CN106389411A - 一种具有脑保护作用的药物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有脑保护作用的药物及其制备方法，其活性成分为银杏内酯L，银杏内酯L具备脑保护作用，具体包括对脑卒中后血小板聚集的抑制作用和神经保护作用。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及一种具有脑保护作用的药物及制备方法，具体涉及一种银杏内酯L的制备方法及其脑保护作用研究，包括对脑卒中后血小板聚集的抑制作用和神经保护作用。
背景技术
银杏是古老的中生代植物，有裸子植物活化石之称。其提取物近年来引起国际高度重视。现代研究表明：银杏叶中含有黄酮类、萜类、酚类、生物碱类、多糖等多种具有药理活性的成分[K.Stromgaard et al，Angew Chem Int Ed Engl，43(2004)，1640-1658.]。银杏内酯是银杏叶中的萜类内酯化合物，包括内酯A，B，C，白果内酯，K，L等。
对于银杏总内酯以及常见单体内酯的分离，目前已经有很多报道，例如刘大伟等人利用溶剂萃取-柱层析方法，得到了纯度较高的银杏总内酯[刘大伟等，科技创新导报，25(2011)]。韩亚荣建立了合适的柱层析方法，得到了高纯度的银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C单体[韩亚荣等，亚太传统医药，8(2009)，第5卷第8期]。然而，对于银杏内酯中的稀有成分，如内酯L的研究较少，对于内酯L的制备方法，目前只有一个专利，一种银杏内酯L的制备方法(CN104356141 A)，该方法以银杏内酯A为原料，经过脱水反应，可以得到内酯L。
银杏内酯(萜类内酯)被认为是银杏叶中脑保护的的主要活性成分。银杏内酯对血小板活化因子受体(PAF)有强大的特异性抑制作用，能有效的防止脑卒中后的血小板聚集和血栓的形成[K.Stromgaard et al，Angew Chem Int EdEngl，43(2004)，1640-1658.]。此外，研究还发现银杏内酯具有减少脑缺血引起的神经元调亡和坏死、发挥神经保护作用[F.V.DeFeudis et al，Curr DrugTargets，1(2000)，25-58.]。目前来讲，对于银杏内酯的药理活性研究已经越来越深入，银杏内酯L在银杏叶中含量极低，关于其药理活性尚未有过研究报道，难以预期银杏内酯L是否能起到脑保护作用。
发明内容
本发明公开了一种具有脑保护作用的药物，以银杏内酯L为活性成分。
本发明公开了一种具有脑保护作用的药物，以银杏内酯L为活性成分，银杏内酯L具备抗血小板聚集、抗凝血的作用和神经保护作用。
本发明公开了一种具有脑保护作用的药物，以银杏内酯L为活性成分，银杏内酯L具备对脑卒中后血小板聚集的抑制作用和神经保护作用。
本发明公开了一种抗血小板聚集的药物，以银杏内酯L为活性成分；银杏内酯L具备神经保护作用，用于脑保护。
本发明公开了一种抗凝血作用的药物，以银杏内酯L为活性成分；银杏内酯L具备神经保护作用，用于脑保护。
本发明公开了一种抗凝血作用的药物，银杏内酯L用量范围为5-320μM。
本发明公开了一种具备神经保护作用的药物，以银杏内酯L为活性成分；银杏内酯L具备抑制脑卒中后的血小板聚集作用，用于脑保护。
本发明公开了一种具备神经保护作用的药物，以银杏内酯L为活性成分；银杏内酯L具备抗凝血作用，用于脑保护。
本发明公开了一种具备神经保护作用的药物，银杏内酯L用量范围为2-80μM。
本发明公开了一种从银杏总内酯制备银杏内酯L的方法。
本发明公开了一种具有良好的水溶性、稳定性的银杏内酯L复合物。
本发明公开了银杏内酯L及其复合物的医药用途。
本发明公开了一种银杏内酯L的复合物的制备方法：是以银杏内酯L和碱性物质制备得到：
精氨酸、赖氨酸、组氨酸、甘氨酸等及其衍生物；
甲胺、乙胺、丙胺、丁胺、乙二胺、葡甲胺、尿素、盐酸胍、1，2-乙二胺、乙醇胺等及其衍生物；
甲酰胺、二甲基甲酰胺、羟泛酸、烟酰胺等酰胺类；
烷基咪唑、烷基吡啶、烷基三甲基胺盐、盐酸硫胺等；
金属碱性物质如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化钡；
分子中含有一个至八个碳原子的含氮有机物。
本发明所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来进一步实现。本发明还提供了一种银杏内酯L的复合物的制备方法，银杏内酯L与碱性物质以为1∶0.2～5的比例，在水和/或醇溶剂中形成复合物。
