CN106421380A - 一种治疗肺鳞癌和小细胞肺癌的中药复合物 - Google Patents

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Abstract

本发明之目的就是提供一种治疗肺鳞癌和小细胞肺癌的中药复合物，可有效解决治疗肺鳞癌和小细胞肺癌的用药问题；本发明解决的技术方案是，该中药复合物是由重量百分比计的：重楼3.5%‑14%、蟾皮1.8%‑4.5%、穿山龙7%‑11.00%、椿皮4.9%‑59.1%和山慈菇21%‑28.1%构成的复合物；本发明原料丰富，组方科学，易生产制备，成本低，效果好，有效用于治疗肺鳞癌和小细胞肺癌，是治疗肺癌药物上的创新。

Description

一种治疗肺鳞癌和小细胞肺癌的中药复合物
技术领域
本发明涉及医药，特别是一种治疗肺鳞癌和小细胞肺癌的中药复合物。
背景技术
肺癌是全世界发病率和病死率最高的恶性肿瘤。最新世界癌症报告显示：2012年约有1400万癌症新发病例及800万死亡病例，且2012年中国新增癌症病例306万(约占全球20％)，癌症死亡220万例(约占全球25％)，其中肺癌发病率最高。另据2015年中国癌症数据分析报告显示，肺癌的发病率及死亡率仍居我国癌症第一位，且男性明显高于女性，农村高于城市，西南地区死亡率高于北部和西北部。多数肺癌患者就诊时已属晚期，化疗虽可延长生命，但患者生活及预后质量差。故急需医学界寻找新的治疗思路。
肺癌从病理角度可分为非小细胞肺癌和小细胞肺癌两大类。非小细胞肺癌最多见，约占80％，大多起源于支气管，临床常见病理类型有鳞癌、未分化癌、腺癌及细支气管肺泡癌四种，其中鳞癌最为常见，与吸烟密切相关，但发展速度比较缓慢、病程较长，对放化疗较敏感，在治疗上，肺鳞癌以手术为主，术后放化疗为辅。小细胞肺癌为肺癌的特殊类型，约占肺癌的20％，起源于支气管粘膜或腺上皮内的嗜银细胞，或支气管粘膜上皮中可向神经内分泌分化的干细胞；小细胞肺癌肿瘤细胞生长迅速，易发生转移，常伴内分泌异常或类癌综合症，是一种预后较差的高度恶性肿瘤。由于小细胞肺癌患者早期即发生血行转移且对放化疗敏感，极易出现耐药及复发，因而治疗小细胞肺癌以全身化疗为主，放疗、手术为辅。
中医古籍中关于肺癌并无专一的论述，散见于“肺积”“咳嗽”“咯血”“胸痛”等病证。如《灵枢·百病始生》“积之始生，得寒乃生，厥乃成积矣”，《医宗必读·积聚篇》“积之成也，正气不足，而后邪踞之”等。肺癌的发生不外乎虚、痰、瘀、毒，肿瘤乃正虚与邪毒互相作用的结果，虚实、寒热错杂，湿痰瘀毒胶结，日久形成肿块。
多项研究表明肿瘤生长过程中，生长因子与特异性受体相结合会激活细胞下游信号通路，促使细胞分裂增殖。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)蛋白家族参与细胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖转运等多种细胞功能的调节，其活性的增加常与多种癌症相关，其激活的结果是在质膜上产生第二信使PIP3，它与细胞内含有PH结构域的信号蛋白AKT和PDK1结合，促使PDK1磷酸化AKT蛋白的Ser308导致AKT活化。AKT是PI3K下游主要的效应物，活化的AKT通过磷酸化多种酶、激酶和转录因子等下游因子，进而调节细胞的功能。mTOR是一个关键激酶PI3K的下游，调节肿瘤细胞的增殖、生长、存活和血管生成。已有研究表明PI3K-Akt-mTOR信号通路在肿瘤干细胞的自身修复及抗放、化疗中起着重要作用，被认为是肿瘤治疗失败、复发及转移的根源，故而PI3K-Akt-mTOR信号通路的研究不可忽视。
当前肺癌的患病率及死亡率仍高居不下，其早期诊断还很困难，现有治疗肺癌的多种西药和中药使用疗效并不尽人意，特别是用于治疗肺鳞癌和小细胞肺癌，总体生存率较低。因此，改进肺鳞癌和小细胞肺癌治疗方法和研发创新高效药物势在必行。本研究从临床治疗肺癌的533味有效中药中分别筛选出对人肺鳞癌细胞SK-MES和小细胞肺癌细胞NCI-H69增殖有抑制作用的中药，并通过正交试验设计结合导师经验组成最佳方剂。运用MTT检测、流式细胞术及Western blot分析等技术，观察清热化痰散结方及拆方对人肺鳞癌细胞SK-MES和小细胞肺癌细胞NCI-H69细胞增殖、细胞形态、细胞周期及PI3K-Akt-mTOR信号转导通路的影响，并评价其治疗肺鳞癌和小细胞肺癌的临床疗效，从分子层面初步探讨中医药治疗肺癌的作用机制，为临床治疗肺癌提供高效中医方药。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种治疗肺鳞癌和小细胞肺癌的中药复合物，可有效解决治疗肺鳞癌和小细胞肺癌的用药问题。
本发明解决的技术方案是，该中药复合物是由重量百分比计的：重楼3.5％-14％、蟾皮1.8％-4.5％、穿山龙7％-11.00％、椿皮4.9％-59.1％和山慈菇21％-28.1％构成的复合物。
本发明原料丰富，组方科学，易生产制备，成本低，效果好，有效用于治疗肺鳞癌和小细胞肺癌，是治疗肺癌药物上的创新。
