CN106434484A - 金橙ii降解菌ao7‑1及其生产的菌剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开金橙II降解菌AO7‑1及其生产的菌剂,金橙II降解菌AO7‑1的菌株是解糖假苍白杆菌Pseudochrobactrum saccharolyticum,菌株AO7‑1于2016年9月19日保藏于中国典型培养物保藏中心,地址:中国武汉市武汉大学,保藏编号:CCTCC M2016501。该细菌的最适生长温度为30ºC左右,最适环境pH为9.0左右,降解菌AO7‑1能使偶氮染料金橙II的残留量降低90%以上,菌剂具有生产使用成本低、使用方便、去除效果好的优点,适合相关染料废水生物强化处理及水体或土壤的污染治理。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及金橙II降解菌AO7-1及其生产的菌剂,是利用微生物的方法降解偶氮染料金橙II,适用于环境污染的治理。
背景技术
偶氮染料(偶氮基两端连接芳基的一类化合物)是纺织品服装在印染工艺中应用最广泛的一类合成染料,用于多种天然和合成纤维的染色和印花,也用于油漆、塑料、橡胶等的着色。在特殊条件下,它能分解产生20多种致癌芳香胺,经过活化作用改变人体的DNA结构引起病变和诱发癌症。
偶氮化合物共同的特征为分子中含有偶氮键“-N=N-”。一般来说,偶氮化合物的分子中含有1-3个“-N=N-”,键上连有笨或苯基,苯或苯基又连有-Cl、-NH2、-CH3、-SO3、-NO2及-OH等基团。
偶氮染料污染的主要特点是污染量大,虽然偶氮染料废水中残留的染料成分浓度很低,但是排入水体会造成水体的透光率降低,破坏水体生态系统。这些染料结构稳定,具有抗碱、抗酸、抗微生物、抗光等特性,可以较长时间地滞留在环境中,因此存在潜在的健康危害。在生产和使用染料的地方,地下水和地表水的重要污染物就是偶氮染料。在很多染料工业密集的地区,河流和地下水都面临着严重污染的危险。
偶氮染料对人体的健康也有严重危害。日本人Yoshida等在20世纪30年代发现,溶剂黄可以引起老鼠肝细胞癌变。此后,人们才开始意识到,在生产和使用过程中,偶氮染料及其中间体具有危险性。芳香胺作为偶氮染料中间体,已被一些国家列为可疑致癌物,其中β-萘胺和联苯胺已经被确认为是对人类最具烈性的致癌物。
其中,偶氮基经常会与一个或多个芳香环系统相连,而形成共轭体系,从而作为染料的发色体。他几乎分布于所有颜色。偶氮染料不仅仅可以用于纺织品的印染,还可以用来染纸张、皮革、食品等。应该指出的是,在一般情况下,偶氮染料自身不会危害人体健康,但是部分偶氮染料使用芳香胺类中间体合成的,而芳香胺类中间体具有致癌性,当人体皮肤长时间与其接触后,通过人体正常的新陈代谢过程而释放出的物质就会与其结合,结合后会发生还原反应,该反应会导致偶氮基断裂,从而再次生成具有致癌性的芳香胺类化合物,假如这些生成的化合物被人体重新吸收,在经过活化作用以后,人体的细胞就会在结构和功能方面发生改变,转变成为人体病变的诱因。这样的结果是,导致癌症的可能性。
偶氮染料金橙II产品可溶于水,偶氮染料金橙II对环境的污染已严重危害着人类的健康,其污染环境的综合治理,未见有比较成熟和稳定高效的技术。金橙II高效降解菌株资源极其匮乏。
发明内容
本发明的目的是:提供一种金橙II降解菌AO7-1及其生产的菌剂,能够高效地降解金橙II,使其脱色率超过90%,用于相关染料废水生物强化处理及水体或土壤的污染治理,丰富金橙II降解菌株资源库。
本发明的技术解决方案是:该金橙II降解菌AO7-1是解糖假苍白杆菌Pseudochrobactrum saccharolyticum,菌株AO7-1于2016年9月19日保藏于中国典型培养物保藏中心,地址:中国武汉市武汉大学,保藏编号:CCTCC M2016501。
利用金橙II降解菌AO7-1生产的菌剂,它的生产方法包括以下步骤:
步骤(1):用接种环刮取一环金橙II降解菌AO7-1的试管种接种于中,30℃,180rpm振荡培养至对数期;其中,1L发酵培养基中各组分的重量含量为:蛋白胨1%,酵母膏0.5%,氯化钠0.5%,其余去离子水,pH为9.0;
步骤(2):将步骤(1)培养好的菌种按培养基体积的1%接种入500L种子罐,培养至对数生长期;1L种子罐培养基中各组分的重量含量为:蛋白胨1%,酵母膏0.5%,氯化钠0.5%,其余去离子水,pH为9.0;培养条件是:培养过程中通无菌空气,每分钟通入的无菌空气与培养基体积之比为1:0.6~1.2,搅拌速度为180~240r/min,培养温度为30℃,培养时间为48~60h;
