CN106390186B - 止血组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及粉末形式的止血组合物，其包含原纤维型的胶原，所述胶原包含按相对于胶原的总重量的重量计至少70％的纤维胶原和/或原纤维胶原的含量，和至少一种单糖，以及任选地至少一种选自凝血因子和糖胺聚糖的化合物。本发明还涉及用于制备这类组合物的方法，和涉及包含这类组合物和喷雾设备的单元。

Description

止血组合物

本发明是申请日为2012年04月26日，申请号为201280031849.4，发明名称为止血组合物的中国发明专利申请的分案申请。

发明领域

本发明涉及止血组合物的领域，涉及具体化合物或组合物作为止血剂的用途，涉及用于制备止血组合物的方法，和涉及止血的方法。

技术背景

伤口，无论是在外部还是内部，创伤还是外科手术所致的，都经常导致流血。这类流血可大致是显著的。流血是通过一组称作“止血”的生理现象而被预防和停止。止血帮助修复血管破损和在一般情况下，确保维持脉管和组织完整性。

当血管受伤时，会触发一个包含多个阶段的天然机制以阻止血流。首先，血管收缩(vasoconstriction)，其使得流血减速，持续15到60秒并诱导复杂级联的反应。在血小板血栓(platelet plug)周围形成由纤维蛋白(fibrin)构成的纤维网状物(fibrous mesh)：最终的血栓形成并受保护以防被第十三因子(factor XIII)中途溶解，这稳定化了纤维蛋白。最后，纤维蛋白网状物收紧(缩进(retraction))，且伤口的边缘汇聚：伤口收缩。在稳定、交联的纤维蛋白内，成纤维细胞可以随即生长并组织成为血栓中的连接的基质(conjunctivematrix)，并最终封闭伤口。

在循环的血液中不存在固体纤维蛋白；如果存在，其会立即堵塞至关重要的血管。然而，纤维蛋白的前体，纤维蛋白原(fibrinogen)是存在的。在凝血酶(thrombin)的作用下，纤维蛋白原被转化为可溶性的纤维蛋白，其中所述凝血酶的合成由凝血因子活化。

最后，在伤口成功愈合后的几天或几周，纤维蛋白簇(fibrin cluster)在血纤蛋白溶解期间被破坏。

尽管存在该生物化学现象，但是，经常，特别是在伤口太大或是弥漫性出血(diffuse bleeding)的情况下，有必要“人工”进行止血。

存在帮助获得止血的“机械性”解决方案，如按压、绷带(ligature)、和电凝法(electrocoagulation)，其用于一线治疗。然而，在某些情况下这些解决方案效果很小或没有效果，如渗出性毛细血管出血(oozing capillary hemorrhages)；多血管器官(hypervascularized organ)如脾或肝的出血；导致弥漫性流血的出血，如骨,和/或在神经外科(neurosurgery)中。

还存在“化学的”解决方案，特别是在某些现有止血产品中实现的。所述化学解决方案的组分通常是“吸收性”或“活性”类型的。

吸收性止血产品，特别地包括多糖如再生氧化纤维素(regenerated oxidizedcellulose)或藻酸盐(alginates)，主要通过机械作用和简单吸收而实现功能。它们经常呈现过度泡胀的问题。如果所述泡胀导致液体，特别是血液，的迅速吸收，则当用于“封闭的”环境时其会导致不合意的压力，所述封闭的环境例如与硬膜(dura mater)接触或在泌尿外科(urology)中。

此外，某些产品，特别是包含植物多糖如纤维素或藻酸盐的那些产品，还可能在它们的再吸收(resorption)期间造成炎性反应和/或可以导致宿主不能识别的降解产物。其结果是，将这类产物去除以使得它们不留存在体内且因此不产生这些不良效果是合意的。

活性止血产品，如含有凝血酶或纤维蛋白的产品，经常是衍生自血液的产品。这类产品牵涉变应反应和疾病传播的风险，特别是在疾病载体不会被传统施用的处理所灭活的情况中。此外，所述下游处理一般是复杂和/或昂贵的。最后，它们在使用前一般需要准备，在紧急情况下其可以是限制性的，并且的确很麻烦。

此外，既含有纤维蛋白也含有凝血酶的产品的作用模式基于在产品中所包含的两种衍生自血液的产物之间的相互作用。偶尔反应可以不与血液相互作用而发生，在这种情况中所述产物被称作漂浮的(float)。换句话说，所述产物被血液推开且血液继续流动，可能造成产物稀释或在血液的顶端凝结并形成胶体，在这种情况下血液的流动不受阻断。因此止血没有达成。

现在在市场上可以获得的产品可以是以下面的形式：

-海绵(sponge)或基质：该物理形式有助于操作，但是在复杂的区域中使用或在腹腔镜手术(laparoscopic application)中使用可能是有问题的，

-纤维：该形式可以容易地置于待治疗的区域，如果该区域是可到达的话，且可以减少待植入的产品的量；另一方面，其对于血管是强烈禁忌的(stronglycontraindictated)，尤其是要避免纤维进入循环中，因为这类情形会带来栓塞(embolism)的风险，以及粘附在器材上的风险，

-固化的液体，如生物粘合剂：这类组合物经常包含至少两种产品，其准备期间混合在一起以进行反应和聚合。一般所述产品必需在使用前，特别是在手术室中制备，这使得它们的制备冗长且需要能够预期到它们的使用。

-喷雾剂：粘合剂可以以喷雾剂的形式，其需要使用特别的设备以供将注射器连接至提供气体的设备，所述气体对于推动产品是必需的。剂量、分配的同质性和/或所堆积的层的厚度是很难调控或不可能调控的。

-粉末：一些由淀粉制成的粉末是市场上可获得的。粉末对血液的吸收使得实现止血粉末。淀粉对血液没有任何生物特性。该粉末的密度和粒度(大小等级)非常小，且粉末在没有形成云雾(cloud)的情况下不能喷雾，这不适于腹腔镜手术。例如，在WO 2005/072700中描述的粉末不适于在伤口上均质和精确的喷雾，尤其是在腹腔镜中。

现有技术的组合物一般都是以海绵、纤维、或粘稠液体的形式提供的，如纤维蛋白粘合剂，其可以喷雾。然而，现在无法获得适于喷雾的粉末。

因此本发明的目的是获得解决以上所提到的所有或一些问题的组合物，且特别是在安全性、有效性、易用性和/或成本方面令人满意的组合物。具体地，所述产品或组合物可以满足每个国家施行的管制性批准(regulatory approval)。

更加精确地，本发明目的在于获得组合物，其具有令人满意的吸收能力、良好的止血能力、最小的不良效果(或没有不良效果)、良好的锚定(anchor)在伤口边缘的能力和用于喷雾的可能性、当喷雾时令人满意的对血流的穿透、和/或有限的泡胀。

具体地，所述组合物目的在于能够在多数外科手术步骤中施用，如剖腹手术(laparotomy)、腹腔镜、体腔镜(coelioscopy)和自动外科手术技术(robotic surgicaltechnique)、和/或可以喷雾。所述组合物及其代谢物优选具有令人满意的无害性，具有改进的安全性，造成较弱的免疫应答或没有免疫应答，不具致癌性，和/或可再吸收。具体地，再吸收是与止血和愈合的现象相容的，以便能在所述过程之后留在原位。

组合物的目标还可以是以可以喷雾的形式提供。

除了解决以上提到的所有或一些问题之外，本发明的目的还可以是获得下述组合物：

-使得可获得产品，特别是包含对止血作用有用的所有组分的干燥、可喷雾的粉末，特别是在储藏期间，换句话说，以随时可用的形式储藏且在使用前不需要混合的产品，和/或

-其主要组分或其组分不会吸收过多的血液以至存在不合意的压力的风险，和/或

-其组分同时具有止血、机械和生物化学、或生物活性，和/或

-其可以无需准备、无需处理止血产品而立即使用，且其可以例如在腹腔镜以及在剖腹手术中使用。

发明概述

根据第一个方面，本发明涉及止血组合物，其包含或构成为(constituted of)：

-胶原，其包含重量按相对于胶原总重量的重量计至少50％的纤维和/或原纤维胶原含量，其是原纤维类型的胶原，

-至少一种单糖，和

-任选地，至少一种选自下组的化合物

○凝血因子(coagulation factors)，特别是凝血酶，其可以特别地来自血液或通过生物技术方法获得，和

○糖胺聚糖(glycosaminoglycans)，特别是硫酸软骨素(chondroitin sulfate)、硫酸皮肤素(dermatan sulfate)、透明质酸(hyaluronic acid)及其混合物。