本发明公开了一种银杏内酯L的复合物的制备方法，其步骤如下：取碱性物质，加水溶解，加热至70-90℃，加入银杏内酯L，搅拌溶解，浓缩，干燥浓缩物，即得。
本发明公开了一种银杏内酯L的复合物的制备方法，其特点是，其步骤如下：取碱性物质，加水与有机溶剂任意比混合溶液溶解，加热至40-70℃，加入银杏内酯L的(甲醇、乙醇等)溶液，搅拌至溶解，过滤，滤液减压浓缩，回收有机溶剂，干燥浓缩物，即得。
本发明公开了碱性物质是精氨酸、赖氨酸、葡甲胺。
银杏内酯L总内酯可以通过市售获得，也可以通过已知方法获得。
本发明公开了一种银杏内酯L的分离制备方法，其特征在于：
从银杏总内酯中制备了高纯度的银杏内酯L单体，含量在98％以上。
一种银杏内酯L的制备方法：
以银杏总内酯为原料，洗脱体系为：
柱层析硅胶为100-300目，洗脱体系为石油醚+乙酸乙酯，洗脱梯度为300∶1-10∶1；
柱层析硅胶为100-300目，洗脱体系为氯仿+甲醇，洗脱梯度为300∶1-10∶1；
柱层析硅胶为100-300目，洗脱体系为石油醚+丙酮，洗脱梯度为300∶1-10∶1。
一种银杏内酯L的制备方法：
以银杏总内酯为原料，选用200-300目硅胶，干法装柱，称取银杏总内酯20g，与100目硅胶混匀，干法上样；选用氯仿-甲醇做为洗脱剂，比例为150∶1，100∶1，50∶1，20∶1递减，梯度洗脱后，利用HPLC-ESI-Q/TOF-MS检测洗脱液成分，得到含有银杏内酯L的洗脱液，旋干后得到淡黄色固体粉末，即为银杏内酯L。
一种银杏内酯L的制备方法：
称取10g银杏总内酯，选用200-300目硅胶，干法装柱，称取银杏总内酯20g，与100目硅胶混匀，干法上样；选用氯仿-甲醇做为洗脱剂，比例为150∶1，100∶1，50∶1，20∶1递减，梯度洗脱后，在50∶1时得到内酯L的洗脱液，旋干后得到淡黄色固体粉末，即为银杏内酯L。
一种银杏内酯L的制备方法：
称取10g银杏总内酯，乙酸乙酯溶解，混合20g硅藻土，拌匀，挥干，研磨，过筛，选用200-300目硅胶，干法装柱，选择高50cm，内径6cm的层析柱，柱层析硅胶为500g，石油醚拌匀，待沉降稳定后，柱高约35cm，选用石油醚-乙酸乙酯做为洗脱剂，比例为200∶1，100∶1，50∶1，20∶1递减，每一个梯度用3倍柱体积的洗脱液洗脱，在20∶1时得到内酯L的洗脱液，旋干后得到淡黄色固体粉末，即为银杏内酯L。
本发明公开了银杏内酯L，用有机溶剂溶解，浓缩，重结晶至高纯度银杏内酯L。
本发明公开了银杏内酯L的重结晶的方法，在溶剂加热、搅拌溶解，放冷析晶，滤过，沉淀洗涤，沉淀干燥恒重，最终得银杏内酯L结晶。
本发明公开了一种银杏内酯L的组合物，制成胶囊、软胶囊、片剂、滴丸、口服液、注射剂、冻干粉、输液剂、脂质体注射剂，靶向给药注射剂、栓剂、缓释制剂、控释制剂。
本发明公开了一种银杏内酯L的组合物，用于制备抗血小板聚集、抗凝血的作用、神经保护、治疗脑卒中，抗血栓、治疗老年痴呆的药物中的用途。
本发明公开了一种银杏内酯L的复合物的组合物，制成胶囊、软胶囊、片剂、滴丸、口服液、注射剂、冻干粉、输液剂、脂质体注射剂，靶向给药注射剂、栓剂、缓释制剂、控释制剂。
本发明公开了一种银杏内酯L的复合物的组合物，用于制备抗血小板聚集、抗凝血的作用、神经保护、治疗脑卒中，抗血栓、治疗老年痴呆的药物中的用途。
一种银杏内酯L的检测方法
实验仪器
高效液相系统为Agilent 1290series HPLC system(Agilent Technologies，USA)；质谱分析采用Agilent 6530HPLC-ESI-Q/TOF-MS系统(Agilent，德国)，具电喷雾离子源(ESI)，双高压泵、脱气机、盘式自动进样器、柱温箱和DAD检测器。Sovall Evolution RC型高速冷冻离心机(KENDRO，美国)；BP 211D十万分之一电子天平(Sartorius)；真空离心干燥/定量浓缩仪(GeneVac EZ-2，英国)。
液相色谱条件
色谱柱为Agilent Zorbax Extend-C18柱(2.1mm×150mm，5μm)。
检测波长203nm。
色谱条件：流动相0.1％甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，
洗脱梯度：
0-11min，20％B-30％B；
11-14min，30％B-35％B；
14-18min，35％-100％B；
18-21min，100％-100％B。
柱温：25℃，流速0.5mL/min。
质谱分析条件：
Q-TOF-MS为Agilent 6530HPLC-ESI-Q/TOF-MS系统，使用ESI离子源，具体条件为：