步骤(3):将步骤(2)的种子液按培养基体积的10%接入生产罐发酵培养;生产罐所用培养基与种子罐培养基相同;培养条件是:培养过程中通无菌空气,每分钟通入的无菌空气与培养基体积之比为1:0.6~1.2,搅拌速度为180~240r/min,培养温度为30℃,培养时间为48~60h;
步骤(4):生产罐中,当菌体数量达到10亿个/mL以上时发酵结束,发酵完成后培养液出罐,直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂,该液体剂即为菌剂。
本发明的有益效果是:金橙II降解菌AO7-1菌剂生产使用成本低,使用方便,该细菌的最适生长温度为30ºC左右,最适环境pH为9.0左右,在短时间内使偶氮染料金橙II降解,降解菌AO7-1能使偶氮染料金橙II的残留量降低90%以上,去除效果好,适合相关染料废水生物强化处理及水体和土壤的污染治理,对于保护生态环境、保护人类身体健康、提高农产品的附加值具有重要的意义。
附图说明
图1是菌株AO7-1对金橙II的降解进程;
图2是温度对AO7-1降解效率的影响;
图3-1是pH对菌株AO7-1生长的影响;
图3-2是pH对AO7-1降解效率的影响;
图3-3是系列pH条件下菌株AO7-1对染料金橙II的吸附;
图4是盐浓度对AO7-1降解效率的影响。
具体实施方式
下面结合实施例及其附图对本发明的技术方案做进一步的分析,但不能理解为是对技术方案的限制。
金橙II降解菌AO7-1,其菌株是解糖假苍白杆菌Pseudochrobactrumsaccharolyticum,于2016年9月19日保藏于中国典型培养物保藏中心,地址:中国武汉市武汉大学,保藏编号:CCTCC M2016501。
1. 菌株的分离和鉴定:取污染土壤10g,置于100mL的无菌水中,振荡5min,得土壤菌悬液;取5mL的土壤菌悬液,加入到100mL的无机盐培养基[[NH4NO3 1g/L, KH2PO4 1.5g/L, K2HPO4 0.5 g/L, NaCl 0.5g/L, MgSO4·7H2O, 0.2g/L]中,添加金橙II作为碳源,置于30℃,150r/min摇床振荡培养获得富集液,梯度稀释富集液涂布于添加金橙II的培养基平板上,直到获得金橙II的降解菌株;该降解菌命名为AO7-1,菌株经16S rRNA基因PCR扩增、测序及比对分析,鉴定为解糖假苍白杆菌Pseudochrobactrum saccharolyticum;该细菌的最适生长温度为30ºC左右,最适环境pH为9.0左右,在实验室条件下该菌降解金橙II的降解率可达90%以上,该菌可以用发酵工业通用发酵设备进行生产。
2. 实验室生物降解实验
2.1菌株AO7-1对金橙II的降解进程:菌株AO7-1在LB培养基(LB培养基配方:蛋白胨1%、酵母膏0.5%、氯化钠0.5%,)中振荡(30℃,180rpm)培养过夜,次日取菌株种子液加液体LB稀释3倍后加入金橙II母液,使其终浓度为20mg/L;将该降解体系放置于37℃恒温培养箱中静置,并按时间间隔取样(时间间隔为2小时),所取样品置于冰水混合物中保存,待所有样品取完后统一处理;所有样品取完后,经12000rpm、3min离心去除菌体,得到含有尚未被降解脱色的金橙II的上清液;上清液采用紫外可见分光光度计于484nm处测量其光密度值;实验设置3个重复,分别检测吸光度后计算平均值并以此来衡量体系中金橙II的残留量;结果如图1所示:随着时间的延长,菌株AO7-1能够快速使金橙II溶液脱色,18小时内脱色率超过90%;据此判断菌株AO7-1对金橙II具有很好的降解脱色性能。
2.2温度对AO7-1降解效率的影响:温度对微生物生长和代谢具有非常显著的影响,为阐明温度对菌株AO7-1降解金橙II的影响,将菌株过夜培养后建立降解体系(同2.1);将该降解体系平均分成6份,每份设置三个重复;将均分后的混合液分别放置于0℃、10℃、20℃、30℃、37℃、50℃、60℃恒温培养箱中,温浴10小时后取出样品,离心,分别测定并计算不同温度下菌株AO7-1对偶氮染料金橙II的降解率(样品处理和检测方法同2.1);结果如图2所示:低温和高温对菌株降解金橙II均具有显著的抑制作用,37℃左右是菌株降解金橙II的最适宜温度。