附图说明
图1为本发明重楼抑制SK-MES细胞增殖的量效关系；
图2为本发明蟾皮抑制SK-MES细胞增殖的量效关系；
图3为本发明穿山龙抑制SK-MES细胞增殖的量效关系；
图4为本发明椿皮抑制SK-MES细胞增殖的量效关系；
图5为本发明山慈菇抑制SK-MES细胞增殖的量效关系；
图6为本发明重楼抑制NCI-H69细胞增殖的量效关系；
图7为本发明蟾皮抑制NCI-H69细胞增殖的量效关系；
图8为本发明穿山龙抑制NCI-H69细胞增殖的量效关系；
图9为本发明椿皮抑制NCI-H69细胞增殖的量效关系；
图10为本发明山慈菇抑制NCI-H69细胞增殖的量效关系；
图11为本发明清热方抑制SK-MES细胞增殖量效关系；
图12为本发明化痰方抑制SK-MES细胞增殖量效关系；
图13为本发明散结方抑制SK-MES细胞增殖量效关系；
图14为本发明清热化痰散结方抑制SK-MES细胞增殖量效关系；
图15为本发明清热方抑制NCI-H69细胞增殖量效关系；
图16为本发明化痰方抑制NCI-H69细胞增殖量效关系；
图17为本发明散结方抑制NCI-H69细胞增殖量效关系；
图18为本发明清热化痰散结方抑制NCI-H69细胞增殖量效关系；
图19为本发明各方对SK-MES细胞增殖抑制作用时效曲线对比；
图20为本发明各方对NCI-H69细胞增殖抑制作用时效曲线对比。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式做详细说明，
本发明在具体实施中可由以下实施例给出：
实施例1：本发明治疗肺鳞癌和小细胞肺癌的中药复合物是由重量百分比计的：重楼3.68％、蟾皮1.93％、穿山龙7.28％、椿皮59.02％和山慈菇28.09％组成。
实施例2：本发明治疗肺鳞癌和小细胞肺癌的中药复合物还可由重量百分比计的：重楼13.81％、蟾皮4.49％、穿山龙11.00％、椿皮49.24％和山慈菇21.46％组成。
实施例3：本发明治疗肺鳞癌和小细胞肺癌的中药复合物还可由重量百分比计的：重楼9％、蟾皮3％、穿山龙9％、椿皮54％和山慈菇25％组成。
本发明是运用MTT法分别检测533味中药对人肺癌细胞SK-MES和NCI-H69增殖抑制的作用，筛选出均能抑制两种细胞增殖的药物，根据《中药学》药物功效、正交试验设计结果和临床经验优选出最佳方剂；用倒置显微镜观察各方对人肺癌细胞SK-MES和NCI-H69细胞形态的影响；运用流式细胞术检测各方对人肺癌细胞SK-MES和NCI-H69细胞周期的影响；运用Western blot法分析各方对人肺癌细胞SK-MES和NCI-H69PI3K-Akt-mTOR信号转导通路中PI3K、Akt、mTOR蛋白表达的影响。对纳入研究的60例中晚期肺鳞癌和小细胞肺癌患者随机分为对照组和治疗组各30例，对照组仅采用西医方案化疗，治疗组在对照组的基础上同时给予清热化痰散结方配合治疗。连续治疗3个月后，观察对照组和治疗组患者治疗前后中医症候变化、瘤体变化、中位生存期和1年生存率、生活质量改善以及不良反应发生情况。
①筛选出5味对人肺癌细胞SK-MES和NCI-H69增殖均有抑制作用的药物。②优选出最佳方剂清热化痰散结方。③清热化痰散结方及其拆方均能抑制人肺癌细胞SK-MES和NCI-H69的增殖，以本发明方作用最强，呈剂量依赖和时间依赖关系，对SK-MES细胞增殖抑制作用强弱依次为：本发明方﹥散结方﹥清热方﹥化痰方，对NCI-H69细胞增殖抑制作用强弱依次为：本发明方﹥清热方﹥散结方﹥化痰方。④清热化痰散结方及其拆方对人肺癌细胞SK-MES和NCI-H69的细胞周期都有明显影响。SK-MES和NCI-H69细胞：清热化痰散结方及其拆方S期细胞比率明显增加，SK-MES细胞作用强弱依次为化痰方>清热方>本发明方>散结方，散结方不仅可以作用于S期，还可以作用于G2期；NCI-H69细胞：作用强弱依次为化痰方>清热方>散结方>本发明方，本发明方不仅可以作用于S期，还可以作用于G2期。⑤人肺鳞癌SK-MES和小细胞肺癌NCI-H69中均有PI3K、Akt、mTOR蛋白表达，清热方、化痰方、散结方及本发明方对PI3K、Akt、mTOR蛋白均有不同程度的抑制作用，两种细胞mTOR和PI3K蛋白表达均显示各方效果强弱依次为：本发明方﹥散结方﹥清热方﹥化痰方；两种细胞Akt蛋白表达均显示各方效果强弱依次为：本发明方﹥清热方﹥散结方﹥化痰方。⑥与对照组相比，中药治疗组在中医临床症候疗效、瘤体变化、生活质量、中位生存期、1年生存率、全身状况及对化疗不良反应等方面与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。
①清热化痰散结方及其拆方均能抑制人肺癌细胞SK-MES和NCI-H69的增殖。②清热化痰散结方及其拆方主要将人肺癌细胞SK-MES和NCI-H69阻滞于S期从而抑制细胞增殖。③清热化痰散结方及其拆方均能抑制人肺癌细胞SK-MES和NCI-H69PI3K、Akt、mTOR蛋白的表达，进而抑制人肺癌细胞的增殖。④在肺癌的病变中，热毒、痰浊、瘀结与PI3K-Akt-mTOR信号通路蛋白表达密切相关。⑤清热化痰散结方能够高效治疗中晚期肺鳞癌和小细胞肺癌患者，在提高疗效，缩小或抑制肿瘤病灶，改善临床症状和生活质量，延长生存期等方面都具有较好的作用。也就是说本发明是申请人经科学研究、试验和对实践总结作出的创造性劳动结晶，具体有关资料如下：
