于二氧化碳的色谱法、亲水相互作用液相色谱法或疏水相互作用液相色谱法。
该色谱固定相可包括径向调节孔隙、非径向调节孔隙、有序孔隙、非有序孔隙、单分散孔隙、非单分散孔隙、光滑表面、粗糙表面或其组合。在一个或多个实施方案中，T具有一个可离子化基团，T具有多于一个可离子化基团，T具有两个或更多个pKa相同的可离子化基团，或T具有两个或更多个pKa不同的可离子化基团。
在另一实施方案中，本公开涉及具有下列结构(i)的色谱固定相：
[X](W)a(Q)b(T)c　　(i)
其中X是是含有二氧化硅、金属氧化物、无机-有机杂化材料、一组嵌段共聚物或其组合的色谱基底；W选自氢和羟基，其中W键合到X的表面上；Q是在具有低水浓度的色谱条件下使随时间经过的分析物保留变化最小化的第一取代基；T是色谱上保留分析物的第二取代基，其中T具有一个或多个芳烃、多环芳烃、杂环芳烃或多杂环芳烃基团，各基团任选被脂族基团取代；且b和c是正数，0.05 ≤ (b/c) ≤ 100，且a ≥ 0。
在另一实施方案中，本公开涉及用于正相色谱法、高压液相色谱法、溶剂化气相色谱法、超临界流体色谱法、亚临界流体色谱法、基于二氧化碳的色谱法、亲水相互作用液相色谱法或疏水相互作用液相色谱法的柱、毛细管柱、微流体器件或装置，其包含具有至少一个限定具有入口和出口的室的壁的外壳和布置在其中的如本公开中所述的固定相，其中所述外壳和固定相适用于正相色谱法、高压液相色谱法、溶剂化气相色谱法、超临界流体色谱法、亚临界流体色谱法、基于二氧化碳的色谱法、亲水相互作用液相色谱法或疏水相互作用液相色谱法。
在另一实施方案中，本公开涉及用于正相色谱法、高压液相色谱法、溶剂化气相色谱法、超临界流体色谱法、亚临界流体色谱法、基于二氧化碳的色谱法、亲水相互作用液相色谱法或疏水相互作用液相色谱法的试剂盒，其包含具有至少一个限定具有入口和出口的室的壁的外壳和布置在其中的如本公开中所述的固定相，其中所述外壳和固定相适用于正相色谱法、高压液相色谱法、溶剂化气相色谱法、超临界流体色谱法、亚临界流体色谱法、基于二氧化碳的色谱法、亲水相互作用液相色谱法或疏水相互作用液相色谱法；和用所述外壳和固定相实施正相色谱法、高压液相色谱法、溶剂化气相色谱法、超临界流体色谱法、亚临界流体色谱法、基于二氧化碳的色谱法、亲水相互作用液相色谱法或疏水相互作用液相色谱法的说明书。
该试剂盒可包括具有至少一个限定具有入口和出口的室的壁的外壳和布置在其中的根据本公开的任一实施方案的固定相。该装置可具有预成型熔块（frit）、由互连材料生成的熔块或无熔块的装置。该外壳和固定相适用于正相色谱法、高压液相色谱法、溶剂化气相色谱法、超临界流体色谱法、亚临界流体色谱法、基于二氧化碳的色谱法、亲水相互作用液相色谱法或疏水相互作用液相色谱法或其组合。另外，可包括用所述外壳和固定相实施正相色谱法、高压液相色谱法、溶剂化气相色谱法、超临界流体色谱法、亚临界流体色谱法、基于二氧化碳的色谱法、亲水相互作用液相色谱法或疏水相互作用液相色谱法或其组合的说明书。
相应地，本公开的试剂盒可用于实施本文所述的本发明的方法。另外，本发明的试剂盒可用于分析各种不同的样品和样品类型，包括下文描述的那些。
在一个或多个实施方案中，本发明可考虑含有本公开的方面的试剂盒以降低或减轻保留漂移或变化的影响。例如，试剂盒可含有填充本公开的固定相介质的色谱柱。在一些实施方案中，该填充柱可直接用于标准色谱系统（例如市售色谱系统，如Waters Acquity®色谱系统）。试剂盒可进一步含有使用说明书。另外，试剂盒可进一步含有用于校准仪器和/或证实基本不存在保留漂移或变化的纯分析物的储备样品。试剂盒可包括任何或所有上述组件（例如固定相、填充柱或色谱装置）以减轻保留漂移或变化的影响。
在另一实施方案中，本公开涉及一种减轻或防止正相色谱法、高压液相色谱法、溶剂化气相色谱法、超临界流体色谱法、亚临界流体色谱法、基于二氧化碳的色谱法、亲水相互作用液相色谱法或疏水相互作用液相色谱法中的保留漂移的方法，其包括使用包含如本公开中所述的色谱固定相的色谱装置色谱分离样品，由此减轻或防止保留漂移。
在一个或多个实施方案中，减轻或防止保留漂移或变化包括经30天≤ 5%、经30天≤ 4%、经30天≤ 3%、经30天≤ 2%、经30天≤ 1%、经10天≤ 5%、经10天≤ 4%、经10天≤3%、经10天≤ 2%、经10天≤ 1%、经3天≤ 5%、经3天≤ 4%、经3天≤ 3%、经3天≤ 2%、经3天≤ 1%、经30次运行≤ 5%、经30次运行≤ 4%、经30次运行≤ 3%、经30次运行≤ 2%、经30次运行≤ 1%、经10次运行≤ 5%、经10次运行≤ 4%、经10次运行≤ 3%、经10次运行≤ 2%、经10次运行≤ 1%、经3次运行≤ 5%、经3次运行≤ 4%、经3次运行≤ 3%、经3次运行≤ 2%或经3次运行≤ 1%的保留漂移或变化。在一些实施方案中，减轻或防止保留漂移或变化包括基本消除色谱材料的烷氧基化和/或脱烷氧基化对保留的影响。
本文所用的化学改性色谱芯材的概念被理解为包括例如用极性硅烷或其它官能团将色谱芯官能化，由此减轻或避免保留漂移或变化。例如，官能化可基本防止分析物和色谱芯之间的色谱相互作用（例如有效消除芯表面硅烷醇和/或烷氧基化硅烷醇的色谱影响）。在一些情况下，官能化（例如使用非极性基团）可降低该柱的保留力。因此，在各种实施方案中，色谱芯材的官能化可包括使用亲水、极性、可离子化和/或带电的官能团，其与分析物色谱相互作用以保持或实现色谱有用的总体保留。可以例如通过标准键合化学引入这样的封端基团。
在一些实施方案中，官能化提供永久接合。因此，选择适合该色谱相的官能化是重要的。在优选实施方案中，该色谱材料具有色谱合意性质（例如总体保留）。因此在一些实施方案中选择具有可模仿传统色谱材料的合意（例如总体保留）性质的性质的官能化是重要的。
在各种实施方案中，可以选择官能团的化学性质以实现所需效果。例如，可以使用一个或多个亲水、极性、可离子化和/或带电的官能团实现与分析物（例如色谱可接受的保留）和/或流动相（例如排斥可能使色谱芯表面烷氧基化的醇）的所需相互作用。同样地，可以选择端基尺寸和/或空间以掩蔽芯表面和/或实现手性分离。
类似地，可以改变官能化的浓度。在一些实施方案中，较大和/或较强相互作用的官能团可在较低浓度下（例如与较小官能团相比）减轻或避免保留漂移或变化。在另一些实施方案中，可以针对所需性质调节覆盖率。例如，非极性官能团可以在比极性官能团低的覆盖率下使用（例如为了保持所需保留）。在各种实施方案中，官能化可以使用一个或多个极性或非极性端基或其组合。在一些实施方案中，提高或降低色谱介质的表面积以补偿由于官能团的极性改变而降低或提高的保留。
在另一实施方案中，本公开涉及一种制备如本公开中所述的固定相的方法，其包括使色谱基底与具有侧反应性基团的硅烷偶联剂反应；使包含一个或多个芳烃、多环芳烃、杂环芳烃或多杂环芳烃基团的第二化学试剂与所述侧反应性基团反应；和中和任何剩余未反应的侧反应性基团，由此制造所述固定相。
在另一实施方案中，本公开涉及一种制备如本公开中所述的固定相的方法，其包括使具有侧反应性基团的硅烷偶联剂低聚；使芯表面与低聚的硅烷偶联剂反应；使包含一个或多个芳烃、多环芳烃、杂环芳烃或多杂环芳烃基团的第二化学试剂与所述侧反应性基团反应；和中和任何剩余未反应的侧反应性基团，由此制造所述固定相。
在一个或多个实施方案中，Q衍生自具有下列结构之一的试剂：
。
在一些实施方案中，Y包括下列结构之一：
其中与Y基团缔合的R6和R7基团各自独立地为脂族基团。在一些实施方案中，Y基团也可以是键或脂族基团。
上述方法可用于制造如本文所述的任何材料（例如色谱固定相材料）。例如，本公开的方法可包括使色谱固定相（例如二氧化硅粒子）与化学试剂（例如如本文所述的任何上述试剂）反应以化学改性固定相的表面以减轻保留漂移或变化的影响的方法。
本公开包括包含本文所述的色谱材料的各种装置（例如色谱柱、毛细管和微流体器件及其使用系统）。尽管下文论述一些示例性实例，本领域普通技术人员会理解，本公开可考虑许多不同的实施方案，包括但不限于色谱柱、装置、使用方法或试剂盒。
在一些实施方案中，本公开提供用于正相色谱法、高压液相色谱法、溶剂化气相色谱法、超临界流体色谱法、亚临界流体色谱法、基于二氧化碳的色谱法、亲水相互作用液相色谱法或疏水相互作用液相色谱法或其组合的柱或装置。该柱或装置包括具有至少一个限定具有入口和出口的室的壁的外壳以及布置在其中的根据本公开的任一实施方案的固定相。该装置可具有预成型熔块、由互连材料生成的熔块或无熔块的装置。该外壳和固定相适用于正相色谱法、高压液相色谱法、溶剂化气相色谱法、超临界流体色谱法、亚临界流体色谱法、基于二氧化碳的色谱法、亲水相互作用液相色谱法或疏水相互作用液相色谱法或其组合。