干燥气(N2)流速，10L/min；干燥气温度350℃；
正离子扫描，雾化压力(N2)，35psig；
鞘气温度，350℃；鞘气流速，11.0L/min；
毛细管电压，3500；锥孔电压，65V；
OCT RFV，750V；碎片电压，120V；
二级碰撞能量，10V，20V；
采用全扫描模式，离子质量数扫描范围设置位m/z 100-1100。
正离子模式下采集数据，参比离子包括m/z112.9859和1033.9881。
数据采集与处理分别采用Agilent LC-Q-TOF-MS Data AcquisitionSoftware Version B.05.01及Qualitative Analysis Software Ver.B.06.00分析软件(Agilent Technologies)。
实验结果如图1-图3：
因此，本发明涉及的银杏内酯L的分离制备方法，操作简单，得率高。
一种银杏内酯L的血小板聚集的抑制作用
仪器与试剂
二水合柠檬酸三钠(南京化学试剂有限公司)；盐酸丁卡因(浙江九旭药业有限公司)；二磷酸腺苷(ADP，美国Sigma-Aldrich公司)；LBY-NJ4血小板聚集仪(北京普利生公司)；Vortex-Genie2涡旋振荡器(美国ScientificIndustries公司)；80-2台式低速离心机(上海医疗器械有限公司手术器械厂)。
血浆样品的制备
家兔用丁卡因局部麻醉后，手术分离颈总动脉取血，用3.8％枸橼酸钠1∶9抗凝，以500r/min离心10min，制备富血小板血浆(PRP)，剩余部分再以3000r/min离心10min，制备贫血小板血浆(PPP)，用PPP调整血小板计数为4x108/ml。按比浊法进行血小板聚集实验。
血小板聚集率的测定
比浊法检测血小板聚集原理：比浊法(Turbidimetric plateletaggregometry，TP A)由Born于1962年最先应用，是一种比较广泛的检测血小板聚集功能的方法。其原理是离心制备贫血小板血浆(platelet poor plasma，PPP)和富血小板血浆(platelet rich plasma，PRP)，将PPP所测得的透光率视为100％，PRP的透光率视为0％。将PRP置于比色管中，加入诱导剂，在搅拌的条件下，诱导剂与血小板膜受体之间相互作用，使膜表面糖蛋白受体II b/IIIa(GPII b/IIIa)活化，与血浆中的纤维蛋白原结合，引起血小板逐渐聚集，血浆浊度下降，透光率增加，光电池迅速将光浊度的信号转换为电讯号，血小板聚集仪自动地进行动态测量和记录，从而描绘出血小板聚集曲线。此法利用血小板聚集仪能够比较方便地获得血小板聚集情况，从而评价血小板的聚集功能。
操作步骤：以PPP调零，比浊管中加入PRP 260μL，受试药物30μL，温孵5min，，以10μL PAF(终浓度1.5μmol/L)为诱导剂，比浊法测定在诱导剂加入5min内血小板的最大聚集率，并计算血小板聚集抑制率。
血小板聚集抑制率按下式计算：
血小板聚集抑制率(％)＝[1-对照组聚集百分率/给药组聚集百分率)]x100
本实验称取银杏内酯L粉末溶于二甲基亚砜中，制成400mM的母液贮存，使用时稀释至终浓度320μM、160μM、80μM、40μM、20μM、10μM、5μM，测定血小板聚集抑制率。数据处理使用GraphPad Prism 6.02软件。
表1：银杏内酯L对PAF诱导的血小板聚集的抑制率
| 浓度(μM) | 抑制率(％) | SD |
| 5 | 5.407988 | 4.898149 |
| 10 | 6.873049 | 4.240127 |
| 20 | 22.339 | 4.627235 |
| 40 | 44.35314 | 1.856017 |
| 80 | 78.53366 | 2.711484 |
| 160 | 90.12676 | 2.358559 |
| 320 | 98.28015 | 1.193388 |
抑制曲线见图4，IC50为42.37μM。
银杏内酯L的神经保护作用
仪器与试剂
DMEM高糖培养基、0.25％胰蛋白酶、胎牛血清、青霉素-链霉素溶液(美国Life Technologies公司)；DMSO(美国Sigma公司)；96孔板(美国Corning公司)；多功能酶标仪(Bio-Tek Instruments，USA)；生物安全柜(Thermo FisherScientific，USA)，CO2细胞培养箱(Thermo Fisher Scientific，USA)。
细胞株
