CN106279359A

CN106279359A - 一种制备五种稻曲病菌毒素的方法

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Publication number: CN106279359A
Application number: CN201610654547.2A
Authority: CN
Inventors: 曹赵云; 陈铭学; 牟仁祥; 卞英芳; 林晓燕
Original assignee: China National Rice Research Institute
Current assignee: China National Rice Research Institute
Priority date: 2016-08-11
Filing date: 2016-08-11
Publication date: 2017-01-04

Abstract

本发明公开了一种制备五种稻曲病菌毒素的方法，包括Ustiloxins A、B、C、D、F，包括以下步骤：1)在容器内加入1重量份的稻曲球，然后再加入5重量份的水进行提取得到提取液；2)获得3组稻曲病菌毒素混合馏分；3)获得单一稻曲病菌毒素馏分；4)获得单一稻曲病菌毒素纯品；5)单一稻曲病菌毒素纯品经减压浓缩及真空冷冻干燥，最终获得五种稻曲病毒素标准品。本发明操作简单，制备效率高；整个制备过程仅采用3次色谱分离，涉及3种常见色谱填料，即PCX净化小柱、反相C18色谱柱和阳离子交换色谱柱；本方法一次制备可同时获得5种稻曲病菌毒素标准品，且制备过程无需额外标准品为参照。

Description

一种制备五种稻曲病菌毒素的方法

技术领域

本发明涉及农产品安全检测技术领域，尤其涉及一种制备五种稻曲病菌毒素的方法。

背景技术

稻曲病是由绿核菌属绿核菌Ustilaginodea virens(Cooke)Tak.侵染水稻穗部引起的一种真菌病害，该病菌从小穗的内、外稃间隙入侵，最终形成形于谷粒数倍的菌丝球即稻曲球。近年来，随着水稻品种、耕作方式、施肥用量及气候环境等因素改变，稻曲病的发生日趋严重，已成为影响全球水稻生产的主要病害之一。稻曲病不但严重影响水稻的产量和品质，且能产生对人畜有剧毒作用的稻曲病菌毒素。因此，有关稻曲病菌及其毒素的研究日益引起人们的关注。然而，截止目前还没有合成的稻曲病菌毒素标准品，这给相关领域研究带来极大的不便。建立一种高效的稻曲病菌毒素制备方法，成为获得这些标准品的最佳途径。

截止目前，共有6种稻曲病菌毒素得到结构鉴定，它们分别是Ustiloxins A、B、C、D、F和E，其中，Ustiloxins A、B、C、D、F的含量较为丰富，活性也较强，它们的化学结构式如下：

目前，有关稻曲病菌毒素的制备方法多采用多次色谱分离，过程较为复杂耗时。早在1994年，Koiso等(J.Antibiot.，1994,47:765-773)首次分离得到5种稻曲病菌毒素(Ustiloxins A、B、C、D和F)纯品。该方法首先将稻曲球水提取物进行过滤、浓缩，经反相C18柱分离，甲醇水溶液洗脱，依次用甲醇水溶液洗脱，并分别收集。在反复利用反相C18色谱柱、硅胶柱和多孔树脂进行分离，从而获得上述5种毒素。该方法虽获得了多种稻曲病菌毒素，但其操作复杂、耗时费力，整个纯化过程涉及10余次色谱分离，其效率较低，不利于大批量分离纯化，且获得的产品量非常有限。

之后，虽经多次改良，制备过程较Koiso等描述的略为简单，但获得的稻曲病菌毒素种类较少。Shan等(Molecules,2013,18:8181-8199)首先将稻曲球粗提物过阴离子交换树脂PA308，pH梯度淋洗和洗脱；洗脱液过多孔径吸附树脂HP-20，水和乙醇水溶液洗脱；洗脱液用透析管纯化，再经反相ODS-AQ柱分离，含三氟乙酸的甲醇溶液洗脱，最后分别用Sephadex LH-20和Sephadex Q15凝胶色谱纯化，得到Ustiloxins A、B两种纯品。

中国专利(公布号为CN102584941 A，公布日为2012年7月18日)公开了“一种稻曲病菌毒素Ustiloxin A的提取纯化方法”，其采用甲酸水溶液提取，粗提取物经阳离子交换柱净化，净化液经浓缩后获得粗毒素干粉；干粉溶液经半制备HPLC分离，最后以标准品为对照，用薄层层析法纯化，获得Ustiloxin A纯品。该方法制备过程尽管简单，但只能得到一种稻曲病菌毒素，同时还另需Ustiloxin A标准品为参照。

