CN106336466A - 一种缓释型抗菌剂及其制备方法 - Google Patents

一种缓释型抗菌剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种缓释型抗菌剂及其制备方法，所述抗菌剂为一种载壳聚糖的蒙脱土，其中壳聚糖的含量为5‑8%；其制备方法具体操作步骤为：将壳聚糖溶于3%醋酸水溶液中，得壳聚糖溶液，待用；将蒙脱土加入到去离子水中，搅拌15‑30分钟至其充分分散，滴加壳聚糖溶液，继续搅拌3‑5小时后，离心，取沉淀物水洗3‑5次后，于60‑70℃真空干燥6‑8小时，得所需缓释型抗菌剂。本发明利用壳聚糖的正离子特性，通过离子交换将其负载到蒙脱土上，从而使抗菌剂具有持久、缓释的优点，且本发明所采用壳聚糖的纯度和脱乙酰度较高，抗菌效果优异。

Description

一种缓释型抗菌剂及其制备方法
技术领域
本发明属于抗菌剂技术领域，具体涉及一种缓释型抗菌剂及其制备方法。
背景技术
壳聚糖又名脱乙酰甲壳素、可溶性甲壳素和聚氨基葡萄糖，其化学名称为β-(1→4)-2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖，系甲壳素用浓碱处理后脱去乙酰基而得到的产物。壳聚糖来源丰富，无毒且有良好的生物相容性和降解性，同时具有良好的抗菌活性，因此其作为天然无毒抗菌剂的研究具有重大意义。
壳聚糖的抗菌作用很大程度上受本身纯度、脱乙酰度等的影响，因此提高壳聚糖的纯度和脱乙酰度能够提高抗菌剂的抗菌活性。
中国专利CN102321192A提供了一种蝇蛆壳聚糖制备方法，将蝇蛆外壳采用盐酸搅拌浸泡离心后，取沉淀物物加入氢氧化钠水溶液中去除废物，再经脱色得到粗制蝇蛆甲壳素，再经微波加热法脱去乙酰基得到壳聚糖。该法所制壳聚糖的脱乙酰率较高，但由于壳聚糖的制备中使用了大量的浓碱，使得壳聚糖的分子链大量断裂，降低了其分子量和纯度，不适合用于制备高活性抗菌剂。
发明内容
本发明提供了一种缓释型抗菌剂，为一种载壳聚糖蒙脱土抗菌剂，其中壳聚糖的具有分子量高、纯度高、脱乙酰度高的特点，抗菌性能强且持久，环保无毒，能广泛应用于多个领域。
本发明解决技术问题所采用的技术方案为：
一种缓释型抗菌剂，为一种载壳聚糖的蒙脱土，其中壳聚糖的含量为5-8％；
所述壳聚糖的制备方法包括如下步骤：
(1)除钙：将昆虫甲壳粉碎后，置于质量浓度为10-20％的稀酸中于30-50℃浸煮4-6小时，过滤，取滤饼水洗3-5次后干燥得脱钙产物A待用，昆虫外壳中含有大量的钙质，利用稀酸将其溶解去除，将原料进一步分解。
(2)脱蛋白：将脱钙产物A、复合酶和水置于反应容器中，控制反应液PH为7.5-8.5，于40-55℃搅拌水解2-3小时后，过滤，取滤饼水洗干燥得脱蛋白产物B待用；所述复合酶为胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和碱性脂肪酶的混合物，三者的质量比为1：1：2。利用复合酶将滤饼A中的蛋白质酶解并溶于水中，反应条件温和，采用该配方的复合酶对昆虫甲壳中蛋白质的酶解效率更高，酶解效果更好。相比于氢氧化钠脱蛋白能获得高质量的甲壳素，且不会造成甲壳素的分子链断裂，从而降低其分子量。
(3)纯化：将脱蛋白产物B置于混合溶剂中，并加入中性盐，于60-80℃搅拌溶解1-3小时后，过滤，滤液经减压干燥去除溶剂，再经水洗去除中性盐，干燥得所需甲壳素；所述混合溶剂为己酸、乙二酸和吡啶的混合物，三者的质量比为1：0.8：0.5。将滤饼B经混合溶剂溶解再浓缩得到高纯度高分子量的甲壳素产品。甲壳素大分子中具有稳定的环状结构和大分子之间存在强的氢键作用，使它的溶解性能变差，不溶于水、稀酸、稀碱和一般的有机溶剂中。甲壳素在浓硫酸、盐酸、硝酸和85％磷酸等强酸中可溶解，但与此同时会发生剧烈的降解，使相对分子质量明显降低。本发明所采用的己酸、乙二酸和吡啶的混合溶剂，对甲壳素溶解率高，同时不会降低其分子量。加入中性盐是为了增加反应液的离子强度，利用甲壳素的阳离子特性，增强其在混合溶剂中的溶解率。
