CN106383234A - 视黄醇结合蛋白检测试剂的包被方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种视黄醇结合蛋白检测试剂的包被方法。该方法包含：向胶乳微球加入交联缓冲液进行稀释，加入交联剂后进行搅拌；在搅拌的过程中加入视黄醇结合蛋白抗体、十二烷基硫酸钠‑聚乙烯吡咯烷酮溶液进行交联，交联后进行离心、超声粉碎后进行清洗，即得离心沉淀物；向离心沉淀物中加入视黄醇结合蛋白检测试剂R2的稀释液，超声粉碎后，即得包被的视黄醇结合蛋白检测试剂。本发明的实施方式，通过在一步法中添加十二烷基硫酸钠‑聚乙烯吡咯烷酮，使得反应得到产物的性能接近两步法反应得到产物的性能，从而实现了提高抗体偶联效率的目的。另外，与两步法相比，一步法步骤简单、方便，节约了工作时间，提高了工作效率。

Description

视黄醇结合蛋白检测试剂的包被方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种视黄醇结合蛋白检测试剂R2的包被方法。
背景技术
视黄醇结合蛋白(Retinol Binding Protein，RBP)为血液中视黄醇(维生素A)的转运蛋白。在几十年研究中，人们对这种蛋白质的分子结构、生物学特性等逐渐了解，发现这种蛋白质广泛地分布于正常人体液中，属α1-球蛋白，具有从肝细胞中转运视黄醇至周围组织的功能。现认为血液中RBP主要以视黄醇、前白蛋白结合的复合物形式存在，当复合物中视黄醇与靶细胞结合后，RBP便与前白蛋白分离，自肾小球滤出，由近端肾小管上皮细胞吸收、降解。近年来的深入研究表明RBP含量的改变能够敏感地反映近端肾小管功能、肝功能损害程度，是反映肾脏、肝脏及营养性疾病发展、转归的敏感指标。
研究发现，视黄醇结合蛋白广泛分布于血液、尿液、脑脊液及其他体液中，其正常值：线性范围：血清：0.5～140ug/ml，尿液：0.1～18ug/ml，参考值：血清：25～70ug/ml，尿液：<0.7ug/ml。目前，测定血、尿中的视黄醇结合蛋白检测方法有很多，比如酶联免疫吸附法(ELISA)、放射免疫分析法(RIA)，但是ELISA方法虽然在临床上使用了近二十年，但它依然存在一些致命缺点，定量准确性差、操作时间长、自动化程度低，一般只能用于定性检测。RIA灵敏度高，但不稳定，重复性比ELISA差，而且存在放射性污染的危险。因此，寻找更加稳定、准确的视黄醇结合蛋白检测方法一直是国际上近十年来的研究热点。
胶乳增强免疫比浊法(particle-enhanced turbidimetric immunoassay，PETIA)是近年来出现的一种比较稳定、准确的体液蛋白均相免疫比浊法。其中，PEITA法大体分为两种：1、散射比浊法，2、透射比浊法。两种方法的基本原理非常相似，都是在高分子纳米胶乳微球的表面交联抗体，当交联有抗体的微球与抗原结合后，在短时间会迅速聚集在一起，改变了反应液的散光性或透光性能。而且，反应液散光性能或透光性能(即吸光度)的改变与被测抗原的浓度有较强的相关性，在一定范围内可以反映被测抗原的浓度。纳米胶乳增强免疫比浊法操作步骤的简化相应的避免了许多人为操作因素和试剂、环境等外界因素的干扰，稳定性和重复性都比较好，能真实地反映被测物质的含量。目前，视黄醇结合蛋白检测试剂(胶乳增强法)的包被方法主要有物理方法、化学方法，其中，物理吸附主要靠氢键，静电等作用结合在一起，抗体与纳米胶乳微球结合不牢固，容易脱落，化学方法使纳米胶乳微球与抗体通过化学共价键结合，结合力强，不易脱落，化学方法主要包含又分为两种：一步法、两步法。一步法简单方便省时，但存在抗体偶联效率低、偶联试剂易失活的问题，而两步法，交联效率虽然很高，但是存在操作繁琐、费时的问题。
综上所述，提供一种抗体偶联效率高的一步法包被视黄醇结合蛋白检测试剂是目前我们亟需解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种视黄醇结合蛋白检测试剂的包被方法，使得抗体偶联效率更高，且方法简单、方便。
