CN106456690B - 包含来自荜茇的提取物的用于预防、治疗和改善排尿功能障碍的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于预防或治疗排尿功能障碍的药物组合物和用于预防或改善排尿功能障碍的健康功能食品，其包含荜茇(Piper Longum L.)的提取物作为活性成分。根据本发明的荜茇提取物不仅是无害的，而且还通过同时涉及与排尿功能障碍相关的多种机制而具有出色的预防、治疗和改善排尿功能障碍的作用，以致其可以增大排尿间隔、减小排尿压力、增大膀胱容量、抑制逼尿肌收缩和引起逼尿肌松弛。

Description

包含来自荜茇的提取物的用于预防、治疗和改善排尿功能障 碍的组合物
技术领域
本发明涉及用于预防或治疗排尿功能障碍(voiding dysfunction)的药物组合物和用于预防或改善排尿功能障碍的健康功能食品(保健功能食品，health functionalfood)，其包含荜茇(Piper Longum L.)的提取物作为活性成分。
背景技术
排尿功能障碍是指背离正常排尿方式的所有排尿行为。排尿功能障碍可以在任何男性和女性身上发生，其包括由神经学异常发展的神经原性膀胱、由非神经源性病因所致的下尿道症状和前列腺增生(prostatic hyperplasia)、以尿失禁(urinaryincontinence)为代表的女性泌尿疾病(Korean Continence Society，2003)。据报道，排尿功能障碍在成人中是很普遍的，并且在排尿功能障碍随其年龄增加的同时，男性尤其显示线性增加。在排尿功能障碍所致的下尿道症状中，据信在所有男性和女性中最常见的是以尿频(frequent urination)和膀胱过度活动症(overactive bladder)为代表的蓄积期功能障碍症状(storage phase dysfunction symptom)，并且据报道，其又发展出排尿期功能障碍(voiding phase dysfunction)和排尿后症状。
各种排尿功能障碍症状如膀胱过度活动症在多个方面负面地影响个体生活的健康相关质量，因为个体生活的质量不得不由于饮料摄入受限、频繁如厕经历不便、对个人关系和社会生活的影响、出现健康问题或夜晚睡眠不足等而降低(Jeung Im KIM，Young HoKIM，&Hyun Chul AHN，2002；Yoo Sik LEE，2001a)。
膀胱过度活动综合征(膀胱急躁症，overactive bladder syndrome，OAB综合征)是最近被确立为疾病概念的复合病症组，并且是指表示一种或多种病症如尿频(每天至少8次)(其是在肾中产生的尿液填充于膀胱中的同时，通过以异常方式频繁收缩膀胱而频繁排尿)、尿急(紧迫性排尿，urgency urination)(其是难以憋尿，并因此不得不快速去如厕)、紧迫性尿失禁(urgency incontinence)(其在排尿时，不会充分地忍耐排尿并且漏尿从而浸湿衣服)和夜尿症(nocturia)(其在夜晚睡觉期间不得不排尿一次或多次，不管是否是紧迫性尿失禁，前提是不存在尿道感染及其他明确的病因。膀胱过度活动的病症与无意识收缩导致膀胱过度活动的状态相关。
由于膀胱由平滑肌组成并且排尿功能由神经系统调控，所以各种排尿功能障碍可能是由平滑肌和神经系统的异常而发展的。疾病的主因尚不清楚，因为虽然膀胱过度活动症通常由源于脑疾病或脊髓损伤的神经源性病因、以男性前列腺增生为代表的膀胱出口阻塞、女性骨盆结构无力、尿道和膀胱的局部疾病等发展，但是存在很多由逼尿肌肌细胞老化、逼尿肌不起眼的功能障碍等导致的病例(Tae Hyung KIM，Journal of Chung AngUniversity College of Medicine 28(3)，p143-149，2003)。
虽然膀胱过度活动综合征不是一种老化的过程，但是事件概率随年龄增大。紧迫性尿失禁更常在女性中发展，虽然男性与女性的比率类似。在(韩国)国内的各种报道为12.7％至30.5％，而根据一项在欧洲的研究，膀胱过度活动症是一种常见疾病以致其在超过40岁的16％的男性和17％的女性中发展，并且特别地，其在超过75岁的42％的男性和31％的女性中发展，并且这些统计数字也类似于发达国家如美国和日本(2011，KoreanContinence Society，Guidelines on Overactive Bladder)。膀胱过度活动症通过影响基本身体活动、性生活并且此外通过社会和精神地影响社会活动而显示生活质量的下降，并且作为调查患者的HRQOL(健康相关的生活质量)的结果，其显示对生活质量的影响比糖尿病更大(Liberman JN，Hunt TL，Stewart WF，Wein A，Zhou Z，HerzogAR等Health-relatedquality of life among adults with symptoms of overactive bladder：results froma U.S.community-based survey(具有膀胱过度活动症症状的成人中的健康相关的生活质量：来自基于美国社区的调查的结果).Urology 2001；57：1044-50)。
虽然目前抗毒蕈碱药物被广泛用作膀胱过度活动症的初始标准治疗，但仍然没有在国际上实施和控制的临床试验的报道以确定地证明有效性，并且据报道，因为这些药物具有影响整个神经系统的抗胆碱能性质，不良作用如口渴、便秘、视力模糊和急性尿潴留(acute urinary retention)以10人中有1-2名的比率发生。据报道，这样的不良作用是在需要控制水摄入的患有排尿功能障碍的患者的情况中降低药物顺从性的一个原因，并且因此，始终需要开发用于排尿功能障碍如膀胱过度活动症的新的备选药物(J.KoreanContinence Soc 2009；13：7-22)。
紧迫性尿失禁是指在严重的尿急病症后突然发展出的无意识漏尿，其中已知其产生因素是特定的场景、声音、接触流动的水、姿势变化等。尿急(urgency urine)也被称为紧迫性尿并且是指突然产生想要排尿的意愿的病症，并且意指这样的状态，即一旦感到尿意，则无法忍耐排尿。在此情况中，已知的是，如果不立即排尿，则可能引起疼痛，并且严重地，膀胱可能任意地接触而进展为漏尿的紧迫性尿失禁。尿频被定义为24小时排尿8次以上的情况，这与每天排尿4～6次(一次的排尿体积约为300cc)的正常成人不同，但是国际自控协会(International Continence Society)在2002年扩展了尿频的定义，该协会将尿频定义为这样的情况，即患者自己感到要非常频繁的排尿。尿频由过量水摄入、逼尿肌过度活动、膀胱容量下降、膀胱超敏感等导致，其是被称为异常排尿病症的排尿功能障碍的一种代表性病症。夜尿症是指在夜晚睡眠期间醒来后的排尿，其被分类为夜间排尿体积与日间排尿体积相比相对较高的夜间多尿和不属于这种情况的夜尿症。要被定义为夜尿症，其必须伴有排尿前和排尿后的睡眠，并且患有夜尿症的患者频繁醒来并且不容易入睡，以致其由于被扰乱的睡眠而在白天感到困乏和疲倦，这导致其日常生活的不便。此外，老年人有摔倒或骨折的风险加大的问题。