发明内容

本发明是为了解决目前没有合成的稻曲病菌毒素标准品，而现有稻曲病菌毒素制备过程复杂，及一次实验获得标准品种类少的问题，提供一种在实验室能够快速，简单和高效的制备五种稻曲病菌毒素的方法。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案，一种制备五种稻曲病菌毒素的方法，五种稻曲病菌毒素为Ustiloxins A、B、C、D、F，包括以下步骤：1)在容器内加入1重量份的稻曲球，然后再加入5重量份的水进行提取得到提取液，提取液采用聚合物阳离子交换树脂净化后获得稻曲球提取物净化溶液；2)以反相色谱-高分辨质谱联用技术为一维制备色谱，采用柱后分流方式，在质谱选择离子峰指导下，以甲醇-水为流动相进行梯度洗脱，对稻曲球提取物净化溶液进行组分切割，获得3组稻曲病菌毒素混合馏分；3)基于220nm紫外色谱峰，以阳离子交换柱为二维制备色谱，乙腈和2.5mmol/L甲基磺酸溶液洗脱，对3组稻曲病毒素混合馏分进行组分切割，获得单一稻曲病菌毒素馏分；4)单一稻曲病菌毒素馏分分别经聚合物阳离子交换树脂净化以去除甲基磺酸，再分数次注入一维制备色谱进行纯化，获得单一稻曲病菌毒素纯品；5)单一稻曲病菌毒素纯品经减压浓缩及真空冷冻干燥，最终获得五种稻曲病毒素标准品。

作为优选，所述的步骤1)中，提取液的净化采用以下步骤：a)在稻曲球提取液中加入甲酸，使提取液中甲酸含量为5％；b)取其中5-10mL过PCX萃取柱，依次用5mL5％甲酸-水和5mL甲醇淋洗；c)用15mL 5％氨水甲醇洗脱小柱；d)收集洗脱液，在50℃下减压浓缩，得到稻曲球提取物净化溶液。

作为优选，所述的步骤2)中，一维制备色谱采用以下步骤：h)以半制备反相C18柱对稻曲球提取物净化溶液进行第一次分离，以水和甲醇为色谱流动相梯度洗脱；i)洗脱液经柱后分流，其中小流份进入高分辨质谱(分辨率可达100000FWHM)进行实时监测；j)大流份依据保留时间进行馏分收集；k)Ustiloxin B和Ustiloxin F单独收集，Ustiloxin A、C和D则一起收集，以此获得3组稻曲病菌毒素混合馏分。

作为优选，所述的步骤h)中，一维色谱的流动相为水和甲醇，流动相流速为1.5mL/min，进样量600μL，梯度洗脱程序为：0～5min，90％水；5～20min，90％～80％水；20～30min，80％～35％水；30.1～40min，10％水；40.1～50min，90％水。

作为优选，所述的步骤k)中，各组分最佳收集时间段为：Ustiloxin B于13.6～15.1min时间段收集，Ustiloxin F于15.8～17.5min时间段收集，Ustiloxin A、C和D则在20.0～24.5min时间段一起收集。

作为优选，所述的步骤3中，稻曲病毒素单一馏分的二维制备色谱采用以下步骤：r)将步骤2获得的3组稻曲病毒素馏分分别浓缩至5mL，分别数次注入阳离子交换柱进行第二次分离；s)阳离子交换柱进行第二次分离中，监测波长220nm；t)以甲基磺酸和乙腈为流动相等度洗脱，依据各目标组分的保留时间进行馏分收集，获得5种稻曲病菌毒素的单一馏分，其中甲基磺酸和乙腈的体积比为90:10，所述的甲基磺酸浓度为2.5mmol/L。

作为优选，所述的步骤t)中，各组分最佳收集时间段为：Ustiloxin B的最佳收集时间段为：28～30min，Ustiloxin F的收集时间段为14～15min，Ustiloxin A的收集时间段为39～42min，Ustiloxin C的收集时间段为15～15.6min，Ustiloxin D的收集时间段为22.8～23.5min。

作为优选，所述的步骤4)中，各稻曲病菌毒素馏分中甲基磺酸的去除步骤如下：u)在各稻曲病菌毒素的单一馏分中加入甲酸，使甲酸含量为5％；v)取其中5-10mL过PCX萃取柱，依次用5mL 5％甲酸-水和5mL甲醇淋洗；w)用15mL 5％氨水甲醇洗脱小柱；x)收集所得的洗脱液，在50℃下减压浓缩，得到单一稻曲病菌毒素净化馏分。

