CN106366052B - 一种半合成多西紫杉醇中杂质的分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
一种半合成多西紫杉醇中杂质的分离纯化方法。溶解半合成多西紫杉醇样品，将溶解液加入MCI，风干溶剂，得到吸附样品的MCI填料；将吸附样品的MCI填料加入MCI柱，洗脱得到半合成多西紫杉醇EP标准中的杂质A和E的混合物；将混合物用有机溶剂溶解，把溶解液加入硅胶中让样品吸附，得到吸附样品的硅胶；所得到吸附样品的硅胶加入到硅胶柱，利用有机溶剂梯度洗脱；浓缩干燥，最终分别得到高纯度的杂质A单体和杂质E单体。本发明根据半合成多西紫杉醇中杂质A和E的结构特点，采用MCI柱层析和硅胶柱层析相结合的分离纯化方法，得到高纯度化合物，该方法操作简单，高效。
Description
技术领域
本发明涉及化合物的分离纯化方法，尤其涉及一种半合成多西紫杉醇中杂质A和E的分离纯化方法。
背景技术
MCI是一种以苯乙烯聚合物为材料的反向树脂填料，该填料适合于分离中等疏水性的化合物。由于具有苯环结构，所以与其他类型的反相填料相比，具有不同的分离选择性，尤其对具有苯环或苯环数量差异的化合物的分离效果最佳。该填料的洗脱剂一般从高比例的水相梯度洗脱到高比例的有机相。
硅胶层析法的分离原理是根据化合物在硅胶上的吸附力不同而得到分离。硅胶柱层析分离的过程是一个吸附-解吸-再吸附-再解吸的过程。极性小的化合物用乙酸乙酯、石油醚和环己烷等弱极性或无极性有机溶剂洗脱；中等极性的化合物可用二氯甲烷、氯仿等中等极性的溶剂洗脱；极性大的化合物用甲醇和水等极性溶剂洗脱。
多西紫杉醇是在C4和C5位置上含有一个带有氧四环的紫杉烷类结构，并在C13位置上含有一个庞大的酯侧链。在其体外活性结构关系中显示C13酯侧链的特性和构型对于多西紫杉醇体外抗微管蛋白活性是至关重要的。多西紫杉醇是以红豆杉中的化学物质为基础而合成出来的一种药物。药物作用机制与紫杉醇相似，即抑制微管的解聚，抑制细胞分裂。适用于局部晚期非小细胞性肺癌或转移性乳腺癌的治疗。
杂质A为半合成多西紫杉醇过程中产生的降解产物，其结构与多西紫杉醇的区别在于C2上由苯甲酰基变成了异戊烯基，结构式见下式I。EP和USP中明确规定了有关物质杂质A在成品多西紫杉醇中的限度为0.2％，控制杂质A在成品中的含量也成为众多医药工作者的工作重点，此外杂质A与成品的极性极为相似，很难获得，因此市场价格昂贵，这也是研究半合成多西紫杉醇中杂质A的难点。
杂质E为半合成多西紫杉醇过程中产生的降解产物和起始物料的残留，其结构与多西紫杉醇的区别在于C13上没有庞大的酯侧链，结构式见下式II。EP和USP中明确规定了有关物质杂质E在成品多西紫杉醇中的限度为0.15％，控制杂质E在成品中的含量和杂质E的充分利用也成为众多制药工作者的工作重点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种半合成多西紫杉醇中杂质，尤其是杂质A和E的分离方法。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
一种半合成多西紫杉醇中杂质的分离纯化方法，包括以下步骤：
(1)向溶于有机溶剂的半合成多西紫杉醇溶液中加入MCI填料，风干溶剂，得到吸附含有杂质的半合成多西紫杉醇的MCI填料；
(2)将步骤(1)所得吸附含有杂质的半合成多西紫杉醇的MCI填料加入MCI柱，洗脱，识别收集含目标物的洗脱液并浓缩干燥得到含有杂质A和E的混合物；
(3)用有机溶剂溶解步骤(2)所得混合物得到溶解液，然后将溶解液加入硅胶中吸附，挥干有机溶剂，得到吸附杂质A和E混合物的硅胶后加入到硅胶柱，利用混合有机溶剂洗脱；
(4)识别收集含目标物的洗脱液，浓缩干燥，分别得到高纯度的杂质A单体和杂质E单体；
其中杂质A如式I所示，杂质E如式II所示。
本发明根据半合成多西紫杉醇中杂质A和E的结构特点，经MCI柱层析，采用不同浓度乙醇梯度洗脱，初步分离得到杂质A和E的混合样品，作为硅胶柱层析的原料，通过硅胶柱分离得到高纯度的杂质A和E单体，从而建立了从半合成多西紫杉醇中高效快速分离杂质A和E的方法。