相应地，本公开的装置可含有（例如填充）本公开的材料（例如色谱固定相，如适用于降低或减轻保留漂移或变化的化学改性的固定相）。此外，本公开的装置可用于进行如本文所述的本公开的方法。
在一个实施方案中, 本公开为填充柱形式。该柱可以填充本文所述的固定相（例如色谱材料）。这样的柱可用于实施不同类型的色谱法（例如正相色谱法、超临界流体色谱法、基于二氧化碳的色谱法、疏水相互作用液相色谱法、亲水相互作用液相色谱法、亚临界流体色谱法、高压液相色谱法和溶剂化气相色谱法），同时减轻或避免保留漂移或变化。
该柱可以与现有色谱平台，如市售色谱系统，包括Waters Alliance® HPLC系统、Waters Acquity®系统或Waters UPC2®系统结合使用。本公开的柱可用于许多不同的质量处理量（例如分析规模色谱法、制备规模色谱法），同时减轻保留漂移或变化的影响。同样地，可以在毛细管和微流体器件及其使用系统（例如可购得并且为本领域普通技术人员已知）中具体实施本公开。本领域普通技术人员容易理解柱、毛细管和微流体器件和相关系统的选择。
在各种实施方案中，根据本公开的材料可用于SFC、HPLC和/或UHPLC系统上使用的微径柱。在各种实施方案中，根据本公开的材料可用于快速平衡柱、长寿命柱和具有水稳定柱的SFC。
本公开可用于从来自许多不同领域，例如来自临床化学、医学、兽医学、法医化学、药理学、食品工业、职业安全和环境污染的许多不同样品中保留、分离和/或分析许多不同的化合物。所述多种样品包括但不限于，小有机分子、蛋白质、核酸、脂质、脂肪酸、碳水化合物、聚合物等。类似地，本公开可用于分离小分子、极性小分子、用于药品、生物分子、抗体、聚合物和低聚物、糖、聚糖分析、石油化学分析、脂质分析、肽、磷酸肽、寡核苷酸、DNA、RNA、极性酸、多环芳烃、食品分析、化学分析、生物分析、滥用药物、法医学、农药、农用化学品、生物仿制药、制剂的分析物。
可用本公开色谱分离的分析物可包括基本任何相关分子，包括例如小有机分子、脂质、肽、核酸、合成聚合物。
临床化学目标分析物可包括存在于生物体（例如人体、动物体、真菌、细菌、病毒等）中的任何分子。例如，临床化学目标分析物 包括，但不限于，蛋白质、代谢产物、生物标记和药物。
人类医学和兽医学目标分析物可包括可用于诊断、预防或治疗对象的疾病或状况的任何分子。例如，人类医学和兽医学目标分析物包括，但不限于，疾病标志物、预防药或治疗药。
法医化学目标分析物可包括取自犯罪现场的样品，如取自受害者身体的样品（例如组织或体液样品、毛发、血液、精液、尿等）中存在的任何分子。例如，临床化学目标分析物包括，但不限于，毒剂、药物和它们的代谢产物、生物标记和鉴别化合物。
药理学目标分析物可包括作为药物或其代谢产物或可用于药物的设计、合成和监测的任何分子。例如，药理学目标分析物包括，但不限于，预防和/或治疗药、它们的前药、中间体和代谢产物。药理学分析可包括例如与通用名药的批准、制造和监测相关的生物等效性试验。
食品工业和农业目标分析物可包括与监测食品、饮料和/或其它食品工业/农业产品的安全性有关的任何分子。来自食品工业领域的目标分析物的实例包括，但不限于，病原体标记、变应原（例如麸质和坚果蛋白）和霉菌毒素。
目标分析物可包括多肽（例如天然和/或非天然存在的氨基酸，如Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp、Cys、Met、Ser、Thr、Tyr、His、Lys、Arg、Asp、Glu、Asn、Gln、硒半胱氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸、羟基脯氨酸、甲基赖氨酸、羧基谷氨酸的聚合物）、肽、蛋白质、糖蛋白、脂蛋白；肽-核酸；激素（如肽激素（例如TRH和加压素）以及合成和工业多肽。
在一些实施方案中，相关化合物是饱和或不饱和脂质、维生素或多环芳烃。本文所用的术语“饱和”是指在该分子的酰基位点不含双键的成分。本文所用的术语“饱和脂质”是指在该分子的酰基链位点不含双键的脂肪和油的成分。本文所用的术语“不饱和”是指在该分子中含有一个或多个不饱和位点的成分。本文所用的术语“不饱和脂质”是指在该分子中含有一个或多个不饱和位点的脂肪和油的成分。这些可存在于该分子的脂肪酸部分中，如在甘油三酯、磷脂和糖脂中，或在该分子中的烷基链中，如在类胡萝卜素、烃和脂溶性维生素中。该脂质可选自饱和和不饱和脂肪酸、磷脂、甘油脂、甘油磷脂、溶血磷酸甘油脂（lysophosphoglycerolipid）、鞘脂、甾醇脂、孕烯醇酮脂、糖脂、类胡萝卜素、蜡和聚酮化合物。
在另一实施方案中，本公开可用于保留、分离和解析多环芳烃和相关化合物。多环芳烃（PAHs）构成一类由稠芳环构成的非官能化芳族化合物。有大约2000种化合物被归类为PAHs。PAHs和它们的衍生物由于燃烧过程，如化石燃料燃烧而广泛存在于环境中。它们强结合到土壤有机质（腐殖酸）上且它们在土壤和其它环境区（environmental compartment）中的降解速率通常缓慢。此外，到达水道的PAHs迅速转移到沉积物中。
PAHs也在民用和工业燃烧工艺，如提取植物油、草药、香料和其它食材、熏制和炙烤食材等的过程中形成。PAHs是有毒致癌的化合物。它们的存在和量的控制在食品安全和健康与安全规章的领域中越来越重要。PAHs的几个效应是酶诱导、免疫抑制、致畸性和促进肿瘤。
在特定实施方案中，脂质可以是饱和或不饱和的脂肪酸、单酰基甘油酯、二酰基甘油酯 、三酰基甘油酯、磷脂或类固醇。甘油三酯（TG、三酰甘油、TAG或三酰基甘油酯）是衍生自甘油和三个脂肪酸的酯。作为血脂，它们有助于脂肪和血糖从肝中双向转移。存在许多甘油三酯：取决于油来源，一些高度不饱和，一些较低度。甘油三酯是植物油（通常更不饱和）和动物脂肪（通常更饱和）的主要成分。甘油三酯是人皮肤油脂的主要组分。
类固醇是含有互相连接的四个环烷烃环的特征排列的一类有机化合物。类固醇的实例包括膳食脂肪胆固醇、性激素雌二醇和睾酮和抗炎药地塞米松。类固醇的核由键合在一起的17个碳原子构成，它们呈四个稠环的形式：三个环己烷环和一个环戊烷环。类固醇通过连接到这种四环核上的官能团和这些环的氧化态改变。甾醇是类固醇的特殊形式，其具有在位置-3的羟基和衍生自胆甾烷的骨架。
在植物、动物和真菌中发现成百上千的不同类固醇。所有类固醇都在细胞中由甾醇羊毛甾醇（动物和真菌）或由环阿屯醇（植物）制成。羊毛甾醇和环阿屯醇都衍生自三萜烯角鲨烯的环化。
在另一些实施方案中，相关化合物可以是选自维生素C、维生素B或其衍生物或组合的脂溶性维生素。脂溶性维生素是相关的，因为它们难以溶解，通常需要强有机溶剂并经RPLC分离。通常，使用SFC条件借助C18硅烷（ODS）或其它烷基键合相分离脂溶性维生素。这些方法通常在流动相中使用极弱的助溶剂和较高百分比的CO2。本公开的优点之一是用富π电子的选择因子（selector），例如1-氨基蒽改性固定相。将富π电子的选择因子偶联到固定相上使两个关键对，如维生素D2和D3，或K1和K2之间的选择性色谱分离最大化。
本公开的另一优点是固定相具有pKa相对较高的选择因子以致不需要酸或碱性添加剂实现该分离。在一个实施方案中，本公开涉及使用无酸添加剂和/或碱性添加剂的流动相的方法。在另一些实施方案中，本公开涉及使用具有少于5.0%或4.0%或3.0%或2.0%、1.0%或0.5%或0.2%或0.1%或0.05%的酸添加剂和/或碱性添加剂的流动相的方法。仅使用用甲醇作为助溶剂改性的二氧化碳，可以产生快速通用的方法。例如，使用具有例如1-氨基蒽作为选择因子的本公开的固定相实现上述维生素关键对的分离。在一个实施方案中，维生素关键对之间的分辨率水平高于现行方法（每相同柱长度的分辨率；使用sub-2 µm粒子和50 mm柱长度）。
本公开可用于保留、分离和解析维生素C和相关化合物。维生素C [2-氧代-L-苏-己烯酸-1,4-内酯2,3-烯二醇（2-oxo-L-threo-hexono-1,4-lactone2,3-enediol）]或L-抗坏血酸是水溶性维生素和人体的必需营养素。其是正常生长和发育以及身体所有部分中的组织修复所需的胶原形成中所必需的。维生素C也充当阻断自由基造成的损伤并直接减少有毒化学品和污染物的抗氧化剂。
由于人类体内不制造维生素C，其主要获自膳食来源，如水果和蔬菜。膳食维生素C的缺乏可能造成维生素C缺乏症。重度维生素C缺乏症，也称作“坏血病”，导致在皮肤上形成肝斑、海绵状龈（spongy gum）和粘膜出血或甚至死亡。