2.3 pH对AO7-1降解效率的影响:pH对微生物生长和代谢同样具有非常显著的影响,微生物都具有一个适宜生长和代谢的pH范围,超出这个范围,微生物就不能很好地生长和代谢。
为考察pH对菌株AO7-1生长的影响,分别用盐酸或氢氧化钠溶液将液体LB培养基调至pH3~pH10;按1%接种量,接种在LB中过夜培养的AO7-1种子液至20mL系列pH值的LB培养基中,置于30℃,180rpm恒温摇床中振荡培养约6小时后,用紫外可见分光光度计在600nm处测定菌液吸光值,并以OD600值来衡量对应样品的菌体浓度;结果如图3-1所示:图3-1的结果显示菌株在中性偏碱环境下生长良好,菌株生长的适宜pH范围是6~9,偏酸性环境及强碱性环境对菌株的生长具有极强的抑制作用,当pH小于等于5或大于等于10时菌株无法正常生长。
将菌株AO7-1在LB中的过夜培养物等分成8份,12000rpm,3min离心收集菌体,并分别用等体积系列pH值的LB培养液重悬体,加入终浓度为20mg/L的金橙II母液,构建好的降解体系置于37℃恒温培养箱中,温浴10小时后取出样品,计算和分析不同pH条件下菌株对金橙II的降解率(样品处理和检测方法同2.1),以研究pH对菌株AO7-1降解金橙II的影响;结果如图3-2和3-3所示:图3-2显示pH3-5范围内混合液中金橙II的去除率逐步降低;pH6-9时去除率逐步升高,pH10时去除率略有降低;但在偏酸性环境中,菌株AO7-2对金橙II有明显的吸附作用,从图3-3可以看出pH越低,菌株吸附染料的浓度就越大,颜色也就越深;综合混合液中染料残留和菌体吸附情况,判断菌株在偏碱性环境中对金橙II有较好的降解效果,最适pH为9。
2.4盐度对AO7-1降解效率的影响:盐浓度是环境质量评估和污水处理过程中经常考查的重要参数之一,对微生物的生长和代谢有较大影响;为研究盐浓度对菌株AO7-1的生长的影响,按1%接种量,分别接种在LB中过夜培养的AO7-1种子液至20mL含系列盐浓度(0%,0.5%,1%,1.5%,2%,2.5%,3%,3.5%,4%,4.5%)的LB培养基中,置于30℃,180rpm恒温摇床中振荡培养约6小时后,用紫外可见分光光度计在600nm处测定菌液吸光值,并以OD600值来衡量对应样品的菌体浓度;将菌株AO7-1在LB中的过夜培养物等分成10份,12000rpm,3min离心收集菌体,并分别用等体积含系列盐浓度的LB培养液重悬体,加入终浓度为20mg/L的金橙II母液,置于37℃恒温培养箱中,温浴10小时后取出样品,计算和分析不同盐浓度条件下菌株对金橙II的降解率(样品处理和检测方法同2.1),以研究盐浓度对菌株AO7-1降解金橙II的影响;结果如图4所示:随着盐浓度的提高,菌株AO7-1的生长受到显著地抑制,对金橙II的降解率也略有下降,但影响不显著。
生产实施例1:依以下步骤生产金橙II降解菌AO7-1菌剂
步骤(1):用接种环刮取一环金橙II降解菌AO7-1的试管种接种于中,30℃,180rpm振荡培养至对数期;其中,1L发酵培养基中各组分的重量含量为:蛋白胨1%,酵母膏0.5%,氯化钠0.5%,其余去离子水,pH为9.0;
步骤(2):将步骤(1)培养好的菌种按培养基体积的1%接种入500L种子罐,培养至对数生长期;1L种子罐培养基中各组分的重量含量为:蛋白胨1%,酵母膏0.5%,氯化钠0.5%,其余去离子水,pH为9.0;培养条件是:培养过程中通无菌空气,每分钟通入的无菌空气与培养基体积之比为1:0.6,搅拌速度为180r/min,培养温度为30℃,培养时间为48h;
步骤(3):将步骤(2)的种子液按培养基体积的10%接入生产罐发酵培养;生产罐所用培养基与种子罐培养基相同;培养条件是:培养过程中通无菌空气,每分钟通入的无菌空气与培养基体积之比为1:0.6,搅拌速度为180r/min,培养温度为30℃,培养时间为48h;
步骤(4):在生产罐中,当菌体数量达到10亿个/mL以上时发酵结束,发酵完成后培养液出罐,直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂,该液体剂即为菌剂。
生产实施例2:依以下步骤生产金橙II降解菌AO7-1菌剂
步骤(1):用接种环刮取一环金橙II降解菌AO7-1的试管种接种于中,30℃,180rpm振荡培养至对数期;其中,1L发酵培养基中各组分的重量含量为:蛋白胨1%,酵母膏0.5%,氯化钠0.5%,其余去离子水,pH为9.0;