本实验应用N2A细胞株是小鼠源性永生化神经元细胞。细胞培养于正常含10％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的DMEM(GIBCO，USA)的完全培养基中。
氧糖剥夺/复糖复氧模型
N2A细胞培养并接种于细胞培养板中，进行体外氧糖剥夺/复糖复氧模型(oxygen-glucose deprivation，OGD)的制备，首先将完全培养基换成无糖的DMEM培养基。置入参数预先设置好的三气培养箱(气体参数设置为：1％O2，94％N2，5％CO2)，O2浓度降至1.0％时开始计时，稳定4h后，将Eagles液换成含10％FBS DMEM的完全培养基，并置于正常(气体参数设置为：21％O2，74％N2，5％CO2)的细胞培养箱中继续培养。
实验分组与给药
培养N2A细胞并接种于细胞培养板中，随机分为正常对照组、OGD组、OGD+药组。将N2A细胞氧糖剥夺(oxygen-glucose deprivation，OGD)4h，OGD完成后换正常培养基时继续给予银杏内酯L，复糖复氧20h后检测细胞活力。N2A细胞在正常状态下，细胞透亮，呈类圆形，有突起；OGD 1h复糖复氧24h后，细胞胞体增大，突起缩短。
统计学分析
采用GraphPad Prism-6.02统计软件(GraphPad Software，USA)进行统计分析和图表处理。空白组与模型两组均数比较采用双尾t检验，其余各组两均数间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，以Dunnett’s post-hot检验进一步检测组间显著性差异。以P＜0.05作为具有显著性差异，P＜0.001为具有非常显著性差异。
实验结果：
缺血性脑卒中血管堵塞后，神经元细胞会缺氧损伤，卒中后脑血管再通后，神经元细胞会复氧产生再灌注损伤。应用体外培养的氧糖剥夺/复糖复氧损伤后的神经元细胞模型，如表2及图5所示，模型组与空白组细胞存活率相比具有显著性差异，说明造模成功(P＜0.001)。在氧糖剥夺时和复糖复氧后给予银杏内酯L保护后，与模型组相比，银杏内酯L给药20μM、40μM时，神经元细胞存活率较模型组显著提高(P＜0.001)。说明银杏内酯L可有效保护脑卒中引起的神经元细胞损伤。
表2：银杏内酯L抑制氧糖剥夺/复糖复氧模型诱导的神经元细胞损伤
附图说明
图1：银杏总内酯的总离子流图。
图2：银杏内酯L的总离子流图。
图3：银杏内酯L的二级质谱图。
图4：GL的IC50曲线图。
图5：GL能抑制氧糖剥夺/复糖复氧模型诱导的神经元细胞损伤。
图1的具体解释：银杏总内酯的总离子流图。将总内酯溶于丙酮中，配制成1mg/ml的溶液，按照上述色谱条件，进样1μl，如图1。在图1中，通过与银杏内酯L标准品比对的保留时间及质谱信息可知，银杏内酯L在14.3min出峰，峰很小，几乎观察不到。
图2的具体解释：银杏内酯L的总离子流图。将分离所得的银杏内酯L标准品溶于丙酮，配成100μg/ml的溶液，按照上述色谱条件，进样1μl，如图2。在图2中，银杏内酯L于14.3min出峰。
图3的具体解释：银杏内酯L的二级质谱图，如图3。
图4的坐标的具体解释
图4的横坐标的中文含义：银杏内酯L的浓度(μM)的对数值。
图4的纵坐标的中文含义：血小板聚集抑制率，单位(％)。
图5的坐标的具体解释
图5的横坐标的中文含义：给药浓度(μM)。
图5的纵坐标的中文含义：神经元细胞存活率，单位(％)
具体实施方式
以下通过实施例对本发明进行进一步说明，具体实施方式不限于实施例所述。
实施例1
一种银杏内酯L的分离制备方法：
称取10g银杏总内酯，选用200-300目硅胶，干法装柱，称取银杏总内酯20g，与100目硅胶混匀，干法上样；选用氯仿-甲醇做为洗脱剂，比例为150∶1，100∶1，50∶1，20∶1递减，梯度洗脱后，在50∶1时得到内酯L的洗脱液，旋干后得到淡黄色固体粉末，即为银杏内酯L。
实施例2
称取10g银杏总内酯，乙酸乙酯溶解，混合20g硅藻土，拌匀，挥干，研磨，过筛，选用200-300目硅胶，干法装柱，选择高50cm，内径6cm的层析柱，柱层析硅胶为500g，石油醚拌匀，待沉降稳定后，柱高约35cm，选用石油醚-乙酸乙酯做为洗脱剂，比例为200∶1，100∶1，50∶1，20∶1递减，每一个梯度用3倍柱体积的洗脱液洗脱，在20∶1时得到内酯L的洗脱液，旋干后得到淡黄色固体粉末，即为银杏内酯L。
实施例3
一种银杏内酯L·精氨酸复合物，取4克精氨酸，加乙醇100ml溶解，加热至70℃，加入10克银杏内酯L，搅拌溶解，浓缩，干燥，即得。
实施例4.