据报道，夜尿症与多种因素相关，所述因素如年龄、生活习惯、多尿、夜间多尿、膀胱障碍、睡眠障碍和心理因素。间质性膀胱炎(interstitial cystitis)也被称为膀胱疼痛综合征或慢性膀胱炎。不存在特征性的病理现象如细菌感染，并且还未发现准确的病因。虽然已知该病症在膀胱上皮细胞发生缺陷而损伤尿液和血流之间的膀胱粘膜内层时发展，膀胱中的炎症或膀胱的血管病症、膀胱粘膜损伤和精神紊乱可能充当诱因。尽管该病症在男性和女性中都发生，但据揭示，90％的程度是在女性中，主要是四十多岁的女性。作为尿急和尿频的症状发展的异常感觉主要是抱怨膀胱疼痛。当尿液充满时，症状变得更糟，虽然其在排尿时的疼痛较小。夜晚排尿1～2次以上并且平均4次，几乎没有血尿。白天排尿至少8次以上并且平均16次，正常人一次的排尿体积为250ml，而患有该疾病的患者的平均体积为75ml。四分之三的患者由于性行为而具有更严重的症状，并且经期、压力、食物等也影响症状的恶化。关于治疗，在施用抗抑郁药和麻醉后，进行手术如膀胱灌水膨胀(hydrodistention)、膀胱神经截断术(cystolysis)、膀胱增大术、尿路分流术(urinarydiversion)或施用药物如抗胆碱能药物或α-肾上腺素能受体阻断剂、抗组胺药物、甾类、硝酸银、肝素，但是疗效不好，并且因此需要治疗这样的排尿功能障碍的新药物。
同时，作为胡椒科(Piperaceae)的攀缘木本植物的荜茇(Piperis Longum L.)的果实的原产于印度的荜茇果(Piperis Longi Fructus)在中国和印度尼西亚被栽培并被进口到韩国，其在国内以东方医药名称荜茇(Pilbal)使用。
荜茇(Piper Longum L.)含有多种成分如精油(莰烯、胡椒醛、桧萜、柠檬烯、桂叶烯)、脂肪酸(棕榈酸)和生物碱(哌啶、胡椒碱、胡椒新碱)，在东方医学中作为温暖脾胃的暖内药具有缓解发烧身体的疼痛的效果，并且被提及用于痢疾、呕吐、腹部胀气、牙疼、痛觉缺失和腹泻。在印度的印度草医学中，荜茇目前以PIPPALI的名称被使用，并且据称被用作消化刺激剂、驱风剂、除痰剂、支气管扩张药、抗蠕虫药、镇静剂、循环刺激剂、壮阳剂(Traditional Medicine of India(印度传统医学)，Shinilbooks，December 2011)，并且作为荜茇的药物作用，已经报道了抗菌、抗惊厥、皮肤血管扩张、抗氧化、抗心肌缺血、抗脂血症、抗癌和抗肥胖(antiobestic)作用。然而，关于荜茇改善排尿功能障碍的作用仍然是未知的。
发明内容
技术问题
在本发明的发明人大量研究了能够有效预防、治疗和改善各种排尿功能障碍的天然产物的同时，他们发现荜茇的提取物不仅无害，而且还通过同时涉及与排尿功能障碍相关的多种机制而具有出色的预防、治疗和改善排尿功能障碍的作用，并因此完成了本发明。
因此，本发明意在提供用于预防或治疗排尿功能障碍的药物组合物，所述药物组合物包含荜茇的提取物作为活性成分。
此外，本发明意在提供用于预防或改善排尿功能障碍的健康功能食品，所述健康功能食品包含荜茇的提取物作为活性成分。
技术方案
本发明提供用于预防或治疗排尿功能障碍的药物组合物，其包含荜茇的提取物作为活性成分。
此外，本发明提供用于预防或治疗排尿功能障碍的药物组合物，其中所述荜茇的提取物从一种或多种选自由以下各项组成的组的提取溶剂提取：水、醇(alcohol)、甘油、丁二醇、丙二醇、乙酸甲酯、乙酸乙酯、丙酮、苯、己烷、二乙醚、氯仿和二氯甲烷。优选地，提取溶剂可以是一种或多种选自由以下各项组成的组的提取溶剂：水、醇、乙酸乙酯、正己烷、氯仿、二氯甲烷。更优选地，提取溶剂可以是水、醇或含水醇(醇水溶液)。所述醇可以是甲醇、乙醇或异丙醇。更加优选地，提取溶剂可以是水或含水乙醇(乙醇水溶液)。
此外，本发明提供用于预防或治疗排尿功能障碍的药物组合物，其中所述醇是具有1至4个碳原子的无水或含水低级醇。优选地，所述醇可以是含水甲醇(甲醇水溶液)或含水乙醇。更优选地，所述醇可以是含水乙醇(乙醇水溶液)。
此外，本发明提供用于预防或治疗排尿功能障碍的药物组合物，其中无水或含水低级醇是30至100体积％的甲醇或乙醇。优选地，含水低级醇可以是30至100体积％(体积/体积；vol/vol)的乙醇水溶液。更优选地，含水低级醇可以是30至95体积％的乙醇水溶液。更优选地，含水低级醇可以是95体积％的乙醇水溶液。
此外，本发明提供用于预防或治疗排尿功能障碍的药物组合物，其中所述荜茇的提取物是极性溶剂可溶的提取物或非极性溶剂可溶的提取物。极性溶剂可溶的提取物可以是在选自以下的溶剂中可溶的提取物：水、甲醇、丁醇或其混合溶剂，并且优选地，在饱和正丁醇中可溶的提取物，并且非极性溶剂可溶的提取物可以是在二氯甲烷或乙酸乙酯中可溶的提取物。
此外，本发明提供用于预防或治疗排尿功能障碍的药物组合物，其中所述荜茇的提取物增大排尿间隔。
此外，本发明提供用于预防或治疗排尿功能障碍的药物组合物，其中所述荜茇的提取物减小排尿压力(micturition pressure)并增大膀胱容量。
此外，本发明提供用于预防或治疗排尿功能障碍的药物组合物，其中所述荜茇的提取物引起逼尿肌收缩的抑制以及逼尿肌的松弛。
此外，本发明提供用于预防或治疗排尿功能障碍的药物组合物，其中所述荜茇的提取物抑制毒蕈碱M3受体或毒蕈碱M2受体。
此外，本发明提供用于预防或治疗排尿功能障碍的药物组合物，其中所述荜茇的提取物是β3-肾上腺素能受体的激动剂。
此外，本发明提供用于预防或治疗排尿功能障碍的药物组合物，其中所述排尿功能障碍是选自由以下各项组成的组的一种或多种：膀胱过度活动综合征、紧迫性尿失禁、尿急、尿频、夜尿症和间质性膀胱炎。
此外，本发明提供用于预防或改善排尿功能障碍的健康功能食品，其包含荜茇的提取物作为活性成分。
此外，本发明提供用于预防或改善排尿功能障碍的健康功能食品，其中所述排尿功能障碍是选自由以下各项组成的组的一种或多种：膀胱过度活动综合征、紧迫性尿失禁、尿急、尿频、夜尿症和间质性膀胱炎。
此外，本发明提供用于预防或治疗排尿功能障碍的药物组合物，其中所述荜茇的提取物是极性溶剂可溶的提取物或非极性溶剂可溶的提取物。
此外，本发明意在提供包含荜茇的提取物作为活性成分的药物组合物，其用于预防或治疗排尿功能障碍。
此外，本发明意在提供包含荜茇的提取物作为活性成分的组合物，其用于预防或改善排尿功能障碍。
此外，本发明意在提供荜茇的提取物用于制备用于预防或治疗排尿功能障碍的药剂(药物制剂，pharmaceutical formulation)的用途。
此外，本发明意在提供预防或治疗排尿功能障碍的方法，所述方法通过向受试者(包括哺乳动物)施用用于预防或治疗排尿功能障碍的药物组合物进行，所述药物组合物包含荜茇的提取物作为活性成分。
有利效果
根据本发明的荜茇的提取物不仅是无害的，而且还通过同时涉及与排尿功能障碍相关的多种机制而具有出色的预防、治疗和改善排尿功能障碍的作用，以致其可以增大排尿间隔、减小排尿压力、增大膀胱容量、抑制逼尿肌收缩和引起逼尿肌松弛。
附图说明
图1显示将在施用荜茇的95体积％乙醇水溶液提取物(200mg/kg)后基底压力(基础压力，BP)、排尿压力(MP)和排尿间隔(MI)的变化与正常对照组和溶剂对照组比较的结果.