现在，维生素C不仅用作膳食补充剂，还用作一些病毒感染和晚期癌症的辅助疗法。预防缺乏症的成年人维生素C推荐每日摄取量是女性75 mg和男性90 mg，两者的可耐受上限都是2,000 mg。对于在解毒和癌症治疗中的治疗用途，以高得多的剂量静脉给予维生素C。尽管维生素C毒性临床少见，但相对较高的口服摄入剂量可能造成胃不适和腹泻。已经开发出对维生素C血浓度的测定并被患者和医师用于评估营养状况或优化治疗剂量。这些化合物的测量是维生素C营养状况和某些维生素C类似物的效力的有用指标。
在另一实施方案中，本公开可用于保留、分离和解析维生素B和相关化合物。B族维生素是在细胞代谢中起到重要作用的一类水溶性维生素。B族维生素曾经被认为是单一维生素，简称为维生素B。后来的研究表明它们是通常在相同食品中共存的化学上不同的维生素。一般而言，含有所有8重的补充剂被称作复合维生素B。单独的B维生素补充剂由该维生素的专用名表示（例如B1、B2、B3等）。B族维生素的名单包括：维生素B1（硫胺素）、维生素B2（核黃素）、维生素B3（烟酸或烟酰胺）、维生素B5（泛酸）、维生素B6（吡哆醇、吡哆醛或吡哆胺或盐酸吡哆醇)、维生素B7（生物素）、维生素B9（叶酸）、维生素B12（各种钴胺素；在维生素补充剂中通常被称作氰钴胺素）。
维生素B化合物的作用不同。例如，硫胺素在由碳水化合物生成能量中起到核心作用。其参与RNA和DNA生产，以及神经功能。其活性形式是被称作焦磷酸硫胺素（TPP）的辅酶，其参与丙酮酸盐在代谢中转化成乙酰辅酶A（CoA）。核黃素参与用于电子传递链、柠檬酸循环以及脂肪酸分解代谢（β-氧化）的能量生产。烟酸由两种结构构成：烟酸和烟酰胺。烟酸有两种辅酶形式：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）。两者都在葡萄糖、脂肪和醇的代谢中的能量转移反应中起到重要作用。NAD在代谢反应过程中携带氢和它们的电子，包括从柠檬酸循环到电子传递链的路径。NADP是脂质和核酸合成中的辅酶。
泛酸参与脂肪酸和碳水化合物的氧化。可由泛酸合成的辅酶A参与氨基酸、脂肪酸、酮、胆固醇、磷脂、甾类激素、神经递质（如乙酰胆碱）和抗体的合成。吡哆醇通常以5'-磷酸吡哆醛（PLP）的形式储存在体内，其是维生素B6的辅酶形式。吡哆醇参与氨基酸和脂质的代谢；神经递质和血红蛋白的合成，以及烟酸（维生素B3）的生产。吡哆醇也在糖异生中起到重要作用。生物素在脂质、蛋白质和碳水化合物的代谢中起到关键作用。其是四种羧化酶的关键辅酶：参与由乙酸盐合成脂肪酸的乙酰辅酶A羧化酶；参与糖异生的丙酰辅酶A羧化酶；参与亮氨酸代谢的β-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶；和参与能量、氨基酸和胆固醇的代谢的丙酮酸辅酶A羧化酶。
叶酸充当四氢叶酸（THF）形式的辅酶，其参与核酸和氨基酸的代谢中的单碳单位的转移。THF参与嘧啶核苷酸合成，因此是正常细胞分裂所需的，尤其是在妊娠和婴儿期，它们是迅速生长期。叶酸也有助于红细胞生成（红血球的生产）。维生素B12参与碳水化合物、蛋白质和脂质的细胞代谢。其是骨髓、神经鞘和蛋白质中的血细胞生产中必需的。维生素B12充当蛋氨酸合成酶与甲钴胺的反应和甲基丙二酰辅酶A变位酶与腺苷钴胺素的反应的中间代谢中的辅酶。
这些维生素的任何缺乏的影响不同。维生素B1硫胺素缺乏造成脚气病。神经系统的这种疾病的症状包括体重减轻、情绪紊乱、韦尼克脑病（感官知觉受损）、虚弱和肢体疼痛、不规则心跳周期和水肿（身体组织肿胀）。在重症病例中可能发生心力衰竭和死亡。慢性硫胺素缺乏症也会造成科尔萨科夫综合征，以健忘和代偿性虚构症为特征的不可逆痴呆。
维生素B2核黃素缺乏造成核黄素缺乏症。症状可能包括唇损害（唇干裂）、对阳光的高敏感性、口角炎、舌炎（舌头炎症）、脂溢性皮炎或假梅毒（特别影响阴囊或大阴唇和口腔）、咽炎（咽喉痛）、充血，和咽喉和口腔粘膜的水肿。
维生素B3烟酸缺乏与色氨酸缺乏一起造成糙皮病。症状包括攻击、皮炎、失眠、虚弱、精神错乱和腹泻。在重症病例中，糙皮病可能造成痴呆和死亡（3(+1) Ds: 皮炎、腹泻、痴呆和死亡）。
维生素B5泛酸缺乏会造成痤疮和感觉异常，尽管这不常见。维生素B6吡哆醇缺乏可能造成小红细胞性贫血（因为磷酸吡多酸是血红素合成的辅助因子）、抑郁、皮炎、高血压（血压过高）、保水性和升高的高半胱氨酸水平。维生素B7生物素缺乏通常不会在成年人中造成症状，但在婴儿中可能造成生长障碍和神经障碍。即使膳食生物素摄入正常，多发性羧化酶缺乏症（先天性代谢异常）也会造成生物素缺乏。
维生素B9叶酸缺乏造成巨红细胞性贫血和升高的高半胱氨酸水平。孕妇体内的缺乏会造成出生缺陷。在妊娠期间通常推荐补充。研究已表明叶酸也可能减慢年龄对大脑的潜在影响。维生素B12钴胺素缺乏造成巨红细胞性贫血、升高的高半胱氨酸、周围神经病、记忆丧失和其它认知缺陷。其最可能在老年人中发生，因为经肠道的吸收随年龄衰减；自身免疫病恶性贫血是另一常见原因。其也会造成躁狂症和精神病的症状。在罕见的极端情况下，会造成麻痹。这些化合物的测量是维生素B营养状况和某些维生素B类似物的效力的有用指标。
在另一些实施方案中，相关化合物可以是选自维生素D、维生素A、维生素K、维生素E、β胡萝卜素或其衍生物或组合的脂溶性维生素。本公开可用于保留、分离和解析维生素D和相关化合物。维生素D是在钙稳态的正调控中具有重要生理作用的必需营养素。维生素D可以在皮肤中通过暴露在阳光下从头合成或其可以从膳食中吸收。维生素D有两种形式；维生素D2（麦角钙化醇）和维生素D3（胆钙化醇）。维生素D3是由动物从头合成的形式。其也是添加到美国生产的乳制品和某些食品中的常见补充剂。膳食和内在合成的维生素D3都必须经过代谢活化才能生成生物活性代谢产物。在人类中，维生素D3活化的初始步骤主要在肝中发生并涉及羟基化以形成中间代谢产物25-羟基胆钙化醇（骨化二醇），其在25位置酶促羟基化。骨化二醇是维生素D3在循环中的主要形式。循环骨化二醇随后被肾转化以形成1,25-二羟基维生素D3（骨化三醇），其通常被认为是生物活性最高的维生素D3代谢产物。维生素D2源自真菌和植物来源。许多非处方膳食补充剂含有麦角钙化醇（维生素D2）而非胆钙化醇（维生素D3）。Drisdol（在美国可用的维生素D的唯一高效力处方形式）用麦角钙化醇配制。维生素D2在人体内经过与维生素D3类似的代谢活化途径，以形成代谢产物骨化二醇和骨化三醇。维生素D2和维生素D3长期被认为在人体内生物等效，但最近的报道表明维生素D的这两种形式在生物活性和生物利用度方面不同。这些化合物的测量是维生素D营养状况和某些维生素D类似物的效力的有用指标。
在另一实施方案中，本公开可用于保留、分离和解析维生素A和相关化合物。维生素A是一类不饱和营养有机化合物，其包括视黄醇、视黄醛、视黄酸和几种前维生素A类胡萝卜素，其中β-胡萝卜素最重要。维生素A具有多种功能：其对生长和发育、免疫系统的维持和良好的视力是重要的。眼睛视网膜需要视黄醛形式的维生素A，其与蛋白质视蛋白合并形成视紫红质光吸收分子，所述分子是低光视觉（暗视觉）和色视觉所必需的。维生素A也作为视黄醇的不可逆氧化形式（被称作视黄酸）发挥非常不同的作用，其是对上皮细胞和其它细胞重要的类激素生长因子。
在动物来源的食品中，维生素A的主要形式是酯，主要棕榈酸视黄酯，其在小肠中转化成视黄醇（化学上是醇）。视黄醇形式充当该维生素的储存形式并可以转化成和转化自其视觉活性的醛形式视黄醛。相关的酸（视黄酸）（可由维生素A不可逆合成的代谢产物）只有部分维生素A活性并且没有在视网膜中对视循环发挥作用。视黄酸用于生长和细胞分化。
维生素A的所有形式具有β-紫罗兰酮环，类异戊二烯链连接到其上，被称作视黄基。这两个结构特征对维生素活性都是必不可少的。胡萝卜的橙色素 – β-胡萝卜素 – 可呈现为两个连接的视黄基，它们在体内被利用以贡献维生素A水平。α-胡萝卜素和γ-胡萝卜素也具有单视黄基，这赋予它们一些维生素活性。
维生素A在食物中以两种主要形式存在：(i) 视黄醇，在食用动物性食物来源时吸收的维生素A形式，是黄色脂溶性物质。由于纯醇形式不稳定，该维生素以视黄酯形式存在于组织中。其也以酯形式商业生产和给药，如视黄醇乙酸酯或棕榈酸酯。(ii) 胡萝卜素α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素；和叶黄素β-隐黄素（所有这些都含有β-紫罗兰酮环），但没有其它类胡萝卜素，在草食动物和杂食动物中充当前维生素A，它们拥有在肠粘膜中裂解β-胡萝卜素并将其转化成视黄醇的酶（15-15'-双加氧酶）。一般而言，食肉动物是含紫罗兰酮的类胡萝卜素的不良转化者，且纯食肉动物如猫和雪貂缺乏15-15'-双加氧酶并且无法将任何类胡萝卜素转化成视黄醛（以致对这些物种而言没有一种类胡萝卜素是维生素A的形式）。这些化合物的测量是维生素A营养状况和某些维生素A类似物的效力的有用指标。