为解决上述技术问题，本发明的实施方式提供了一种视黄醇结合蛋白检测试剂的包被方法，该方法包含以下步骤：向纳米胶乳微球加入交联缓冲液进行稀释，加入交联剂后进行搅拌；在搅拌的过程中加入视黄醇结合蛋白抗体、十二烷基硫酸钠-聚乙烯吡咯烷酮溶液进行交联，交联后进行离心、超声分散清洗，再离心即得离心沉淀物；向离心沉淀物中加入视黄醇结合蛋白检测试剂R2的稀释液，超声分散后，即得包被的视黄醇结合蛋白检测试剂R2。
本发明实施方式相对于现有技术而言，通过在一步法中添加十二烷基硫酸钠-聚乙烯吡咯烷酮，加入十二烷基硫酸钠-聚乙烯吡咯烷酮的目的可以使抗体在交联体系中充分分散，长链的聚乙烯吡咯烷酮使视黄醇结合蛋白抗体间隔偶联到纳米胶乳微球上，且竖直伸向外围溶液，更方便与抗原结合，再加上十二烷基硫酸钠-聚乙烯吡咯烷酮的存在可以促使交联剂的水解失活速度降低，促进了抗体与纳米胶乳微球的偶联效率。使得一步法反应得到产物的性能接近两步法反应得到产物的性能。另外，与两步法相比，一步法步骤简单、方便，节约了工作时间，提高了工作效率。
另外，交联剂为碳二亚胺盐酸盐或者N-羟基硫代琥珀酰亚胺。
另外，碳二亚胺盐酸盐的浓度为5～15mg/ml；N-羟基硫代琥珀酰亚胺的浓度为50～150mg/ml。根据纳米胶乳微球表面的功能基团摩尔数确定交联剂含量，保证了纳米胶乳微球表面功能基团的充分活化。
另外，交联缓冲液为2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液；交联缓冲液的浓度为20～70mM。高离子浓度的缓冲液影响抗体的偶联，且次缓冲液的PH值范围适合所选交联剂的活化。
另外，十二烷基硫酸钠-聚乙烯吡咯烷酮溶液的质量百分数为1～3％。高浓度反而抑制抗体的偶联。
另外，视黄醇结合蛋白检测试剂R2稀释液包含：浓度为50～100mM的磷酸氢钠溶液、浓度为50～100mM的磷酸氢二钠溶液以及浓度为10～30g/mL的氯化钠溶液。保证一定的离子浓度、PH值，有利于抗体抗原反应。
另外，视黄醇结合蛋白检测试剂R2稀释液还包含：聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯溶液以及小牛白蛋白溶液。
另外，聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯溶液的体积百分数为：0.2～0.5％，小牛白蛋白溶液的质量百分数为：1～1.5％。合适的浓度，可以起到分散、封闭、阻止非特异性吸附作用。
另外，视黄醇结合蛋白抗体的浓度为10～20mg/mL。保证足够的抗体。
另外，纳米微球的粒径为50～150nm。合适的粒径能够保证试剂具有较高的线性和灵敏度。
附图说明
图1是根据本发明第一实施方式中的一步法、两步法包被视黄醇结合蛋白检测试剂与抗原反应的吸光度曲线图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的各实施方式进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施方式中，为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施方式的种种变化和修改，也可以实现本申请所要求保护的技术方案。
本发明的第一实施方式涉及一种视黄醇结合蛋白检测试剂R2的包被方法，该方法包含以下步骤：向纳米胶乳微球加入交联缓冲液进行稀释，加入交联剂后进行搅拌；在搅拌的过程中加入视黄醇结合蛋白抗体、十二烷基硫酸钠-聚乙烯吡咯烷酮溶液(简称：SDS-PVP)进行交联，交联后进行离心、超声分散清洗，再离心即得离心沉淀物；向离心沉淀物中加入视黄醇结合蛋白检测试剂R2的稀释液，超声分散后，即得包被的视黄醇结合蛋白检测试剂R2。
具体地，在本实施方式中，交联剂可以为碳二亚胺盐酸盐或者N-羟基硫代琥珀酰亚胺，其中，碳二亚胺盐酸盐的浓度可以为5～15mg/ml；N-羟基硫代琥珀酰亚胺的浓度可以为50～150mg/ml。
值得注意的是，交联缓冲液为2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液；交联缓冲液的浓度可以为20～70mM，SDS-PVP溶液的质量百分数可以为1～3％。