图2显示将在施用荜茇的95体积％乙醇水溶液提取物(200mg/kg)后基底压力(BP)、排尿压力(MP)、阈值压力(TP)和排尿间隔(MI)的变化与正常对照组、溶剂对照组和阳性对照组(奥昔布宁(oxybutynin))比较的结果。
图3显示比较在施用荜茇的水提取物(200mg/kg)和95体积％乙醇水溶液提取物(200mg/kg)后排尿间隔(MI)和排尿体积(VV)的变化的结果。
图4显示比较在施用荜茇的水提取物(300mg/kg)和30体积％乙醇水溶液提取物(300mg/kg)后排尿频率、总排尿体积和每次排尿体积的变化的结果。
图5显示将在施用荜茇的水提取物(300mg/kg)之前和之后膀胱容量(BC)、排尿体积(VV)和排尿间隔(MI)的变化与阳性对照组(托特罗定(tolterodine))比较的结果。
具体实施方式
本发明提供用于预防或治疗排尿功能障碍的药物组合物，其包含荜茇的提取物作为活性成分。
根据本发明的荜茇的提取物不仅是无害的，而且还同时涉及与排尿功能障碍相关的多种机制，以致其可以增大排尿间隔、减小排尿压力、增大膀胱容量、抑制逼尿肌收缩和引起逼尿肌松弛。推想根据本发明的荜茇的提取物的预防、治疗和改善排尿功能障碍的效果由以下事实所致，即荜茇的提取物抑制毒蕈碱M3受体或毒蕈碱M2受体或激活β3-肾上腺素能受体，其涉及在脊髓和上脊髓途径以及膀胱的肠神经系统中的膀胱的收缩和松弛。然而，本发明的范围不限于以上机制。
根据本发明的“荜茇(Piper Longum L.)”可以不受限制地利用自栽培的、收集的或市售的那些，并且包括其茎、叶、根和果实，只要它们显示预防、治疗或改善排尿功能障碍的效果即可，并且优选地是荜茇的果实。
根据本发明的荜茇的提取物可以是从常用提取溶剂(或用常用提取溶剂)提取的提取物，所述提取溶剂包括，但不限于，例如，水；无水或含水醇；多元醇如甘油、丁二醇和丙二醇；烃系溶剂如乙酸甲酯、乙酸乙酯、丙酮、苯、己烷、二乙醚和二氯甲烷；或其混合物。此外，根据本发明的荜茇的提取物可以是从一种或多种优选地选自由以下各项组成的组的提取溶剂提取的提取物：水、醇、甘油、丁二醇、丙二醇、乙酸甲酯、乙酸乙酯、丙酮、苯、己烷、二乙醚、氯仿和二氯甲烷。优选地，提取溶剂可以是一种或多种选自由以下各项组成的组的提取溶剂：水、醇、乙酸乙酯、正己烷、氯仿、二氯甲烷。更优选地，提取溶剂可以是水、醇或含水醇。醇可以是甲醇、乙醇或异丙醇。更优选地，提取溶剂可以是水或含水乙醇。
此外，优选地，根据本发明的荜茇的提取物可以是利用具有1至4个碳原子的无水或含水低级醇作为提取溶剂提取的提取物，其中所述具有1至4个碳原子的无水或含水低级醇可以是10至100体积％，优选地30至100体积％，更优选地70至100体积％的甲醇或乙醇。优选地，提取溶剂可以是水或30至95体积％的乙醇。下文中，如本文中所述的‘％醇’以与‘体积％醇’相同的含义使用。
优选的是，荜茇的提取物通过包括以下步骤的制备方法制备(但不限于此)。
(1)在干燥后将荜茇破碎(切碎，chop)；
(2)向破碎后的荜茇中添加提取溶剂以提取提取物；
(3)在冷却后过滤该提取物；和
(4)浓缩过滤后的提取物。
步骤(1)中使用的荜茇可以不受限制地利用自栽培的、收集的或市售的那些，并且步骤(1)中的干燥优选地通过在阴凉处风干。
步骤(2)中的提取可以利用自提取方法，如，但不限于，搅拌提取、回流冷却提取、低温沉淀提取(cryoprecipitation extraction)、超声提取和超临界提取。提取温度优选为50至120℃，并且更优选80至100℃。并且，提取时间优选为1至20小时，并且更优选为2至5小时。此外，提取频率可以为1至5次，更优选为2或3次。此外，步骤(2)中的提取可以通过基于荜茇的体积按1至10倍向荜茇中添加提取溶剂来进行。
虽然步骤(3)中的过滤可以用100～500目筛进行，但优选的是使用300目筛。
步骤(4)中的浓缩可以在10至100℃进行，并且优选地在50至80℃进行，并且优选的是使用真空浓缩器或真空旋转蒸发器。
此外，除了以上过程以外，其还可以包括干燥步骤作为步骤(5)，其中所述干燥可以使用减压干燥、真空干燥、煮沸干燥(boil drying)、喷雾干燥或冻干法进行。
此外，根据本发明的荜茇的提取物可以包含荜茇的提取物的提取级分。荜茇的提取物的提取级分可以从通过使用具有1至4个碳原子的无水或含水低级醇作为提取溶剂，经由本领域中通常用于获得级分的方法如浓度梯度柱色谱法(使用具有1至4个碳原子的无水或含水醇或乙腈和水的混合溶剂作为流动相)获得的荜茇的提取物获得。
此外，本发明提供用于预防或治疗排尿功能障碍的药物组合物，其中所述荜茇的提取物是极性溶剂可溶的提取物或非极性溶剂可溶的提取物。极性溶剂可溶的提取物可以是在选自水、甲醇、丁醇或其混合溶剂中的溶剂中可溶的提取物，并且优选地是，在饱和正丁醇中可溶的提取物，并且非极性溶剂可溶的提取物可以是在二氯甲烷或乙酸乙酯中可溶的提取物。优选地，其可以是通过包括以下步骤的制备方法分级提取的提取物：向荜茇的乙醇水溶液提取物中添加水和二氯甲烷以制备二氯甲烷可溶的提取物和二氯甲烷不可溶的提取物(水层)，向二氯甲烷不可溶的提取物中添加水和乙酸乙酯以制备乙酸乙酯可溶的提取物和乙酸乙酯不可溶的提取物(水层)，和向乙酸乙酯不可溶的提取物中添加水和饱和正丁醇以制备饱和正丁醇可溶的提取物和饱和正丁醇不可溶的提取物(水层)。所述乙醇水溶液可以是30至95体积％乙醇水溶液，并且更优选地，含水低级醇可以是95体积％乙醇水溶液。
根据本发明的荜茇的提取物可能涉及常规地作为用于排尿功能障碍的治疗剂的靶标的β3-肾上腺素能受体的cAMP信号转导途径以及抗毒蕈碱机制，从而靶向在排尿功能障碍中所涉及的复合机制，并且因此显示改善排尿功能障碍的作用。
因此，根据本发明的荜茇的提取物可以减小排尿压力并且增大膀胱容量。此外，根据本发明的荜茇的提取物可以引起逼尿肌收缩的抑制和逼尿肌的松弛。
此外，根据本发明的荜茇的提取物可以抑制毒蕈碱M3受体或毒蕈碱M2受体，并且可以是β3-肾上腺素能受体的激动剂。
M3/M2受体是影响分布在眼、泌尿器官、胃肠道、心血管系统中的副交感神经的受体，并且它们的相关疾病或症状包括慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonarydisease)、慢性支气管炎(chronic bronchitis)、哮喘(asthma)、成人/急性呼吸窘迫综合征(adult/acute respiratory distress syndrome)、慢性呼吸阻塞(chronicrespiratory obstruction)、支气管过度活动(bronchial hyperactivity)、肺纤维化(pulmonary fibrosis)、肺气肿(emphysema)或变应性鼻炎(allergic rhinitis)、肠易激综合征(irritable bowel syndrome)、痉挛性大肠炎(convulsive colitis)、胃十二指肠溃疡(gastroduodenal ulcer)、胃肠痉挛(gastrointestinal convulsion)或蠕动亢进(hyperanakinesia)、憩室炎(diverticulitis)、胃肠软肌肉的伴有疼痛的痉挛(painaccompanying convulsion of gastrointestinal soft muscle)；排尿功能障碍，包括神经源性尿频(neurogenic sychnuria)、神经源性膀胱(neurogenic bladder)、遗尿症(enuresis)、精神性膀胱(psychosomatic bladder)、与膀胱痉挛或慢性膀胱炎相关的失禁(incontinence related to bladder convulsion or chronic cystitis)、膀胱过度活动综合征、尿急或尿频。
β3-肾上腺素能受体分布在膀胱以及白色脂肪细胞和褐色脂肪细胞中，并且它们的相关疾病或症状包括超重(overweight)、肥胖(obesity)、葡萄糖耐受障碍(glucosetolerance disorder)、1型糖尿病(diabetes mellitus type 1)、2型糖尿病(diabetesmellitus type 2)、尿急、遗尿和排尿功能障碍，包括失禁、神经源性膀胱、膀胱过度活动综合征、尿急或尿频。
因此，根据本发明的“排尿功能障碍”可以包括关于排尿的背离正常排尿模式的各种功能障碍，并且可以是由于逼尿肌活动低下如逼尿肌异常收缩或松弛、逼尿肌不稳定、感觉尿急等而出现的功能障碍。特别地，排尿功能障碍可以包括，优选地，蓄积症状(storagesymptom)，包括尿频、夜尿症、尿急、尿失禁(incontinence)、遗尿(enuresis)；排尿症状，包括尿无力(weak stream)、尿分叉(splitting)、尿断断续续(intermittency)、排尿犹豫(urinary hesitancy)、腹压排尿(abdominal straining voiding)、尿末滴沥(terminaldribbling)；排尿后症状，包括尿不尽(残尿感，residual urine sense)、排尿后滴沥(postmicturition dribble)或间质性膀胱炎等，并且更优选地，可以是选自由以下各项组成的组的一种或多种：膀胱过度活动综合征、紧迫性尿失禁、尿急、尿频、夜尿症和间质性膀胱炎。