在另一实施方案中，本公开可用于保留、分离和解析维生素K和相关化合物。维生素K是人体在血液凝结所需的某些蛋白质的翻译后修饰和在骨骼和其它组织中的代谢途径中需要的一类结构上类似的脂溶性维生素。它们是2-甲基-1,4-萘醌(3-)衍生物。这类维生素包括两种天然维生素：维生素K1和维生素K2。
维生素K1，也称作叶绿醌、phytomenadione或植物甲萘醌，由植物合成并在绿叶蔬菜中以最高量存在，因为其直接参与光合作用。其可被认为是维生素K的“植物形式”。其在动物中有活性并可在动物体内发挥维生素K的经典功能，包括其在凝血蛋白生产中的活性。动物也可能将其转化成维生素K2。
维生素K2，在动物体内的主要储存形式，具有几种亚型，它们的类异戊二烯链长不同。这些维生素K2同系物被称作甲基萘醌类，并通过它们侧链中的类异戊二烯残基数表征。甲基萘醌类缩写为MK-n，其中M代表甲基萘醌，K代表维生素K，且n代表类异戊二烯侧链残基数。例如，甲基萘醌-4（缩写MK-4）在其侧链中具有四个异戊二烯残基。甲基萘醌-4（也由其四个异戊二烯残基被称作四烯甲萘醌）是动物产品中最常见类型的维生素K2，因为MK-4通常由某些动物组织（动脉壁、胰腺和睾丸）中的维生素K1通过用含有四个异戊二烯单元的不饱和geranylgeranyl尾替代叶绿基尾合成，由此产生甲基萘醌-4。维生素K2的这种同系物可具有与维生素K1不同的酶功能。
结肠（大肠）中的细菌也可将K1转化成维生素K2。此外，细菌通常延长维生素K2的类异戊二烯侧链以产生一系列维生素K2形式，最尤其是维生素K2的MK-7至MK-11同系物。除MK-4外的所有形式的K2只能由细菌生产，它们在厌氧呼吸中利用这些形式。MK-7和其它细菌来源的维生素K2形式在动物体内表现出维生素K活性，但MK-7超过MK-4的额外效用（如果有的话）不清楚并且目前仍在研究。
维生素K的三种合成类型是已知的：维生素K3、K4和K5。尽管天然K1和所有K2同系物已证实无毒，但合成形式K3（甲萘醌）已表现出毒性。K4和K5也无毒。这些化合物的测量是维生素K营养状况和某些维生素K类似物的效力的有用指标。
在另一实施方案中，本公开可用于保留、分离和解析维生素E和相关化合物。维生素E是指一类八种脂溶性化合物，包括生育酚和生育三烯酚。在维生素E的许多不同形式中，γ-生育酚在北美饮食中最常见。γ-生育酚可存在于玉米油、大豆油、人造黄油和酱汁中。α-生育酚，维生素E的最生物活性形式，是饮食中第二常见的维生素E形式。这一变体最丰富存在于小麦胚芽油、葵花油和红花油中。作为脂溶性抗氧化剂，其终止在脂肪发生氧化时形成的活性氧簇的生产。每天超过1,000毫克（1,500 IU）的量被称作维生素E过多，因为它们可能提高出血问题和维生素K缺乏的风险。这些化合物的测量是维生素E营养状况和某些维生素E类似物的效力的有用指标。
一般而言，样品是包括至少一种目标分析物（例如上文公开的类型或种类的分析物，与基质一起）的组合物。样品可包括固体、液体、气体、混合物、材料（例如具有中间稠度，如提取物、细胞、组织、生物体）或其组合。在各种实施方案中，该样品是身体样品、环境样品、食物样品、合成样品、提取物（例如通过分离技术获得）或其组合。
身体样品可包括源自个体身体的任何样品。在这方面，个体可以是动物，例如哺乳动物，例如人。其它示例性个体包括小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、猫、狗、山羊、绵羊、猪、牛或马。该个体可以是患者，例如患有疾病或疑似患有疾病的个体。身体样品可以是体液或组织，例如为科学或医学试验提取，例如用于研究或诊断疾病（例如通过检测和/或鉴定病原体或生物标志物的存在）。身体样品也可包括细胞，例如个体身体样品的病原体或细胞（例如肿瘤细胞）。这样的身体样品可通过已知方法，包括组织活检（例如钻取活组织检查）和通过提取血液、支气管吸出物、痰、尿、粪便或其它体液获得。示例性的身体样品包括体液、全血、血浆、血清、脐带血（特别是通过经皮脐带血取样（PUBS）获得的血液、脑脊髓液（CSF）、唾液、羊水、母乳、分泌物、脓水、尿、粪便、胎粪、皮肤、指甲、毛发、脐、胃内容物、胎盘、骨髓、外周血淋巴细胞（PBL）和实体器官组织提取物。
环境样品可包括源自环境，如自然环境（例如海洋、土壤、空气和植物区系）或人工环境（例如运河、隧道、建筑物）的任何样品。示例性环境样品包括水（例如饮用水、河水、地表水、地下水、饮用水、污水、流出水、废水或渗滤液）、土壤、空气、沉积物、生物区系（例如土壤生物）、植物区系、动物区系（例如鱼）和土体（例如挖出物）。
食物样品可包括源自食物（包括饮料）的任何样品。这样的食物样品可用于各种用途，包括例如(1) 核查食物是否安全；(2) 核查在食用食物（留样）时食物是否含有有害污染物或食物是否不含有害污染物；(3) 核查食物是否仅含允许的添加剂（例如符合法规）；(4) 核查其是否含有正确水平的强制成分（例如食物标签上的声明是否正确）；或(5) 分析食物中所含的营养素量。示例性食物样品包括动物、植物或合成来源的食用产品（例如奶、面包、蛋或肉）、谷类、饮料及其部分，如留样。食物样品还可包括水果、蔬菜、豆类、坚果、油籽、油果、谷类、茶、咖啡、草药浸汁、可可、啤酒花、香草、香料、糖料植物、肉、脂肪、肾、肝、内脏、奶、蛋、蜂蜜、鱼和饮料。
合成样品可包括源自工业过程的任何样品。该工业过程可以是生物工业过程（例如使用含有遗传信息并能自复制或在生物系统中复制的生物材料的过程，如使用转染细胞的发酵过程）或非生物工业过程（例如化合物，如药物的化学合成或降解）。合成样品可用于核查和监测工业过程的进程，测定所需产物的收率和/或测量副产物和/或原材料的量。
实施例
材料
除非另行指明，所有试剂按来样使用。本领域技术人员会认识到，存在下列供应物和供应商的同等物，因此下列供应商不应被视为限制性的。
表征技术
本领域技术人员会认识到，存在下列仪器和供应商的同等物，因此下列仪器不应被视为限制性的。
通过燃烧分析（CE-440元素分析仪；Exeter Analytical Inc., NorthChelmsford, MA）或通过库仑碳分析仪（模块CM5300、CM5014, UIC Inc., Joliet, IL）来测量%C值。通过烧瓶燃烧，接着离子色谱法（Atlantic Microlab, Norcross, GA）测定溴和氯含量。使用多点N2吸附法（Micromeritics ASAP 2400；Micromeritics InstrumentsInc., Norcross, GA）测量这些材料的比表面积（SSA）、比孔隙体积（SPV）和平均孔径（APD）。使用BET法计算SSA，SPV是P/P0 > 0.98所测得的单点值，并使用BJH法由等温线的解吸分支计算APD。作为从比表面积（SSA）中减去孔隙< 34 Å的累积吸附孔径数据测定微孔表面积（MSA）。通过压汞法（Micromeritics AutoPore II 9220或AutoPore IV,Micromeritics, Norcross, GA）测量中值介孔直径（MMPD）和介孔孔隙体积（MPV）。使用Micromeritics AccuPyc 1330 Helium Pycnometer（V2.04N, Norcross, GA）测量骨架密度。使用Beckman Coulter Multisizer 3分析仪（30 µm孔径，70,000次计数；Miami, FL）测量粒度。作为基于体积的粒度分布的50%累积直径测量粒径（dp50）。作为90%累积体积直径除以10%累积体积直径（称作90/10比率）测量分布宽度。使用Brookfield数字粘度计ModelDV-II（Middleboro, MA）测定这些材料的粘度。用Oakton pH100系列仪表（Cole-Palmer,Vernon Hills, Illinois）进行pH测量并在临使用前在环境温度下使用Orion（ThermoElectron, Beverly, MA）pH缓冲标样校准。使用Metrohm 716 DMS Titrino自动滴定仪（Metrohm, Hersau, Switzerland）进行滴定，并作为毫克当量/克（mequiv/g）报道。通过滴定在添加硫代硫酸钠时释放的OH-测定环氧化物的覆盖水平。使用Bruker InstrumentsAvance-300光谱仪（7 mm双宽带探针）获得多核(13C, 29Si) CP-MAS NMR谱。自旋速度通常为5.0-6.5 kHz，循环延迟为5秒。且交叉极化接触时间为6毫秒。使用外标金刚烷（13C CP-MAS NMR, δ 38.55）和六甲基环三硅氧烷（29Si CP-MAS NMR, δ -9.62）相对于四甲基硅烷记录报道的13C和29Si CP-MAS NMR谱移。通过使用DMFit软件的光谱反褶积来评估不同硅环境的群体（population）。[Massiot, D.；Fayon, F.；Capron, M.；King, I.；Le Calvé, S.；Alonso, B.；Durand, J.-O.；Bujoli, B.；Gan, Z.；Hoatson, G. Magn.Reson. Chem.2002, 40, 70-76]。
