CN106432429A

CN106432429A - 一种帕西瑞肽的合成方法

Info

Publication number: CN106432429A
Application number: CN201610926750.0A
Authority: CN
Inventors: 孙良玉; 陈为光; 张旭光; 郑范娜; 郭杰
Original assignee: Guo Tai Bio Tech Ltd Hefei
Current assignee: Guo Tai Bio Tech Ltd Hefei
Priority date: 2016-10-24
Filing date: 2016-10-24
Publication date: 2017-02-22

Abstract

本发明公开一种帕西瑞肽的合成方法，包括如下步骤：以2‑Cl‑Resin为起始树脂载体，选择缩合反应的起始氨基酸，通过固相合成法依次连接帕西瑞肽序列中相对应的氨基酸，得到Fmoc‑帕西瑞肽前体肽Ⅰ‑2‑Cl‑Resin；将Fmoc‑帕西瑞肽前体肽Ⅰ‑2‑Cl‑Resin全保护切割，得到帕西瑞肽前体肽Ⅱ；帕西瑞肽前体肽Ⅱ进行液相环化，得到帕西瑞肽前体肽Ⅲ；帕西瑞肽前体肽Ⅲ进行切割沉降反应，得到帕西瑞肽粗肽产品；帕西瑞肽粗肽产品用反相高效液相色谱法纯化、冻干，得到帕西瑞肽纯品多肽：本发明采用Fmoc固相合成法，大大简化了工艺流程，提高了产品的收率，具有可观的经济适用价值和广泛的应用前景。

Description

一种帕西瑞肽的合成方法

技术领域

本发明属于多肽药物合成的技术领域，特别涉及一种帕西瑞肽的合成方法。

背景技术

中文名：帕西瑞肽

英文名：Pasireotide

结构式：

分子式：C₅₈H₆₆N₁₀O₉

帕西瑞肽(Pasireotide)是一种可注射的环六肽生长抑素类似物,适用于未进行垂体手术或手术未治愈的库欣氏病成年患者的治疗。同奥曲肽相比，帕西瑞肽有更长的半衰期、能与更多受体结合，抑制胰腺分泌，抑制肠道蛋白水解酶的活性，通过这些机制来降低胰腺术后并发症。美国纽约Memorial Sloan-Kettering癌症中心的学者进行了一项研究，提示帕西瑞肽能明显减少胰腺切除术后胰瘘的发生。

现有的帕西瑞肽合成方法产品收率低，副产物多，生产成本高，不利于帕西瑞肽的大规模生产。CN201310370228.5的合成方法中，以空间位阻较大的(4R)-(2-氨基乙基氨基甲酰氧基)-脯氨酰为起始原料与树脂载体缩合，虽然降低了消旋的比率，但同时也大大降低了氨基酸的缩合效率，从源头降低了产品的收率，并且环化方法复杂，周期长，不易中控，容易产生较多的副产物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种帕西瑞肽的合成方法，该合成方法反应条件温和、反应效率高、成本低、具有生产帕西瑞肽粗肽产品的广泛应用前景，以用于大规模生产帕西瑞肽。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种帕西瑞肽的合成方法，包括如下步骤：

(1)以2-Cl-Resin为起始树脂载体，选择缩合反应的起始氨基酸，通过固相合成法依次连接帕西瑞肽序列中相对应的氨基酸，得到Fmoc-帕西瑞肽前体肽Ⅰ-2-Cl-Resin，如下：

Fmoc-(4-Boc-NH-C2H4-NH-CO-O)-Pro-Phg-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Tyr(4-B zl)-Phe-2-Cl-Resin；

(2)将Fmoc-帕西瑞肽前体肽Ⅰ-2-Cl-Resin全保护切割，得到帕西瑞肽前体肽Ⅱ，如下：

(4-Boc-NH-C2H4-NH-CO-O)-Pro-Phg-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Tyr(4-Bzl)-P he；

(3)帕西瑞肽前体肽Ⅱ进行液相环化，得到帕西瑞肽前体肽Ⅲ，产品如下：

(4)帕西瑞肽前体肽Ⅲ进行切割沉降反应，得到帕西瑞肽粗肽产品；

(5)帕西瑞肽粗肽产品用反相高效液相色谱法纯化、冻干，得到帕西瑞肽纯品多肽如下：

步骤(1)所述缩合反应的起始氨基酸为Fmoc-Phe-OH，反应中以DIC/HOBt为缩合剂和活化试剂，以20％Pip/DMF溶液为脱保护试剂，进行多肽的连续缩合反应。

步骤(1)所述固相合成法依次缩合的Fmoc-保护氨基酸为：Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Tyr(4-Bzl)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Phg-OH、Fmoc-(4-Boc-NH-C2H4-NH-CO-O)-Pro-OH，缩合反应中氨基酸投料量为1.5倍所投树脂摩尔数，缩合反应温度为28℃。