一种银杏内酯L·赖氨酸复合物，取赖氨酸2.5克，加乙醇20ml溶解，加热至40℃，10克银杏内酯L，搅拌至溶解，过滤，滤液减压浓缩，回收乙醇，干燥，即得银杏内酯L·赖氨酸复合物。
实施例5
一种银杏内酯L·葡甲胺复合物，取葡甲胺4克，加无水乙醇100ml溶解，加热至70℃，加入10克银杏内酯L，搅拌至溶解，过滤，滤液减压浓缩，回收乙醇，干燥，即得。
实施例6
一种银杏内酯L·组氨酸复合物，取组氨酸2.0克，加25％乙醇100ml溶解，加热至90℃，加入10银杏内酯L，搅拌溶解，浓缩，干燥，即得。
实施例7
一种银杏内酯L·丁胺复合物，取丁胺4克，加25％乙醇100ml溶解，加热至75℃，加入10克银杏内酯L，搅拌至溶解，浓缩，干燥，即得。
实施例8
一种银杏内酯L·盐酸胍复合物，取盐酸胍4克，加25％乙醇80ml溶解，加热至85℃，加入10克银杏内酯L，搅拌至溶解，浓缩，干燥，即得。
实施例9
一种银杏内酯L·乙醇胺复合物，取乙醇胺6克，加25％甲醇50ml溶解，加热至60℃，加入10克银杏内酯L，搅拌至溶解，浓缩，干燥，即得。
实施例10
一种银杏内酯L·乙二胺复合物，取乙二胺4克，加80％乙醇20ml溶解，加热至45℃，加入10克银杏内酯L，搅拌至溶解，浓缩，干燥，即得。
实施例11
一种银杏内酯L·1，2-乙二胺复合物，取1，2-乙二胺4克，加80％乙醇20ml溶解，加热至45℃，加入10克银杏内酯L，搅拌至溶解，浓缩，干燥，即得。
实施例12
一种银杏内酯L·甲酰胺复合物，取甲酰胺6克，加25％甲醇50ml溶解，加热至60℃，加入10克银杏内酯L，搅拌至溶解，浓缩，干燥，即得。
实施例13
一种银杏内酯L·二甲基甲酰胺复合物，取二甲基甲酰胺6克，加10％乙醇50ml溶解，加热至60℃，加入10克银杏内酯L，搅拌至溶解，浓缩，干燥，即得。
实施例14
一种银杏内酯L·羟泛酸复合物，取羟泛酸6克，加10％乙醇50ml溶解，加热至60℃，加入10克银杏内酯L，搅拌至溶解，浓缩，干燥，即得。
实施例15
一种银杏内酯L·烟酰胺复合物，取烟酰胺6克，加10％乙醇50ml溶解，加热至60℃，加入10克银杏内酯L，搅拌至溶解，浓缩，干燥，即得。
实施例16
一种银杏内酯L·烷基咪唑复合物，取烷基咪唑6克，加40％乙醇50ml溶解，加热至60℃，加入10克银杏内酯L，搅拌至溶解，浓缩，干燥，即得。
实施例17
一种银杏内酯L·烷基吡啶复合物，取烷基吡啶6克，加40％乙醇50ml溶解，加热至60℃，加入10克银杏内酯L，搅拌至溶解，浓缩，干燥，即得。
实施例18
一种银杏内酯L·烷基三甲基胺盐复合物，取烷基三甲基胺盐2克，加40％乙醇50ml溶解，加热至60℃，加入5克银杏内酯L，搅拌至溶解，浓缩，干燥，即得。
实施例19
一种银杏内酯L·盐酸硫胺复合物，取盐酸硫胺2克，加70％乙醇50ml溶解，加热至60℃，加入8克银杏内酯L，搅拌至溶解，浓缩，干燥，即得。
实施例20
一种银杏内酯L·氢氧化钙复合物，取氢氧化钙2克，加水500ml溶解，加热至60℃，加入8克银杏内酯L，搅拌至溶解，浓缩，干燥，即得。
实施例21
一种银杏内酯L·氢氧化钡复合物，取氢氧化钡2克，加水500ml溶解，加热至60℃，加入8克银杏内酯L，搅拌至溶解，浓缩，干燥，即得。
实施例22
一种银杏内酯L的药物制剂，它是由以下重量配比的原料制成的药剂：
取银杏内酯L溶于少量乙醇；微晶纤维素，甘露醇，羧甲基淀粉钠分别过100目筛混合均匀，加入银杏内酯L乙醇溶液并充分搅拌，使乙醇全部挥发；2％羟乙基甲基纤维素溶液为粘合剂制软材，过80目筛制颗粒，湿颗粒于40℃烘箱鼓风干燥；干颗粒过80目筛整粒，与硬脂酸钙混匀，灌胶囊。
实施例23
一种银杏内酯L的药物制剂，它是由以下重量配比的原料制成的药剂：
其制备方法如下：
取银杏内酯L溶于少量乙醇；微晶纤维素，乳糖，羟丙基淀粉分别过100目筛混合均匀，加入银杏内酯L乙醇溶液并充分搅拌，使乙醇全部挥发；以2％羟丙基甲基纤维素溶液为粘合剂制软材，过80目筛制颗粒，湿颗粒于50℃烘箱鼓风干燥；干颗粒过80目筛整粒，与硬脂酸镁混匀，压片。
实施例24