另外，在本实施方式中，视黄醇结合蛋白检测试剂R2稀释液可以包含：浓度可以为50～100mM的磷酸氢钠溶液、浓度可以为50～100mM的磷酸氢二钠溶液以及浓度可以为10～30g/mL的氯化钠溶液。
进一步地，视黄醇结合蛋白检测试剂R2稀释液还包含：聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯溶液以及小牛白蛋白溶液，其中，聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯溶液的体积百分数可以为：0.2～0.5％，小牛白蛋白溶液的质量百分数可以为：1～1.5％。
值得一提的是，在本实施方式中，视黄醇结合蛋白抗体的浓度可以为10～20mg/mL。
另外，值得一提的是，在本实施方式中，纳米微球的粒径可以为50～150nm。
举例来说，本实施方式中，需要准备的实验材料如下：
1、视黄醇结合蛋白检测试剂盒(胶乳增强法)R2配套实用的试剂R1：氯化钠：30g/ml；磷酸盐缓冲液：100mM；聚乙二醇6000:2.0％(w/w)
2、视黄醇结合蛋白抗体：科华自制
3、交联剂：外购sigma公司：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，英文名为1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride简称：EDC)，或者N-羟基硫代琥珀酰亚胺(简称：Sulfo-NHS)。其中，EDC的浓度为：10mg/ml，Sulfo-NHS的浓度为:100mg/ml
4、纳米微球：粒径为100nm，外购于苏州智微纳米科技有限公司
5、交联缓冲液：2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)缓冲液25mM
6、抗原：视黄醇结合蛋白，浓度为256mg/L，由科华公司自制
对上述抗原进行稀释：用R2稀释液稀释1/10-10/10梯度，再对1/10进行4/5、3/5、2/5、1/5、1/5对半稀释释，构成15个不同浓度的梯度
7、添加物：SDS-PVP的质量百分数：1％、聚乙二醇(PEG)400的质量百分数：2％,葡聚糖的质量百分数：2％
8、视黄醇结合蛋白检测试剂R2稀释液：包含磷酸氢钠的浓度：100mM，磷酸氢二钠的浓度：100mM，吐温-20的体积百分数：0.3％，小牛白蛋白的质量百分数：1.5％，氯化钠的浓度：30g/ml
9、检测仪器：日立7100
10、超声设备：Hielscher UP400S
具体实验步骤：
一步法：取10ml粒径为100nm纳米胶乳微球，取25mM交联缓冲液稀释10倍，加入2.5mL EDC，搅拌，逐滴加入10ml视黄醇结合蛋白抗体，平均分为四组，然后对上述4组混合物分别做下述处理：
1、不加任何物质；
2、加入2.5mL 2％的SDS-PVP
3、加入2.5mL 2％的PEG4000
4、加入2.5mL 2％的葡聚糖
同时进行交联反应2h，交联后进行离心，超声分散清洗。再离心得沉淀物，最后将视黄醇结合蛋白检测试剂R2稀释液加入离心沉淀物中，超声分散，制成视黄醇结合蛋白检测试剂R2。
为验证视黄醇结合蛋白检测试剂通过一步法包被和两步法包被的区别，下面对两步法进行实验以形成对比，具体实验步骤如下：
两步法：取2.5ml粒径为100nm胶乳微球，取25mM交联缓冲液稀释10倍，加入0.85mlEDC，Sulfo-NHS 1.25ml，搅拌30分钟，离心，去离心上清液，沉淀物加12.5ml交联缓冲液，移液器吹散，超声分散，加入1.25ml视黄醇结合蛋白抗体，交联2h。然后离心得沉淀物，超声分散清洗。最后将视黄醇结合蛋白检测试剂R2稀释液加入离心沉淀物，超声分散，制成视黄醇结合蛋白检测试剂R2。
需要说明的是，一步法和两步法的基本原理是：在高分子纳米胶乳微球的表面交联抗体，当交联有抗体的微球与抗原结合后，在短时间会迅速聚集在一起，从而改变反应液的散光性或透光性能。而且，反应液散光性能或透光性能(即吸光度)的改变与被测抗原的浓度有较强的相关性。