优选地，提出了粉末形式的止血组合物，其包含原纤维类型的胶原，所述原纤维类型的胶原包含按相对于胶原总重量的重量计的至少70％的纤维胶原和/或原纤维胶原的含量，以及至少一种单糖。

本发明可以具体使得可获得组合物，其具有特别好的止血特性，同时产生有限的泡胀，所述止血特性具体是由于所述组合物的大小和/或颗粒的密度的特征以及是由于其组分。

根据一种变化，所述组合物不含从血液中直接或间接获得的组分。例如当存在凝血酶时，其可以是从血液中提取的或是重组凝血酶。非常具体地，组合物构成为(isconstituted of)在体内迅速降解的和/或生物相容的化合物，换句话说，其不诱导不合意的应答。

组合物的优选但不受限制的，单独或组合的方面为下述：

-组合物包含按相对于组合物的总重量的重量计80％至90％范围的胶原含量。

-组合物包含按相对于组合物的总重量的重量计1％至12.5％范围的单糖含量。

-组合物包含重量比值范围为10至50，优选19的胶原/单糖。

-胶原包含按相对于胶原总重量的重量计的从85％至95％范围的纤维胶原和/或原纤维胶原含量。

-组合物还包含按相对于组合物的总重量的重量计从2％至25％范围的糖胺聚糖含量。

-组合物还包含重量比值范围为从2至40的胶原/总糖化合物，其中总糖化合物的重量是单糖的重量和糖胺聚糖重量之和。

-组合物还包含凝血因子，特别是凝血酶，其量的范围为从组合物的0.01IU/mg至20IU/mg。

-组合物具有大于0.4g/mL的致密密度(tapped density)。

-组合物包含按重量计至少50％的大小在200μm和400μm之间的颗粒。

-权利要求1至10任一项的组合物，其包含

○胶原，其量按相对于组合物的总重量的重量计为86.36％，

○葡萄糖，其量按相对于组合物的总重量的重量计为4.54％，

○硫酸软骨素，其量按相对于组合物的总重量的重量计为9.09％。

-组合物还包含凝血酶，其量为组合物的0.2IU/mg至2IU/mg。

根据进一步的方面，本发明涉及用于制备止血组合物的方法，其至少包括下述步骤：

a)形成包含原纤维类型的胶原的水性悬液，所述原纤维类型的胶原具有重量按相对于胶原总重量的重量计至少70％的纤维胶原和/或原纤维胶原含量，以及至少一种单糖，其中在该步骤中使用的胶原优选通过碱性提取获得；

b)以沉淀、糊或凝胶的形式回收产物，特别是通过离心或倾析，

b)干燥产物，

c)将产物研磨至合意的粒度。

这种方法可以包括步骤d)之后的步骤e)，其包括添加选自下组的化合物：

-凝血因子，特别是凝血酶，和

-糖胺聚糖，特别是硫酸软骨素、硫酸皮肤素、透明质酸及其混合物。

本发明还涉及试剂盒，其包含以上描述的组合物和适于容纳和推进这类组合物的喷雾设备。

附图简述

其它本发明的特征和优势将从以下描述而变得清楚，所述描述仅作为例示性的目的给出且绝非限制性，且应该参考所附的附图而解读，其中图1是如在实施例13中所描述的电泳结果的实例。

发明详述

在下述描述中，在没有相反的陈述的情况下，重量百分数是按相对于组合物的总干重计而给出的。

在本发明的语境中，“组合物的总干重”指没有溶剂，特别是水的组合物的总重量，且因此是相对于无水产品的总重量。

此外，组分的重量和所得的百分数可以对应于这些组分的无水重量，换句话说，当组分可以含有水时，组分不包括水的重量。这也可适用于所获得的百分数。

组合物可以包含按相对于组合物的总重量的总量计大于或等于70％的胶原含量，特别是按重量计大于或等于75％，特别是大于或等于77％，事实上大于或等于80％。

此外，组合物可以包含按相对于组合物的总重量的重量计小于或等于99％的胶原含量，特别是按重量计小于或等于96％，特别是小于或等于93％，事实上小于或等于90％。

因此，组合物可以包含按相对于组合物的总重量的重量计从70％至99％范围的胶原含量，特别是按重量计从75％至96％范围，特别是从77％至93％范围，事实上从80％至90％范围。优选地，胶原的含量是按相对于组合物的总重量的重量计约86％。

胶原是哺乳动物中的主要结构蛋白质。胶原由原胶原(tropocollagen，TC)分子组成，所述原胶原分子具有大约280-300nm的长度和大约1.5nm的直径。

术语“纤维胶原”指代纤维形式的胶原，对应于原纤维的集合(assembly offibrils)。纤维一般具有范围为从1μm至10μm的直径。术语“原纤维胶原”指代原纤维形式的胶原。更精确地，原纤维一般具有10nm至1μm的直径。因此，原纤维是由原胶原分子的交错的阵列(staggered array)形成的，且这些原纤维可以排列以形成胶原纤维。纤维和/或原纤维胶原一般是不可溶的，而非原纤维胶原是高度可溶的。

纤维胶原和原纤维胶原的定义可以具体是由Markus Buehler在“Nature designstough collagen:explaining the nanostructure of collagen fibrils,”in PNAS,August 15,2006,vol.103,no.33,pp.12285-12290中所给出的。

已经发现了多于28种不同的胶原，其可以分类为3个主要类别：原纤维类型的胶原(collagens of the fibrillar type)、非原纤维类型的胶原(collagens of the non-fibrillar type)、和FACIT胶原。

原纤维类型的胶原是大部分包含原纤维和/或纤维胶原且几乎不包含非原纤维胶原的胶原(例如I型胶原)。相似地，非原纤维类型的胶原是大部分包含非原纤维胶原的胶原。一些非原纤维类型的胶原可仅包含非原纤维胶原(consist only in)(例如IV型或V型胶原)。

胶原的工业提取和纯化一般包括(consists in)将初始组织(initial tissues)去结构化(destructuration)以1)去除所有或大多数杂质蛋白质，和2)取决于产品的最终用途而获得所需的结构化(structuration)水平。胶原提取一般在酸性或碱性条件中进行以允许将非原纤维的单分子可溶性胶原溶解。最终胶原自然含有纤维/原纤维胶原和非原纤维胶原的混合物。原纤维/纤维胶原和非原纤维胶原之间的比例取决于所挑选的用于提取的组织和提取工艺。

最终产物不同于通过将仅原纤维胶原和仅非原纤维胶原人工混合而获得的胶原。在标题为“Extraction of collagen from connective tissue by neutral saltsolutions”(Proceedings of the NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES Volume 41Number IJanuary 15,1955by

Gross,John H.Highberger and Francis O.Schmitt)的文献中，显示了在具体的提取工艺之后获得的原纤维和非原纤维胶原之间的区别，所述提取工艺-如前文所描述-导致了这两种胶原的混合物。

在本发明的组合物中，胶原是原纤维类型的，且包含其量为按相对于胶原的总重量的重量计至少60％的纤维和/或原纤维胶原，特别是按重量计至少70％，特别是至少75％，实际上至少80％。

更具体地，胶原包含按相对于组合物中胶原的总重量的重量计至少85％，特别是至少90％，特别是至少95％，实际上至少98％的纤维和/或原纤维胶原。

优选组合物包含按相对于组合物中胶原的总重量的重量计从85％至95％范围的纤维和/或原纤维胶原的含量，且最优选按重量计从85％至90％。

这意指在优选的实施方案中，组合物因此包含按相对于组合物中胶原的总重量的重量计从5％至15％范围的非原纤维胶原的含量，且最优选按重量计从10％至15％。

具有纤维和/或原纤维胶原相对于非原纤维胶原的这种比值的组合物是非常有利的，特别是用作止血粉末。事实上，纤维和/或原纤维胶原应以足够以进行止血的量存在，而非原纤维胶原也应为足以用于产品的粘着(cohesion)的量，且不应为太大量以避免过度的泡胀。

胶原可以选自I型胶原或I型和III型胶原。胶原可以从多种源组织中提取，特别是来自所有物种，特别是猪、牛、或马物种的皮肤和/或腱。

胶原可以大部分由源自猪、从皮肤和/或腱提取的纤维胶原制得。在胶原从腱提取的情况中，提取可以是如在国际申请WO 2010/125086中所描述的。

前述的胶原，特别是纤维胶原和/或原纤维胶原，可以来自酸性或碱性提取。根据一个具体实施方案，所述胶原来自碱性提取。根据一个具体实施方案，胶原可以是如在专利申请FR2944706中所描述的。