实施例1 用于固定相的环氧化物层的制备
在典型反应中，将杂化多孔粒子分散在环氧丙氧丙基三甲氧基硅烷/甲醇（0.25 mL/g）（GLYMO, Aldrich, Milwaukee, WI）在20 mM乙酸盐缓冲液（pH 5.5，使用乙酸和乙酸钠制备，J.T. Baker，5 mL/g稀释）中的溶液中，其已在70℃下预混60分钟。将该混合物在70℃下保持20小时。然后冷却该反应，过滤产物并相继用水和甲醇（J.T. Baker）洗涤。然后将产物在减压下在80℃下干燥16小时。所用的特定粒子显示在表1中。
表1 所用的特定基础粒子
条目 材料
B1 杂化有机二氧化硅(3.8 µm, 90 Ǻ APD, 1.3立方厘米/克 TPV)1
B2 杂化有机二氧化硅(3.8 µm, 115 Ǻ APD, 1.3立方厘米/克 TPV)1
B3 杂化有机二氧化硅(2.3 µm, 115 Ǻ APD, 1.3立方厘米/克 TPV)1
B4 杂化有机二氧化硅(1.7 µm, 143 Ǻ APD, 0.73立方厘米/克 TPV
B5 杂化有机二氧化硅(1.7 µm, 106 Ǻ APD, 1.25立方厘米/克 TPV
1 如US7919177、US 7223473、US6686035和WO2011084506中所述。
反应数据列在表2中。对这种通用程序的具体改变包括：1) 材料1E使用6小时反应时间制备，2) 材料1F使用100 mM乙酸盐缓冲液制备，3) 材料1G使用50℃保持20小时制备，4) 材料1H使用50℃预混和50℃保持温度制备。由通过元素分析测得的表面改性之前和之后的粒子%C差异来测定3.90 – 6.0微摩尔/平方米的总表面覆盖率。通过13C CP-MAS NMR光谱法分析这些材料表明对这些材料而言存在环氧基和二醇基团的混合物。
表2 固定相的初始层的覆盖率
1 这是指来自键合的GPTMS硅烷的合计覆盖率 – 来自未水解环氧化物的覆盖率 + 来自水解环氧化物（作为二醇）的覆盖率
2 如通过滴定测定。
实施例2 具有二醇官能的固定相的制备
在典型反应中，将杂化多孔粒子分散在环氧丙氧丙基三甲氧基硅烷/甲醇（0.25 mL/g）（GLYMO, Aldrich, Milwaukee, WI）在20 mM乙酸盐缓冲液（pH 5.5，使用乙酸和乙酸钠制备，J.T. Baker，5 mL/g稀释）中的溶液中，其已在70℃下预混60分钟。该混合物在70℃下保持20小时。然后冷却该反应，过滤产物并相继用水和甲醇（J.T. Baker）洗涤。该材料随后在0.1 M乙酸溶液（5 mL/g稀释，J.T. Baker）中在70℃下回流20小时。然后冷却该反应，过滤产物并相继用水和甲醇（J.T. Baker）洗涤。然后将产物在减压下在80℃下干燥16小时。反应数据列在表3中。由通过元素分析测得的表面改性之前和之后的粒子%C差异来测定0.93– 6.0微摩尔/平方米的表面覆盖率。通过13C CP-MAS NMR光谱法分析这些材料表明没有留下可测量量的环氧基团，这些材料只存在二醇基团。
表3 固定相的初始层的覆盖率
。
实施例3 - 具有混合官能团的固定相的制备
在标准实验中，将10克上文制成的材料分散在溶剂，例如但不限于水、异丙醇或二氧杂环己烷中。添加超过对上文制成的材料测定的环氧化物覆盖率的亲核体的量并将该混合物加热到70℃进行16小时。表4提供所用的特定亲核体的名单。在反应后，粒子相继用水和0.5M乙酸洗涤，该材料然后在0.1 M乙酸溶液（5 mL/g稀释，J.T. Baker）中在70℃下搅拌20小时。然后冷却该反应，过滤产物并相继用水和甲醇（J.T. Baker）洗涤。然后将产物在减压下在80℃下干燥16小时。反应数据列在表5中。由通过元素分析测得的表面改性之前和之后的粒子%C、%N或%S差异来测定0.2 – 2.3微摩尔/平方米的亲核体表面浓度。通过13C CP-MASNMR光谱法分析这些材料表明没有留下可测量量的环氧基团。
表4 所用的特定亲核体的名单
条目 亲核体
N1 1-氨基蒽
N2 4-正辛基苯胺
N3 6-氨基喹啉
N4 苯胺
N5 1-萘基胺
N6 8-氨基喹啉
N7 2-氨基蒽
N8 苄基胺
N9 2-氨甲基吡啶
N10 吡啶
N11 N-十八烷基胺
N12 二乙胺
表5
。
实施例4 固定相的进一步表征
应用实施例1-3中详述的用于粒子键合/官能化的通用程序来改性不同多孔材料的表面硅烷醇基团。其中包括整料、球形、颗粒状、表面多孔和不规则材料，其是在杂化无机/有机、二氧化硅、氧化钛、氧化铝、氧化锆、聚合物或碳材料上的二氧化硅、杂化无机/有机材料、杂化无机/有机表面层，和在杂化无机/有机、二氧化硅、氧化钛、氧化铝、氧化锆或聚合物或碳材料上的二氧化硅表面层。还包括球形材料、非球形材料（例如包括环圈、多面体）形式的固定相材料；具有高度球形的芯形态、杆形的芯形态、弯杆形的芯形态、环圈形的芯形态；或哑铃形的芯形态的固定相材料；和具有高度球形、杆形、弯杆形、环圈形或哑铃形的形态的混合物的固定相材料。示例性杂化材料显示在美国专利Nos. 4,017,528、6,528,167、6,686,035和7,175,913以及国际公开No. WO2008/103423中，它们的内容全文经此引用并入本文。表面多孔粒子包括美国公开Nos. 2013/0112605、2007/0189944和2010/061367中描述的那些，它们的内容全文经此引用并入本文。球形、颗粒状或不规则材料的粒度可以为5-500微米；更优选15-100微米；更优选20-80微米；更优选40-60微米不等。这些材料的APD可以为30至2,000 Å；更优选40至200 Å；更优选50至150 Å不等。这些材料的SSA可以为20至1000平方米/克；更优选90至800平方米/克；更优选150至600平方米/克；更优选300至550平方米/克不等。这些材料的TPV可以为0.3至1.5立方厘米/克；更优选0.5至1.4立方厘米/克；更优选0.7至1.3立方厘米/克不等。整料的大孔直径可以为0.1至30微米，更优选0.5至25微米，更优选1至20微米不等。
实施例5 固定相表现出在色谱条件下随时间经过的极小分析物保留变化
通过取用由第3、10或30天色谱试验测得的平均绝对峰保留与在第1天色谱试验时测得的平均绝对峰保留的百分比差异来计算平均%保留变化。对于试验的每天，在Mix1试验条件下平衡该柱20分钟，接着三次注入Mix1，然后在Mix2试验条件下平衡10分钟，接着三次注入Mix2。条件显示在表6中。结果显示在表7和8中。
通过取用对Mix 1和Mix 2测得的第1天平均绝对峰保留与在实施例1A上对Mix 1和Mix 2测得的第1天平均绝对峰保留的百分比差异来计算%少保留。
表6 用于测量保留变化的色谱试验条件
助溶剂Mix1 5%甲醇
样品Mix1 3-苯甲酰基吡啶(0.1mg/mL)
助溶剂Mix2 10%甲醇
样品Mix2 咖啡因、胸腺嘧啶、罂粟碱、泼尼松龙、磺胺(各0.2mg/mL)
柱尺寸 2.1 x 150 mm
流量 1.0 mL/min
柱温度 50℃
背压 1800 psi
检测器 Acquity PDA，具有SFC Flow Cell
检测器设置 254 nm 40 spec/sec
弱洗针 异丙醇
注射 1.0 µL (2.0µL循环，PLUNO注射模式)
仪器 UPC²
软件 Empower
表7 随时间经过来自实施例2的材料的保留变化
/表明未对这种材料进行该试验。
表8 随时间经过来自对比材料的保留变化
。
/表明未对这种材料进行该试验。
实施例6 用环氧丙氧丙基三甲氧基硅烷（GPTMS）和1-氨基蒽将有机-无机杂化粒 子表面官能化