另外，值得一提的是，由于线性灵敏度与很多因素相关，首先要保证纳米胶乳微球上偶联上过量的抗体，使其与抗原反应，保证抗原不足，抗体过量，一步法和两步法的原理都是一样的，都是通过交联剂EDC来偶联带氨基的抗体，一步法是只加EDC，由于EDC易水解，导致EDC失活，而抗体连接不上去足够的量；两步法是通过NHS的作用，形成个稳定的中间酯，不易水解失活，用它去和带氨基的抗体偶联保证偶联效率，足够过量的抗体被偶联上纳米胶乳微球。一步法与两步法性能接近，只需要保证一定的纳米胶乳微球偶联上的抗体量接近。
实验药品：
抗原：视黄醇结合蛋白，浓度为256mg/L，由科华公司自制对上述抗原进行稀释：用稀释液稀释1/10-10/10梯度，再对1/10进行4/5、3/5、2/5、1/5、1/5对半稀释释，构成15个不同浓度的梯度
检测参数：样本量:1.5ml，视黄醇结合蛋白检测试剂R1:120ml，一步法、两步法最后制备得到的视黄醇结合蛋白检测试剂R2：30ml。
检测结果如表1所示：
表1中的各组实验对应的线性关系具体可见图1：
实验数据分析：就试剂线性而言，一步法中RBP3在添加了SDS-PVP后，在180mg/L线性范围内达到，在与两步法几乎是一致的。其他添加物试剂，或未添加任何物质的试剂均线性达不到成品试剂线性要求，故无法应用与视黄醇结合蛋白试剂R2的包被。
与现有技术相比，本实施方式中，通过在一步法中添加十二烷基硫酸钠-聚乙烯吡咯烷酮，使得一步法反应得到产物的性能接近两步法反应得到产物的性能，从而实现了提高抗体偶联效率的目的。另外，与两步法相比，一步法步骤简单、方便，节约了工作时间，提高了工作效率。
本发明的第二实施方式涉及一种视黄醇结合蛋白检测试剂的包被方法，第二实施方式与第一实施方式大致相同，其主要不同之处在于反应过程中的各个反应物设置的参数不同，具体的实验步骤如下：
实验用品：
1、视黄醇结合蛋白抗体：由科华自制
2、交联剂：外购sigma公司：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的浓度为:50mg/ml
3、纳米微球：粒径为150nm，外购于苏州智微纳米科技有限公司
4、交联缓冲液：2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)缓冲液70mM
5、添加物：SDS-PVP的质量百分数：1％
6、视黄醇结合蛋白检测试剂R2稀释液：包含磷酸氢钠的浓度：50mM，磷酸氢二钠的浓度：50mM，吐温-20的体积百分数：0.2％，小牛白蛋白的质量百分数：1.0％，氯化钠的浓度：10g/ml
7、检测仪器：日立7100
8、超声设备：Hielscher UP400S
具体实验步骤：
取10ml粒径为150nm纳米胶乳微球，取70mM交联缓冲液稀释10倍，加入2.5mlSulfo-NHS，搅拌，逐滴加入10ml视黄醇结合蛋白抗体，加入2.5ml3％的SDS-PVP，进行交联反应3h，交联后进行离心，超声破碎分散清洗。最后将视黄醇结合蛋白检测试剂R2稀释液加入离心沉淀物中，超声破碎分散，制成视黄醇结合蛋白检测试剂的包被液。
本发明的第三实施方式涉及一种视黄醇结合蛋白检测试剂的包被方法，第二实施方式与第一实施方式大致相同，其主要不同之处在于反应过程中的各个反应物设置的参数不同，具体的实验步骤如下：
实验用品：
1、视黄醇结合蛋白抗体：市场购买获得
2、交联剂：外购sigma公司，碳二亚胺盐酸盐的浓度为5mg/ml
3、纳米微球：粒径为50nm，外购于苏州智微纳米科技有限公司
4、交联缓冲液：2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)缓冲液的浓度50mM
5、添加物：SDS-PVP的质量百分数：1％
6、视黄醇结合蛋白检测试剂R2稀释液：包含磷酸氢钠的浓度：100mM，磷酸氢二钠的浓度：100mM，吐温-20的体积百分数：0.5％，小牛白蛋白的体积百分数：1.2％，氯化钠的浓度：30g/ml
7、检测仪器：日立7100
8、超声设备：Hielscher UP400S
具体实验步骤：