优选地，胶原来自碱性提取，其使得能够在提取的胶原中最大化纤维和/或原纤维胶原的含量。此外，可以优化这类碱性提取以控制提取的胶原中的原纤维/纤维胶原和非原纤维胶原的比例。与酸性提取不同，碱性提取允许对蛋白聚糖的水解。该作用导致组织的去结构化并在不改变纤维形状的前提下将其分离。在酸性条件中，纤维中内部胶原分子的膨胀导致其在工艺中的部分去结构化，其释放更大量的非原纤维可溶性胶原。

可以将胶原交联，特别是通过经典的交联模式如热脱水；使用桥联剂(bridgingagents)，例如甲醛和/或戊二醛；通过氧化的多糖，如根据在国际专利申请WO 2010/125086中所描述的方法；和/或通过氧化的支链淀粉(amylopectins)或糖原。

组合物包含至少一种单糖，其单独存在或与其它单糖形成混合物。所述单糖可以选自核糖、蔗糖、果糖、葡萄糖及其混合物。存在于本发明的组合物中、单独存在或是与单糖形成混合物的单糖，特别地是葡萄糖。

组合物可以包含按相对于组合物的总重量的重量计从1％至12.5％范围的单糖含量，特别是按重量计从1.5％到10％范围，特别是按重量计从2％至8％范围，且相当特别的是按重量计从2.5％至7.5％范围。最优选地，单糖含量按相对于组合物的总重量的重量计为约5％。

组合物可以包含范围为从5至100的胶原/单糖重量比值，特别是从7至65，更特别是从10至50，且还更特别是从11至40。最优选地，组合物包含约19的胶原/单糖重量比值。

所述单糖，特别是核糖、蔗糖、果糖、葡萄糖及其混合物，且特别是葡萄糖，可以特别的使得可能获得具有合意的特征、主要包含纤维和/或原纤维胶原和单糖的颗粒，所述合意的特征特别地是大小和密度。将单糖组入胶原的混合物中还允许降低组合物中的电荷，这使得能够形成适于放置在如管、鼓风机(blower)、喷雾罐的容器中的粉末。

相当特别地，单糖的存在使得更容易和/或更便宜地获得具有合意的密度和/或大小的颗粒，特别是在改进组合物的粉末的止血特性方面。

在没有任何添加剂的情况下研磨胶原会减少纤维的大小和降低粉末的密度。此外，最终制备物含有大量的电荷，其阻止对最终产品的处理。因此提出在研磨胶原之前添加单糖，其造成待混合的制备物变硬(hardening)允许迅速的研磨(限制变性)，因此使得能够制备电荷减少(适于将粉末放置于容器中，例如喷雾罐)、且具有适于喷雾组合物的最终密度的粉末。

与所预期的不同，这类对单糖的添加对于产品的最终活性没有作用。特别地，其不改变最终产品的生物活性。单糖没有止血效果。

此外，这类单糖的添加不使得其作为发泡剂起作用，如在WO 01/97873中的情况。在WO 01/97873中，对稀释的溶液加热导致形成明胶。可以制成高浓度的明胶以获得非常浓的溶液，但是最终产品含有明胶而非胶原。已知明胶不如胶原止血性好，因为血小板聚集需要存在胶原原纤维和天然胶原的结构，这在明胶中是不存在的。

根据一个实施方案，组合物包含，或事实上组成为颗粒，所述颗粒包含或实际上组成为胶原和单糖，特别是选自核糖、蔗糖、果糖、葡萄糖及其混合物的糖，特别是葡萄糖。

组合物可以包含至少一种，特别是一种，凝血因子。所述凝血因子是本领域技术人员所熟知的。优先地，所述凝血因子是凝血酶。

所述凝血因子，特别是凝血酶，可以来自动物来源(从动物组织或体液中提取)或来自重组来源(通过培养经遗传修饰细胞而产生)。所述凝血因子可以例如是从人组织中提取的凝血酶。

当存在凝血因子，特别是凝血酶时，其含量可以按组合物的总重量的重量计小于0.1％。

在凝血酶的情况中，一般使用国际单位(international unit，IU)。因此，组合物可以包含从组合物的0.01IU/mg至20IU/mg范围的凝血酶含量，特别是从0.05IU/mg至10IU/mg，特别是从0.1IU/mg至5IU/mg，特别是从0.2IU/mg至2IU/mg。最优选凝血酶的含量-如果有的话-是组合物的约0.83IU/mg。

除了单糖，组合物还可以包含至少一种其它糖化合物，其可以是糖胺聚糖。这类糖化合物可以是组合物的一部分，所述组合物含或不含凝血因子如凝血酶。

所述糖胺聚糖可以选自硫酸软骨素、硫酸皮肤素、透明质酸及其混合物，特别是硫酸软骨素。

糖胺聚糖可以使得改进粉末吸收血液的速度成为可能。更特别地，糖胺聚糖可以加速血液与止血产品的接触，特别是与胶原和凝血酶的接触。

组合物可以包含按相对于组合物的总重量的重量计从2％至25％范围的糖胺聚糖含量，特别是按重量计从3％至20％范围，特别是按重量计从4％至15％范围，相当特别的是按重量计从5％至12.5％范围。最优选糖胺聚糖的含量-如果有的话-是按相对于组合物的总重量的重量计约9％。

组合物可以包含重量比值为从2.5至50范围的胶原/糖胺聚糖，特别是从3.5至35，更特别是从5至25，且还更特别是从6.5至20。

根据一个实施方案，组合物包含至少一种，特别是一种单糖以及至少一种，特别是一种，糖胺聚糖，特别是如以上所定义的单糖和糖胺聚糖，且特别是以上面所定义的量。

糖化合物相当特别地是单糖和糖胺聚糖。

组合物可以包含按相对于组合物的总重量的重量计从2％至25％范围的糖含量，特别是按重量计从5％至23％范围，特别是按重量计从7％至21％范围，相当特别地是按重量计从10％至18％范围。

组合物可以包含重量比值为从2至40范围的胶原/糖，特别是从2.5至30，更特别是从3至20，且还更特别地是从3.5至15。

表述方法“糖化合物的总重量”指以上所定义的单糖的重量和以上所提到的其它糖化合物的重量之和。

根据一个实施方案，本发明包含或事实上组成为：

-胶原，其主要包含按相对于胶原的总重量的重量计至少50％的纤维和/或原纤维胶原含量，和

-至少一种，特别是一种，单糖。

相当特别地，组合物包含或事实上组成为：

-胶原，其量特别为按相对于组合物的总重量的重量计从70％至99％范围，特别是按重量计从75％至96％范围，特别是按重量计从77％至93％范围，特别是按重量计从80％至90％范围，其中所述胶原包含按相对于胶原的总重量的重量计至少50％的纤维和/或原纤维胶原含量，和

-至少一种单糖，特别是葡萄糖。其量为按相对于组合物的总重量的重量计从1％至12.5％范围，特别是按重量计从1.5％至10％范围，特别是按重量计从2％至8％范围，和相当特别地是按重量计从2.5％至7.5％范围。

根据另一个实施方案，组合物包含或事实上组成为：

-胶原，其主要包含按相对于胶原的总重量的重量计至少50％的纤维和/或原纤维胶原含量，

-至少一种，特别是一种，单糖，

-至少一种，特别是一种，凝血因子。

相当特别地，组合物包含或事实上组成为：

-胶原，其量特别地是按相对于组合物的总重量的重量计从70％至99％范围，特别是按重量计从75％至96％范围，特别是按重量计从77％至93％范围，事实上是按重量计从80％至90％范围，其中所述胶原含量包含按相对于胶原总重量的重量计至少50％的纤维和/或原纤维胶原含量，

-至少一种单糖，特别是葡萄糖，其量为按相对于组合物的总重量的重量计从1％至12.5％范围，特别是按重量计从1.5％至10％范围，特别是按重量计从2％至8％范围，且相当特别地是按重量计从2.5％至7.5％范围，和

-至少一种，特别是一种，凝血因子，特别是凝血酶，其量为组合物的从0.01IU/mg至20IU/mg范围，特别是从0.05IU/mg至10IU/mg，特别是从0.1IU/mg至5IU/mg，事实上是从0.2IU/mg至2IU/mg。