此外，为了预防、治疗或改善排尿功能障碍，根据本发明的药物组合物可以单独使用或与手术、激素治疗、药物治疗和利用生物反应调节剂的方法联合使用。
根据本发明的药物组合物可以通过向其中添加药用载体配制，并且对于配制的细节可参见Remington′s Pharmaceutical Science(最新版)，Mack Publishing Company，Easton PA。药用载体是指药物发明领域的普通技术人员在制备药物组合物时常用的载体。例如，其包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藻糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯树胶(gum acasia)、藻酸酯(盐)、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油等。此外，药用载体包括稀释剂或赋形剂如填充剂、增容剂(extender)、粘合剂、湿润剂、崩解剂和表面活性剂。
用于口服给药的固体制剂包括片剂、丸剂、粉剂、粒剂和胶囊，并且这样的固体制剂通过将本发明的药物组合物与至少一种赋形剂如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖、蔗糖、乳糖、明胶等混合来制备。除了简单的赋形剂以外，还可以使用润滑剂如硬脂酸镁、滑石。
用于口服给药的液体制剂(对应于混悬剂、内部药物、乳剂和糖浆)可以包含多种赋形剂，例如，湿润剂、增甜剂、芳香剂和防腐剂以及常用的作为简单稀释剂的水和液体石蜡。
作为经皮给药的实例，可以提及载体和/或赋形剂，其适用于制备粉剂(dustingpowder)、乳剂、混悬剂、油、喷雾剂、软膏、油膏、霜剂糊剂(cream paste)、凝胶、泡沫剂或溶液，并且适合于透皮治疗系统(TTS)。根据本发明的局部药物制剂可以是半固体剂型，并且具体地是软膏(溶液软膏、混悬剂软膏)、霜剂、凝胶或糊剂。以下主要用于油相：脂肪醇，如月桂醇，十六烷醇，十八烷醇，脂肪酸，如棕榈酸或硬脂酸，液体或固体石蜡或地蜡，液体或固体蜡，如肉豆蔻酸异丙酯，天然脂肪或部分合成脂肪，如椰子脂肪酸甘油三酯，硬化油，如氢化花生油或蓖麻油，或甘油的脂肪酸偏酯，如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。合适的乳化剂包括表面活性剂，如非离子表面活性剂，例如，多元醇的脂肪酸酯或其环氧乙烷加成物，例如聚甘油脂肪酸酯或聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯、脱水山梨糖醇脂肪酸酯，例如，脱水山梨糖醇油酸酯和/或脱水山梨糖醇异硬脂酸酯，异硬脂酸酯，甾醇，或聚氧乙烯脂肪醇醚或脂肪酸酯；阴离子表面活性剂，例如，脂肪醇硫酸酯的碱金属盐，例如十二烷基硫酸钠，十六烷基硫酸钠或十八烷基硫酸钠，其通常在存在以上脂肪醇(例如十六烷醇或十八烷醇)的情况下使用。这些之中，可能的是向水相添加抑制霜剂干燥的制剂，如多元醇，例如，甘油，山梨糖醇，丙二醇和/或聚乙二醇或向水相添加防腐剂、香味剂等。
然而，本发明不受限于仅为示例性的如以上所列出的药用载体。
虽然包含在药物组合物中的荜茇的提取物的用量取决于患者状态和体重、疾病的严重度、药物形式、给药途径和周期而变化，但在需要时，可以对其进行适当选择。本文中的术语“给药(施用，administration)”是指通过任何合适的方法将根据本发明的用于预防或治疗排尿功能障碍的组合物引入到患者中，并且根据本发明的用于预防或治疗排尿功能障碍的组合物的给药途径可以是任何常规的途径，只要其可以到达靶组织即可。例如，荜茇的提取物可以以这样的剂量给药：基于体重60kg的成人，1至2400mg/天，优选地10至1000mg/天，每天施用一次或若干次。而且，所述药物组合物可以以相对于组合物总重量的0.0001至50重量％的量包含荜茇的提取物。所述药物组合物可以通过多种途径(例如，经皮、口服、静脉内、肌肉内或皮下注射)施用于哺乳动物，如人。
此外，本发明提供用于预防或改善排尿功能障碍的健康功能食品，其包含荜茇的提取物作为活性成分。
根据本发明的健康功能食品包括韩国2002年8月26日立法的功能健康食品法案(Functional Health Foods Act)中定义的食品。具体地，“健康功能食品”包括通过使用在人体内具有有用功能的原料或成分被制备或处理成片剂、胶囊、粉剂、粒剂、液体、丸剂等的形式的食品。
排尿功能障碍可以包括关于排尿的背离正常排尿模式的各种功能障碍，并且可以是由于逼尿肌活动低下如逼尿肌异常收缩或松弛、逼尿肌不稳定、感觉尿急等而出现的功能障碍，并且优选地，可以是选自由以下各项组成的组的一种或多种：膀胱过度活动综合征、紧迫性尿失禁、尿急、尿频、夜尿症和间质性膀胱炎。
健康功能食品可以含有各种营养物、维生素、矿物质(电解质)、调味剂如合成调味剂和天然调味剂、着色剂和增强剂(奶酪、巧克力等)、果胶酸及其盐、藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇、用于碳酸饮料的碳酸化剂等，并且此外的用于制备果汁饮料和蔬菜饮料的天然果汁和果肉。这样的组分可以独立使用或以其组合使用。
健康功能食品可以是以下的任一种形式：肉、香肠、面包、巧克力、糖果、点心、甜点、披萨、拉面、口香糖、冰激凌、汤、饮料、茶、功能性水、保健饮料、酒精饮料和维生素复合物。
健康功能食品还可以包含食品添加剂，其作为“食品添加剂”的兼容性由关于根据韩国食品和药品安全部批准的食品添加剂法典(Food Additives Codex)的通用规章制度和通用测试方法的相应项目的标准和基准确定，除非有其他规章制度。
“食品添加剂法典”中所列项目可以包括，例如，化学合成品如酮、甘氨酸、柠檬酸钾、烟酸和肉桂酸、天然添加剂如柿子色(persimmon color)、欧亚甘草提取物(licoriceextract)、结晶纤维素、高粱色(kaoliang color)和瓜尔胶、混合制剂如L-谷氨酸钠制剂、面条用碱剂、防腐制剂和焦油色(tar color)制剂。
在制备根据本发明的健康功能食品的过程期间添加到包括饮料在内的食品中的根据本发明的荜茇的提取物在需要时可以合适地减少或增大含量，并且优选地，优选的是以相对于100重量％的总食品的1至15重量％添加该提取物。
除非另外指出，说明书中描述的数值应当被解释为包括等效范围。
接下来，为了有助于理解本发明，描述了优选的制备例、实施例和制剂例。然而，提供以下制备例、实施例和制剂例仅是为了容易理解本发明，本发明不受这些制备例、实施例和制剂例的限制。在以下制备例1至5中，为了制备荜茇的提取物，使用购自GyeungDong的BooYoung Oriental Medicine(147Wangsan-ro，Dongdaemun-ku，Seoul)的荜茇的果实。
制备例1：制备荜茇的提取物
制备例1-1：制备荜茇的水提取物
将1L的水加入到100g的阴干的荜茇的果实中，以在恒温水浴(HYNDAE Science，B-90)中在95℃在回流下提取3.5小时。将所得的提取物在减压下用滤纸过滤，然后将所得的滤液用真空旋转蒸发仪(EYELA，N-1100)在50-60℃的条件下减压浓缩，得到9.6g±0.1g的荜茇提取物的软浸膏(荜茇的水提取物)，其被用作用于以下毒性鉴定实验的样品。
制备例1-2：制备荜茇的30体积％的乙醇水溶液提取物
为制备30体积％的乙醇水溶液提取物，将1L的30体积％的乙醇水溶液加入到120g阴干的荜茇果实中以在恒温水浴(HYNDAE Science，B-90)中在85-95℃在回流下提取3.5小时。将所得的提取物在减压下用滤纸过滤，然后将所得的滤液利用真空旋转蒸发仪(EYELA，N-1100)在50-60℃的条件下蒸发浓缩并利用真空干燥器(JEIO Tech，OV-12)干燥至少12小时，得到10.86g的荜茇的30体积％的乙醇水溶液提取物，其被用作用于以下毒性鉴定实验的样品。
实施例1：荜茇的提取物的毒性鉴定
1.1急性毒性实验
使用6周龄无特定病原体的(SPF)SD雄性和雌性大鼠(ORIENT，Korea)进行急性毒性研究。将动物分成5只大鼠/组。以2g/kg的单剂量口服施用在制备例1.1中制备的荜茇水的提取物一次。在施用实验材料后，观察死亡率、临床症状和体重变化，并且在尸体剖检后进行腹腔和胸腔中的器官的肉眼发现(gross finding)。