取10ml粒径为50nm纳米胶乳微球，取50mM交联缓冲液稀释10倍，加入2.5ml MES，搅拌，逐滴加入10ml视黄醇结合蛋白抗体，加入2.5ml 1％的SDS-PVP，进行交联反应2h，交联后进行离心，超声破碎分散清洗。最后将视黄醇结合蛋白检测试剂R2稀释液加入离心沉淀物中，超声破碎分散，制成视黄醇结合蛋白检测试剂的包被液。
本发明的第三实施方式涉及一种视黄醇结合蛋白检测试剂的包被方法，第二实施方式与第一实施方式大致相同，其主要不同之处在于反应过程中的各个反应物设置的参数不同，具体的实验步骤如下：
实验用品：
1、视黄醇结合蛋白抗体：市场购买获得
2、交联剂：外购sigma公司，碳二亚胺盐酸盐的浓度为10mg/ml
3、纳米微球：粒径为80nm，外购于苏州智微纳米科技有限公司
4、交联缓冲液：2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)缓冲液的浓度60mM
5、添加物：SDS-PVP的质量百分数：1.5％
6、视黄醇结合蛋白检测试剂R2稀释液：包含磷酸氢钠的浓度：80mM，磷酸氢二钠的浓度：70mM，吐温-20的体积百分数：0.3％，小牛白蛋白的质量百分数：1.0％，氯化钠的浓度：20g/ml
7、检测仪器：日立7100
8、超声设备：Hielscher UP400S
具体实验步骤：
取10ml粒径为80nm纳米胶乳微球，取60mM交联缓冲液稀释10倍，加入3.5ml MES，搅拌，逐滴加入15ml视黄醇结合蛋白抗体，加入2.5ml 1.5％的SDS-PVP，进行交联反应3h，交联后进行离心，超声破碎分散清洗。最后将视黄醇结合蛋白检测试剂R2稀释液加入离心沉淀物中，超声破碎分散，制成视黄醇结合蛋白检测试剂的包被液。
本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。

Claims (10)

1.一种视黄醇结合蛋白检测试剂的包被方法，其特征在于，包含以下步骤：
向纳米胶乳微球加入交联缓冲液进行稀释，加入交联剂后进行搅拌；
在所述搅拌的过程中加入视黄醇结合蛋白抗体、十二烷基硫酸钠-聚乙烯吡咯烷酮溶液进行交联，交联后进行离心、超声分散清洗，再离心即得离心沉淀物；
向所述离心沉淀物中加入视黄醇结合蛋白检测试剂R2的稀释液，超声分散后，即得包被的视黄醇结合蛋白检测试剂R2。
2.根据权利要求1所述的包被方法，其特征在于，所述交联剂为碳二亚胺盐酸盐或者N-羟基硫代琥珀酰亚胺。
3.根据权利要求2所述的包被方法，其特征在于，所述碳二亚胺盐酸盐的浓度为5～15mg/ml；所述N-羟基硫代琥珀酰亚胺的浓度为50～150mg/ml。
4.根据权利要求1所述的包被方法，其特征在于，所述交联缓冲液为2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液；所述交联缓冲液的浓度为20～70mM。
5.根据权利要求1所述的包被方法，其特征在于，所述十二烷基硫酸钠-聚乙烯吡咯烷酮溶液的质量百分数为1～3％。
6.根据权利要求1所述的包被方法，其特征在于，所述视黄醇结合蛋白检测试剂R2稀释液包含：浓度为50～100mM的磷酸氢钠溶液、浓度为50～100mM的磷酸氢二钠溶液以及浓度为10～30g/mL的氯化钠溶液。
7.根据权利要求6所述的包被方法，其特征在于，所述视黄醇结合蛋白检测试剂R2稀释液还包含：聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯溶液以及小牛白蛋白溶液。
8.根据权利要求7所述的包被方法，其特征在于，所述聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯溶液的体积百分数为：0.2～0.5％，所述小牛白蛋白溶液的质量百分数为：1～1.5％。
9.根据权利要求1所述的包被方法，其特征在于，所述视黄醇结合蛋白抗体的浓度为10～20mg/mL。
10.根据权利要求1至9任一项所述的包被方法，其特征在于，所述纳米胶乳微球的粒径为50～150nm。
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