1材料
1.1实验材料
1.1.1实验药物
533味候选中药全部购自河南中医学院第三附属医院，经鉴定为正品。
1.1.2细胞株
人肺鳞癌细胞株SK-MES、小细胞肺癌NCI-H69购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。
1.1.3主要试剂
95％乙醇(分析纯)(天津市科密欧化学试剂开发中心)、胎牛血清(PAA公司)、MEM培养基、1640培养基(GIBCO公司)、MTT、DMSO(Amresco公司)、细胞周期检测试剂盒(南京凯基公司)；Anti-PI3K(韩国浦项科技大学信号传导实验室惠赠)、Anti-Akt、Anti-mTOR(兔抗人多克隆抗体，Abgent公司)、山羊抗小鼠IgG-HRP、山羊抗兔IgG-HRP(北京博奥森公司)、硝酸纤维素膜(Bio-Rad公司)、ECL发光试剂盒(Santa Cruze公司)。其它化学试剂均为分析纯，商业购得。
1.1.4主要仪器
Heraeus细胞培养箱(Kendro公司)、倒置显微镜(Zeiss公司)、ROTINA 35型离心机(Hettich公司)、RE-52AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)、DK-S24型电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)、超纯水制备器(LABCONCO公司)、ELx800型酶标仪(BIO-TEK公司)、BioMate紫外可见分光光度计(Thermo公司)、蛋白电泳系统(BIO-RAD公司)、FACSCalibur流式细胞仪(BD公司)。
1.2临床资料
观察病例为2014年3月-2016年3月河南中医学院第三附属医院收治的中晚期肺鳞癌和小细胞肺癌患者60例，所有患者符合卫生部《中国常见恶性肿瘤诊治规范》肺癌的诊断标准和国际肺癌研究中心(IASLC)制定的第七版国际肺癌TNM分期标准；排除标准：患者不能合作或不能坚持治疗者；肺癌脑转移者；哺乳期妇女；患精神障碍疾病者；有严重心、肝、肾等脏器功能衰竭者；合并活动性结核及其他严重感染性疾病者；过敏体质及对多种药物过敏者。采用随机数字表法将患者分为对照组和治疗组各30例，其中治疗组男20例，女10例，平均年龄56.82±13.63岁，肺鳞癌18例，小细胞肺癌12例；对照组男22例，女8例，年龄54.43±12.36岁，肺鳞癌20例，小细胞肺癌10例。两组在性别、年龄等一般资料方面比较差异无统计学意义﹙P>0.05﹚，具有可比性。
2方法
2.1药物制备
2.1.1药物提取：每味候选中药各50克，250ml 95％乙醇浸泡，避光保存，每天摇晃1～2次，浸泡7天后开始提纯药物：用过滤漏斗真空抽滤药液，将过滤的药液用旋转蒸发仪(58℃)浓缩至50ml左右，浓缩后的药液倒入坩埚中，置58℃恒温水浴锅上继续浓缩，待药液无乙醇味呈膏状放入真空干燥箱干燥(58℃)，收集各药的干燥醇提物并用十万分之一天平称量，装入1.5ml离心管内，进行标记(药物名称、净重及称量时间)，置于-20℃冰箱内保存备用。
2.1.2药物配制
取适量(0.2g～0.3g)醇提药物干燥物，溶解于二甲基亚砜(DMSO)，制成浓度为300ug/ul的药液，放在振荡器上震荡至完全溶解，再分别用不含血清的MEM或RPMI1640培养基稀释成浓度为4000μg/ml的贮存液1.5ml，0.22μm滤膜过滤，做好药物名称及不同培养基的标记，放于-20℃冰箱保存备用。
2.2细胞培养
从液氮中迅速取出冻存的细胞株SK-MES和NCI-H69，1min内水浴使之快速解冻。吸出细胞悬液转移到15ml离心管中，分别补加10ml MEM或RPMI1640培养基，吹打混匀，1000rpm×10min离心，弃上清，加入不含血清的培养基5ml，吹打混匀，细胞计数，SK-MES细胞用含10％胎牛血清的MEM培养基以0.75×106个细胞/皿(10ml细胞悬液)接种于培养皿中，NCI-H69细胞用含10％胎牛血清的RPMI1640培养基以2×106个细胞/瓶(20ml细胞悬液)接种于75ml细胞培养瓶中，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养。SK-MES细胞3～4天传代1次，NCI-H69细胞2～3天传代1次。
2.3MTT法检测细胞增殖活性
用MTT法检测单味药及组方后的清热化痰散结方及其拆方对SK-MES和NCI-H69细胞增殖抑制的量效和时效关系。
2.3.1单味药的筛选及其量效关系检测