作为结果，不存在死亡的动物和异常的临床症状，并且在体重变化、肉眼发现等方面没有观察到任何毒性变化。根据以上结果，荜茇的水提取物的LD50(50％动物测试群体的致死剂量)高于2g/kg。因此，得出的结论是，荜茇水提取物是安全的材料。
1.2重复1周的口服用药毒性研究
为了长期重复剂量毒性研究中的剂量设定基础的目的，使用无特定病原体的(SPF)雌性ICR小鼠(ORIENT，Korea)进行重复1周的口服剂量毒性研究。将动物分成5只大鼠/组。以1000、500和250mg/kg的剂量水平口服施用在制备例1.2中制备的荜茇的30体积％乙醇水溶液提取物，每天一次，持续7天。在施用实验材料后，观察死亡率、临床症状和体重变化，并且在验尸后进行腹腔和胸腔中的器官的肉眼发现。
在所有用药组中都没有死亡的动物。虽然在1000mg/kg用药组中，在开始施用后2天观察到体重和活动稍微减少的趋势，但这些变化之后在2天后恢复至正常。根据以上结果，在肉眼发现中没有观察到异常的临床症状、体重变化和毒性改变。根据以上结果，荜茇的30体积％乙醇水溶液提取物被鉴定为是不显示毒性的安全材料，即使在高达1g/kg的情况下将其向小鼠重复施用达1周。
1.3持续4周的重复剂量毒性实验
为鉴定长期剂量的毒性，使用无特定病原体的(SPF)ICR小鼠进行重复口服剂量毒性实验达4周。以2000、1000、500、250、125mg/kg的剂量将制备例1.1中制备的荜茇水萃取物口服施用给每组的5只实验动物，每天一次，达28天。在施用实验材料后，不论动物是否死亡，都对临床症状和体重变化进行观察，然后在验尸后肉眼观察腹腔和胸腔中的器官的异常。
作为结果，在所有施用实验材料的动物中都不存在具有特别明显的临床症状并且死亡的动物，并且此外，没有自体重变化和验尸表现等观察到毒性变化。由以上结果，荜茇水萃取物被鉴定为是不显示毒性的安全材料，即使在高达2g/kg的情况下将其向小鼠重复施用达4周。
制备例2：制备荜茇萃取物
分别使用水和有机溶剂，如乙醇、甲醇、乙酸乙酯、异丙醇、二氯甲烷、氯仿和正己烷作为萃取溶剂，制备荜茇萃取物。
制备例2.1：制备荜茇水萃取物
使用100mL的纯水，将各5g的阴干的荜茇果实在恒温水浴(HYNDAE Science，B-90)中在80-90℃在回流下萃取3小时。将所得的萃取物在减压下用滤纸过滤，然后将所得的滤液利用真空旋转蒸发仪(EYELA，N-1100)在50-60℃的条件下蒸发浓缩并且利用真空干燥器(JEIOTech，OV-12)干燥至少12小时以产生0.76g的荜茇水萃取物，其被显示在以下表1中。
制备例2.2：制备有机溶剂荜茇萃取物
通过与以上制备例2.1相同的方法制备萃取物，不同之处在于分别使用乙醇、95体积％乙醇水溶液、甲醇和乙酸乙酯代替水作为萃取溶剂。然后，当分别将作为萃取溶剂的溶剂改变成二氯甲烷、氯仿和己烷时，通过与以上制备例2.1相同的方法制备萃取物，不同之处在于将其在恒温水浴(HYNDAE Science，B-90)中在60-70℃萃取。获得0.21g至0.81g的萃取物，其被具体显示在表1中。
[表1]
Figure BDA0001157614840000171
制备例2.3：根据浓度制备茇萃的乙醇水溶液荜取物
通过与以上制备例2.1相同的方法制备萃取物提取物，不同之处在于使用30体积％、50体积％、70体积％和95体积％乙醇水溶液作为提取溶剂。获得0.61g至0.86g的提取物，其被具体提供在表2中。
[表2]
生药重量 提取溶剂 产量(g) 收率(％)
5g 95％乙醇水溶液 0.61 12.2
5g 70％乙醇水溶液 0.86 17.2
5g 50％乙醇水溶液 0.83 16.52
5g 30％乙醇水溶液 0.71 14.12
制备例2.4：制备茇萃的95体积％乙醇水溶液荜取物的有机溶剂级分
使用约10L的95体积％乙醇水溶液，将1kg阴干的荜茇的果实在恒温水浴(JISICO，J-BAL)中在回流下进行两次3.5小时的提取。将所得的提取物在减压下用滤纸过滤，然后将所得的滤液利用真空旋转蒸发仪(EYELA，N-1100)在50-60℃的条件下蒸发浓缩并且利用真空干燥器(JE10Tech，OV-12)干燥至少12小时，得到82.99g的荜茇的95体积％乙醇水溶液提取物。通过向分馏漏斗添加1.5L的蒸馏水使荜茇的95体积％乙醇水溶液提取物悬浮，通过添加1.2至1.5L的有机溶剂振荡以确认将有机溶剂层分开，然后通过采用相应的有机溶剂在减压下进行浓缩的过程。依次使用二氯甲烷、乙酸乙酯、水饱和的正丁醇，进行所述过程以制备有机溶剂级分(56.13g至2.2g)和排除有机溶剂层的水层的级分(约10g)，其提供在以下表3中。
[表3]
Figure BDA0001157614840000181
实施例2：测量抑制毒蕈碱M3受体的活性的效果
从Lonza(cambrex)购买并使用其中已表达了毒蕈碱M3受体的人膀胱平滑肌细胞(hBdSMC)。将同样购买自Lonza(cambrex)的包含胎牛血清(5％)、重组生长因子(人表皮生长因子；hEGF，人成纤维生长因子；hFGF)、抗生素(庆大霉素)和胰岛素的用于平滑肌细胞的培养基(SmGM-2)用作培养液，并将以上细胞在5％CO2培养箱中进行传代培养，传10～13代。将培养的细胞接种在6孔板中，并在24小时后，在无血清DMEM培养基中再培养48小时。将在制备例2中制备的荜茇的提取物制成表4和5中所示的浓度以将培养的细胞预处理2小时，向其施用25μM的引起逼尿肌收缩的乙酰胆碱(Ach)达2分钟以诱导M3受体的活性。将没有用乙酰胆碱和荜茇的提取物处理的细胞和仅用25μM乙酰胆碱处理的细胞用作对照组。将以上细胞用冰冷的PBS清洁，溶解在裂解用缓冲液(100mM NaCl、0.75％DOC(脱氧胆酸)、0.5％SDS(十二烷基硫酸钠)、1mM DTT(二硫苏糖醇)、20mM Tris/HCl·pH8.0)中，并离心，然后通过SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)对上清进行分离。然后，使用phospho-MLC20(p-MLC20抗体)，通过蛋白印迹法(Biochem.J.(2003)374：145)鉴定对平滑肌细胞的收缩最为重要的MLC20(肌球蛋白轻链)的活性，并且利用密度计(Bio-rad，GS-700)定量活化的程度。基于在其中仅放置乙酰胆碱的对照组的孔中所得到的0％抑制的值，计算根据药物浓度的MLC20活性(pMLC20)的抑制率(％)，并且结果提供在以下表4和5中。
[表4]
Figure BDA0001157614840000191
[表5]
Figure BDA0001157614840000201
作为调查在通过用作为神经递质的乙酰胆碱处理人膀胱平滑肌细胞诱导涉及无意识逼尿肌收缩的MLC20活性后，通过荜茇的提取物的活性抑制率的结果，可知的是，从多种溶剂提取的荜茇提取物显示抑制活性，如以上表4中所示。基于来自这些溶剂的荜茇的提取物的结果，通过在制备例2中所述的方法制备根据乙醇含量和95％乙醇提取物的级分的提取物，以通过与以上相同的方法测量MLC20活性。作为结果，在100μg/ml的处理组中，所有从含至少30体积％乙醇的乙醇水溶液提取的提取物都显示至少45～50％的抑制率，如表5中所示，并且95％乙醇提取物的二氯甲烷和乙酸乙酯级分也显示高的MLC20活性抑制。通过以上结果，认为根据本发明的荜茇提取物和乙醇提取物的级分抑制由在储尿期中经由M3受体传递的乙酰胆碱等引起的逼尿肌活动过度(收缩)，从而具有改善排尿功能障碍的作用。
制备例3：制备荜茇的95体积％乙醇水溶液提取物
将7L的95体积％乙醇水溶液加入到700g阴干后的干燥荜茇果实中以在95℃在回流下提取3.5小时。将所得的提取物过滤，然后在减压下在50-60℃的条件下利用真空旋转蒸发仪进行浓缩，得到52.7±0.1g的荜茇的95体积％乙醇水溶液提取物的软浸膏，将其用于以下实验。
实施例3：测量抑制毒蕈碱M2受体活性的效果
已知当作为GPCR(G蛋白偶联受体)之一的毒蕈碱M2受体与作为激动剂的乙酰胆碱偶联时，其抑制腺苷酸环化酶的活性从而降低细胞中cAMP的浓度，在细胞中如果cAMP的量增加，则逼尿肌松弛，或者相反如果cAMP的量减小，则逼尿肌收缩。因此，在确认排尿功能障碍的改善方面，重要的是鉴定能够增加或减小cAMP的量的作用。因此，通过预处理荜茇的95体积％乙醇水溶液提取物，将其用可充当毒蕈碱M2受体的活化剂的乙酰胆碱处理以引起cAMP浓度的减小，并且将其用可以提高cAMP在细胞中的浓度的毛喉素(Forskolin)处理，鉴定了荜茇的提取物是否具有抑制毒蕈碱受体(其可以通过乙酰胆碱抑制cAMP浓度的减小)的活性。更具体地，过程如下。