步骤(2)所述全保护切割试剂为DCM：TFE＝4：1体积比的混合溶液，反应液体积为反应器容积的1/3-1/2。

步骤(3)所述液相环化的环化液为：样品：HOBT：PyBop：DIEA＝1:1:1.2:3(摩尔比)，环化条件为28℃恒温反应48h后旋蒸冻干。

步骤(4)所述切割沉降反应，所用切割试剂的100ml配方为：95ml TFA+2.5ml H2O+2.5ml TIS，切割液体积为反应器容积的1/2，树脂切割两次，将切割液分别吹入到冰乙醚中，离心沉淀去上清，重复操作3次得到帕西瑞肽粗肽产品。

步骤(5)所述纯化选用C18，5um制备柱进行反相高效液相色谱纯化，以B.Cone/％(2→70)，0→70min的梯度程序进行多肽的分离提纯。

本发明的有益效果：本发明采用Fmoc固相合成法，以2-Cl-Resin为固相载体，以DIC/HOBt为缩合剂，依次缩合帕西瑞肽氨基酸序列中相对应的氨基酸，采用特有的多肽环化技术进行环化，切割沉降、冻干后得到帕西瑞肽纯品多肽；大大简化了工艺流程，提高了产品的收率，具有可观的经济适用价值和广泛的应用前景。

具体实施方式

通过下述实施例将有助于理解本发明，但不能限制本发明的内容。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单替换或推演，都视为属于本发明的保护范围。

实施例一Fmoc-帕西瑞肽前体肽Ⅰ-2-Cl-Resin的合成

1.2-Cl-Resin的溶胀

称量取代度为0.64mmol/g的2-Cl-Resin 1g，从开口端加入至多肽合成反应器中，取DCM试剂加入至反应器中，使树脂完全浸没在DCM溶剂中，与溶剂充分接触，溶胀0.5h。

2.Fmoc-帕西瑞肽前体肽Ⅰ-2-Cl-Resin的合成

Fmoc-帕西瑞肽前体肽Ⅰ-2-Cl-Resin为：

Fmoc-(4-Boc-NH-C2H4-NH-CO-O)-Pro-Phg-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Tyr(4-B zl)-Phe-2-Cl-Resin

本实施例使用的保护氨基酸从树脂起算第1-6个氨基酸相对应的保护氨基酸及分子量如下表所示：

本发明中一些常用的缩写具有以下含义：

Fmoc：芴甲氧羰基

Boc：叔丁氧羰基

4-Bzl：苄基

DMF：N,N-二甲基甲酰胺

DCM：二氯甲烷

Pip：六氢吡啶

TFA：三氟醋酸

TFE：三氟乙醇

TIS：三异丙基硅烷

DIC：N,N-二异丙基碳化二亚胺

DIEA：N,N-二异丙基乙胺

HOBT：1-羟基苯并三唑

PyBop：六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷

(1)Fmoc-Phe-2-Cl-Resin的合成

称取116mg Fmoc-Phe-OH和122mg HOBT放于10ml离心管中，加3ml DCM将其溶解，再用滴管向溶液中加DIEA活化20s，混合均匀。最后将混合液加到抽干的反应器中反应50min。

(2)Fmoc-Phe-2-Cl-Resin的封头反应

配制甲醇：DIEA＝1:1(体积比)的混合液2ml，将其加入到抽干的反应器中，置于20-30r/min的摇床上摇20min。

(3)树脂的洗涤方法

用真空泵将反应器中的脱保护溶液抽干，然后加入1/3-1/2反应器体积的DMF溶液，置于30r/min的脱色摇床上摇1min，抽干反应器中溶液再加入DMF洗涤，重复操作3次。

(4)脱除Fmoc保护基

加入1/3-1/2反应器体积的20％哌啶/DMF脱保护溶液到抽干的反应器中，置于30r/min的脱色摇床上摇晃反应20min。

(5)保护氨基酸的活化方法

以Fmoc-Tyr(4-Bzl)-Phe-2-Cl-Resin的缩合为例，称取585mg Fmoc-Tyr(4-Bzl)-OH和122mg HOBT放于10ml离心管中，加入3mlDMF将其溶解，再用滴管向溶液中加DIC活化20s，混合均匀得到活化的保护氨基酸溶液。

(6)Fmoc-帕西瑞肽前体肽Ⅰ-2-Cl-Resin的合成

将上述活化的保护氨基酸溶液加到抽干的反应器中，再将反应器置于28℃的恒温震荡器中反应30-40min，然后洗涤，脱除Fmoc保护基再洗涤。采用上述同样方法，依次缩合第3-6个Fmoc-保护氨基酸，即得到Fmoc-帕西瑞肽前体肽Ⅰ-2-Cl-Resin。