根据另一个实施方案，组合物包含或事实上组成为：

-胶原，其主要包含按相对于胶原总重量的重量计至少50％的纤维和/或原纤维胶原含量的，

-至少一种，特别是一种，单糖，和

-至少一种，特别是一种，糖胺聚糖。

相当特别地，组合物包含或事实上组成为：

-胶原，其量特别为按相对于组合物的总重量的重量计从70％至99％范围，特别是按重量计从75％至96％范围，特别是按重量计从77％至93％范围，事实上是按重量计从80％至90％范围，其中所述胶原包含按相对于胶原总重量的重量计至少50％的纤维和/或原纤维胶原含量，

-至少一种单糖，特别是葡萄糖，其量为按相对于组合物的总重量的重量计从1％至10％范围，特别是按重量计从1％至12.5％范围，特别是按重量计从1.5％至10％范围，特别是按重量计从2％至8％范围，且相当特别地是按重量计从2.5％至7.5％范围，和

-至少一种糖胺聚糖，特别是硫酸软骨素，其量为按相对于组合物的总重量的重量计从2％至25％范围，特别是按重量计从3％至20％范围，特别是按重量计从4％至15％范围，相当特别地是按重量计从5％至12.5％范围。

根据还另一个实施方案，组合物包含或事实上组成为：

-胶原，其主要包含按相对于胶原总重量的重量计至少50％的纤维和/或原纤维胶原含量，

-至少一种，特别是一种，单糖，

-至少一种，特别是一种，凝血因子，和

-至少一种，特别是一种，糖胺聚糖。

相当特别地，组合物包含或事实上组成为：

-胶原，其量特别为按相对于组合物的总重量特别是干重的重量计从70％至99％范围，特别是按重量计从75％至96％范围，特别是按重量计从77％至93％范围，特别是按重量计从80％至90％范围，其中所述胶原包含按相对于胶原总重量的重量计至少50％的纤维和/或原纤维胶原含量，

-至少一种单糖，特别是葡萄糖，其量为按相对于组合物的总重量的重量计从1％至10％范围，特别是按重量计从1.5％至12.5％范围，特别是按重量计从1.5％至10％范围，特别是按重量计从2％至8％范围，且相当特别地是按重量计从2.5％至7.5％范围，

-至少一种凝血因子，特别是凝血酶，其量为组合物的从0.01IU/mg至20IU/mg范围，特别是从0.05IU/mg至10IU/mg范围，特别是从0.1IU/mg至5IU/mg范围，事实上是从0.2IU/mg至2IU/mg范围，和

-至少一种糖胺聚糖，特别是硫酸软骨素，其量为按相对于组合物的总重量的重量计从2％至25％范围，特别是按重量计从3％至20％范围，特别是按重量计从4％至15％范围，相当特别地是按重量计从5％至12.5％范围。

根据一个相当具体的实施方案，组合物包含或事实上组成为：

-原纤维类型的胶原，大部分包含纤维和/或原纤维胶原，所述原纤维类型的胶原是通过例如在碱性介质(basic medium)中提取而获得的，且量为按相对于组合物的总重量的重量计约85％，

-葡萄糖，其量为按相对于组合物的总重量的重量计约4.9％，

-凝血酶，其量为组合物的0.2IU/mg至2IU/mg，和

-硫酸软骨素，其量为按相对于组合物的总重量的重量计约10％。

根据另一个具体的实施方案，组合物包括或事实上组成为：

-原纤维类型的胶原，大部分包含纤维和/或原纤维胶原，所述原纤维类型的胶原是通过例如在碱性介质中提取而获得的，且量为按相对于组合物的总重量的重量计约85％，

-葡萄糖，其量为按相对于组合物的总重量的重量计5％，

-硫酸软骨素，其量为按相对于组合物的总重量的重量计10％。

在本发明的语境中，表述“约X％的量”指正负20％的变化，换句话说，约10％的量意指从8％至12％，特别是正负10％的变化，事实上是正负5％的变化。

当添加凝血酶时，将凝血酶粉末与已经制备的胶原/单糖的均质分子混合物物的粉末混合。当添加硫酸软骨素时，将凝血酶首先添加至硫酸软骨素粉末，并将该混合物添加至之前的胶原/单糖混合物(已经研磨成粉末)。凝血酶不受糖或胶原稳定化。凝血酶从不与单糖的溶液接触(与WO 98/57678相反)，这阻止蛋白质的任何变性和粉末的再水化(rehydration)，这会使得无法再适当地将粉末干燥。

组合物可以以几种形式的固体粉末提供，特别是可喷雾的粉末。本发明的组合物优选是可喷雾的粉末。

粉末形式的组合物可以具体包含或组成为：

-颗粒，其包含或组成为原纤维类型的胶原和至少一种单糖，特别是葡萄糖，其中特别地所述颗粒具有如在本发明说明书中所定义的大小、粒度和/或密度，和

-任选地，颗粒，其包含或组成为至少一种糖胺聚糖，特别是硫酸软骨素，和/或至少一种凝血因子，特别是凝血酶，其中特别地所述颗粒具有如在本发明说明书中所定义的大小、粒度和/或密度。

粉末形式的本组合物，相当特别地可喷雾粉末，可以有利地具有大于0.4g/mL，相当特别地大于或等于0.4g/mL的致密密度(tapped density)。事实上，当将粉末用作止血剂时，其密度必须足以防止血流对产品的任何稀释和排斥。提供给具有大于0.4g/mL的密度的粉末组合物防止粉末被血液冲走。

当手动施用时，外科医师应当以纱布(a gauze)压制粉末而在压制最后不去除产品。

当意图将粉末组合物喷雾在流血的伤口上时，优选这类组合物具有高得多的密度以允许粉末颗粒在从喷雾器中射出时达到一定的动能。事实上，气体不能完美地移动具有低密度的粉末以抵达伤口而不形成云雾，而这与在多数情况中所需要的精确的施用不相容。具有较高的密度还使得喷雾器能够赋予粉末足够的动能以使粉末较好的冲击至伤口上。因此，粉末组合物优选具有高于0.4g/mL的致密密度。甚至更优选粉末组合物具有小于或等于0.6g/mL的致密密度。

获得具有这类密度特征的粉末组合物的一种方式包括：研磨干燥的胶原的饼(cake of dry collagen)，此种饼是胶原的硬而致密的制备物。所需的密度不可通过研磨胶原的冻干的制备物而达到，因为该最终颗粒将会是扁平的且因此不能喷雾，其具有重要的静电电荷。例如，如在WO 01/97873中制备的产品不能制成具有这样的密度和这样可喷雾特征的粉末。

在WO 2005/072700中描述的粉末具有非常低的密度，且该粉末因此不能被喷雾以抵达目标器官，特别是在腹腔镜中。特别地，其在需要冲击以防止来自血流的排斥的时候不会抵达伤口。

本组合物，特别是粉末形式的组合物，相当特别地是可喷雾的，可以优选具有高于0.4g/mL的致密密度，特别是高于0.41g/mL。

还更优选地，组合物粉末的致密密度高于0.4g/mL，且最优选小于或等于0.6g/mL。

散装密度(bulk density)一般大于或等于0.3g/mL，相当特别地大于或等于0.31g/mL。

散装密度有利地高于0.3g/mL，相当特别地高于0.31g/mL。

这些密度是根据在实施例中所描述的规程而测量的。

本发明的组合物有利地具有范围为从1秒至600秒的止血能力，特别是从1秒至200秒，更特别是从1秒至60秒，事实上是从1秒至40秒。止血能力是根据在实施例中呈现的规程测量的。

本发明的组合物有利地包含按重量计至少50％的颗粒，其大小在200μm和400μm之间。

构成粉末的颗粒有利地具有从10μm至500μm的平均粒度范围，特别是从50μm至400μm。

有利地，按重量计至少90％，特别是按重量计100％的构成所述粉末的颗粒可以穿过筛网，所述筛网的筛目是500μm，特别是400μm。

按重量计至少90％重，且特别是按重量计至少95％的构成所述粉末的颗粒可以被筛目为10μm，显著地20μm，事实上30μm，事实上50μm的筛网保留。

选择该再分配(repartition)以允许喷雾粉末。颗粒大小太小的话，粉末过于粉状以致不能适当地抵达目标，且具有过高的颗粒大小使得粉末不能喷雾。

组合物的主要化合物，特别是胶原，可以在20分钟处具有范围从0.7至1的溶胀比(swelling ratio)，如根据在实施例中所描述的规程所测量的(见实施例4)。