GPTMS和1-氨基蒽的结构显示在图1中。图1A显示GPTMS（硅烷表面改性剂）的结构。部分105显示GPTMS（三烷氧基硅烷）的表面反应性基团，而部分110显示反应性基团（环氧化物）。图1B显示选择性配体（1-氨基蒽）。
首先使GPTMS通过在70℃下在20 mM乙酸钠缓冲液pH 5.0中预培养来预形成低聚物。在培养过程中，形成水解硅烷的小低聚物。在合适的预培养期后，以干燥粉末形式添加待改性的粒子。低聚物和任何剩余单体与该材料表面反应以产生如图2中所示共价连接到材料表面上的硅烷改性剂的高表面覆盖率。
图2显示硅烷偶联剂与有机-无机杂化材料表面的反应。为简单起见，描绘硅烷(205)作为单体。预形成的低聚硅烷可以与表面反应性基团(210)相同的方式偶联。在一些实施方案中，未连接到表面上的一部分硅烷也可偶联到涂层上（例如交叉聚合）。在反应条件下，消除甲醇(215)以产生表面改性粒子(220)。
在硅烷与色谱材料反应后，通过用MilliQ H2O洗涤除去过量试剂和缓冲盐并将该材料转移到有机溶剂（例如1,4-二氧杂环己烷）中并添加1-氨基蒽。1-氨基蒽的氨基通过GPTMS的侧环氧化物基团偶联到表面上。可以通过限制1-氨基蒽添加量来控制转化的环氧基的比例。然后将该偶联材料洗涤到0.5M乙酸中并且未反应的环氧化物基团如图3中所示水解成相应的二醇。
所得1-氨基蒽/二醇表面含有均匀分布的1-氨基蒽基团并提供优异的选择性，同时二醇屏蔽表面硅烷醇与分析物的相互作用。该多组分表面优于单独的二醇表面或单独的1-氨基蒽表面。
图3显示表面改性粒子(305)与选择性配体(310)的反应。给出反应条件(315)并包括在70℃下用异丙醇和0.5 M乙酸处理。结果获得用于色谱分离的具有多组分表面的固定相粒子(320)。
替代地，可以在制造聚合表面的条件下使用具有侧反应性基团作为键合相的硅烷偶联剂在反应条件（其同时键合到基材表面上、部分使该侧反应性基团反应以形成惰性侧基并也造成相邻硅烷偶联剂分子上的侧反应性基团之间的有限聚合）下制造该多组分表面。
类似地，可以在制造聚合表面的条件下通过共价键合能与分析物相互作用以通过将带电、不带电、极性、非极性、亲脂或亲水特性引入色谱相而影响保留的第二化学试剂制造该多组分表面。或者，在某些条件下，GPTMS的环氧基可以与相邻硅烷的羟基反应以形成醚桥，其交联表面上的GPTMS。这样的交联可以为该键合相提供稳定性并也可增强硅烷醇保护。此类交联的存在与这些材料的NMR分析相符。交联表面的类型的一个实施方案显示在图4中。图4还显示涂层中的交联硅烷基团，其中该硅烷没有连接到表面上。这种结构证实通过表面环氧化物的聚合形成醚桥。
实施例7
图5显示用于制备本公开的色谱固定相的两个可能的合成途径。如方案(500)中所示，未改性的BEH粒子(505)可以至少两种不同的方式化学改性。相应地，作为一个选项，首先通过使GPTMS与1-氨基蒽反应制备化学改性剂(510)。然后使试剂510与BEH粒子(505)反应以产生官能化色谱表面(515)。
替代地，图5显示不同的合成途径。在该实施方案中，粒子505直接与GPTMS反应以产生GPTMS-改性表面(520)。然后可以使表面520与1-氨基蒽(525)反应以产生官能化色谱表面(515)。
在一个优选实施方案中，包括首先使粒子505与GPTMS反应接着用1-氨基蒽(525)官能化的第二反应途径表现优于包括使粒子505与预形成的化学改性剂510反应的第一反应途径。
实施例8 在有机-无机杂化材料上的GPTMS键合减轻保留漂移或变化
如图6中所示，用环氧丙氧丙基三甲氧基硅烷（GPTMS）处理桥连亚乙基杂化物（BEH）固定相，接着环氧化物开环反应以产生二醇，这可以显著减轻保留漂移效应。图600显示与二醇官能化的3µm BEH粒子(610)相比，未官能化的3µm BEH粒子(605)的%原始保留的图。作为时间的函数给出%原始保留，在x轴上给出天数。结果表明，在至少一些优选实施方案中，用GPTMS将色谱表面官能化和随后环氧化物开环以产生二醇可以减轻保留漂移。结果还表明，单独的GPTMS涂层解决保留漂移的问题并也提供显著保留。
实施例9 使用基于1-氨基蒽的固定相分离相关化合物
使用简单色谱条件，本公开的方法和固定相提供与当前的现有技术方法相比更优相关化合物，例如脂质和脂溶性维生素的分离。它们也提供不同的选择性，这有利于解析不同种类的化合物。
使用ACQUITY UPC2系统，其配有：使用收敛色谱二元溶剂管理器(ccBSM)、样品管理器 (SM)、收敛色谱管理器(CCM)、柱管理器(CM-A)和光电二极管阵列(PDA)。如下提供该系统和分离条件：
第一条件: 流量: 梯度: 在2分钟内3-20%甲醇/CO2；20%甲醇/CO2 0.5分钟；在0.5分钟内20-3%甲醇/CO2。ABPR设置: 2175 psi。柱温度: 40℃。检测: 235 nm，补偿400-500 nm（视需要，对维生素A而言，320 nm，补偿400-500 nm）。柱尺寸: 3.0 x 50 mm。固定相: 如实施例7中提供的1-氨基蒽改性二醇，2.5 µm。
第二条件: 流量: 2.0 mL/min. 梯度: 在3分钟内3-8%甲醇/CO2（#8曲线）；在0.5分钟内8-35%甲醇/CO2（#1曲线）；35%甲醇/CO2 1分钟；在0.5分钟内35-3%甲醇/CO2（#1曲线）。ABPR:1800 psi。柱温度: 50℃。样品: GLC85脂质标样（Nu-chek Prep, Elysian, MN,USA）, 1 g/L在CHCl3储液中，用1:1庚烷:IPA稀释20x。柱尺寸: 3.0x50 mm。固定相: 如实施例7中提供的1-氨基蒽改性二醇，2.5 µm。
也使用ACQUITY SQD2质谱仪: 3.46kV毛细管；25V锥；350℃源；500 L/hr脱溶剂气体；10 L/hr锥气体；LM Res 11.8；HM Res 15.1；-0.2 离子能量提供峰检测和结构测定。
图7-16显示使用本公开的方法和固定相实现的脂质分离。这些分离的结果表明，1-氨基蒽偶联出色地保留和分离脂溶性维生素、脂质和代谢产物。与C18键合相相比，1-氨基蒽偶联增强形状/异构选择性。
这些结果令人惊讶，因为在相同配体上混合疏水和亲水基团不仅具有挑战性，还对固定相而言是非典型的基序（motif）。通常，富π电子配体用于非常专业化的分离并用于提供与C18键合相略微不同的选择性。发现在基于1-氨基蒽的固定相和例如ACQUITY UPC2HSS C18 SB（在本公开中用于比较目的）之间存在非常不同的选择性。
在脂溶性维生素的情况下，如它们的名字所示，这些分子是非极性的并通常具有很少可离子化基团。在一些实施方案中，该固定相可含有不能增强非极性化合物的分离的残留胺。在一些实施方案中，这些基团可以控制配体的表面pH。这些基团的存在并未指示有可能分离脂溶性维生素。通常，在C18键合相，如ACQUITY UPC2 HSS C18 SB上进行维生素、脂质和代谢产物分离。在该材料上，烷基链是产生高亚甲基/疏水选择性但极小的形状/异构选择性的保留选择因子。本公开的材料，如含有1-氨基蒽的那些出色地保留和分离脂溶性维生素、脂质和代谢产物。这些材料还与C18键合相相比增强形状/异构选择性。
用于脂质时产生类似的结论，即1-氨基蒽偶联优于ACQUITY UPC2 HSS C18 SB。当使用优化方法时，在1-氨基蒽偶联原型上解析更多脂质峰。观察到的提高的峰数与脂肪酸的碳链长度和饱和度的选择性相关。1-氨基蒽原型解决“Fast and Simple Free FattyAcids Analysis Using UPC2/MS”（Library Number: APTNT134753626；Part Number720004763en）中注明的问题，其声称“反相色谱法根据链长和不饱和度分离脂质。该问题在 于该反相分离法的双重性质（脂肪酰基链中的双键降低保留时间且脂肪酰基链长提高保留 时间）会阻碍实际样品的分析的事实；组分数通常如此大以致由于共洗脱而难以识别”。本公开的固定相带来不饱和脂肪酸链的更多保留（更多的双键带来更长的保留时间）和更长的链长。该分离基于碳原子数和双键数提高保留，这是与烷基键合的固定相相比出色的改进。
本领域技术人员会理解，本公开可用于发展和调节其它应用领域中的方法：精细化学品/材料（OLEDs、农用化学品、染料/有机染料、构象聚合物、聚合物添加剂和表面活性剂）、食品和环境（农药、甘油酯、食用油、烟草、食物掺假）、药品/生命科学（脂质谱、天然产品、DMPK/生物分析、杂质谱、医药化学）和法医学/研究（鸦片剂、滥用药物、类固醇、脂肪酸、抗抑郁药、火药组分、爆炸物）。