SK-MES细胞：取对数生长期的细胞，以0.75×106个/板的细胞密度接种于96孔平面培养板，200μl/孔，置于37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中培养，细胞贴壁24h后，弃上清，分别加入各备选药物(各药物浓度均为100μg/ml)，200μl/孔，每个药物3个复孔，同时加入含10％胎牛血清的MEM培养基200μl/孔。继续培养48h后，弃上清，每孔加入100μl含10％MTT的MEM培养基，放置培养箱4个小时后，弃孔内上清，每孔加入150μl DMSO，放置于摇床上晃动15分钟待孔内台盼蓝充分溶解混匀后用酶标仪(波长设置为570nm/630nm)测光吸收值(即OD值)，将结果输入excel表格，按照公式计算：抑制率(％)＝(1-加药组OD值/对照组OD值)×100％，计算出各药物对SK-MES细胞的抑制率，得出抑制率高的药物。
NCI-H69细胞：以2×106个/板的细胞密度接种于96孔平面培养板，每孔100μl，放置培养箱平衡30分钟后加入备选药物(各药物浓度均为100μg/ml)，100μl/孔，每个药物3个复孔，同时设空白对照组3个复孔加入含10％胎牛血清的RPMI1640培养基100μl/孔，置于37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中培养48h后，1000rpm×10min离心，弃上清，每孔加入100μl含10％MTT的RPMI1640培养基，放置培养箱4个小时后，1000rpm×10min离心，弃上清，每孔加入150μl DMSO，放置于摇床上晃动15分钟待孔内台盼蓝充分溶解混匀后用酶标仪(波长设置为570nm/630nm)测光吸收值(即OD值)，按上述公式计算出各药物对NCI-H69细胞的抑制率，得出抑制率高的药物。
将初筛的抑制率高的药物再次进行复筛直至结果稳定，选取均能明显抑制两种细胞增殖且抑制率稳定的5味药物分别进行浓度梯度量效实验，按照上述抑制率计算公式求得各浓度组抑制率，运用excel表格的绘图功能及SPSS18.0软件绘制量效关系曲线图，求得对两种细胞均有明显抑制作用药物的IC50值。
2.3.2通过正交试验确定组方
根据《中药学》每味中药的功效、性味，对SK-MES和NCI-H69细胞增殖均有较强抑制作用的5味中药初步分为三组：清热方(重楼、蟾皮)，化痰方(穿山龙、椿皮)，散结方(山慈菇)。根据初步分组进行正交实验设计，以对SK-MES和NCI-H69抑制率均较高的5味中药的IC50值为各药的实验浓度，选出效果最好的药物组合方案作为本发明方组合。
2.3.3清热化痰散结方及其拆方对肺癌细胞SK-MES和NCI-H69量效关系检测
清热化痰散结方及其拆方分别以其单味药IC50值的0.0625，0.125，0.25，0.5，1，2，4倍共8个浓度进行配制后分别作用于两种细胞，设置对照组，每组3个复孔，通过MTT法检测量效关系，绘制量效、拟合曲线，并求得两种细胞清热化痰散结本发明方及拆方组的IC50值。
SK-MES细胞本发明方的最高浓度为单味药IC50值的1倍，倍比稀释8个浓度，NCI-H69细胞本发明方的最高浓度为单味药IC50值的2倍，倍比稀释8个浓度进行实验，两种细胞的清热方、化痰方、散结方的最高浓度为单味药IC50值的4倍，倍比稀释8个浓度。
2.3.4清热化痰散结方及其拆方对肺癌细胞SK-MES和NCI-H69时效关系检测
以清热化痰散结方及其拆方的IC50浓度分别作用于两种细胞，设对照组，每组3个复孔，运用MTT检测法检测5个不同时间点(12h、24h、36h、48h和72h)各组对细胞的抑制率，绘制时效曲线。
2.3.5倒置显微镜下观察清热化痰散结方及其拆方对肺癌细胞SK-MES和NCI-H69细胞形态影响
SK-MES细胞以0.75×106个细胞/皿接种于Φ10cm培养皿，NCI-H69细胞以2×106个细胞/皿接种于Φ10cm培养皿内，均设置空白对照组、清热方、化痰方、散结方、清热化痰散结本发明方5组，置于37℃，5％CO2饱和湿度的培养箱中培养24小时后，以各治法组IC50值的药物浓度处理细胞，空白对照组加入新的含10％胎牛血清的MEM或RPMI1640培养基。继续培养48小时后，于倒置显微镜下观察细胞的生长形态，并对每组细胞镜下拍照。
2.4清热化痰散结方及其拆方对肺癌细胞SK-MES和NCI-H69细胞周期影响
SK-MES和NCI-H69细胞接种及各组处理同上2.3.5。SK-MES细胞加药继续培养48小时后，弃上清，PBS清洗细胞两次，每皿加3ml 0.25％胰蛋白酶消化，3～5分钟后倒置显微镜下观察细胞开始脱壁，加3ml含血清培养基终止消化，将细胞悬液转至15ml离心管内进行离心，2000rpm/min，5min，弃上清；NCI-H69细胞加药继续培养48小时后，将细胞悬液转至50ml离心管内进行离心，2000r/min，5min，弃上清。之后两种细胞分别按细胞周期试剂盒步骤要求处理细胞，最后300目尼龙滤膜直接过滤到流式检测管中，每样本获取2×104个细胞荧光信号，激发波长488nm，用CellQuest Pro获取、MODFIT软件检测SK-MES和NCI-H69细胞周期分布。
2.5Western-blot法分析清热化痰散结方及其拆方对人肺癌细胞SK-MES和NCI-H69PI3K、Akt、mTOR蛋白表达影响