一种银杏内酯L的药物制剂，它是由以下重量配比的原料制成的胶囊：
取银杏内酯L、乙基纤维素、羟丙甲纤维素过60目筛混均，加入8％PVP无水乙醇溶液适量制软材，过80目筛制粒。40℃烘箱鼓风干燥，干颗粒过80目筛整粒，加入硬脂酸镁，混合均匀，灌装胶囊。
实施例25
一种银杏内酯L的药物制剂，它是由以下重量配比的原料制成：
将银杏内酯L溶于少量乙醇；糊精，淀粉，羧乙基纤维素钠分别过100目筛混合均匀，加入银杏内酯L乙醇溶液并充分搅拌，使乙醇全部挥发；以聚维酮溶液为粘合剂制软材，过80目筛制颗粒，湿颗粒于60℃烘箱鼓风干燥；干颗粒过80目筛整粒，与硬脂酸镁混匀，灌胶囊。
实施例26
一种银杏内酯L的药物制剂，它是由以下重量配比的原料制成：
银杏内酯L 50g
明胶 10g
大豆卵磷脂 90g
制备工艺：取银杏内酯L过100目筛，加明胶、大豆软磷脂，用胶体磨混匀，抽真空脱气，送入软胶囊包装机压制。
实施例27
一种银杏内酯L的药物制剂，它是由以下重量配比的原料制成：
银杏内酯L 20mg
3.5％乙醇溶液 5.0mg
注射用水加至 1000.0mL；
将银杏内酯L溶于3.5％乙醇溶液，加注射用水调至总量1000ml，用无菌滤板下衬0.22um微孔滤膜过滤，分装，即得。
实施例28
一种银杏内酯L的药物制剂，它是由以下重量配比的原料制成：
银杏内酯L 50.0g
葡甲胺 20.0g
β-环糊精 130.0g
制成5000ml注射液，分装，冻干，即得；
β-环糊精、葡甲胺加5000ml注射用水溶解，得溶液I，80℃保温，备用；另取银杏内酯50克加适量丙酮使其溶解，再将其缓缓加入溶液I中进行溶解，保温60分钟，然后放冷至室温，滤过，再微孔滤膜过滤，分装1000支，冻干，即得。
冻干工艺为，先-15℃冷冻成型，再-40℃冷冻降温，冷冻下真空干燥，36小时后，缓缓升温，直至25℃封盖，即得。
实施例29
一种银杏内酯L·葡甲胺复合物的药物制剂，它是由以下重量配比的原料制成的药剂：
取一种银杏内酯L·葡甲胺复合物；微晶纤维素，甘露醇，羧甲基淀粉钠分别过100目筛混合均匀，加入银杏内酯L乙醇溶液并充分搅拌，使乙醇全部挥发；2％羟乙基甲基纤维素溶液为粘合剂制软材，过80目筛制颗粒，湿颗粒于40℃烘箱鼓风干燥；干颗粒过80目筛整粒，与硬脂酸钙混匀，灌胶囊。
实施例30
一种银杏内酯L·葡甲胺复合物的药物制剂，它是由以下重量配比的原料制成的药剂：
其制备方法如下：
取一种银杏内酯L·葡甲胺复合物；微晶纤维素，乳糖，羟丙基淀粉分别过100目筛混合均匀，加入银杏内酯L乙醇溶液并充分搅拌，使乙醇全部挥发；以2％羟丙基甲基纤维素溶液为粘合剂制软材，过80目筛制颗粒，湿颗粒于50℃烘箱鼓风干燥；干颗粒过80目筛整粒，与硬脂酸镁混匀，压片。
实施例31
一种银杏内酯L·葡甲胺复合物的药物制剂，它是由以下重量配比的原料制成的胶囊：
取银杏内酯L·葡甲胺复合物、乙基纤维素、羟丙甲纤维素过60目筛混均，加入8％PVP无水乙醇溶液适量制软材，过80目筛制粒。40℃烘箱鼓风干燥，干颗粒过80目筛整粒，加入硬脂酸镁，混合均匀，灌装胶囊。
实施例32
一种银杏内酯L·葡甲胺复合物的药物制剂，它是由以下重量配比的原料制成：
将银杏内酯L·葡甲胺复合物、糊精，淀粉，羧乙基纤维素钠分别过100目筛混合均匀，加入银杏内酯L乙醇溶液并充分搅拌，使乙醇全部挥发；以聚维酮溶液为粘合剂制软材，过80目筛制颗粒，湿颗粒于60℃烘箱鼓风干燥；干颗粒过80目筛整粒，与硬脂酸镁混匀，灌胶囊。
实施例33
一种银杏内酯L·葡甲胺复合物的药物制剂，它是由以下重量配比的原料制成：
银杏内酯L·葡甲胺复合物 50g
明胶 10g
大豆卵磷脂 90g
制备工艺：取银杏内酯L过100目筛，加明胶、大豆软磷脂，用胶体磨混匀，抽真空脱气，送入软胶囊包装机压制。
实施例34
一种银杏内酯L·葡甲胺复合物的药物制剂，它是由以下重量配比的原料制成：
银杏内酯L·葡甲胺复合物 20mg
3.5％乙醇溶液 5.0mg
注射用水加至 1000.0mL；
将银杏内酯L·葡甲胺复合物溶于3.5％乙醇溶液，加注射用水调至总量1000ml，用无菌滤板下衬0.22um微孔滤膜过滤，分装，即得。