(4)脱乙酰：将步骤(3)所得甲壳素和15-20％NaOH水溶液加入石英玻璃反应容器中，置于紫外光下照射2-3小时，同时予以超声处理，反应结束后降温至室温，离心，沉淀物水洗至中性，于50-60℃干燥24小时后得壳聚糖。通常使用浓碱脱乙酰基，在获得高的脱乙酰率同时，甲壳素的主链降解严重，从而降低了壳聚糖的分子质量，影响了产品质量。本发明采用浓度较低的稀碱，通过超声-紫外联合的方式，脱除乙酰基，在获得高脱乙酰度的同时，减少了甲壳素主链降解，保证了壳聚糖产品质量。
作为优选，步骤(1)中所述稀酸为盐酸、硫酸或磷酸。
作为优选，步骤(1)中所述稀酸质量为昆虫甲壳质量的20-30倍。
作为优选，步骤(2)中所述脱钙产物A、复合酶和水的质量比为1：0.05-0.08：10-30。
作为优选，步骤(3)中所述脱蛋白产物B、混合溶剂和中性盐的质量比为1：15-20：0.1-0.3。
作为优选，所述中性盐为NaCl、KCl、Na2SO4、MgCl2或MgSO4。
作为优选，步骤(3)中所述甲壳素与NaOH水溶液质量比为1：8-15。
作为优选，步骤(4)中所述甲壳素与NaOH水溶液质量比为1：8-15。
本发明同时提供了一种缓释型抗菌剂的制备方法，包括如下步骤：将壳聚糖溶于3％醋酸水溶液中，得壳聚糖溶液，待用；将蒙脱土加入到去离子水中，搅拌15-30分钟至其充分分散，滴加壳聚糖溶液，继续搅拌3-5小时后，离心，取沉淀物水洗3-5次后，于60-70℃真空干燥6-8小时，得所需缓释型抗菌剂。
蒙脱土是一种具有双八面体层状结构的天然纳米级铝硅酸盐矿物质，因其具有较大的比表面积和层间可交换阳离子的存在，使蒙脱石具有吸附和交换性能，且其来源广泛，价格低廉、性质稳定，可作为抗菌金属离子的理想载体材料。壳聚糖分子中带有游离氨基，在酸性溶液中易成盐，呈阳离子性质，可与蒙脱土中的阳离子发生离子交换，从而形成缓释型再壳聚糖蒙脱土抗菌剂。
作为优选，所述壳聚糖、蒙脱土和去离子水的质量比为0.05-0.08：1：8-10，所述3％醋酸水溶液的质量为壳聚糖质量的10-20倍。
壳聚糖的质量为蒙脱土质量0.05-0.08倍时，所得抗菌剂的抗菌效果最好，壳聚糖的含量低，则抗菌效果不好，当壳聚糖的用量超过该范围时，抗菌效果也不再增加。醋酸水溶液的用量以壳聚糖质量的10-20倍为最佳，醋酸水溶液用量过低时，壳聚糖不能充分溶解和质子化，蒙脱土上所吸附壳聚糖量过低，则抗菌效果不好；醋酸水溶液用量过高时，壳聚糖发生降解，抗菌效果下降。
本发明的有益效果为：
1、本发明所提供的缓释型抗菌剂，具有安全、无毒、生物相容性好的优点，同时具有持久抗菌的功效。
2、本发明所制得壳聚糖的纯度和脱乙酰度较高，采用该壳聚糖所制缓释型抗菌剂抗菌效果更好。
3、本发明的壳聚糖制备工艺简单，设备常规，酸碱废水产量低，符合绿色环保生产的要求。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
实施例1
(1)除钙：将10g昆虫甲壳粉碎后，置于200g质量浓度为10％的稀酸中于50℃浸煮4小时，过滤，取滤饼水洗3-5次干燥后得7.2g脱钙产物A；
(2)脱蛋白：将7.2g脱钙产物A、0.09g胰蛋白酶、0.09g木瓜蛋白酶、0.18g碱性脂肪酶和144g水置于三口烧瓶中，控制反应液PH为7.5，于40℃搅拌水解3小时后，过滤，取滤饼水洗干燥得4.3g脱蛋白产物B；