SK-MES和NCI-H69细胞接种及各组处理同上2.3.5。SK-MES细胞加药继续培养48小时后，弃上清，收获细胞；NCI-H69细胞加药继续培养48小时后，将细胞悬液转至50ml离心管内进行离心，弃上清，收获细胞。两种细胞分别提取蛋白，Bradford法测蛋白浓度，20ug/孔上样，SDS-PAGE凝胶电泳，转至硝酸纤维素膜，封闭1h，加入一抗反应4h，洗涤30min，加入二抗反应2h，洗涤30min，用增强化学发光(ECL)试剂曝光、显影、定影、洗片，重复3次。
2.6治疗方法和疗效评价
2.6.1治疗方案
对照组：化疗方案：肺鳞癌选用TP方案(紫杉醇135mg/m2，d1；顺铂75mg/m2，d1、2、3)；小细胞肺癌采用EP方案(DDP 60mg/m2，d1；VP-16 120mg/m2，d1、2、3)。以21d为1个周期，连用4个周期。治疗组：从化疗第1天开始给予清热化痰散结方治疗，并随症加减。中药均购自河南中医学院第三附属医院，水煎温服，每日1剂，分2次，每次约150-180mL，连服4个周期。两组在治疗期间均不使用其他抗肿瘤药物。
2.6.2疗效评价
(1)中医症候变化：参照卫生部《中药新药临床研究指导原则(试行)》制定症状分级量化：①显效：症状总积分比治疗前积分减少≥70％；②有效：症状总积分比治疗前积分减少≥30％而<70％；③无效：症状总积分比治疗前积分减少<30％或者增加。(2)瘤体变化：根据WHO实体瘤疗效评价标准(RECIST)分为：①完全缓解(CR)；②部分缓解(PR)；③稳定(SD)；④进展(PD)，其中CR+PR为有效(RR)。(3)中位生存期和1年生存率：按月计算，患者以确诊时间为起点，终点为随访结束(2016年3月)、失访或死亡时间。(4)生活质量状况：按卡氏评分标准计分：①改善：治疗后增加≥10分；②降低：较治疗前减少≥10分；③稳定：较治疗前增加或减少<10分。(5)全身状况及对化疗不良反应评价：主要观察咳嗽、气急、胸痛、发热、神疲乏力、食欲不振、自汗或盗汗等的变化。观察化疗后患者出现恶心、呕吐、头晕、头痛、肝功能异常、肾功能异常等不良反应的发生率。
3统计学处理
本研究数据用SPSS18.0统计软件，采用回归分析或曲线拟合(R2值)、方差分析进行统计学分析。临床疗效评价数据分析，符合参数检验条件者，计量资料用t检验，计数资料用χ2检验，不符合参数检验条件者，采用秩和检验。生存率按寿命表法计算，生存期按时序检验法比较。
1最佳抑制肺癌细胞增殖的药物
运用MTT检测法，将533味中药以100ug/ml的药物浓度分别作用于人肺癌细胞SK-MES和NCI-H69，筛选出对SK-MES及NCI-H69细胞增殖均有最佳抑制作用的药物有重楼、蟾皮、穿山龙、椿皮、山慈菇。
2单味药对SK-MES、NCI-H69细胞增殖抑制作用的量效关系
MTT法测定5种药物不同浓度分别对SK-MES和NCI-H69细胞增殖的抑制率。运用excel绘图工具绘制量效关系曲线，并依据SPSS18.0软件求出单味药的IC50值，见表1～表2。以单味药的浓度为横坐标，以不同浓度的该药对SK-MES和NCI-H69细胞增殖的抑制率为纵坐标，进行绘图表示见图1～图10。
表1 5种药物不同浓度对SK-MES细胞增殖的影响
表2 5种药物不同浓度对NCI-H69细胞增殖的影响
运用SPSS软件的回归分析，求得：
SK-MES细胞各药物的IC50值分别为：重楼12.157ug/ml、蟾皮6.37ug/ml、穿山龙24.025ug/ml、椿皮194.878ug/ml、山慈菇为92.768ug/ml。
NCI-H69细胞各药物的IC50值分别为：重楼39.182ug/ml、蟾皮12.726ug/、穿山龙31.193ug/ml、椿皮139.674ug/ml、山慈菇为60.875ug/ml。
3正交试验设计方案及结果
SK-MES与NCI-H69细胞的正交试验设计方案及步骤相同：将重楼、蟾皮、穿山龙、椿皮、山慈菇5味中药按功效组成清热化痰散结方，该方分成3组：清热方(重楼、蟾皮)；化痰方(穿山龙、椿皮)；散结方：(山慈菇)。选用L27(313)正交表安排实验(见表3)。共得27次实验方案：根据正交试验设计，需作27次实验，具体试验方案安排及结果如下(见表4～7)：1重楼、穿山龙、山慈菇，2重楼、穿山龙，3重楼、穿山龙、山慈菇，4重楼、椿皮、山慈菇，5重楼、椿皮，6重楼、椿皮、山慈菇，7重楼、椿皮、穿山龙、山慈菇，8重楼、椿皮、穿山龙，9重楼、椿皮、穿山龙、山慈菇，10蟾皮、穿山龙、山慈菇，11蟾皮、穿山龙，12蟾皮、穿山龙、山慈菇，13蟾皮、椿皮、山慈菇，14蟾皮、椿皮，15蟾皮、椿皮、山慈菇，16蟾皮、椿皮、穿山龙、山慈菇，17蟾皮、椿皮、穿山龙，18蟾皮、椿皮、穿山龙、山慈菇，19重楼、蟾皮、穿山龙、山慈菇，20重楼、蟾皮、穿山龙，21重楼、蟾皮、穿山龙、山慈菇，22重楼、蟾皮、椿皮、山慈菇，23重楼、蟾皮、椿皮，24重楼、蟾皮、椿皮、山慈菇，25重楼、蟾皮、椿皮、穿山龙、山慈菇，26重楼、蟾皮、椿皮、穿山龙，27重楼、蟾皮、椿皮、穿山龙、山慈菇。每组方案设置3个复孔作用于SK-MES细胞，并设置三个复孔为空白对照组，加药后48小时用MTT法检测OD值，观察药物间的协同作用关系，利用方差分析，结合导师司富春教授的经验筛选出最佳组合方案。