从Lonza(cambrex)购买并使用表达毒蕈碱M2受体的人膀胱平滑肌细胞(hBdSMC)。将同样购买自Lonza(cambrex)的包含胎牛血清(5％)、重组生长因子(hEGF、hFGF)、抗生素(庆大霉素)和胰岛素的用于平滑肌细胞的培养基(SmGM-2)用作培养液，并将以上细胞在5％CO2培养箱中进行传代培养，传10～13代。使培养的人膀胱平滑肌细胞(hBdSMC)在24孔板中生长至汇合，然后用PBS洗涤，用0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)在无血清DMEM培养基中预处理30分钟，并且用作为对照药物的奥昔布宁或在制备例3中制备的荜茇的乙醇提取物以各浓度处理30分钟。然后，在向其施用10μM的乙酰胆碱(ACh)达5分钟后，将其用10μM的毛喉素培养15分钟，并且通过添加0.1M HCl使反应完成。通过利用ELISA试剂盒从在将溶解在0.1M HCl中的细胞离心后取得的上清测量吸光度(408nm)来评价细胞中的cAMP的量。
结果提供在以下表6中。
[表6]
Figure BDA0001157614840000221
如以上表6中所示，仅用乙酰胆碱处理的组将由用毛喉素直接活化腺苷酸环化酶引起的细胞中cAMP的显著增加降低至约11％的水平，而用荜茇的提取物处理的实验组根据荜茇提取物的处理浓度而使cAMP浓度增加。即，可以证实，荜茇的提取物可以通过抑制毒蕈碱M2受体以减轻对细胞中积聚cAMP的抑制从而增加细胞中cAMP的浓度。具体地，用150μg/ml的荜茇提取物处理的实验组显示出色的效果：使cAMP浓度水平恢复至仅用毛喉素(Foskolin)处理的组的84.82％。从这样的结果可以看出，荜茇的提取物可以通过增大cAMP的量而用作可以用于有效松弛逼尿肌的材料。
实施例4：测量活化β3-肾上腺素能受体的作用
因为已知β3-肾上腺素能受体通过cAMP信号转导途径涉及逼尿肌松弛，所以通过测量细胞中作为其活化参数的cAMP量来确认荜茇提取物的改善排尿异常症状的作用。将其中β3和β1-肾上腺素能受体已被过表达的SK-N-MC(成神经细胞瘤细胞)以5X105个细胞/孔分配到24孔板中，24小时后用PBS漂洗，然后转移到无血清培养基中，并且用0.5mM的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)和5μM的作为β1-肾上腺素能受体的拮抗剂的CGP-20712A预处理以排除β1-肾上腺素能受体作用达30分钟。进行该预处理以排除β1-肾上腺素能受体的作用并鉴定由β3-肾上腺素能受体作用所致的cAMP量的改变。将来自制备例2的荜茇提取物制成下表中所示的浓度，施用至处理的细胞，并且在培养箱中反应30分钟，然后通过添加0.1MHCl使细胞溶解。利用ELISA试剂盒测量细胞中cAMP的量，将提取物处理组与未用提取物处理的对照组比较，结果提供在以下表7和8中。
[表7]
Figure BDA0001157614840000231
[表8]
Figure BDA0001157614840000232
如以上表7中所示，与未用荜茇提取物处理的对照组相比，荜茇的乙醇提取物明显地增大细胞中cAMP的量(取决于浓度)，并且在用100μg/ml以上的荜茇提取物的处理组中，可以鉴定出色的效果：cAMP增大3倍以上。此外，显示了荜茇的水提取物以及荜茇的二氯甲烷和甲醇提取物使cAMP的量增大。根据以上表7中的95％乙醇提取物的结果，通过与以上相同的方法，根据乙醇含量和95％乙醇提取物的级分用提取物处理细胞以测量细胞中cAMP的量，将其与对照组相比较。作为结果，相对于对照组，在100μg/ml的所有从含至少30体积％乙醇的水溶液提取的提取物的组中，可以鉴定使cAMP增大约2倍以上的效果，如表8中所示，并且甚至在95％乙醇提取物的二氯甲烷级分中也鉴定了使cAMP增大的效果。因此证实了用不同浓度的含水乙醇和乙醇水溶液提取物的各种有机溶剂级分提取的荜茇的乙醇水溶液提取物可以引起逼尿肌松弛。
根据以上结果，荜茇的提取物被鉴定是这样的材料，使得它们可以抑制由乙酰胆碱引起的MLC20活性、经由毒蕈碱M2受体有效地减轻细胞中积聚cAMP的抑制并且增加作为涉及逼尿肌松弛的β3-肾上腺素能受体的活性的参数的细胞中cAMP的量。因此，荜茇的提取物可以被认为对排尿异常症状具有治疗或改善作用，因为其不仅可以通过抑制毒蕈碱M3/M2受体及与其相关的信号转导系统而用作这些受体的拮抗剂，而且还可以经由β3-肾上腺素能受体的激动作用的组合作用而抑制逼尿肌的收缩和引起逼尿肌的松弛。
制备例4：制备荜茇的提取物
制备例4.1：制备荜茇的95％乙醇水溶液提取物
为了进一步鉴定荜茇的提取物在动物模型中改善排尿功能障碍的作用，制备荜茇的95％乙醇水溶液提取物和水提取物。将1.0L的95体积％乙醇水溶液加入到200g的荜茇的果实中并将其在95℃在回流下进行两次3.5小时的提取。将所得的提取物过滤，然后浓缩至干以制备95％乙醇水溶液提取物。
制备例4.2：制备荜茇的水提取物
使用与以上制备例4.1中制备95体积％乙醇提取物相同的方法制备荜茇的水提取物，不同之处在于将提取溶剂改变为水。
实施例5：在用荜茇的提取物预处理7天的CYP诱发的膀胱炎模型中控制排尿压力和排尿间隔的效果
使用CYP诱发的膀胱炎大鼠模型来鉴定荜茇的提取物对排尿压力和膀胱容量的效果。
作为膀胱炎动物模型的环磷酰胺(以下称为CYP)诱发的大鼠模型具有以下优点，即在用药后数小时内炎症仅在膀胱中发生并且不需要手术过程或气管插管。此外，疼痛类型和排尿症状类似于人，因为CYP在人中也引起膀胱炎(The Effect of Botulinum Toxinand Resiniferatoxn on the Detrusor Overactivity Induced by Cyclophophamide inRat Bladder(肉毒杆菌毒素和树胶脂毒素对由环磷酰胺在大鼠膀胱中诱发的逼尿肌过度活动的作用)，Korean Journal of Urology：Vol.47No.1，2006)。因此，CYP通过在尿动力学研究中显示逼尿肌过度活动的化学炎症诱发动物和人的膀胱中的膀胱过度活动以及应激性排尿症状，使得CYP诱发的膀胱炎大鼠模型被视为膀胱过度活动的动物模型(Journal ofphysiology and pharmacology 2009，60，4，85-91.Urodynamic effects of the bladderc-fiber afferent activity modulation in chronic model of overactive bladderin rats(在大鼠的膀胱过度活动的慢性模型中膀胱c-纤维传入活性调节的尿动力学作用))。
5.1.实验动物
从ORIENT(Korea)购买并使用20只无特定病原体的(SPF)雌性SD大鼠(在收到时为8周龄)。通过12小时周期控制昼夜，并且允许它们自由地接近食物和水。
5.2.荜茇的提取物对改善尿动力学参数的作用
为了测量作为用于鉴定排尿功能障碍的改善的参数的膀胱压力和排尿间隔，将环磷酰胺(150mg/kg)一次性腹膜内施用至除了正常对照组以外的大鼠以诱发应激性膀胱症状，3天后进行膀胱测压。自膀胱测压前7天起，将溶剂(DMSO/10％Cremophor EL＝1∶9，体积/体积)施用于溶剂对照组，并将在制备例4.1中制备的荜茇的果实的95体积％乙醇水溶液提取物以200mg/kg施用于实验组。
为了进行膀胱测压和生理盐水溶液注射，在测量尿动力学参数的当天将大鼠麻醉后，用荷包缝合法(purse-stringsuture)经由其下腹部的中央切口将有封套的(cuffed)聚乙烯导管(PE-50，Becton Dickinson，Parsippany，USA)固定在其膀胱腔圆顶上。在进行膀胱导管和用于测量腹部压力的导管的插入后，将大鼠的膀胱导管连接至微量注射泵(KDS100 Single Syringe Infusion Pump；KD Scientifics)和具有3通旋塞的压力转换器(GRASS MODEL 7 POLYGRAPH；GRASS instrument Co.U.S.A)。然后，在插入后30分钟，在使用膀胱内灌注泵以0.04ml/min的速度注射生理盐水溶液达2小时的情况下，测量尿动力学参数如膀胱内压力。利用Chart 4PowerLab(ADinstument，USA)观察膀胱内压力数据获取的分析，并且单独选择测量的排尿周期中施用药物之前和之后的4～5个连续的排尿收缩峰以求平均值。
CYP动物模型中的尿动力学研究的测量值及其定义如下。
基底压力(BP)，其是5个重复的排尿周期中的膀胱内压力的参数，是膀胱测压中的最低压力，阈值压力(TP)是即将排尿收缩前的压力，并且排尿压力(MP)表示在排尿时呈现的最大膀胱压力。通过计算连续排尿压力之间的时间间隔来确定排尿间隔(MI)。对排尿周期的测量持续120分钟，并且通过选择所测量的排尿周期之中的最具代表性的5个连续周期来计算各参数的平均值。
结果提供在以下表9和图1中。
[表9]涉及压力和排尿间隔的尿动力学参数