实施例35
一种银杏内酯L·葡甲胺复合物的药物制剂，它是由以下重量配比的原料制成：
银杏内酯L·葡甲胺复合物 50.0g
β-环糊精 130.0g
制成5000ml注射液，分装，冻干，即得；
β-环糊精加5000ml注射用水溶解，得溶液I，80℃保温，备用；另取银杏内酯50克加适量丙酮使其溶解，再将其缓缓加入溶液I中进行溶解，保温60分钟，然后放冷至室温，滤过，再微孔滤膜过滤，分装1000支，冻干，即得。
冻干工艺为，先-15℃冷冻成型，再-40℃冷冻降温，冷冻下真空干燥，36小时后，缓缓升温，直至25℃封盖，即得。
实施例36
一种银杏内酯L·精氨酸复合物的药物制剂，它是由以下重量配比的原料制成的药剂：
取一种银杏内酯L·精氨酸复合物；微晶纤维素，甘露醇，羧甲基淀粉钠分别过100目筛混合均匀，加入银杏内酯L乙醇溶液并充分搅拌，使乙醇全部挥发；2％羟乙基甲基纤维素溶液为粘合剂制软材，过80目筛制颗粒，湿颗粒于40℃烘箱鼓风干燥；干颗粒过80目筛整粒，与硬脂酸钙混匀，灌胶囊。
实施例37
一种银杏内酯L·精氨酸复合物的药物制剂，它是由以下重量配比的原料制成的药剂：
其制备方法如下：
取一种银杏内酯L·精氨酸复合物；微晶纤维素，乳糖，羟丙基淀粉分别过100目筛混合均匀，加入银杏内酯L乙醇溶液并充分搅拌，使乙醇全部挥发；以2％羟丙基甲基纤维素溶液为粘合剂制软材，过80目筛制颗粒，湿颗粒于50℃烘箱鼓风干燥；干颗粒过80目筛整粒，与硬脂酸镁混匀，压片。
实施例38
一种银杏内酯L·精氨酸复合物的药物制剂，它是由以下重量配比的原料制成的胶囊：
取银杏内酯L·葡甲胺复合物、乙基纤维素、羟丙甲纤维素过60目筛混均，加入8％PVP无水乙醇溶液适量制软材，过80目筛制粒。40℃烘箱鼓风干燥，干颗粒过80目筛整粒，加入硬脂酸镁，混合均匀，灌装胶囊。
实施例39
一种银杏内酯L·精氨酸复合物的药物制剂，它是由以下重量配比的原料制成：
将银杏内酯L·葡甲胺复合物、糊精，淀粉，羧乙基纤维素钠分别过100目筛混合均匀，加入乙醇溶液并充分搅拌，使乙醇全部挥发；以聚维酮溶液为粘合剂制软材，过80目筛制颗粒，湿颗粒于60℃烘箱鼓风干燥；干颗粒过80目筛整粒，与硬脂酸镁混匀，灌胶囊。
实施例40
一种银杏内酯L·精氨酸复合物的药物制剂，它是由以下重量配比的原料制成：
银杏内酯L·精氨酸复合物 50g
明胶 10g
大豆卵磷脂 90g
制备工艺：取银杏内酯L精氨酸复合物过100目筛，加明胶、大豆软磷脂，用胶体磨混匀，抽真空脱气，送入软胶囊包装机压制。
实施例41
一种银银杏内酯L·精氨酸复合物的药物制剂，它是由以下重量配比的原料制成：
银杏内酯L·精氨酸复合物 20mg
3.5％乙醇溶液 5.0mg
注射用水加至 1000.0mL；
将银杏内酯L·精氨酸复合物溶于3.5％乙醇溶液，加注射用水调至总量1000ml，用无菌滤板下衬0.22um微孔滤膜过滤，分装，即得。
实施例42
一种银杏内酯L·精氨酸复合物的药物制剂，它是由以下重量配比的原料制成：
银杏内酯L·精氨酸复合物 50.0g
β-环糊精 130.0g
制成5000m1注射液，分装，冻干，即得；
β-环糊精、银杏内酯L·精氨酸复合物加5000ml注射用水溶解，得溶液I，80℃保温，备用；另取银杏内酯50克加适量丙酮使其溶解，再将其缓缓加入溶液I中进行溶解，保温60分钟，然后放冷至室温，滤过，再微孔滤膜过滤，分装1000支，冻干，即得。
冻干工艺为，先-15℃冷冻成型，再-40℃冷冻降温，冷冻下真空干燥，36小时后，缓缓升温，直至25℃封盖，即得。
实施例43
将银杏内酯L用乙醇-水(8∶2)加热、搅拌溶解，放冷析晶，滤过，沉淀用纯化水洗涤，沉淀干燥恒重，最终得到高纯度的银杏内酯L，HLPC分析。
Claims (13)
1.一种具有脑保护作用的药物，其特征在于：以银杏内酯L或其复合物为活性成分。
2.一种具有脑保护作用的药物，其特征在于：以银杏内酯L为活性成分，银杏内酯L具备对卒中后血小板聚集的抑制作用，或，银杏内酯L具备神经保护作用。
3.一种抑制血小板聚集的药物，其特征在于：以银杏内酯L为活性成分。