表3清热化痰散结方对SK-MES、NCI-H69细胞的正交试验因素水平表
表4清热化痰散结方对SK-MES细胞正交试验设计方案及结果
表5清热化痰散结方对SK-MES细胞的正交试验方差分析表
由方差分析可知A、B、C是结果的主要影响因子，因素影响大小依次为B>A>C>BC>ABC>AC>AB，结合表4SK-MES细胞的正交试验结果及导师司富春教授的经验得出最佳组合为清热化痰散结本发明方。
表6清热化痰散结方对NCI-H69细胞的正交试验设计方案及结果
表7清热化痰散结方对NCI-H69细胞的正交试验方差分析表
由方差分析可知A、B、C是结果的主要影响因子，因素影响大小依次为A≥B≥C＞BC＞AC＞ABC＞AB，结合表6NCI-H69细胞及导师司富春教授的经验得出最佳组合为清热化痰散结本发明方。
4清热化痰散结方及其拆方对SK-MES、NCI-H69细胞增殖抑制的量效关系
分别以各方的浓度(单味药IC50值的倍数)为横轴，以药物对SK-MES、NCI-H69细胞增殖的抑制率为纵轴，绘制量效曲线见图11～图18，并计算出SK-MES、NCI-H69细胞各治法组的IC50值。清热化痰散结方及其拆方能够不同程度地抑制SK-MES、NCI-H69细胞增殖，且其对SK-MES、NCI-H69细胞的抑制作用随着药物浓度的升高而增强，表现出明显的量效依赖，见表8～表9。
运用SPSS软件的回归分析，求得：SK-MES细胞清热方、化痰方、散结方、本发明方的IC50值分别是各治法组单味药IC50值的0.283倍、0.854倍、0.223倍、0.13倍。根据该结果可以看出各组对细胞增殖抑制强弱为：本发明方﹥散结方﹥清热方﹥化痰方。
运用SPSS软件的回归分析，求得：NCI-H69细胞清热方、化痰方、散结方、本发明方的IC50值分别是各治法组单味药IC50值的0.219倍、0.44倍、0.332倍、0.106倍。根据该结果可以看出各组对细胞增殖抑制强弱为：本发明方﹥清热方﹥散结方﹥化痰方。
表8各方对人肺鳞癌SK-MES细胞增殖抑制作用的量效关系
表9各方对小细胞肺癌NCI-H69细胞增殖抑制作用的量效关系
5清热化痰散结方及其拆方对SK-MES、NCI-H69细胞增殖抑制的时效关系
清热化痰散结方及其拆方对人肺癌细胞SK-MES和NCI-H69增殖抑制作用的时效关系见表10～表11，图19～图20。
表10各方对SK-MES细胞增殖抑制作用的时效关系
由表10、图19可以看出各方对肺鳞癌SK-MES细胞株的抑制作用随着时间的增长而增强，不同药物在不同时段表现出明显的时效依赖。清热方在初始时抑制率较强，但增势缓慢，增势主要在36h～72h之间，其余各方增势主要在24h～72h之间，化痰方增势最为显著，其次本发明方，再者散结方。
表11各方对NCI-H69细胞增殖抑制作用的时效关系
由表11和图20可以看出各方对小细胞肺癌NCI-H69细胞株的抑制作用随着时间的增长而增强，不同药物在不同时段表现出明显的时效依赖。清热方与化痰方在12h～36h之间时增势缓慢，在36h～72h是增势开始升高；散结方及本发明方在24h以后增势就开始升高，其中散结方更为显著。
6清热化痰散结方及其拆方对SK-MES、NCI-H69细胞细胞形态的影响
肺鳞癌SK-MES细胞：空白对照组细胞呈梭型贴壁生长，分布均匀，细胞数量较多；各方对SK-MES细胞均有抑制作用，细胞数量少于空白对照组，且不同程度地漂有死细胞。清热方细胞呈梭形生长，细胞间接触松散，细胞皱缩。化痰方细胞呈梭形生长，形态变小，细胞间隙变大；散结方细胞较对照组偏小，部分细胞膜皱缩发泡且细胞透光度增高，死细胞较多；本发明方细胞数目有所减少，细胞间隙变大，细胞出现皱缩。
小细胞肺癌NCI-H69细胞：观察可见空白对照组细胞悬浮聚团生长，细胞数量较多；各方对NCI-H69细胞均有抑制作用，细胞数量少于空白对照组，细胞聚团生长较对照组少，单个细胞存在现象较为普遍，死细胞较多，其中散结方的细胞偏小。
7清热化痰散结方及其拆方对SK-MES、NCI-H69细胞细胞周期的影响
表12不同方对SK-MES细胞细胞周期(FCM)的影响
由表12可以看出，与空白对照组相比，清热方、化痰方、散结方及本发明方G1期的细胞百分比均下降，化痰方下降最为明显；S期的细胞百分比均升高，其中化痰方最为明显，清热方次之，之后依次是散结方、本发明方；G2期除清热方下降明显外，其余无明显变化。提示清热化痰散结方及其拆方主要将SK-MES细胞阻滞于S期从而抑制细胞增殖，抑制作用强弱依次为化痰方>清热方>本发明方>散结方。
表13不同方对NCI-H69细胞细胞周期(FCM)的影响
由表13可以看出，与空白对照组相比，清热方、化痰方、散结方及本发明方G1期的细胞百分比均下降，化痰方下降最为明显；S期的细胞百分比均升高，其中化痰方最为明显，其次是清热方，之后是散结方、本发明方；G2期除化痰方下降明显、本发明方略有升高外，其余两组无明显变化(细胞周期图见附录2图16-20)。提示清热化痰散结方及其拆方主要将NCI-H69细胞阻滞于S期从而抑制细胞增殖，抑制作用强弱依次为化痰方>清热方>散结方>本发明方。