Figure BDA0001157614840000271
如从以上表9和图1可见的，证实了与未用荜茇的提取物处理的膀胱过度活动综合征的溶剂对照组相比，荜茇的乙醇提取物出色地将排尿间隔增大至195.90±92.91，并且均匀地保持作为各种膀胱压力指标的BP、IMP、MP和TP全部至正常对照组的水平，并且特别地，其被鉴定为显示显著改善作为测量与膀胱的蓄积功能相关的膀胱压力的参数的阈值压力(TP)的作用。
实施例6：在CYP诱发的膀胱炎模型中在给药荜茇的提取物达3天后荜茇的提取物对排尿压力、膀胱容量和排尿间隔的作用
6.1.实验动物
从ORIENT(Korea)购买并使用65只无特定病原体的(SPF)SD雌性大鼠。通过12小时周期控制昼夜，并且允许它们自由地接近食物和水。
6.2.荜茇的提取物对改善尿动力学参数的作用
为了测量作为用于鉴定排尿功能障碍改善的参数的膀胱压力、膀胱容量和排尿体积，在膀胱测压前3天，将环磷酰胺(150mg/kg)一次性腹膜内地施用于除正常对照组以外的大鼠以诱发应激性膀胱症状。自膀胱测压前的3天起，将溶剂(DMSO/10％Cremophor EL＝1∶9，体积/体积)施用于溶剂对照组，并将在制备例4.1中制备的荜茇的果实的95体积％乙醇水溶液提取物以200mg/kg施用于实验组。此外，在实验当天，经由尾静脉以0.3mg/kg注射作为阳性对照组的奥昔布宁。
关于膀胱测压和生理盐水溶液注射，用于膀胱测压和膀胱导管插入的设备与以上实施例5.2中相同，并且通过在1.5ml管中对尿液取样并测量其重量来记录排尿体积和残余体积。
CYP动物模型中的尿动力学研究的测量值及其定义如下。
基底压力(BP)、阈值压力(TP)、排尿压力(MP)和排尿间隔(MI)如在以上实施例5.2中那样定义。此外，通过在尿动力学测量期间的最后一次排尿时在1.5ml管中对尿液取样并测量其重量来定义作为体积参数的参数的排尿体积。在完成排尿后，通过将插入膀胱的导管置于比大鼠更低的部分并且测量获得的生理盐水的重量来定义残余体积。通过将测量的大鼠的残余体积(RV)和排尿体积(VV)合并来计算膀胱容量(BC)。
对排尿周期的测量持续120分钟，并且通过选择所测量的排尿周期之中的最具代表性的5个连续周期来计算各参数的平均值。
结果提供在表10和图2中。
[表10]与体积和膀胱重量相关的尿动力学参数
Figure BDA0001157614840000281
如以上表10和图2所示，相对于溶剂对照组诱发的膀胱过度活动症状，荜茇的乙醇提取物显示显著改善作为与如排尿功能障碍状态的膀胱过度活动中呈现的尿频相关的参数的排尿间隔(MI)的作用。此外，其还显示在基底压力(BP)、排尿压力(MP)和阈值压力(TP)在作为用于测量与膀胱的蓄积功能相关的膀胱压力的参数的无排尿(non-voiding)方面改善膀胱过度活动症状的作用。鉴定了可以将排尿体积(VV)改善至与作为阳性对照组的用奥昔布宁处理的组类似的水平。
6.3.荜茇的乙醇和水提取物对于改善尿动力学参数的作用
鉴定了荜茇的水提取物是否也可以改善尿动力学参数。更具体地，使用CYP动物模型来评价改善尿动力学参数的作用，所用方法与以上实施例6.2相同，不同之处在于除了在制备例4.1中的荜茇的95体积％乙醇提取物以外，用在制备例4.2中的荜茇的水提取物对其进行处理作为另外的实验组，并且通过测量作为评价与膀胱过度活动综合征相关的排尿功能障碍的代表性参数的排尿体积和排尿间隔(MI)进行比较。
结果提供在以下表11和图3中。
[表11]
Figure BDA0001157614840000291
如由以上表11和图3可见的，荜茇的乙醇和水提取物相对于溶剂对照组的膀胱过度活动都非常显著地增大了排尿体积(VV)，并且同样相对于溶剂对照组使排尿间隔(MI)显著增大约2倍以上。根据以上结果，因为荜茇的水和乙醇提取物都能够改善伴随排尿功能障碍的排尿间隔减小和排尿体积减小，所以它们被鉴定为具有能够以与市售的奥昔布宁类似的水平预防或治疗各种排尿功能障碍如伴有尿频、尿急等的膀胱过度活动综合征的优异作用的材料。
制备例5：制备荜茇的提取物
制备例5.1：制备荜茇的水提取物
将6.0L的水加入到1Kg阴干的荜茇的果实中以在恒温水浴(HYNDAE Science，B-90)中在80-90℃在回流下进行两次3.5小时的提取。将所得的提取物在减压下用滤纸过滤，然后将所得的滤液用真空旋转蒸发仪(EYELA，N-1100)在50-60℃的条件下蒸发浓缩并且用真空干燥器(JEIOTech，OV-12)干燥至少12小时，得到荜茇的水提取物。
制备例5.2：制备荜茇的30体积％乙醇水溶液提取物
将6.0L的30体积％乙醇水溶液加入到1Kg阴干的荜茇的果实中以在恒温水浴(HYNDAE Science，B-90)中在80-90℃在回流下进行两次3.5小时的提取。将所得的提取物在减压下用滤纸过滤，然后将所得的滤液用真空旋转蒸发仪(EYELA，N-1100)在50-60℃的条件下蒸发浓缩并且用真空干燥器(JEIO Tech，OV-12)干燥至少12小时，得到荜茇的95体积％乙醇水溶液提取物。
制备例5.3：制备荜茇的95体积％乙醇水溶液提取物
将7.0L的95体积％乙醇水溶液加入到700g阴干的荜茇的果实中以在恒温水浴(HYNDAE Science，B-90)中在80-90℃在回流下进行两次3.5小时的提取。将所得的提取物在减压下用滤纸过滤，然后将所得的滤液用真空旋转蒸发仪(EYELA，N-1100)在50-60℃的条件下蒸发浓缩并且用真空干燥器(JEIO Tech，OV-12)干燥至少12小时，得到荜茇的95体积％乙醇水溶液提取物。
细节提供在以下表12中。
[表12]
Figure BDA0001157614840000311
实施例7：经由SHR非麻醉评价模型的荜茇的提取物对排尿频率的作用
因为排尿功能障碍是基于患者经历的症状进行诊断的，所以除了膀胱和神经系统的控制以外，心理因素也起重要作用。因此，为了评价排尿功能障碍，重要的是在有意识的动物中客观地观察排尿参数。考虑到这样的需要，对人膀胱过度活动的研究不断增大对自发性高血压大鼠(下文中称为SHR)模型的使用。虽然自发性高血压大鼠原本是作为人高血压的动物模型开发的，但目前其已被用作膀胱过度活动模型，在尿动力学研究中显示逼尿肌过度活动以及尿频，并因此被认为是客观上被批准的用于人膀胱过度活动的动物模型(Jin LH等substantial detrusor overactivity in conscious spontaneouslyhypertensive rats with hyperactive behaviour.Scand J Urol Nephrol 2009；43：3-7)。在使用与人膀胱过度活动综合征最相似的自发性高血压大鼠的实验中，用于评价用药后排尿间隔增大的模型是一种改进的模型，从而通过多种机制而不是任何一种机制的效果来评价改善程度。因此，由SHR模型来鉴定通过根据本发明的荜茇的提取物改善和治疗膀胱过度活动综合征的作用。
7.1实验动物
从SLC (Japan)购买并使用12周龄雄性SHR。通过12小时周期控制昼夜，并且允许它们自由地接近食物和水。在向18周龄的SHR施用溶剂和在制备例5中的药物后，进行测量排尿频率的实验。
7.2荜茇的提取物对于减小排尿频率的作用
在实验的第一天，在相同的SHR上，向其施用溶剂，并且在第二天，以300mg/kg向其施用在制备例5.2中的实验药物(荜茇的水提取物和30体积％乙醇水溶液提取物)。两天的施用体积相同，为kg/10ml。在此时，施用至在第一天施用了荜茇的水提取物的组的溶剂是蒸馏水(D.W)，并且施用至施用了荜茇的30体积％乙醇水溶液的组的溶剂是DMSO/10％Cremophor EL＝1∶9(体积/体积)。
测量施用了溶剂的相同SHR的排尿频率、排尿体积和单次排尿体积的结果被认为是对照组的值，而测量施用了实验药物的SHR的排尿频率、排尿体积和单次排尿体积的结果成为实验组。
具体地，在施用溶剂(第一天)后，将SHR置于代谢笼中，并且在仅供水16小时(5PM～9AM)的情况下，使用等长传感器(Harvard apparatus)和MP150(BIOPAC systems，型号MP150CE)测量排尿频率、排尿体积和单次排尿体积，并且结果被视为是对照组的值。在向在第一天施用了溶剂的SHR施用制备例5.2的实验药物(第二天)(荜茇的水和30体积％乙醇水溶液提取物)后，将SHR置于代谢笼中，并且在仅供水16小时(5PM～9AM)的情况下，使用等长传感器(Harvard apparatus)和MP150(BIOPAC systems，型号MP150CE)测量排尿频率、排尿体积和单次排尿体积，并且结果被视为是实验组的值。将施用溶剂(第一天)和实验药物(第二天)后16小时的排尿频率数据进行比较并且统计学计算(配对学生t检验)。
结果提供在以下表13和图4中。
[表13]
Figure BDA0001157614840000331