组合物，特别是当所述组合物包含至少一种糖胺聚糖时，且特别是当所述组合物包含硫酸软骨素时，可以在20分钟处具有从5至15的溶胀比，特别是从8至12，且相当特别地是从10至12，如根据在实施例中所描述的规程而测量的(见实施例5)。

根据一个优选的实施方案，组合物是以可喷雾的干燥粉末的形式而提供的。

粉末形式的组合物特别地包含：

-包含胶原和单糖的颗粒，和

-任选地，至少一种糖胺聚糖和/或凝血酶。

组合物可以包含：

-包含胶原、单糖、和任选地至少一种糖胺聚糖和/或凝血因子的颗粒，

-包含胶原、单糖、和任选地凝血因子和任选地糖胺聚糖颗粒的颗粒

-包含胶原和单糖的颗粒以及包含至少一种糖胺聚糖和/或凝血因子的颗粒。

在本发明的语境中，表述“干燥的粉末”意指组合物包含有限的溶剂含量，特别是水。所述有限的含量可以是按相对于组合物的总重量的重量计小于20％，特别是按重量计小于15％，特别是按重量计小于10％，且相当特别地是按重量计小于5％。

所述干燥的形式可以通过将所使用的溶剂简单地蒸发、通过脱水或通过有机溶剂获得。

干燥粉末形式的组合物可以特别地通过喷雾而施用。

特别地，本发明涉及包含试剂盒，其包含：

-根据本发明的组合物，和

-喷雾设备。

所述组合物是如根据本发明说明书所定义的。本领域技术人员知晓用于喷雾粉末形式的药物组合物的喷雾设备。

特别地，所述设备可以包含压缩气体的储备，其中通过激活装置的激活，特别是通过触发器(trigger)，而将所述压力释放。

所述设备可以包含：

-激活装置，

-粉末储备，特别包含根据本发明的粉末，

-气体储备，其连接至粉末储备，

-连接至粉末储备的喷雾器，

-与激活手段偶联的阀门A，其中当激活装置静止时所述阀门A关闭且因此阻断气体储备和粉末储备之间的气体的流通，且其中当激活装置被激活时所述阀门开启以输送气体的注入(an injection of gas)以喷雾至少部分的粉末。

可以将气体储备与供应压缩气体的装置，例如压缩气体的系统或压缩气体的罐(tank)偶联，特别是为了使得系统自主(autonomous)。

设备可以在气体储备和供应装置之间包含阀门B，其中所述阀门B与激活装置偶联。

阀门B默认处在开启位置，除非当激活装置被激活时，在该情况中其关闭。

因此，当阀门A开启时，阀门B关闭，反之亦然。这使得能够递送预定量的压缩气体以递送粉末的剂量，而防止污染物接触设备的内部。

当设备不与供应气体的装置偶联时，优选阀门B关闭。这可以帮助限制污染设备内部的风险。

相当特别地，粉末储备是以圆筒的形式，其包含几个剂量的粉末。所述圆筒可以与由气流所激活的推进器偶联，其使得在激活装置激活后粉末能够被喷雾，且因此旋转圆筒并改变粉末的剂量。

存在于圆筒中的剂量可以密封以使得无菌，所述密封特别是具有当气流穿过所述的剂量时会掀开(tears open)的组件。这使得有可能将剂量保存在无菌的环境中。

剂量的体积可以是约0.2cm³至1cm³，特别是约0.3cm³。

所使用的气体可以是空气、二氧化碳或任意惰性气体(inert gas)。

特别地，设备是如在欧洲专利EP11163820.1和美国临时申请号61/479,805中描述的，其都在2011年4月27日提交，并通过提述并入本文。

本发明还涉及用于制备止血组合物的方法，特别地如上面所定义的，其包括至少以下步骤：

a)形成水性悬液，其包含、或事实上组成为，原纤维类型的胶原——主要包含纤维和/或原纤维胶原——和单糖，如葡萄糖，

b)以沉淀、糊或凝胶形式回收产物，特别是通过离心或倾析，

c)干燥产物，例如通过蒸发。

d)将产物研磨至合意的粒度，特别是通过锤式粉碎机(hammer mill)，和

e)任选地，添加凝血酶和/或硫酸软骨素，特别是以固体形式，特别是以粉末形式添加。

步骤a)中形成包含纤维/原纤维胶原和单糖的水性悬液导致单糖在胶原分子周围的再分配(repartition)。此外，胶原和单糖分子种之间紧密的接触导致在脱水后形成硬的饼，其适于通过研磨获得具有所需的高密度的粉末。与之相反，将胶原粉末和葡萄糖粉末混合无法获得均质和可喷雾的粉末，特别是因为密度和电荷的缘故。

在步骤a)中，胶原可以以从30g/L至150g/L范围的浓度存在。

可将单糖以如在说明书中所定义的量添加至悬液或添加至均质胶原糊中，且更特别地为按相对于胶原重量的重量计2％至5％。

在步骤a)中单糖可以以从0.3g/L至10g/L范围的浓度而存在。

步骤a)的胶原的水性悬液可以是酸，且特别是包含酸如盐酸。所述酸可以以从0.01M至0.5M范围的浓度而存在，且特别是从0.02M至0.1M，事实上是约0.05M。所述悬液可以为均质糊的形式。

步骤b)可以包括将悬液倾入铸模(mold)中。

进行步骤c)以获得尽可能厚的饼(比所期望的最终粒度更好(superior thefinal granulometry wanted))，其具有非常高的密度且饼内部具有尽可能少的气泡(小于5％)。

步骤d)可以继以筛选粉末的步骤，特别是用于获得合意的粒度。

根据一个优选的实施方案，步骤a)包括形成包含按重量计95％的原纤维类型的胶原和按重量计5％的葡萄糖的混合物。在已经将该混合物干燥(步骤b))和研磨(步骤c))后，添加按相对于混合物的总重量的重量计10％的硫酸软骨素，使得最终组合物包含：

-胶原：其按相对于组合物的总重量的重量计为86.36％；

-葡萄糖：其按相对于组合物的总重量的重量计为4.54％；

-硫酸软骨素：其按相对于组合物的总重量的重量计为9.09％；

当也添加凝血酶时，其代表按相对于组合物的总重量的重量计低于0.01％的最终含量。在上述的混合物中，凝血酶的量可以是组合物的0.083IU/mg。

根据另一个实施方案，本发明还涉及通过本发明的方法可获得的粉末。

对于所有前述的粉末产品，很明显可能施以大致彻底的研磨以根据研磨的类型及其持续时间获得具有不同粒度的粉末。

根据其另一个方面，本发明涉及如上所定义的组合物作为止血剂的用途。

根据其还另一个方面，本发明涉及药物组合物或药物，其包含、或事实上组成为，如以上所定义的组合物，特别是作为止血剂。

根据其另一个方面，本发明涉及如上所定义的组合物用于制备药物或药物组合物的用途，特别是止血性药物或药物组合物。

根据其另一个方面，本发明涉及止血方法，其包括将如以上所定义的组合物沉积和/或喷雾在动物的身体的出血的部分。特别地，所述组合物可以用于外科手术步骤，特别是剖腹手术、腹腔镜、体腔镜、和自动步骤(robotic procedures)。

本发明还涉及止血方法，其包括将本发明的组合物喷雾的步骤。

根据其另一个方面，本发明涉及将如以上所定义的组合物用作生物粘合剂。

根据其还另一个方面，本发明涉及如以上所定义的组合物作为瘢痕形成剂(cicatrizing agent)用于内部和外部伤口的用途。表述“瘢痕形成剂”指使得与其接触的组织获得临床上令人满意的瘢痕形成成为可能的产品。

实施例

实施例1：用于测量密度的规程

将待测试的产品(600mg)，特别是粉末形式的产品，引入5mL的带刻度的量筒(graduated cylinder)中。测量了产品的高度并记录了相应的体积。将测量重复3次。然后将产品物通过在坚硬表面上敲击100次而将产品压缩(pack)3次。再次测量产品的高度和对应的体积。由此获得了压缩前和压缩后的产品的密度，分别称为散装密度和致密密度。

实施例2：用于体外测量止血能力的规程

在整个测量过程中将柠檬酸化(约0.1M)的人血液在水浴中保持在37℃。将要测量的产品(10mg)沉积于带有扣盖(snap-on cap)的5mL聚丙烯试管中，然后添加柠檬酸化的新鲜血液(2mL)。然后添加CaCl₂使得血液中的CaCl₂终浓度为15mM，然后将试管封闭。将内含物通过剧烈地反转(10次)混合，然后将试管浸没在水浴中；每10秒将试管回复至垂直位置。记录形成血块所需的时间并与止血能力相对应。