8清热化痰散结方及其拆方对SK-MES、NCI-H69细胞PI3K、Akt、mTOR蛋白表达影响
查阅Pubmed关于肺癌细胞SK-MES和NCI-H69磷脂酶信号转导通路研究的相关文献，得知二种细胞内均有Akt、mTOR、PI3K蛋白表达，其分子量依次为55KD、283KD、85KD。
8.1清热化痰散结方及其拆方对人肺癌细胞SK-MES PI3K、Akt、mTOR蛋白表达的影响
用各方IC50值的药物浓度分别作用于SK-MES细胞48小时，与空白对照组相比，各方对SK-MES细胞中的PI3K、Akt、mTOR蛋白表达均有不同程度的抑制作用，对PI3K蛋白表达作用强弱依次为：本发明方>散结方>清热方>化痰方，对Akt蛋白表达作用强弱依次为：本发明方>清热方>散结方>化痰方，对mTOR蛋白表达作用强弱依次为：本发明方>散结方>清热方>化痰方。
8.2清热化痰散结方及其拆方对人肺癌细胞NCI-H69PI3K、Akt、mTOR蛋白表达的影响
用各方IC50值的药物浓度分别作用于NCI-H69细胞48小时，与空白对照组相比，各方对NCI-H69细胞中的PI3K、Akt、mTOR蛋白表达均有不同程度的抑制作用，对PI3K蛋白表达作用强弱依次为：本发明方>散结方>清热方>化痰方，对Akt蛋白表达作用强弱依次为：：本发明方>清热方>散结方>化痰方，对mTOR蛋白表达作用强弱依次为：本发明方>散结方>清热方>化痰方。
9清热化痰散结方对肺鳞癌和小细胞肺癌的临床疗效评价
9.1中医症候疗效
两组治疗后中医临床症状总有效率比较，治疗组优于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表14。
表14中医临床症状疗效比较
注：与对照组比较，*P<0.05，表15-表17同此。
9.2瘤体情况变化
两组治疗前后实体瘤近期疗效有效率比较，治疗组优于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表15。
表15实体瘤近期疗效比较
9.3中位生存期和1年生存率
两组生存率比较，治疗组优于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表16。
表16中位生存期和1年生存率比较
9.4生活质量状况
两组治疗后生存质量提高稳定率(提高+稳定)比较，治疗组高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表17。
表17生活质量比较
9.5全身状况及对化疗不良反应比较
与治疗组治疗前及对照组治疗后比较，治疗组治疗前出现的食欲不振、咳嗽、气急、胸痛、发热、神疲乏力、自汗或盗汗等症状明显改善，均有显著性差异(P＜0.05)；治疗组不良反应发生率为26.7％(8/30)，对照组不良反应发生率为50.0％(15/30)，与对照组比较，治疗组不良反应发生率明显低于对照组差异有显著统计学意义(P＜0.05)，提示治疗组患者对化疗的耐受力优于对照组患者。
结论：
1抑制肺癌细胞株SK-MES和NCI-H69细胞增殖的中药筛选
将533味中药以100ug/ml的药物浓度分别作用于人肺癌细胞SK-MES和NCI-H69，MTT法检测得出重楼、蟾皮、穿山龙、椿皮、山慈菇均能最佳抑制SK-MES和NCI-H69细胞增殖。
2清热化痰散结方的方义和临床疗效分析
根据《中药学》的药物功效、正交试验结果及临床经验，将对SK-MES细胞株和NCI-H69细胞株最佳抑制作用的重楼、蟾皮、穿山龙、椿皮、山慈菇5味药物进行组方，命名为清热化痰散结方，该方分为清热方(重楼、蟾皮)、化痰方(穿山龙、椿皮)及散结方(山慈菇)。
在这个清热化痰散结方中，共涵盖了5味中药：重楼清热解毒；蟾皮清热解毒；穿山龙清肺化痰、祛湿通络；椿皮清热燥湿兼止血；山慈菇清热解毒、消痈散结。肺癌早期症状有刺激性干咳，咳痰，痰中带血，胸痛、胸闷、气急，晚期症状为反复发作咳嗽，发热，胸痛，咯血，喘鸣，食欲减退，消瘦。咳黏液痰且痰中带血，可见血、热焦灼；痰阻胸中，气机不畅，不通则痛，导致胸闷、胸痛、气急。中医讲肺为贮痰之器，痰积聚日久易化热成块，此清热化痰散结方，清热、化痰、散结药物相配伍，可清热解毒、化痰通络、散结消痈，故而该方可有效治疗肺癌，缩小或抑制肿瘤病灶，改善临床症状，副作用少，减轻肿瘤给患者带来的痛苦，提高患者的生活质量，延长生存期。
3清热化痰散结方及其拆方对SK-MES、NCI-H69细胞量效和时效的影响
分别用清热化痰散结方及其拆方作用于人肺癌细胞SK-MES和NCI-H69 48小时后，结果表明各方对人肺癌细胞SK-MES和NCI-H69的增殖抑制作用随着药物浓度的增加而增强，呈现剂量依赖，其中本发明方对细胞增殖的抑制作用最强，表明了各药物对细胞的增殖抑制表现出协同作用。