此外，这些材料和方法可用作多维实验（2D-SFC、SFC-LC等）的一部分。与这些结合的其它材料包括Argentation（银浸渍材料）和现有脂质方法，如在CSH品牌的柱上的方法。
实施例10 使用本公开的各种固定相分离相关化合物
根据之前的实施例使用不同选择因子制备另一些色谱材料。在这些附加固定相上进行脂质分析。受试材料包括使用下列选择因子的固定相：1-氨基蒽、2-氨甲基吡啶、吡啶、6-氨基喹啉、苯胺、二醇和4-正辛基苯胺。
如下提供通用色谱条件：样品：GLC85脂质(Nu-chek Prep), 1 g/L在CHCl3中；用1:1 IPA:庚烷稀释20x。系统：UPC2 w/ SQD2, ESI- 电离。流动相: 97.5/2.5 MeOH/H2O w/0.1M NH3补充流。3.0x50 mm柱。该样品含有C4-C24脂质的混合物（m/z: 87；115.1；143.1；171.1；185.1；199.2；213.2；227.2；241.2；255.2；269.2；283.3；311.3；339.3；225.2；239.2；253.2；267.2；277.2；279.2；281.2；303.2；305.2；307.3；309.3；327.2；335.3；337.3；365.3）。
图17-24显示使用这些固定相的脂质分离，分布图和基于碳键数的每种脂质。一般而言，基于双键数，含有1-氨基蒽和4-正辛基苯胺的固定相表现出该混合物的足够的分辨率，以及保留的提高。使用2-氨甲基吡啶、吡啶、6-氨基喹啉和苯胺偶联和二醇的固定相不能解析样品中的大多数脂质峰。表9提供这些固定相的性能的概要。
表9 本公开的各种固定相的性能
。
表9提供结果的概要。作为该脂质混合物的第一个和最后一个洗脱峰之间的时间差测量保留窗。希望使这一值最大化，因为其代表分离空间。材料3A提供最高保留窗值，为HSS C18 SB（对比）的200%。作为保留窗除以在该保留窗中洗脱的所有峰的平均峰宽测量峰容量。材料3E提供与HSS C18 SB相比的显著改进，峰容量大20%。C18:0、C18:1、C22:1和C22:6的保留值代表分别具有18和22的碳链长度和在链中分别0、1和6个双键的脂质的保留时间。材料3E和HSS C18 SB表现出随双键数增加而降低的保留，而所有其它材料表现出提高的保留，该混合物中的所有C18和C22脂质的（保留）范围通过分别从饱和脂质C18或C22的保留时间中减去具有最高不饱和水平（最多双键）的脂质C18或C22的保留时间计算。这些柱中的负值代表基于链中存在的双键数的保留降低。这一名单中的材料的正C18和C22范围值代表与HSS C18 SB相比的独特选择性。总双键（DB）范围是由C18和C22范围的总和的绝对值计算的C18和C22脂质物类的总范围。希望使这一值最大化，这体现在材料3A中。在一些实施方案中，本公开的材料在正常或常规色谱条件下提供大于0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4或1.5的DB值。
据观察，N-辛基苯胺、HSS C18 SB（对比柱）、1-氨基蒽和苯胺基固定相提供最佳峰容量。峰容量是保留窗除以在13.4%下的平均峰宽（4 sigma宽度）。吡啶、6-氨基喹啉、2-氨甲基吡啶和1-氨基蒽提供最佳C18和C22范围。C18范围是C18:2和C18:0之间的时间差。负值表明C18:2在C18:0前洗脱。这同样适用于C22范围。1-氨基蒽、吡啶、6-氨基喹啉和2-氨甲基吡啶提供最佳总双键范围。C18:0具有18个碳和0个双键；C18:1具有18个碳和1个双键；等等。总DB（双键）范围是C18和C22系列的最大和最小保留时间之差。
实施例11 使用本公开的各种固定相分离维生素D和K
使用本公开的固定相测试两个关键对，维生素K1和K2和维生素D2和D3以测定这些材料是否改进这些对的分辨率。色谱条件提供在表10中。表11提供结果的概要。对于各受试材料，分别测量两个关键对维生素K1和K2和维生素D2和D3的分辨率。与HSS C18 SB（对比）相比，材料3J、3H和3P显著改进关键对的分辨率，特别是对维生素K1和K2而言。如下计算百分比改进：
。
预计材料3J、3H和3P的较小粒度会进一步改进关键对的分辨率。例如，预计降低材料3P的粒度会将观察到的分辨率提高另外44%。据信，与HSS C18 SB相比，材料3J、3H和3P的共轭部分提高色谱表面和维生素之间的相互作用，以促进独特的选择性。
在一些实施方案中，本公开的材料在正常或常规色谱条件下提供大于1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0或4.5的维生素D3/D4的Rs值。在一些实施方案中，本公开的材料在正常或常规色谱条件下提供大于1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0或4.5的维生素K1/K2的Rs值。
表10 色谱条件
助溶剂 甲醇
梯度 在2分钟中3-20%助溶剂
样品 维生素: A、维生素A乙酸酯、E、维生素E乙酸酯、K1、K2、D2、D3 (各0.2mg/mL)
柱尺寸 3.0 x 50 mm
流量 1.2 mL/min
柱温度 40℃
背压 2175 psi
检测器 Acquity PDA，具有SFC Flow Cell
检测器设置 235 nm 40 spec/sec (320 nm对于维生素A)
弱洗针 异丙醇
注射 0.5 µL (2.0µL循环，PLUNO注射模式)
仪器 UPC²
软件 Empower
表11 本公开的各种固定相在维生素D和K分离中的性能
材料 维生素k Rs 维生素D Rs 维生素D Rs的%改进（与HSS C18 SB相比）
HSS C18SB 0.23 0.74 0
2F 2.09 0.26 -64
3L 3.40 0.46 -38
3O 2.20 0.22 -71
3N 0.30 0.32 -57
3F 2.77 0.43 -42
3I 3.86 0.67 -9
3G 3.54 0.54 -27
3M 2.65 / /
3E 2.01 0.00 -100
3J 3.49 0.86 16
3H 3.97 0.79 7
3P 3.81 0.99 34
除非另有说明，所有技术，包括试剂盒和试剂的使用，可以根据制造商的信息、本领域中已知的方法进行。
本文中的数值范围的列举仅意在用作单独提到落在该范围内的各单独数值的简写法。除非另有说明，各单独数值就像单独列举那样并入本说明书。本文中引用的各文献（包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商规范和说明书）全文经此引用并入本文。
说明书应被理解为公开并包括所述方面、实施方案和实施例的所有可能的排列和组合，除非上下文另有说明。本领域普通技术人员会认识到，可以与出于举例说明而非限制性目的给出的概述和描述的方面、实施方案和实施例不同地实施本发明。

Claims (30)

1.一种从混合物中分离相关化合物的方法，所述方法包括：
(a) 提供含有相关化合物的混合物；
(b) 将一部分所述混合物引入具有色谱柱的色谱系统；和
(c) 从所述柱中洗脱分离的相关化合物；
其中所述柱具有固定相，所述固定相具有下列结构(i)：
[X](W)a(Q)b(T)c　　(i)
其中：
X是含有二氧化硅、金属氧化物、无机-有机杂化材料、一组嵌段共聚物或其组合的色谱基底；
W选自氢和羟基，其中W键合到X的表面上；
Q是在具有低水浓度的色谱条件下使随时间经过的分析物保留变化最小化的第一取代基；
T是色谱上保留分析物的第二取代基，其中T具有一个或多个单环芳族、多环芳族、杂环芳族或多杂环芳族基团，各基团任选被脂族基团取代；且
b和c是正数，0.05 ≤ (b/c) ≤ 100，且a ≥ 0。
2.权利要求1的方法，其中第一分数的Q键合到X上，且第二分数的Q聚合。
3.权利要求1的方法，其中第一分数的T键合到X上，且第二分数的T聚合。
4.权利要求1的方法，其中第一分数的Q键合到X上，第二分数的Q聚合，第三分数的T键合到X上，且第四分数的T聚合。
5.权利要求1的方法，其中第二分数的Q的一部分和第四分数的T的一部分互相聚合。
6.权利要求1的方法，其中Q具有下列结构(ii)：
其中：
n1是1-30的整数；
n2是1-30的整数；
R1、R2、R3和R4各自独立地选自氢、羟基、氟、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、低级烷基、保护或脱保护醇和两性离子；
Z是