实施例3：用于测量颗粒大小的规程

将已知量的产品，特别是粉末，通过50μm，100μm，200μm，300μm和400μm筛网过筛2分钟(每次筛选)。将来自每次筛选的级分称重。确定粒度范围的比例。

实施例4：用于测量组合物的多数化合物的泡胀的规程

将组合物，特别是胶原(40mg至70mg)在称量舟(weighing boat)中称量。将6mL的0.15M NaCl沉积于另一个称量舟中。将待测试的化合物沉积于0.15M NaCl上(t＝0)。在20分钟后，去除过量的液体并称量泡胀了的产品。溶胀比对应于吸收的水的量相比于干燥的初始产品的重量。

实施例5：用于测量组合物的泡胀的规程

称量了15mL的烧瓶(以mg计的m₀)，然后添加X mg的干燥组合物的粉末(以mg计的m_0+X)。添加0.15M水性NaCl溶液(2mL)并允许组合物泡胀20分钟；然后将烧瓶在1,000rpm离心。

以巴斯德吸管将过量的NaCl去除并通过将烧瓶反转到滤纸上而消除了微滴(droplets)；然后称量带有潮湿粉末的烧杯(以mg计的m₁)。

溶胀比是如下所述计算的：((m₁-m₀)/(m_0+X-m₀))。

实施例6：通过碱性提取制备原纤维类型的胶原

将猪真皮的片(30kg)以丙酮脱脂，并允许其在100kg的0.05M NaOH溶液中泡胀3小时。以切割碎机(cutting mill)将真皮精细地切碎并将所获得的糊以50升的0.05M NaOH稀释。然后使混合物在压力下通过1mm筛网。然后以HCl将所获得的糊调节至pH 6-7.5并通过离心或经过1mm筛网过滤收集所获得的糊。

根据本领域技术人员已知的方法以丙酮将渗余物(retentate)脱水。因此脱水的渗余物包含原纤维类型的胶原，其具有相对于非原纤维胶原的大量的纤维/原纤维胶原。一般地，此种提取的胶原包含按相对于胶原的总重量的重量计从85％至95％的纤维/原纤维胶原，和按相对于胶原的总重量的重量计5％至15％的非原纤维胶原。

实施例7：制备止血粉末#1

将30g如在实施例6中所制备的原纤维类型的胶原添加至1L的0.02M水性HCl溶液，然后搅拌混合物5小时。接着，向所获得的均质糊添加量为按相对于胶原的重量的重量计2％(0.6g)的粉末化的果糖。

将混合物均质化1小时并且然后倾倒出并脱水。在干燥后，使用7,000rpm的Fitzpatrick锤式粉碎机在受控的加热下以25g/min的速率将干燥的产物研磨。然后将产物通过机械过筛(mechanical sifting)筛选以消除大小大于400μm的颗粒。

然后向粉末添加量为按相对于粉末的干物质的重量计2％的硫酸皮肤素(0.612g)。

然后使用球磨机(ball mill)将混合物均质化，以粉末的15IU/mg的量将冻干的凝血酶添加至混合物，且最后使用球磨机将混合物均质化。

实施例8：制备止血粉末#2

将7.5kg如在实施例6中制备的原纤维类型的胶原添加至50L的0.05M水性HCl溶液，然后搅拌混合物16小时。接着，向所获得均质糊中添加量为按相对于胶原的重量的重量计5％的粉末化的果糖(375g)。

将混合物均质化3小时且然后分布至板上并脱水。在干燥后，通过使用在12,000rpm的锤式粉碎机在受控的加热下的以5g/min的速率通过分级研磨干燥的产物。然后通过机械过筛筛选产物以消除大小大于400μm的颗粒和大小小于50μm的颗粒。

测量了粒度以验证其分布为按重量计60％的样品具有大于200μm的粒度。

然后向粉末添加量为按粉末的干物质的重量计20％的纯化的硫酸软骨素(1.575kg)。使用球磨机将混合物均质化。

最终，向混合物中添加量为粉末的10IU/mg的冻干的凝血酶。如同之前，使用球磨机将混合物均质化。

实施例9：制备止血粉末#3

将1000g如在实施例6中制备的原纤维类型的胶原添加至60mL的0.02M水性HCl溶液，然后搅拌混合物5小时。接着，向所获得的均质糊添加量为按相对于胶原的重量的重量计5％的粉末化的葡萄糖(50g)。

将混合物均质化1小时并倾倒出和脱水。在干燥后，使用Fitzpatrick锤式粉碎机以7,000rpm在受控的加热下以25g/min的速率将干燥的产物研磨。然后将产物通过机械过筛筛选以消除大小大于400μm的颗粒和大小小于50μm的颗粒。

然后向粉末添加量为按粉末的干物质的重量计10％的硫酸软骨素(105g)。然后使用球磨机将混合物均质化。

这类的粉末组合物具有约0.408g/mL的致密密度。

实施例10：制备止血粉末#4

将500g如在实施例6中制备的原纤维类型的胶原添加至30mL的0.02M水性HCl溶液，然后搅拌混合物5小时。下一步，向所获得的均质糊添加按相对于胶原的重量的重量计5％的粉末化的葡萄糖(25g)。

将混合物均质化1小时并然后倾倒出和脱水。在干燥后，使用7,000rpm的Fitzpatrick锤式粉碎机在受控的加热下以25g/min的速率将干燥产物研磨。然后将产物通过机械过筛筛选以消除大小大于400μm的颗粒和大小小于50μm的颗粒。

然后向粉末添加量为按粉末的干物质的重量计10％的混合了凝血酶粉末的硫酸软骨素(52.5g)。以0.85U/mg的最终量向混合物中添加凝血酶。然后使用球磨机将混合物均质化。

这类粉末组合物具有约0.425g/mL的致密密度。

实施例11：基于粉末#3的止血胶原的性能

在体内实验期间测试了如在实施例9中所制备的含有胶原、葡萄糖、硫酸软骨素，不含凝血酶的基于胶原的粉末#3。

该实验的规程如下：

-在左旁正中肝叶表面上造成大小为大约10*10*1-3mm³的伤口。

-然后在30秒期间施用测试中产物。施用了足量的产物以覆盖伤口；将测试材料使用纱布通过温和按压保持在伤口位点。

-然后做了出血评级(bleeding grading)以评价所达到的止血的百分数。如果达到了临床可接受的止血，则停止实验。否则，再完成另一轮按压-评级，最多5轮按压。在每一轮都更新接受实验的产物。

用下述产物进行了实验：不带任何止血组合物的纱布(称为“对照”)，由止血粉末#3所覆盖的纱布(称为“GHP#3”)，来自Davol的止血纱布“Avitene”(称作“Avitene”，由胶原纤维构成)，来自Ethicon的止血纱布“Surgicel”(称为“Surgicel”，由氧化纤维素(oxidized cellulosis)构成)。

结果在下述表1中总结，其显示了每种产物所达到的止血的百分数：

表1

	第1轮	第2轮	第3轮	第4轮	第5轮
						对照	18.2％	36.4％	36.4％	63.6％	63.6％
GHP#3	81.8％	100％	100％	100％	100％
						Avitene	85.7％	85.7％	71.4％	100％	100％
Surgicel	71.4％	100％	100％	100％	100％

该实验显示了本发明所提出的止血粉末是非常有效和非常快速的，因为在仅两轮后即可完全止血，而仅在第1轮后即有高于80％的效率。

对于“Avitene”，在第2轮和第3轮之间所达到的止血的百分数的下降是因为伤口又开始流血了。

实施例12：基于粉末#4的止血胶原的性能

在体内实验中测试了如在实施例10中所制备的含有胶原、葡萄糖、硫酸软骨素、和凝血酶的基于胶原的粉末#4.