SK-MES细胞：清热方、化痰方、散结方、本发明方的IC50值分别是各治法组单味药IC50值的0.283倍、0.854倍、0.223倍、0.13倍，作为后续实验的工作浓度，各方对细胞增殖抑制强弱为：本发明方﹥散结方﹥清热方﹥化痰方；NCI-H69细胞：清热方、化痰方、散结方、本发明方的IC50值分别是各治法组单味药IC50值的0.219倍、0.44倍、0.332倍、0.106倍，作为后续实验的工作浓度，各方对细胞增殖抑制强弱为：本发明方﹥清热方﹥散结方﹥化痰方。
清热化痰散结方及其拆方对肺癌细胞SK-MES和NCI-H69增殖抑制作用均随时间的增加而升高，呈现时效依赖，为临床用药提供了依据。
SK-MES细胞：清热方在初始时抑制率较强，但增势缓慢，增势主要在36h～72h之间，其余各方增势主要在24h～72h之间，化痰方增势最为显著，其次本发明方、散结方，到72h时，四方的抑制率较为接近；NCI-H69细胞：清热方与化痰方在12h～36h之间时增势缓慢，在36h～72h是增势开始升高；散结方及本发明方在24h以后增势就开始升高，其中散结方更为显著，到72h时，四方的抑制率均较为接近。
4清热化痰散结方及其拆方对SK-MES、NCI-H69细胞细胞形态的影响
该清热化痰散结方及其拆方分别作用于两种细胞后，细胞形态变化有所异同。肺鳞癌为贴壁细胞，肉眼镜下观较易看出其差异，但由于悬浮细胞聚团生长，故而肉眼镜下观其更大的差异不易看出，但就其整体而言，细胞聚团生长的减弱、单个细胞散在存在的情况是其共同现象。表明不同药物组抑制肺鳞癌及小细胞肺癌生长的作用机制有所差异，同时也说明热毒、痰浊、瘀结在肺鳞癌及小细胞肺癌发生过程中有着不可忽视的重要作用。
5清热化痰散结方及其拆方对SK-MES、NCI-H69细胞细胞周期的影响
SK-MES和NCI-H69细胞周期检测结果表明清热化痰方主要将这两种细胞阻滞于S期从而抑制肿瘤细胞的生长，对SK-MES细胞作用强弱依次为化痰方>清热方>本发明方>散结方，对NCI-H69作用强弱依次为化痰方>清热方>散结方>本发明方。
对SK-MES和NCI-H69两种细胞而言，化痰方及清热方均主要作用于S期，对于SK-MES细胞，散结方不仅可以作用于S期，还可以作用于G2期，对于小细胞肺癌，本发明方不仅可以作用于S期，还可以作用于G2期。可见，不同药物组分能作用在不同的细胞周期，但主要是作用于S期阻止DNA的合成，抑制肿瘤细胞的生长致其凋亡。不同药物组抑制细胞周期中的不同时相，为中医药对肿瘤治疗寻找新的药物作用靶点提供了更多的可能性。
6清热化痰散结方及其拆方对SK-MES、NCI-H69细胞PI3K、Akt、mTOR蛋白表达的影响
多项研究数据表明PI3K-Akt-mTOR信号通路在肿瘤干细胞的自身修复及抗放、化疗中起着重要作用，这被认为是治疗失败、复发及转移的根源。研究肺癌中PI3K-Akt-mTOR信号传导变化，对于探讨肺癌分子病机具有重要意义。本发明方作用于肺癌细胞SK-MES和NCI-H69 48小时后，运用Western blot分析法，与空白对照组相比，各方对SK-MES和NCI-H69细胞中的PI3K、Akt、mTOR蛋白表达均有不同程度的抑制作用。SK-MES和NCI-H69细胞中PI3K蛋白表达结果表明：各方作用强弱依次为：本发明方>散结方>清热方>化痰方；SK-MES和NCI-H69细胞中Akt蛋白表达结果表明：各方作用强弱依次为：本发明方>清热方>散结方>化痰方；SK-MES和NCI-H69细胞中mTOR蛋白表达结果表明：各方作用强弱依次为：本发明方>散结方>清热方>化痰方。由以上结果可以推断出肺癌中的热毒、痰浊、瘀结与这些蛋白的表达相关，且抑制肿瘤生长的作用机制有所不同。
从而充分证明本发明能有效抑制人肺癌细胞SK-MES和NCI-H69的增殖；将人肺癌细胞SK-MES和NCI-H69阻滞于S期从而抑制细胞增殖；能抑制细胞PI3K、Akt、mTOR蛋白的表达，进而抑制肿瘤细胞的增殖，在肺癌的病变中，热毒、痰浊、瘀结与PI3K-Akt-mTOR信号表达及转导的增强密切相关；能够高效治疗中晚期肺鳞癌和小细胞肺癌患者，在提高疗效，缩小或抑制肿瘤病灶，改善临床症状和生活质量，延长生存期，是治疗肺鳞癌和小细胞肺癌上的创新，经济和社会效益巨大。

Claims (4)

1.一种治疗肺鳞癌和小细胞肺癌的中药复合物，其特征是：是由重量百分比计的：重楼3.5%-14%、蟾皮1.8%-4.5%、穿山龙7%-11.00%、椿皮4.9%-59.1%和山慈菇21%-28.1%构成的复合物。
2.根据权利要求1所述的治疗肺鳞癌和小细胞肺癌的中药复合物，其特征是：是由重量百分比计的：重楼3.68%、蟾皮1.93%、穿山龙7.28%、椿皮59.02%和山慈菇28.09%组成。
3.根据权利要求1所述的治疗肺鳞癌和小细胞肺癌的中药复合物，其特征是：是由重量百分比计的：重楼13.81%、蟾皮4.49%、穿山龙11.00%、椿皮49.24%和山慈菇21.46%组成。
4.根据权利要求1所述的治疗肺鳞癌和小细胞肺癌的中药复合物，其特征是：是由重量百分比计的：重楼9%、蟾皮3%、穿山龙9%、椿皮54%和山慈菇25%组成。
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