所述的步骤x)中获得的单一稻曲病菌毒素净化馏分分别注入半制备反相C18柱进行分离，其步骤如下：y)以半制备反相C18柱对稻曲球提取物净化溶液进行分离纯化，以体积比为80:20的水和甲醇为色谱流动相等度洗脱；监测波长220nm；z)依据各目标组分的保留时间进行馏分收集，其中，Ustiloxin B和F的收集时间段均为：5.5～6.5min，UstiloxinA的收集时间段为6.8～8.1min，Ustiloxin C的收集时间段为6.5～8min，Ustiloxin D的收集时间段为8.3～9.5min，各馏分分别经减压浓缩，得到进一步净化的单一稻曲病菌毒素净化馏分。

作为优选，将得到的单一稻曲病菌毒素净化馏分真空冷冻干燥后，获得白色粉末状五种稻曲病菌毒素标准品。

因此，本发明具有如下有益效果：(1)二维液相色谱-高分辨质谱联用制备5种高纯度稻曲病菌毒素方法，具有操作简单，制备效率高；(2)整个制备过程仅采用3次色谱分离，涉及3种常见色谱填料，即PCX净化小柱、反相C18色谱柱和阳离子交换色谱柱；(3)本方法一次制备可同时获得5种稻曲病菌毒素标准品，且制备过程无需额外标准品为参照。

附图说明

图1为本发明制备5种稻曲病菌毒素的流程框图。

图2为本发明5种稻曲病菌毒素经半制备C18柱(Eclipse XDB-C18)分离后的总离子流图。

图3为本发明5种稻曲病菌毒素经阳离子交换柱(Dionex IonPacTM CS17)分离后的色谱图。

图4为本发明单一稻曲病菌毒素净化馏分经半制备C18柱(Eclipse XDB-C18)分离后的色谱图。

具体实施方式

下面对本发明做进一步的描述。

一种制备五种稻曲病菌毒素的方法，五种稻曲病菌毒素为Ustiloxins A、B、C、D、F，包括以下步骤：1)在容器内加入1重量份的稻曲球，然后再加入5重量份的水进行提取得到提取液，提取液采用聚合物阳离子交换树脂净化后获得稻曲球提取物净化溶液；2)以反相色谱-高分辨质谱联用技术为一维制备色谱，采用柱后分流方式，在质谱选择离子峰指导下，以甲醇-水为流动相进行梯度洗脱，对稻曲球提取物净化溶液进行组分切割，获得3组稻曲病菌毒素混合馏分；3)基于220nm紫外色谱峰，以阳离子交换柱为二维制备色谱，乙腈和2.5mmol/L甲基磺酸洗脱，对各混合馏分进行组分切割，获得单一稻曲病菌毒素馏分；4)单一稻曲病菌毒素馏分分别经聚合物阳离子交换树脂净化以去除甲基磺酸，将单一稻曲病菌毒素净化馏分分别注入一维制备色谱进行纯化，获得单一稻曲病菌毒素纯品；5)单一稻曲病菌毒素纯品经减压浓缩及真空冷冻干燥，最终获得五种稻曲病毒素标准品；

步骤1)中，提取液的净化采用以下步骤：a)在稻曲球提取液中加入甲酸，使提取液中甲酸含量为5％；b)取其中5-10mL过PCX萃取柱，依次用5mL 5％甲酸-水和5mL甲醇淋洗；c)用15mL 5％氨水甲醇洗脱小柱；d)收集洗脱液，在50℃下减压浓缩，得到稻曲球提取物净化溶液；

步骤2)中，一维制备色谱采用以下步骤：h)以半制备反相C18柱对稻曲球提取物净化溶液进行第一次分离，以水和甲醇为色谱流动相梯度洗脱；i)洗脱液经柱后分流，其中小流份进入高分辨质谱进行实时监测；j)大流份依据保留时间进行馏分收集；k)Ustiloxin B和Ustiloxin F单独收集，Ustiloxin A、C和D则一起收集，以此获得3组稻曲病菌毒素混合馏分；

步骤h)中，一维色谱的流动相为水(A)和甲醇，流动相流速为1.5mL/min，梯度洗脱程序为：0～5min，90％A；5～20min，90％～80％A；20～30min，80％～35％A；30.1～40min，10％A；40.1～50min，90％A。；