a) 具有式(B1)x(R5)y(R6)zSi-的表面连接基团，其中x是1-3的整数，y是0-2的整数，z是0-2的整数，且x+y+z = 3；
R5和R6各自独立地选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、取代或未取代芳基、环烷基、支链烷基、低级烷基、保护或脱保护醇、两性离子基团和硅氧烷键；且
B1是硅氧烷键；
b) 通过直接碳-碳键形成或通过杂原子、酯、醚、硫醚、胺、酰胺、酰亚胺、脲、碳酸酯、氨基甲酸酯、杂环、三唑或聚氨酯键与表面有机官能杂化基团的连接；或
c) 没有共价连接到所述材料的表面上的吸附表面基团；
Y是嵌入的极性官能团、键或脂族基团；且
A选自亲水端基、可官能化基团、氢、羟基、氟、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、低级烷基和可极化基团。
7.权利要求1的方法，其中T具有下列结构(iii)：
其中
m1是1-30的整数；
m2是1-30的整数；
m3是1-3的整数；
R7、R8、R9和R10各自独立地选自氢、羟基、氟、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、低级烷基、保护或脱保护醇、两性离子、芳烃基团和杂环芳烃基团；
Z是
a) 具有式(B1)x(R5)y(R6)zSi-的表面连接基团，其中x是1-3的整数，y是0-2的整数，z是0-2的整数，且x+y+z = 3；
R5和R6各自独立地选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、取代或未取代芳基、环烷基、支链烷基、低级烷基、保护或脱保护醇、两性离子基团和硅氧烷键；且
B1是硅氧烷键；
b) 通过直接碳-碳键形成或通过杂原子、酯、醚、硫醚、胺、酰胺、酰亚胺、脲、碳酸酯、氨基甲酸酯、杂环、三唑或聚氨酯键与表面有机官能杂化基团的连接；或
c) 没有共价连接到所述材料的表面上的吸附表面基团；
Y是嵌入的极性官能团、键或脂族基团；
D选自键、N、O、S、
–(CH2)0-12–N–R11R12、
–(CH2)0-12–O–R11、
–(CH2)0-12–S–R11、
–(CH2)0-12–N–(CH2)0-12–R11R12、
–(CH2)0-12–O–(CH2)0-12–R11、
–(CH2)0-12–S–(CH2)0-12–R11、
–(CH2)0-12–S(O)1-2–(CH2)0-12–N–R11R12、
–(CH2)0-12–S(O)1-2–(CH2)0-12–O–R11、
–(CH2)0-12–S(O)1-2–(CH2)0-12–S–R11；
–(CH2)0-12–S(O)1-2–(CH2)0-12–N–(CH2)0-12–R11R12、
–(CH2)0-12–S(O)1-2–(CH2)0-12–O–(CH2)0-12–R11和
–(CH2)0-12–S(O)1-2–(CH2)0-12–S–(CH2)0-12–R11；
R11是第一单环芳族、多环芳族、杂环芳族或多杂环芳族基团；且
R12是氢、脂族基团或第二单环芳族、多环芳族、杂环芳族或多杂环芳族基团，其中R11和R12任选被脂族基团取代。
8.权利要求1的方法，其中所述相关化合物是脂质、维生素或多环芳烃。
9.权利要求8的方法，其中所述脂质是饱和或不饱和的脂肪酸、单酰基甘油酯、二酰基甘油酯、三酰基甘油酯、磷脂、鞘脂或类固醇。
10.权利要求8的方法，其中所述维生素是选自维生素C、维生素B或其衍生物或组合的水溶性维生素。
11.权利要求8的方法，其中所述维生素是选自维生素A、维生素D、维生素K、维生素E、β胡萝卜素或其衍生物或组合的脂溶性纤维素。
12.权利要求7的方法，其中R11或R12的至少第一或第二单环芳族、多环芳族、杂环芳族或多杂环芳族基团是具有至少2个芳环的多环芳烃或多杂环芳烃。
13.权利要求7的方法，其中R11或R12的至少第一或第二单环芳族、多环芳族、杂环芳族或多杂环芳族基团是具有至少3个芳环的多环芳烃或多杂环芳烃。
14.权利要求7的方法，其中R11或R12的至少第一或第二单环芳族、多环芳族、杂环芳族或多杂环芳族基团是具有至少4个芳环的多环芳烃或多杂环芳烃。
15.权利要求7的方法，其中R11或R12的至少第一或第二单环芳族、多环芳族、杂环芳族或多杂环芳族基团被至少一个C4-C24脂族基团取代。
16.权利要求7的方法，其中R11或R12的第一单环芳族、多环芳族、杂环芳族或多杂环芳族基团选自呋喃、吡咯、吡咯啉、噁唑、噻唑、咪唑、咪唑啉、吡唑、吡唑啉、吡唑烷、异噁唑、异噻唑、苯、吡啶、哒嗪、嘧啶、吡嗪、三嗪、噻吩、茚、中氮茚、吲哚、异吲哚、吲哚啉、吲唑、苯并咪唑、苯并噻唑、萘、喹嗪、喹啉、异喹啉、噌啉、酞嗪、喹唑啉、喹喔啉、1,8-萘啶、奎宁环、芴、咔唑、蒽、吖啶、吩嗪、吩噻嗪、吩噁嗪、芘、菲、䓛及其衍生物，其中所述基团未取代或任选被脂族基团取代。
17.权利要求6的方法，其中Q包含的官能团是二醇。
18.权利要求17的方法，其中Q由下列结构表示：
。
19.权利要求7的方法，其中T由下列结构之一表示：
。
20.权利要求1的方法，其中X的表面在色谱条件下通过色谱流动相进行烷氧基化。
21.权利要求20的方法，其中X的表面的大部分不在色谱条件下通过色谱流动相进行烷氧基化。
22.权利要求1的方法，其中X的表面不包含二氧化硅，且b = 0或c = 0。
23.权利要求1的方法，其中所述色谱固定相适用于超临界流体色谱法。
24.权利要求1的方法，其中所述色谱固定相适用于基于二氧化碳的色谱法。
25.具有下列结构(i)的色谱固定相：
[X](W)a(Q)b(T)c　　(i)
其中：
X是含有二氧化硅、金属氧化物、无机-有机杂化材料、一组嵌段共聚物或其组合的色谱基底；
W选自氢和羟基，其中W键合到X的表面上；
Q是在具有低水浓度的色谱条件下使随时间经过的分析物保留变化最小化的第一取代基；
T是色谱上保留分析物的第二取代基，其中T具有一个或多个芳烃、多环芳烃、杂环芳烃或多杂环芳烃基团，各基团任选被脂族基团取代；且
b和c是正数，0.05 ≤ (b/c) ≤ 100，且a ≥ 0。
26.用于正相色谱法、高压液相色谱法、溶剂化气相色谱法、超临界流体色谱法、亚临界流体色谱法、基于二氧化碳的色谱法、亲水相互作用液相色谱法或疏水相互作用液相色谱法的柱、毛细管柱、微流体器件或装置，其包含：
具有至少一个限定具有入口和出口的室的壁的外壳和布置在其中的根据权利要求25的固定相，其中所述外壳和固定相适用于正相色谱法、高压液相色谱法、溶剂化气相色谱法、超临界流体色谱法、亚临界流体色谱法、基于二氧化碳的色谱法、亲水相互作用液相色谱法或疏水相互作用液相色谱法。
27.用于正相色谱法、高压液相色谱法、溶剂化气相色谱法、超临界流体色谱法、亚临界流体色谱法、基于二氧化碳的色谱法、亲水相互作用液相色谱法或疏水相互作用液相色谱法的试剂盒，其包含：
具有至少一个限定具有入口和出口的室的壁的外壳和布置在其中的根据权利要求25的固定相，其中所述外壳和固定相适用于正相色谱法、高压液相色谱法、溶剂化气相色谱法、超临界流体色谱法、亚临界流体色谱法、基于二氧化碳的色谱法、亲水相互作用液相色谱法或疏水相互作用液相色谱法；和
用所述外壳和固定相实施正相色谱法、高压液相色谱法、溶剂化气相色谱法、超临界流体色谱法、亚临界流体色谱法、基于二氧化碳的色谱法、亲水相互作用液相色谱法或疏水相互作用液相色谱法的说明书。
28.一种制备根据权利要求25的固定相的方法，其包括：
使色谱基底与具有侧反应性基团的硅烷偶联剂反应；
使包含一个或多个芳烃、多环芳烃、杂环芳烃或多杂环芳烃基团的第二化学试剂与所述侧反应性基团反应；和
中和任何剩余未反应的侧反应性基团，
由此产生根据权利要求25的固定相。
29.一种制备根据权利要求25的固定相的方法，其包括：
使具有侧反应性基团的硅烷偶联剂低聚；
使芯表面与低聚的硅烷偶联剂反应；
使包含一个或多个芳烃、多环芳烃、杂环芳烃或多杂环芳烃基团的第二化学试剂与所述侧反应性基团反应；和
中和任何剩余未反应的侧反应性基团，
由此产生根据权利要求25的固定相。
30.一种减轻或防止正相色谱法、高压液相色谱法、溶剂化气相色谱法、超临界流体色谱法、亚临界流体色谱法、基于二氧化碳的色谱法、亲水相互作用液相色谱法或疏水相互作用液相色谱法中的保留漂移的方法，其包括：
使用包含根据权利要求25的色谱固定相的色谱装置色谱分离样品，由此减轻或防止保留漂移。
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