步骤(2):将步骤(1)培养好的菌种按培养基体积的1%接种入500L种子罐,培养至对数生长期;1L种子罐培养基中各组分的重量含量为:蛋白胨1%,酵母膏0.5%,氯化钠0.5%,其余去离子水,pH为9.0;培养条件是:培养过程中通无菌空气,每分钟通入的无菌空气与培养基体积之比为1:0.9,搅拌速度为210r/min,培养温度为30℃,培养时间为54h;
步骤(3):将步骤(2)的种子液按培养基体积的10%接入生产罐发酵培养;生产罐所用培养基与种子罐培养基相同;培养条件是:培养过程中通无菌空气,每分钟通入的无菌空气与培养基体积之比为1:0.9,搅拌速度为210r/min,培养温度为30℃,培养时间为54h;
步骤(4):在生产罐中,当菌体数量达到10亿个/mL以上时发酵结束,发酵完成后培养液出罐,直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂,该液体剂即为菌剂。
生产实施例3:依以下步骤生产金橙II降解菌AO7-1菌剂
步骤(1):用接种环刮取一环金橙II降解菌AO7-1的试管种接种于中,30℃,180rpm振荡培养至对数期;其中,1L发酵培养基中各组分的重量含量为:蛋白胨1%,酵母膏0.5%,氯化钠0.5%,其余去离子水,pH为9.0;
步骤(2):将步骤(1)培养好的菌种按培养基体积的1%接种入500L种子罐,培养至对数生长期;1L种子罐培养基中各组分的重量含量为:蛋白胨1%,酵母膏0.5%,氯化钠0.5%,其余去离子水,pH为9.0;培养条件是:培养过程中通无菌空气,每分钟通入的无菌空气与培养基体积之比为1:1.2,搅拌速度为240r/min,培养温度为30℃,培养时间为60h;
步骤(3):将步骤(2)的种子液按培养基体积的10%接入生产罐发酵培养;生产罐所用培养基与种子罐培养基相同;培养条件是:培养过程中通无菌空气,每分钟通入的无菌空气与培养基体积之比为1:1.2,搅拌速度为240r/min,培养温度为30℃,培养时间为60h;
步骤(4):在生产罐中,当菌体数量达到10亿个/mL以上时发酵结束,发酵完成后培养液出罐,直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂,该液体剂即为菌剂。
实施例1-3所得菌剂降解金橙II的效果如下表:
。
Claims (2)
1.金橙II降解菌AO7-1,其特征在于:该菌株是解糖假苍白杆菌Pseudochrobactrumsaccharolyticum,菌株AO7-1于2016年9月19日保藏于中国典型培养物保藏中心,地址:中国武汉市武汉大学,保藏编号:CCTCC M2016501。
2.利用如权利要求1所述的金橙II降解菌AO7-1生产的菌剂,该菌剂通过以下方法制备而成,其特征在于该方法包括以下步骤:
步骤(1):用接种环刮取一环金橙II降解菌AO7-1的试管种接种于中,30℃,180rpm振荡培养至对数期;其中,1L发酵培养基中各组分的重量含量为:蛋白胨1%,酵母膏0.5%,氯化钠0.5%,其余去离子水,pH为9.0;
步骤(2):将步骤(1)培养好的菌种按培养基体积的1%接种入500L种子罐,培养至对数生长期;1L种子罐培养基中各组分的重量含量为:蛋白胨1%,酵母膏0.5%,氯化钠0.5%,其余去离子水,pH为9.0;培养条件是:培养过程中通无菌空气,每分钟通入的无菌空气与培养基体积之比为1:0.6~1.2,搅拌速度为180~240r/min,培养温度为30℃,培养时间为48~60h;
步骤(3):将步骤(2)的种子液按培养基体积的10%接入生产罐发酵培养;生产罐所用培养基与种子罐培养基相同;培养条件是:培养过程中通无菌空气,每分钟通入的无菌空气与培养基体积之比为1:0.6~1.2,搅拌速度为180~240r/min,培养温度为30℃,培养时间为48~60h;
步骤(4):在生产罐中,当菌体数量达到10亿个/mL以上时发酵结束,发酵完成后培养液出罐,直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂,该液体剂即为菌剂。
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CN106434484B (zh) | 2019-07-09 |
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