作为优选，步骤(1)中所述有机溶剂为甲醇、无水乙醇和丙酮中1种或2种以上的混合，优选为无水乙醇。
优选地，所述有机溶剂和半合成多西紫杉醇的比例为50:1～10:1ml/g，例如为13:1ml/g、18:1ml/g、22:1ml/g、30:1ml/g、35:1ml/g、40:1ml/g、46:1ml/g等，优选为25:1～15:1ml/g。
优选地，半合成多西紫杉醇与填料的质量比为1:1～1:5，例如为1:1.3、1:2、1:2.5、1:3.2、1:4、1:4.7等，优选为1:3。
作为优选，步骤(2)中吸附含有杂质的半合成多西紫杉醇的MCI填料与MCI柱中填料的质量比为1:5～1:50，例如为1:7、1:13、1:21、1:25、1:32、1:40、1:46等，优选为1:20～1:30。
优选地，洗脱所用溶剂为甲醇、无水乙醇和丙酮中1种或2种以上的混合，优选为依次用不同浓度的乙醇，更优选为依次用20％、30％、40％、50％、60％和70％的乙醇。
优选地，含目标物的洗脱液是用浓度为40％和50％乙醇洗脱的洗脱液。
作为优选，步骤(3)中所述有机溶剂为甲醇、无水乙醇和丙酮中1种或2种以上的混合，优选为无水乙醇。
优选地，有机溶剂与步骤(2)所得混合物的比为1:1～10:1ml/mg，例如为3:1ml/g、6:1ml/g、8:1ml/g、9.5:1ml/g等，优选为1:1～5:1ml/mg。
优选地，杂质A和E混合物和硅胶的比例为1:1-10ml/mg例如为1:2ml/mg、1:4ml/mg、1:6ml/mg、1:8ml/mg、1:9.5ml/mg等，优选为1:3～1:7ml/mg。
优选地，吸附杂质A和E混合物的硅胶与硅胶柱中填料的质量比为1:10-60，例如为1:13、1:21、1:25、1:32、1:40、1:47、1:53、1:58等，优选为1:20-40。
优选地，混合有机溶剂为正己烷和丙酮。
优选地，洗脱时正己烷和丙酮的体积比为5:1,3.5:1,3:1,2.5:1和2:1。
作为优选，所述浓缩干燥为减压浓缩干燥。
本发明采用MCI柱层析和硅胶柱层析相结合的分离纯化方法，得到高纯度化合物，该方法操作简单，高效。
附图说明
图1是分离杂质A和E的流程图；
图2是MCI柱和硅胶柱分离后效果图，其中T：半合成紫杉醇成品，A+E：MCI柱分离后得到白色粉末，A和E：分别为硅胶柱分离后得到的两种白色粉末。
下面对本发明进一步详细说明。但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。
为更好地说明本发明，便于理解本发明的技术方案，本发明的典型但非限制性的实施例如下：
图1是分离杂质A和E的流程图。
实施例1
称取半合成多西紫杉醇样品10g，加500ml的甲醇完全溶解，加入到10g的MCI填料中，自然风干，得到吸附样品的MCI填料，上100g MCI柱进行分离，依次用20％、30％、40％、50％、60％和70％的乙醇洗脱，收集40％和50％洗脱的洗脱液，减压蒸干得到含有杂质A和E的混合类白色粉末约50mg，加50ml无水乙醇使得到的白色粉末完全溶解，加入到50mg硅胶(100-200目)填料中，得到吸附样品的硅胶填料，上500mg的硅胶(300-400目)柱进行分离，用正己烷和丙酮的混合溶剂进行梯度(5:1,3.5:1,3:1,2.5:1和2:1)洗脱，对滤液进行薄层分析，将薄层行为一致的流份合并，将获得的2个杂质分别减压干燥，即可获得纯度均大于95％的杂质A和E。
实施例2
称取半合成多西紫杉醇样品10g，加100ml的丙酮完全溶解，加入到50g的MCI填料中，自然风干，得到吸附样品的MCI填料，上2500g MCI柱进行分离，依次用20％、30％、40％、50％、60％和70％的乙醇洗脱，收集40％和50％洗脱的洗脱液，减压蒸干得到含有杂质A和E的混合类白色粉末约50mg，加500ml的无水乙醇使白色粉末完全溶解，自然风干，加入到500mg的硅胶(100-200目)填料中，得到吸附样品的硅胶填料，上3g硅胶(300-400目)柱进行分离，用正己烷和丙酮的混合溶剂(5:1,3.5:1,3:1,2.5:1和2:1)进行梯度洗脱，对滤液进行薄层分析，将薄层行为一致的流份合并，将获得的2个杂质分别减压干燥，即可获得纯度均大于95％的杂质A和E。