实验的规程如下：

-动物模型：肝素化的猪

-腹部外科手术：

○中线腹腔镜(midline laparoscopy)；肝暴露(liver exposition)；以手术刀，大约10*10*1-3mm³的切向(tangential)肝伤口

○施用测试中产物将伤口良好覆盖；在2min期间按压；

○流血评分(等级从0到4)；如果成功则在第1轮停止。否则，开始新一轮的按压和流血评分；最多允许5轮。

-髂嵴(iliac crest)外科手术：

○背侧皮肤(dorsal lateral skin)和肌肉切口以暴露髂嵴；骨皮质切除术(corticotomy)使得骨松质(spongy bone)暴露(大约12*12*3mm³的缺损)

○施用测试中产物将伤口良好覆盖；在2min期间按压；

○流血评分(等级从0到4)；如果成功则在第1轮停止。否则，开始新一轮的按压和流血评分；最多允许5轮。

该实验是以以下产物进行的：不带任何止血组合物的纱布(称为“对照”)，止血粉末#4覆盖的纱布(称为“GHP#4”)，来自Baxter的止血纱布“Floseal”(称为“Floseal”，由明胶基质凝胶+凝血酶构成)，来自Ethicon的止血纱布“Surgicel”(称为“Surgicel”，由氧化纤维素构成)

-结果如下：腹部外科手术(n＝8至10次重复)-10min的按压后给出结果(＝5轮，每轮2min)

○对照：10/10失败

○GHP#4：11/11成功

○Floseal：9/9成功

○Surgicel：8/10成功；2/10失败

-整形外科(orthopeadic)(n＝4次重复)-在10min的按压后给出结果(＝5轮，每轮2min)

○对照：1/4成功；3/4失败

○GHP#4：4/4成功

○Floseal：3/4成功；1/4失败

○Surgicel：4/4成功

该实验显示本发明提出的止血粉末对任何种类的伤口都100％有效，与市场的产品不同其是伤口特异性的。

实施例13：胶原表征→胶原中可溶性胶原的存在，确定纤维/原纤维胶原和非原纤维胶原之间的比值

实验的目标是确定胶原中(提取的胶原或研磨成粉末的胶原)的纤维/原纤维胶原和非原纤维的比例。此种比例可以通过研究胶原中的不可溶(对应于纤维/原纤维胶原)和可溶胶原(对应于非原纤维胶原)的比例而确定。

该实验包括在16小时期间将大约2.5g的测试中胶原溶解于166mL pH13的水中。然后将溶液离心(在10分钟期间10 000rpm)。然后将上清(对应于非原纤维胶原)和残留物(对应于纤维/原纤维胶原)分开。以连续的丙酮浴(acetone baths)和在受控的空气流下将残留物直接干燥。以6M的醋酸和盐酸将上清的pH调节至pH 3。通过添加NaCl 0.6M和通过进行离心从上清获得固体胶原。然后将其以连续的丙酮浴和在受控的空气流下干燥。

计算了来自残留物(M_残留)和来自上清(M_上清)的胶原重量，且公式M_残留/(M_残留+M_上清)x100给出纤维胶原在胶原总量中的百分数。

在本发明中，对于用于制备粉末的胶原和最终胶原粉末二者，M_残留/(M_残留+M_上清)都必须高于80％。优选比值高于85％。

例如，三批次如在实施例6中所制备的胶原所做的以上实验分别给出了相似的92.67％，94.60％和91.51％的比值。在将这三个批次的胶原研磨后，其比值依然非常相似，分别为91.63％，88.02％，和88.69％。

显示纤维/原纤维胶原和可溶性胶原的存在的另一种方法是进行SDS PAGE电泳。

图1例示了这类电泳，其中样品S1对应于第一批次的上清(从如在实施例6中所提取的胶原制得)，样品S2对应于第一批次的残留物，且样品S3对应于第二批次的上清(也是从如在实施例6中所提取的胶原制得)，样品S4对应于该第二批次的残留物。

该结果显示对于来自残留物的胶原，大量的纤维不能迁移通过丙烯酰胺凝胶并在凝胶的顶部染色。样品的制备不允许将每条链从胶原分开。因此，alpha链以非常低的量存在。来自上清的胶原能够整个迁移进凝胶，没有纤维被阻塞在顶部，在电泳过程中胶原的链被完全地分开了。

参考文献资料

-WO 2005/072700

-“Nature designs tough collagen:explaining the nanostructure ofcollagen fibrils,”由Markus Buehler所著(PNAS,August 15,2006,vol.103,no.33,pp.12285-12290)

-“Extraction of collagen from connective tissue by neutral saltsolutions”由

Gross,John H.Highberger和Francis O.Schmitt所著(Proceedingsof the NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES Volume 41Number I January 15,1955)

-WO 2010/125086

-FR2944706

-WO 01/97873

本发明包括以下内容：

1.一种粉末形式的止血组合物，其包含

-原纤维类型的胶原，所述胶原包含按相对于胶原的总重量的重量计至少70％的纤维胶原和/或原纤维胶原含量，以及

-至少一种单糖。

2.项1的组合物，其中所述组合物包含按相对于组合物的总重量的重量计80％-90％范围的胶原含量。

3.项1至2任一项的组合物，其中所述组合物包含按相对于组合物的总重量的重量计1％到12.5％范围的单糖含量。

4.项1至2任一项的组合物，其中所述组合物包含从10到50范围，且优选为19的胶原/单糖重量比值。

5.项1至4任一项的组合物，其中所述胶原包含按相对于胶原的总重量的重量计85％到95％范围的纤维胶原和/或原纤维胶原含量。

6.项1至5任一项的组合物，其中所述组合物还包含按相对于组合物的总重量的重量计2％到25％范围的糖胺聚糖含量。

7.项1至8任一项的组合物，其中所述组合物还包含在2到40范围的胶原/总糖化合物的重量比值，其中总糖化合物的重量是单糖的重量和糖胺聚糖的重量之和。

8.项1至7任一项的组合物，其中所述组合物还包含凝血因子，特别是凝血酶，其量的范围为0.01IU/mg至20IU/mg组合物。

9.项1至8任一项的组合物，其中所述组合物具有大于0.4g/mL的致密密度(tappeddensity)。

10.项1至9任一项的组合物，其中所述组合物包含按重量计至少50％的颗粒，所述颗粒的大小在200μm和400μm之间。

11.项1至10任一项的组合物，其包含：

-按相对于组合物的总重量的重量计86.36％的量的胶原，

-按相对于组合物的总重量的重量计4.54％的量的葡萄糖，

-按相对于组合物的总重量的重量计的9.09％的量的硫酸软骨素。

12.项11的组合物，还包含凝血酶，其量为0.2IU/mg至2IU/mg组合物。

13.一种用于制备止血组合物的方法，其至少包括以下步骤：

a)形成包含原纤维类型的胶原和至少一种单糖的水性悬液，所述原纤维类型的胶原具有按相对于胶原的总重量的重量计的至少70％的纤维胶原和/原纤维胶原含量，

b)以沉淀、糊、或凝胶形式回收产物，特别是通过离心或倾析，

c)干燥产物，

d)将产物研磨至合意的粒度。

14.项13的方法，其中所述在步骤a)中使用的胶原是通过碱性提取获得的。

15.项13或14任一项的方法，还包括在步骤d)之后的步骤e)，其包括添加至少一种选自下组的化合物：

-凝血因子，特别是凝血酶，以及

-糖胺聚糖，特别是硫酸软骨素、硫酸皮肤素、透明质酸、及其混合物。

16.项1至12的组合物或可以通过如项13所定义的方法而获得的组合物，其用于与止血剂相同的用途。

17.一种试剂盒，其包含

-项1至12和16任一项的组合物，和

-喷雾设备。

Claims (57)

1.粉末形式的止血组合物，其包含

-原纤维类型的胶原，所述原纤维类型的胶原包含相对于所述原纤维类型的胶原的总重量按重量计至少80％的纤维胶原和/或原纤维胶原含量，所述原纤维类型的胶原以相对于所述组合物的总重量按重量计75％至96％范围的含量；

-相对于所述组合物的总重量按重量计1％至12.5％范围的含量的至少一种单糖；以及

-相对于所述组合物的总重量按重量计2％至20％范围的含量的至少一种糖胺聚糖，

其中构成所述粉末的颗粒具有从10μm至500μm的平均粒度范围。

2.权利要求1的组合物，其中构成所述粉末的颗粒具有从50μm至400μm的平均粒度范围。

3.权利要求1的组合物，其中按重量计至少90％的构成所述粉末的颗粒能够穿过筛目为500μm的筛网。

4.权利要求1的组合物，其中按重量计至少90％的构成所述粉末的颗粒能够被筛目为10μm的筛网保留。

5.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含10至50范围的原纤维类型的胶原/单糖重量比值。

6.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含19的原纤维类型的胶原/单糖重量比值。

7.权利要求1的组合物，其中所述原纤维类型的胶原包含相对于所述原纤维类型的胶原的总重量按重量计85％至95％范围的纤维胶原和/或原纤维胶原含量。

8.权利要求1的组合物，其中所述组合物进一步包含2至40范围的原纤维类型的胶原/总糖化合物重量比值，其中所述总糖化合物的重量是单糖的重量和糖胺聚糖重量之和。

9.权利要求1的组合物，其中所述组合物进一步包含凝血因子，所述凝血因子以0.01IU/mg至20IU/mg组合物范围的量。

10.权利要求9的组合物，其中所述凝血因子是凝血酶。

11.权利要求1的组合物，其中所述组合物具有大于0.4g/mL的致密密度(tappeddensity)。

12.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含按重量计至少50％的颗粒，所述颗粒的大小在200μm和400μm之间。