4.一种抑制血小板聚集的药物，其特征在于：银杏内酯L用量范围为5-320μM。
5.一种抗凝血的药物，其特征在于：以银杏内酯L为活性成分。
6.一种具备神经保护的药物，其特征在于：以银杏内酯L为活性成分。
7.一种具备神经保护的药物，其特征在于：银杏内酯L用量范围为2-80μM。
8.根据权利要求1-3的一种具有脑保护作用的药物，其特征在于：
银杏内酯L的制备方法为以下任意方案的一种或多种：
以银杏总内酯为原料，采用如下之一的洗脱体系，用硅胶柱分离，
柱层析硅胶为100～300目，洗脱体系为石油醚+乙酸乙酯，洗脱梯度为300∶1～10∶1；
柱层析硅胶为100～300目，洗脱体系为氯仿+甲醇，洗脱梯度为300∶1～10∶1；
柱层析硅胶为100～300目，洗脱体系为石油醚+丙酮，洗脱梯度为300∶1～10∶1。
或；
以银杏总内酯为原料，选用200-300目硅胶，干法装柱，称取银杏总内酯20g，与100目硅胶混匀，干法上样；选用氯仿-甲醇做为洗脱剂，比例为150∶1，100∶1，50∶1，20∶1递减，梯度洗脱后，利用HPLC-ESI-Q/TOF-MS检测洗脱液成分，得到含有银杏内酯L的洗脱液，旋干后得到淡黄色固体粉末，即为银杏内酯L；
或；
称取10g银杏总内酯，乙酸乙酯溶解，混合20g硅藻土，拌匀，挥干，研磨，过筛，选用200-300目硅胶，干法装柱，选择高50cm，内径6cm的层析柱，柱层析硅胶为500g，石油醚拌匀，待沉降稳定后，柱高约35cm，选用石油醚-乙酸乙酯做为洗脱剂，比例为200∶1，100∶1，50∶1，20∶1递减，每一个梯度用3倍柱体积的洗脱液洗脱，在20∶1时得到内酯L的洗脱液，旋干后得到淡黄色固体粉末，即为银杏内酯L。
9.根据权利要求1-3的一种具有脑保护作用的药物，其特征在于：
液相色谱条件
色谱柱为Agilent Zorbax Extend-C18柱，2.1mm×150mm，5μm，
检测波长203nm，
色谱条件：流动相0.1％甲酸水溶液A-乙腈B
洗脱梯度：
0-1lmin，20％B-30％B；
11-14min，30％B-35％B；
14-18min，35％-100％B；
18-21min，100％-100％B；
柱温：25℃，流速0.5mL/min。
10.根据权利要求1-3的一种具有脑保护作用的药物，其特征在于：制成胶囊、软胶囊、片剂、注射剂、冻干粉。
11.根据权利要求1-3的一种具有脑保护作用的药物，其特征在于：银杏内酯L的复合物的制备方法是：
以银杏内酯L和碱性物质制备得到：
精氨酸、赖氨酸、组氨酸、甘氨酸等及其衍生物；
甲胺、乙胺、丙胺、丁胺、乙二胺、葡甲胺、尿素、盐酸胍、1，2-乙二胺、乙醇胺等及其衍生物；
甲酰胺、二甲基甲酰胺、羟泛酸、烟酰胺等酰胺类；
烷基咪唑、烷基吡啶、烷基三甲基胺盐、盐酸硫胺等；
金属碱性物质如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化钡；
分子中含有一个至八个碳原子的含氮有机物。
12.根据权利要求1-3的一种具有脑保护作用的药物，其特征在于：银杏内酯L与碱性物质1∶0.2～10的比例，在溶剂中形成复合物。
13.根据权利要求1-3的一种具有脑保护作用的药物，其特征在于：银杏内酯L的重结晶的方法，在溶剂加热、搅拌溶解，放冷析晶，滤过，沉淀洗涤，沉淀干燥恒重，最终得银杏内酯L结晶。
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|---|---|---|---|---|
| WO2019140793A1 (zh) * | 2018-01-19 | 2019-07-25 | 上海上药杏灵科技药业股份有限公司 | 一种高纯度银杏总内酯制备方法及其应用 |
| WO2020207398A1 (zh) * | 2019-04-10 | 2020-10-15 | 成都百裕制药股份有限公司 | 银杏萜内酯在制备预防和/或治疗吉兰-巴雷综合征药物中的用途 |
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