实施例3
称取半合成多西紫杉醇样品10g，加250ml的无水乙醇完全溶解，加入到30g的MCI填料中，自然风干，得到吸附样品的MCI填料，上600g MCI柱进行分离，依次用20％、30％、40％、50％、60％和70％的乙醇洗脱，收集40％和50％洗脱的洗脱液，减压蒸干得到含有杂质A和E的混合类白色粉末约50mg。加50ml的无水乙醇使白色粉末完全溶解，自然风干，加入到150mg的硅胶(100-200目)填料中，得到吸附样品的硅胶填料，上3g硅胶(300-400目)柱进行分离，用正己烷和丙酮的混合溶剂(5:1,3.5:1,3:1,2.5:1和2:1)进行梯度洗脱，对滤液进行薄层分析，将薄层行为一致的流份合并，将获得的2个杂质分别减压干燥，即可获得纯度均大于96％的杂质A和E。
实施例4
称取半合成多西紫杉醇样品10g，加150ml的无水乙醇完全溶解，加入到30g的MCI填料中，自然风干，得到吸附样品的MCI填料，上900g的MCI柱进行分离，依次用20％、30％、40％、50％、60％和70％的乙醇洗脱，收集40％和50％洗脱的洗脱液，减压蒸干得到含有杂质A和E的混合类白色粉末约50mg。
杂质A和E的混合类白色粉末，加250ml的无水乙醇完全溶解，自然风干，加入到350mg的硅胶(100-200目)填料中，得到吸附样品的硅胶填料，上14g硅胶(300-400目)柱进行分离，用正己烷和丙酮的混合溶剂(5:1,3.5:1,3:1,2.5:1和2:1)进行梯度洗脱，对滤液进行薄层分析，将薄层行为一致的流份合并，将获得的2个杂质分别减压干燥，即可获得纯度均大于97％的杂质A和E。
半合成多西紫杉醇中杂质A和E的检测
收集液检测采用TLC薄板层析，展开剂为二氯甲烷：甲醇(9:1)，用硫酸香兰素显色。图2是MCI柱和硅胶柱分离后效果图。
结果表明，利用MCI柱能够将杂质A和E完全从半合成多西紫杉醇和其他杂质中分离出来，硅胶柱能够将杂质A和E完全分离。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细结构特征，但本发明并不局限于上述详细结构特征，即不意味着本发明必须依赖上述详细结构特征才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用部件的等效替换以及辅助部件的增加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (21)
1.一种半合成多西紫杉醇中杂质的分离纯化方法，包括以下步骤：
(1)向溶于有机溶剂的半合成多西紫杉醇溶液中加入MCI填料，风干溶剂，得到吸附含有杂质的半合成多西紫杉醇的MCI填料；
(2)将步骤(1)所得吸附含有杂质的半合成多西紫杉醇的MCI填料加入MCI柱，洗脱，识别收集含目标物的洗脱液并浓缩干燥得到含有杂质A和E的混合物；
(3)用有机溶剂溶解步骤(2)所得混合物得到溶解液，然后将溶解液加入硅胶中吸附，挥干有机溶剂，得到吸附杂质A和E混合物的硅胶后加入到硅胶柱，利用混合有机溶剂洗脱；
(4)识别收集含目标物的洗脱液，浓缩干燥，分别得到高纯度的杂质A单体和杂质E单体；
其中杂质A如式I所示，杂质E如式II所示：
步骤(1)中半合成多西紫杉醇与填料的质量比为1:1～1:5，步骤(2)中吸附含有杂质的半合成多西紫杉醇的MCI填料与MCI柱中填料的质量比为1:5～1:50，步骤(2)中洗脱为依次用20％、30％、40％、50％、60％和70％的乙醇洗脱。
2.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤(1)中所述有机溶剂为甲醇、无水乙醇、丙酮中1种或2种以上的混合。