(3)纯化：将4.3g脱蛋白产物B、28g己酸、22g乙二酸、14g吡啶和0.43gNaCl中，于60℃搅拌溶解3小时后，过滤，滤液经减压干燥去除溶剂，再经水洗去除NaCl，干燥得3.2g甲壳素，HPLC纯度为92.3％，回收率为29.54％，灰分为0.8％。
(4)脱乙酰：将3g甲壳素和45g 15％NaOH水溶液加入石英玻璃反应容器中，置于245nm紫外光下照射2小时，同时予以超声处理，反应结束后降温至室温，离心，沉淀物水洗至中性，于50℃干燥24小时后得2.4g壳聚糖，其脱乙酰度为95.2％，纯度为97.3％，粘度为165cp。
注：壳聚糖粘度的测定方法为：取0.5g壳聚糖溶于100ml 0.5％醋酸中，室温下用旋转粘度计测定，壳聚糖粘度越高，则其分子量越大。
(5)将0.5g壳聚糖溶于5g 3％醋酸水溶液中，得壳聚糖溶液，待用；将10g蒙脱土加入到80g去离子水中，搅拌15分钟至其充分分散，滴加壳聚糖溶液，于20min内滴加完毕，继续搅拌3小时后，离心，取沉淀物水洗3次后，于60℃真空干燥8小时，得10.2g缓释型抗菌剂。
实施例2
(1)除钙：将10g昆虫甲壳粉碎后，置于250g质量浓度为15％的稀酸中于30℃浸煮6小时，过滤，取滤饼水洗3-5次干燥后得7.8g脱钙产物A；
(2)脱蛋白：将7.8g脱钙产物A、0.12g胰蛋白酶、0.12g木瓜蛋白酶、0.24g碱性脂肪酶和78g水置于三口烧瓶中，控制反应液PH为8，于50℃搅拌水解2.5小时后，过滤，取滤饼水洗干燥得5.1g脱蛋白产物B；
(3)纯化：将5.1g脱蛋白产物B、40g己酸、32g乙二酸、20g吡啶和1g MgSO4中，于70℃搅拌溶解2小时后，过滤，滤液经减压干燥去除溶剂，再经水洗去除MgSO4，干燥得3.8g甲壳素，HPLC纯度为93.8％，回收率为35.6％，灰分为0.78％。
(4)脱乙酰：将3g甲壳素和30g 18％NaOH水溶液加入石英玻璃反应容器中，置于245nm紫外光下照射2.5小时，同时予以超声处理，反应结束后降温至室温，离心，沉淀物水洗至中性，于55℃干燥24小时后得2.7g壳聚糖，其脱乙酰度为94.8％，纯度为96.3％，粘度为158cp。
(5)将0.6g壳聚糖溶于9g 3％醋酸水溶液中，得壳聚糖溶液，待用；将10g蒙脱土加入到90g去离子水中，搅拌20分钟至其充分分散，滴加壳聚糖溶液，于20min内滴加完毕，继续搅拌4小时后，离心，取沉淀物水洗5次后，于70℃真空干燥6小时，得10.5g缓释型抗菌剂。
实施例3
(1)除钙：将10g昆虫甲壳粉碎后，置于300g质量浓度为20％的稀酸中于40℃浸煮5小时，过滤，取滤饼水洗3-5次干燥后得6.9g脱钙产物A；
(2)脱蛋白：将6.9g脱钙产物A、0.14g胰蛋白酶、0.14g木瓜蛋白酶、0.28g碱性脂肪酶和水置于三口烧瓶中，控制反应液PH为8.5，于55℃搅拌水解2小时后，过滤，取滤饼水洗干燥得4.6g脱蛋白产物B；
(3)纯化：将4.6g脱蛋白产物B、40g己酸、32g乙二酸、20g吡啶和1.4g Na2SO4中，于80℃搅拌溶解1小时后，过滤，滤液经减压干燥去除溶剂，再经水洗去除Na2SO4，干燥得3.5g甲壳素，HPLC纯度为93.1％，回收率为32.6％，灰分为0.72％。
(4)脱乙酰：将3g甲壳素和24g 20％NaOH水溶液加入石英玻璃反应容器中，置于245nm紫外光下照射3小时，同时予以超声处理，反应结束后降温至室温，离心，沉淀物水洗至中性，于60℃干燥24小时后得2.2g壳聚糖，其脱乙酰度为93.6％，纯度为96.8％，粘度为153cp。