实施例二帕西瑞肽前体肽的环化

(1)帕西瑞肽前体肽Ⅱ的合成

配置全保护切割试剂DCM：TFE＝4：1(体积比)混合溶液5ml，加入到反应器中摇晃反应40min，转速20r/min，将切割液旋蒸冻干，得到帕西瑞肽前体肽Ⅱ。

(2)配置环化反应液

用DCM分别溶解样品和缩合剂(HOBT、PyBop)，将缩合剂和DIEA缓慢加入到溶解的样品中，混匀。样品：HOBT：PyBop：DIEA＝1:1:1.2:3(摩尔比)。

(3)帕西瑞肽前体肽Ⅲ的环化

将环化反应液置于恒温摇床中反应48h，温度28℃，转速90r/min；然后将反应液旋蒸、冻干，得到帕西瑞肽前体肽Ⅲ。

实施例三帕西瑞肽的合成制备

(1)帕西瑞肽前体肽Ⅲ的切割沉降

配置5ml切割试剂4.75ml TFA+0.125ml H2O+0.125ml TIS，加入到冻干的帕西瑞肽前体肽Ⅲ中，是样品完全溶解，然后置于脱色摇床上摇晃反应30min，速度20r/min。切割结束后，加入约5ml冰乙醚至10ml离心管中，将反应器中溶液经砂芯过滤到冰乙醚中，盖上离心管盖子，上下震荡离心管，混合均匀。将离心管放入离心机中，3000r/min，3min，离心弃上清，重复操作3次得到帕西瑞肽粗肽产品。

(2)帕西瑞肽粗肽的纯化

将样品溶解并过滤，采用流动相：A 0.1％乙酸/水，B 0.1％乙酸/乙腈，在214nm下按照如下程序进样制备纯化：

(3)帕西瑞肽纯品多肽的收率

称量冻干后的帕西瑞肽纯品，质量为1035.3mg，经分析计算，产品纯度为99％，其纯品收率为83.8％，比现有技术仅30-40％的收率有大幅度提高。

以上内容仅仅是对本发明所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种帕西瑞肽的合成方法，其特征在于，该合成方法包括以下步骤：

(1)以2-Cl-Resin为起始树脂载体，选择缩合反应的起始氨基酸，通过固相合成法依次连接帕西瑞肽序列中相对应的氨基酸，得到Fmoc-帕西瑞肽前体肽Ⅰ-2-Cl-Resin；

(2)将Fmoc-帕西瑞肽前体肽Ⅰ-2-Cl-Resin全保护切割，得到帕西瑞肽前体肽Ⅱ；

(3)将帕西瑞肽前体肽Ⅱ进行液相环化，得到帕西瑞肽前体肽Ⅲ；

(4)将帕西瑞肽前体肽Ⅲ进行切割沉降反应，得到帕西瑞肽粗肽产品；

(5)将帕西瑞肽粗肽产品用反相高效液相色谱法纯化、冻干，得到帕西瑞肽纯品多肽。

2.根据权利要求1所述的一种帕西瑞肽的合成方法，其特征在于，步骤(1)所述缩合反应的起始氨基酸为Fmoc-Phe-OH，反应中以DIC/HOBt为缩合剂和活化试剂，以20％Pip/DMF溶液为脱保护试剂，进行多肽的连续缩合反应。

3.根据权利要求1所述的一种帕西瑞肽的合成方法，其特征在于，步骤(1)所述固相合成法依次缩合的Fmoc-保护氨基酸为：Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Tyr(4-Bzl)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Phg-OH、Fmoc-(4-Boc-NH-C2H4-NH-CO-O)-Pro-OH，缩合反应中氨基酸投料量为1.5倍所投树脂摩尔数，缩合反应温度为28℃。

4.根据权利要求1所述的一种帕西瑞肽的合成方法，其特征在于，步骤(2)所述全保护切割试剂为DCM：TFE＝4：1体积比的混合溶液，反应液体积为反应器容积的1/3-1/2。

5.根据权利要求1所述的一种帕西瑞肽的合成方法，其特征在于，步骤(3)所述液相环化的环化液摩尔比为：样品：HOBT：PyBop：DIEA＝1:1:1.2:3，环化条件为28℃恒温反应48h后旋蒸冻干。

6.根据权利要求1所述的一种帕西瑞肽的合成方法，其特征在于，步骤(4)所述切割沉降反应，所用切割试剂的100ml配方为：95ml TFA+2.5ml H₂O+2.5mlTIS，切割液体积为反应器容积的1/2，树脂切割两次，将切割液分别吹入到冰乙醚中，离心沉淀去上清，重复操作3次得到帕西瑞肽粗肽产品。

7.根据权利要求1所述的一种帕西瑞肽的合成方法，其特征在于，步骤(5)所述纯化选用C18，5um制备柱进行反相高效液相色谱纯化，以B.Cone/％(2→70)，0→70min的梯度程序进行多肽的分离提纯。