3.根据权利要求2所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤(1)中所述有机溶剂为无水乙醇。
4.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，所述有机溶剂和半合成多西紫杉醇的比例为50:1～10:1ml/g。
5.根据权利要求4所述的分离纯化方法，其特征在于，所述有机溶剂和半合成多西紫杉醇的比例为25:1～15:1ml/g。
6.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤(1)中半合成多西紫杉醇与填料的质量比为1:3。
7.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤(2)中吸附含有杂质的半合成多西紫杉醇的MCI填料与MCI柱中填料的质量比为1:20-30。
8.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤(2)中洗脱所用溶剂为依次用不同浓度的乙醇。
9.根据权利要求7所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤(2)中洗脱所用溶剂为依次用20％、30％、40％、50％、60％和70％的乙醇。
10.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤(2)中含目标物的洗脱液是用浓度为40％和50％乙醇洗脱的洗脱液。
11.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤(3)中所述有机溶剂为甲醇、无水乙醇和丙酮中1种或2种以上的混合。
12.根据权利要求11所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤(3)中所述有机溶剂为为无水乙醇。
13.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤(3)中所述有机溶剂与步骤(2)所得混合物的比为1:1～10:1ml/mg。
14.根据权利要求13所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤(3)中所述有机溶剂与步骤(2)所得混合物的比为1:1～5:1ml/mg。
15.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤(3)中杂质A和E混合物和硅胶的质量比为1:1～1:10。
16.根据权利要求15所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤(3)中杂质A和E混合物和硅胶的质量比为1:3～1:7。
17.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤(3)所述吸附杂质A和E混合物的硅胶与硅胶柱中的填料质量比为1:20-60。
18.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤(3)所述吸附杂质A和E混合物的硅胶与硅胶柱中的填料质量比为1:30-40。
19.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤(3)中混合有机溶剂为正己烷和丙酮。
20.根据权利要求19所述的分离纯化方法，其特征在于，洗脱时正己烷与丙酮的体积比为5:1、3.5:1、3:1、2.5:1和2:1。
21.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，所述浓缩干燥为减压浓缩干燥。
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