(5)将0.8g壳聚糖溶于16g 3％醋酸水溶液中，得壳聚糖溶液，待用；将10g蒙脱土加入到100g去离子水中，搅拌30分钟至其充分分散，滴加壳聚糖溶液，于30min内滴加完毕，继续搅拌5小时后，离心，取沉淀物水洗4次后，于65℃真空干燥7小时，得10.6g缓释型抗菌剂。
实施例4抗菌实验
称取40mg实施例3所制抗菌剂于装有100ml菌液(菌液浓度103cfu/m1)的无菌三角瓶中，混匀；另取一份不加载银蒙脱石作为对照组，同时置于37℃恒温摇床中振荡培养，分别于不同时间取出振荡瓶中混合液0.2ml溶液，均匀涂布于营养琼脂平板上，37℃培养24h后观察结果。活菌计数，计算抑菌率。
实验结果见表1所示：
表1：
从表1所示实验数据可以看出，本发明所制抗菌剂在短时间内即有较好的抗菌效果。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

Claims (9)

1.一种缓释型抗菌剂，其特征在于，所述缓释型抗菌剂为一种载壳聚糖的蒙脱土，其中壳聚糖的含量为5-8%；
所述壳聚糖的制备方法包括如下步骤：
(1) 除钙：将昆虫甲壳粉碎后，置于质量浓度为10-20%的稀酸中于30-50℃浸煮4-6小时，过滤，取滤饼水洗3-5次后干燥得脱钙产物A待用；
(2) 脱蛋白：将脱钙产物A、复合酶和水置于反应容器中，控制反应液PH为7.5-8.5，于40-55℃搅拌水解2-3小时后，过滤，取滤饼水洗干燥得脱蛋白产物B待用；所述复合酶为胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和碱性脂肪酶的混合物，三者的质量比为1：1：2；
(3) 纯化：将脱蛋白产物B置于混合溶剂中，并加入中性盐，于60-80℃搅拌溶解1-3小时后，过滤，滤液经减压干燥去除溶剂，再经水洗去除中性盐，干燥得所需甲壳素；所述混合溶剂为己酸、乙二酸和吡啶的混合物，三者的质量比为1：0.8：0.5；
(4) 脱乙酰：将步骤(3)所得甲壳素和15-20% NaOH水溶液加入石英玻璃反应容器中，置于紫外光下照射2-3小时，同时予以超声处理，反应结束后降温至室温，离心，沉淀物水洗至中性，于50-60℃干燥24小时后得壳聚糖。
2.如权利要求1所述的缓释型抗菌剂，其特征在于，步骤(1)中所述稀酸为盐酸、硫酸或磷酸。
3.如权利要求1所述的缓释型抗菌剂，其特征在于，步骤(1)中所述稀酸质量为昆虫甲壳质量的20-30倍。
4.如权利要求1所述的缓释型抗菌剂，其特征在于，步骤(2)中所述脱钙产物A、复合酶和水的质量比为1：0.05-0.08：10-30。
5.如权利要求1所述的缓释型抗菌剂，其特征在于，步骤(3)中所述脱蛋白产物B、混合溶剂和中性盐的质量比为1：15-20：0.1-0.3。
6.如权利要求1或5所述的缓释型抗菌剂，其特征在于，所述中性盐为NaCl、KCl、Na2SO4、MgCl2或MgSO4。
7.如权利要求1所述的缓释型抗菌剂，其特征在于，步骤(4)中所述甲壳素与NaOH水溶液质量比为1：8-15。
8.制备如权利要求1所述的缓释型抗菌剂的方法，其特征在于，所述制备方法的具体操作方法为：将壳聚糖溶于3%醋酸水溶液中，得壳聚糖溶液，待用；将蒙脱土加入到去离子水中，搅拌15-30分钟至其充分分散，滴加壳聚糖溶液，继续搅拌3-5小时后，离心，取沉淀物水洗3-5次后，于60-70℃真空干燥6-8小时，得所需缓释型抗菌剂。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述壳聚糖、蒙脱土和去离子水的质量比为0.05-0.08：1：8-10，所述3%醋酸水溶液的质量为壳聚糖质量的10-20倍。
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