如由以上表13和图4可见的，所有荜茇的水提取物和荜茇的30体积％乙醇水溶液提取物相对于溶剂对照组都显示对作为与膀胱过度活动中发展的尿频相关的参数的排尿频率的显著改善作用。具体地，荜茇的30体积％乙醇水溶液提取物还显著增大与膀胱的蓄积功能相关的单次排尿体积，并因此，其被鉴定为具有比荜茇的水提取物更好的对膀胱过度活动症状的改善作用。
实施例8：在未麻醉的SHR中经由尿动力学研究的荜茇提取物的作用
8.1实验动物
从Charles River (Japan)购买并使用12～18周龄的雄性SHR。通过12小时周期控制昼夜，并且允许它们自由地接近食物和水。所有大鼠都需要在不给药的情况下排尿3-5个周期。大鼠在不给药的情况下的排尿参数被视为是对照组的尿动力学参数，而经由与胃相连的导管以300mg/kg直接在胃肠道中施用了在制备例4.2中制备的荜茇的果实的水提取物的大鼠成为实验组。作为阳性对照组，使用施用了1mg/kg的托特罗定的大鼠。设定荜茇的水提取物给药组和托特罗定给药组各有6只大鼠。
8.2.通过荜茇的提取物改善尿动力学参数的作用
为了测量作为用于鉴定排尿功能障碍改善的参数的膀胱压力、膀胱容量、排尿体积和排尿间隔，在SHR模型中进行膀胱管和用于测量腹部压力的导管的插入。关于膀胱测压和生理盐水溶液的注射，在测量尿动力学参数的那天之前3天在大鼠的下腹部的中央进行切割，并且用荷包缝合法将用封套套住的聚乙烯导管(PE-50，Becton Dickinson，Parsippany，USA)固定在其膀胱圆顶上。此外，将具有用于测量腹部压力的气囊的聚乙烯导管(PE-10，Becton Dickinson，Parsippany，USA)固定在膀胱上，并且将另一根聚乙烯导管(PE-10，Becton Dickinson，Parsippany，USA)在插入到胃肠道中后进行固定。以上导管通过在下面的皮肤，然后被固定在背侧皮肤上，通过施加热使其端部封闭。在插入膀胱管和用于测量腹部压力的导管后3天，将自由的未麻醉大鼠置于代谢笼中。利用T形管将其颈部背侧上的管与微量注射泵(PHD22/2000泵；Harvard Apparatus)和压力传感器(ResearchGrade Blood Pressure Transducer；Harvard Apparatus，Holliston，USA)相连，然后测量膀胱内压力，在室温以10ml/小时的速度注射生理盐水溶液。利用以下原理测量大鼠中的膀胱内压力：当在膀胱中填充预定体积的生理盐水溶液时，其收缩从而排尿。通过将用于测量腹部压力的导管与另一个压力传感器相连来测量腹部压力。此外，为了测量作为体积参数指标的排尿体积，由在与力位移传感器器(Research Grade Isometric Transducer；Harvard Apparatus)相连的尿液收集杯(液体收集器)中收集的尿量测量排尿体积。利用MP150数据获取系统(BIOPAC systems，Goleta，USA)和Acq Knowledge 3.8.1软件观察来自膀胱内压力、腹部压力和排尿体积的数据获取的分析。
在施用荜茇的提取物和托特罗定前开始测量尿动力学参数，获得3至5个稳定的排尿周期的记录。然后，在将导管拆开后口服施用荜茇的提取物和托特罗定。在口服施用药物20分钟后再次将导管与其相连，并通过使大鼠排尿3至5次进行排尿周期和尿动力学研究。通过从施用药物前后测量的排尿周期选择最具代表性的3个连续周期来计算各参数的平均值。
该实验中的尿动力学值及其定义如下。
在3个重复的排尿周期中，作为膀胱内压力的参数的基底压力(BP)是膀胱测压中的最低压力，阈值压力(TP)是将要排尿收缩前的压力，并且排尿压力(MP)是指排尿时出现的最大膀胱压力。在完成排尿后，通过将插入膀胱的导管置于比大鼠更低的部分并且测量获得的生理盐水的重量来定义残余体积。通过将测量的大鼠的残余体积(RV)和排尿体积(VV)合并来计算膀胱容量(BC)。
在SHR模型中，排尿间隔(MI)表示通过确定3个排尿周期中的排尿压力和下一个排尿周期中的排尿压力之间的时间间隔并由所述时间间隔推算测量残余尿液的时间获得的值。
结果提供在以下表14和图5中。
[表14]
Figure BDA0001157614840000351
如由以上表14和图5可见，与用药前的对照组相比，荜茇的提取物使排尿间隔(MI)增大60.7％。这意味着作为膀胱过度活动综合征最独特症状的尿频可以被有效地改善。与对照组相比，它们还使排尿体积(VV)和膀胱容量(BC)增大60％以上。根据以上结果，证实了根据本发明的荜茇的提取物可以出色地改善作为与在膀胱过度活动中呈现的频繁排尿相关的体积参数的排尿体积(VV)、膀胱容量(BC)和排尿间隔(MI)中的所有项，并且显示比市售的托特罗定更好的效果。
制剂例1：制备药物
1.1.制备粉剂
荜茇的提取物 100mg
乳糖 100mg
滑石 10mg
将以上组分混合并填充到气密性粉剂袋中以制备粉剂。
1.2.制备片剂
荜茇的提取物 100mg
玉米淀粉 100mg
乳糖 100mg
硬脂酸镁 2mg
将以上组分混合，然后根据用于制备片剂的通用方法进行压缩以制备片剂。
1.3.制备胶囊
荜茇的提取物 100mg
玉米淀粉 100mg
乳糖 100mg
硬脂酸镁 2mg
根据用于制备胶囊的通用方法，将以上组分混合并填充到明胶胶囊中以制备胶囊。
1.4.制备注射液
荜茇的提取物 100mg
注射用无菌蒸馏水 适量
pH调节剂 适量
根据用于制备注射液的通用方法，以每安瓿(2ml)的上述量由以上组分制备注射液。
1.5.制备液体制剂
荜茇的提取物 100mg
糖 20g
异构化糖 20g
柠檬香料 适量
向其中加入净化水以调至1,00ml。根据用于制备液体制剂的通用方法，将以上组分混合，然后填充到棕色小瓶中并灭菌以制备液体制剂。
制剂例2：制备健康功能食品
荜茇的提取物 100mg
维生素混合物 适量
维生素A乙酸酯 70μg
维生素E 1.0mg
维生素B1 0.13mg
维生素B2 0.15mg
维生素B6 0.5mg
维生素B12 0.2μg
维生素C 10mg
生物素 10μg
烟酰胺 1.7mg
叶酸 50μg
泛酸钙(Calcium panthothenate)0.5mg
矿物混合物 适量
硫酸亚铁 1.75mg
氧化锌 0.82mg
磷酸二氢钾 15mg
磷酸二钙 55mg
柠檬酸钾 90mg
碳酸钙 100mg
氯化镁 24.8mg
虽然以上维生素和矿物质混合物由作为优选实施例的相对适合于治愈功能性食品的组分以以上组成比混合并由其组成，但可以允许任选地改变组合比率，并且根据用于制备一般健康功能食品的通用方法，可以将以上组分混合，然后根据通用方法，将其用于制备健康功能食品组合物(例如，营养糖果等)。
制剂例3：制备健康功能饮料
荜茇的提取物 100mg
柠檬酸 1000mg
寡糖 100g
美洲李提取物(Plum extract) 2g
牛磺酸 1g
加净化水至总共900ml
根据用于制备健康功能饮料的通用方法，将以上组分混合，在搅拌的情况下在85℃加热约1小时，然后将所得的溶液过滤并将其盛在灭菌的21容器中，将所述容器密封并灭菌，冷藏保存，然后用于制备根据本发明的健康功能饮料组合物。
虽然相对适合于有利饮料的组分以以上组成比率混合和构成以作为优选实施例，但可以允许任选地改变组合比率，这取决于地区或种族偏好如需求类别、需求国家及用途。

Claims (10)

1.荜茇(Piper Longum L.)的提取物作为活性成分在制备用于预防或治疗排尿功能障碍的药物组合物中的应用，其中所述荜茇的提取物是选自以下的溶剂提取的混合物：水、甲醇、乙醇、异丙醇、乙酸乙酯、正己烷和二氯甲烷。
2.根据权利要求1所述的应用，其中所述溶剂是30至100体积％的甲醇或乙醇。
3.根据权利要求1所述的应用，其中所述荜茇的提取物增大排尿间隔。
4.根据权利要求1所述的应用，其中所述荜茇的提取物减小排尿压力并且增大膀胱的容积。
5.根据权利要求1所述的应用，其中所述荜茇的提取物引起逼尿肌收缩的抑制以及逼尿肌的松弛。
6.根据权利要求1所述的应用，其中所述荜茇提取物的提取物抑制毒蕈碱M3受体或毒蕈碱M2受体。
7.根据权利要求1所述的应用，其中所述荜茇的提取物是β3-肾上腺素能受体的激动剂。
8.根据权利要求1所述的应用，其中所述排尿功能障碍是选自由以下各项组成的组的一种或多种：膀胱过度活动综合征、紧迫性尿失禁、尿急、尿频、夜尿症和间质性膀胱炎。
9.荜茇的提取物作为活性成分在制备用于预防或改善排尿功能障碍的健康功能食品中的应用，其中所述荜茇的提取物是选自以下的溶剂提取的混合物：水、甲醇、乙醇、异丙醇、乙酸乙酯、正己烷和二氯甲烷。
10.根据权利要求9所述的应用，其中所述排尿功能障碍是选自由以下各项组成的组的一种或多种：膀胱过度活动综合征、紧迫性尿失禁、尿急、尿频、夜尿症和间质性膀胱炎。
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