13.权利要求1的组合物，其中所述糖胺聚糖选自硫酸软骨素、硫酸皮肤素、透明质酸及其混合物。

14.权利要求1的组合物，其包含：

-相对于所述组合物的总重量按重量计86.36％的量的原纤维类型的胶原；

-相对于所述组合物的总重量按重量计4.54％的量的葡萄糖；以及

-相对于所述组合物的总重量按重量计9.09％的量的硫酸软骨素。

15.权利要求14的组合物，其进一步包含凝血酶，所述凝血酶以0.2IU/mg至2IU/mg组合物的量。

16.用于制备止血组合物的方法，其至少包括以下步骤：

a)形成包含通过碱性提取获得的原纤维类型的胶原和至少一种单糖的水性悬液，所述原纤维类型的胶原具有相对于所述原纤维类型的胶原的总重量按重量计至少80％的纤维胶原和/或原纤维胶原含量，其中所述原纤维类型的胶原含量为相对于所述组合物的总重量按重量计75％至96％范围，单糖含量为相对于所述组合物的总重量按重量计1％至12.5％范围。

b)以沉淀、糊、或凝胶形式回收所述产物，

c)干燥所述产物，

d)将所述产物研磨至合意的粒度，

e)添加至少一种糖胺聚糖，所述至少一种糖胺聚糖以相对于所述组合物的总重量按重量计2％至20％范围的含量，

其中所述合意的粒度为从10μm至500μm的平均粒度范围。

17.权利要求16的方法，其中所述合意的粒度为从50μm至400μm的平均粒度范围。

18.权利要求16的方法，其中所述合意的粒度为按重量计至少90％的颗粒能够穿过筛目为500μm的筛网。

19.权利要求16的方法，其中所述合意的粒度为按重量计至少90％的颗粒能够被筛目为10μm的筛网保留。

20.权利要求16的方法，其中在步骤b)中通过离心或倾析进行所述产物的回收。

21.权利要求16的方法，其中在步骤e)中进一步添加至少一种凝血因子。

22.权利要求21的方法，其中所述凝血因子是凝血酶。

23.权利要求16的方法，其中所述糖胺聚糖选自硫酸软骨素、硫酸皮肤素、透明质酸、及其混合物。

24.权利要求1至15任一项的组合物，其作为止血剂使用。

25.试剂盒，其包含：

-权利要求1至15任一项的组合物，和

-喷雾设备，

其中所述组合物具有大于0.4g/mL的致密密度，

且所述组合物包含按重量计至少50％的颗粒，所述颗粒的大小在200μm和400μm之间。

26.粉末形式的止血组合物，其包含

-原纤维类型的胶原，所述原纤维类型的胶原包含相对于所述原纤维类型的胶原的总重量按重量计至少80％的纤维胶原和/或原纤维胶原含量，所述原纤维类型的胶原以相对于所述组合物的总重量按重量计70％-99％范围的含量；

-相对于所述组合物的总重量按重量计1％至12.5％范围的含量的至少一种单糖；以及

-以0.01IU/mg至20IU/mg范围的含量的至少一种凝血因子，

其中构成所述粉末的颗粒具有从10μm至500μm的平均粒度范围。

27.权利要求26的组合物，其中构成所述粉末的颗粒具有从50μm至400μm的平均粒度范围。

28.权利要求26的组合物，其中按重量计至少90％的构成所述粉末的颗粒能够穿过筛目为500μm的筛网。

29.权利要求26的组合物，其中其中按重量计至少90％的构成所述粉末的颗粒能够被筛目为10μm的筛网保留。

30.权利要求26的组合物，其中所述组合物包含相对于所述组合物的总重量按重量计75％至96％范围的原纤维类型的胶原含量。

31.权利要求26的组合物，其中所述组合物包含相对于所述组合物的总重量按重量计77％至93％范围的原纤维类型的胶原含量。

32.权利要求26的组合物，其中所述组合物包含相对于所述组合物的总重量按重量计80％至90％范围的原纤维类型的胶原含量。

33.权利要求26的组合物，其中所述组合物包含相对于所述组合物的总重量按重量计1.5％至10％范围的单糖含量。

34.权利要求26的组合物，其中所述组合物包含相对于所述组合物的总重量按重量计2％至8％范围的单糖含量。

35.权利要求26的组合物，其中所述组合物包含相对于所述组合物的总重量按重量计2.5％至7.5％范围的单糖含量。

36.权利要求26的组合物，其中所述组合物包含10至50范围的原纤维类型的胶原/单糖重量比值。

37.权利要求26的组合物，其中所述组合物包含19的原纤维类型的胶原/单糖重量比值。

38.权利要求26的组合物，其中所述原纤维类型的胶原包含相对于所述原纤维类型的胶原的总重量按重量计85％至95％范围的纤维胶原和/或原纤维胶原含量。

39.权利要求26的组合物，其中所述组合物进一步包含糖胺聚糖，所述糖胺聚糖以相对于所述组合物的总重量按重量计2％至20％范围的含量。

40.权利要求26的组合物，其中所述组合物进一步包含糖胺聚糖，其中所述原纤维类型的胶原/总糖化合物重量比值范围为2至40，其中所述总糖化合物重量是单糖的重量和糖胺聚糖重量之和。

41.权利要求39或40的组合物，其中所述糖胺聚糖选自硫酸软骨素、硫酸皮肤素、透明质酸、及其混合物。

42.权利要求26的组合物，其中所述组合物包含0.05IU/mg至10IU/mg范围的含量的凝血因子。

43.权利要求26的组合物，其中所述组合物包含0.1IU/mg至5IU/mg范围的含量的凝血因子。

44.权利要求26的组合物，其中所述组合物包含0.2IU/mg至2IU/mg范围的含量的凝血因子。

45.权利要求26的组合物，其中所述至少一种凝血因子是凝血酶。

46.权利要求26的组合物，其中所述组合物具有大于0.4g/mL的致密密度。

47.权利要求26的组合物，其中所述组合物包含按重量计至少50％的颗粒，所述颗粒的大小在200μm和400μm之间。

48.制备止血组合物的方法，其至少包括以下步骤：

a)形成包含原纤维类型的胶原和至少一种单糖的水性悬液，所述原纤维类型的胶原具有相对于所述原纤维类型的胶原的总重量按重量计至少80％的纤维胶原和/或原纤维胶原含量，其中原纤维类型的胶原含量为相对于所述组合物的总重量按重量计70％至99％范围，且单糖含量为相对于所述组合物的总重量按重量计1％至12.5％范围，

b)以沉淀、糊、或凝胶形式回收所述产物，

c)干燥所述产物，

d)将所述产物研磨至合意的粒度，

e)添加至少一种凝血因子，所述凝血因子以0.01IU/mg至20IU/mg范围的含量，

其中所述合意的粒度为从10μm至500μm的平均粒度范围。

49.权利要求48的方法，其中所述合意的粒度为从50μm至400μm的平均粒度范围。

50.权利要求48的方法，其中所述合意的粒度为按重量计至少90％的颗粒能够穿过筛目为500μm的筛网。

51.权利要求48的方法，其中所述合意的粒度为按重量计至少90％的颗粒能够被筛目为10μm的筛网保留。

52.权利要求48的方法，其中在步骤b)中通过离心或倾析进行所述产物的回收。

53.权利要求48的方法，其中在步骤a)中使用的所述原纤维类型的胶原通过碱性提取获得。

54.权利要求48的方法，其中所述凝血因子是凝血酶。

55.权利要求48的方法，其中在步骤e)中进一步添加至少一种糖胺聚糖。

56.权利要求26至41任一项的组合物作为止血剂的用途。

57.试剂盒，其包含：

-权利要求26至41任一项的组合物；和

-喷雾设备，

其中所述组合物具有大于0.4g/mL的致密密度，

且所述组合物包含按重量计至少50％的颗粒，所述颗粒的大小在200μm和400μm之间。

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