步骤k)中，各组分最佳收集时间段为：Ustiloxin B于13.6～15.1min时间段收集，Ustiloxin F于15.8～17.5min时间段收集，Ustiloxin A、C和D则在20.0～24.5min时间段一起收集；

稻曲病菌毒素的二维制备色谱采用以下步骤：r)将3组稻曲病毒素混合馏分分别浓缩至5mL，注入二维制备色谱；s)阳离子交换柱进行第二次分离，监测波长220nm；t)以甲基磺酸和乙腈为流动相等度洗脱，依据各目标组分的保留时间进行馏分收集，以此获得5种稻曲病菌毒素的单一馏分；

步骤t)中，甲基磺酸和乙腈的体积比为90:10，所述的甲基磺酸浓度为2.5mmol/L；各组分最佳收集时间段为：Ustiloxin B的收集时间段为：28～30min，Ustiloxin F的收集时间段为14～15min，Ustiloxin A的收集时间段为39～42min，Ustiloxin C的收集时间段为15～15.6min，Ustiloxin D的收集时间段为22.8～23.5min；

步骤4)中，稻曲病菌毒单一馏分中甲基磺酸去除步骤如下：u)在稻曲病菌毒素的单一馏分中分别加入甲酸，使甲酸含量为5％；v)各取其中1mL过PCX萃取柱，依次用5mL 5％甲酸-水和5mL甲醇淋洗；w)用15mL 5％氨水甲醇洗脱小柱；x)收集洗脱液，在50℃下减压浓缩，得到单一稻曲病菌毒素净化馏分；

步骤x)中获得的单一稻曲病菌毒素净化馏分分别注入半制备反相C18柱进行分离，其步骤如下：y)以半制备反相C18柱对稻曲球提取物净化溶液进行分离纯化，以体积比为80:20的水和甲醇为色谱流动相等度洗脱；监测波长220nm；z)依据各目标组分的保留时间进行馏分收集，其中，Ustiloxin B和F的收集时间段均为：5.5～6.5min，Ustiloxin A的收集时间段为6.8～8.1min，Ustiloxin C的收集时间段为6.5～8min，Ustiloxin D的收集时间段为8.3～9.5min，各馏分分别经减压浓缩，得到进一步净化的单一稻曲病菌毒素净化馏分；

各馏分经减压浓缩至3mL时，采用真空冷冻干燥，获得白色粉末状五种稻曲病菌毒素标准品。

具体实施过程是，如图1、图2、图3和图4所示，以下实施中使用的主要仪器是：Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL系统；Agilent 1200高效液相色谱仪，紫外检测器；LABCONCO FreeZone 2.5plus真空冷冻干燥机；BUCHI R-210旋转蒸发仪，包括如下步骤：

步骤1，取稻曲球粉末，加入其5倍质量的水，置于摇床，摇床条件为室温、130转/分钟，30min后取出，再加入等体积二氯甲烷，充分振摇，于7000转/分钟下离心15min，使其分层，取上清液；

步骤2，将上清液中加入甲酸，并调整甲酸含量为5％，每取5～10mL过1支PCX小柱，依次用5mL 5％甲酸-水和5mL甲醇淋洗，再用15mL 5％氨水甲醇洗脱小柱；收集洗脱液，于旋转蒸发仪中50℃下减压浓缩，得到稻曲病菌毒素粗提取物25mL；

步骤3，采用半制备反相C18柱(Eclipse XDB-C18，9.4×250mm，5μm)对粗提取物进行第一次分离，以水(A)和甲醇为色谱流动相梯度洗脱；流动相流速为1.5mL/min，进样量为600μL，梯度洗脱程序为：0～5min，90％A；5～20min，90％～80％A；20～30min，80％～35％A；30.1～40min，10％A；40.1～50min，90％A；洗脱液经柱后分流(约20:1)，其中小流份进入高分辨质谱(LTQ/Orbitrap MS)进行实时监测(保留时间和监测离子见表1)，大流份依据保留时间进行馏分收集。其中，Ustiloxin B于13.6～15.1min时间段收集，Ustiloxin F于15.8～17.5min时间段收集，Ustiloxin A、C和D则在20.0～24.5min时间段一起收集，以此获得3组稻曲病菌毒素混合馏分；

步骤4，将上述3组馏分于旋转蒸发仪中50℃下旋转蒸发浓缩至约5mL，分别数次注入阳离子交换柱(Dionex IonPacTM CS17，4×250mm，7μm)进行第二次分离，流动相流速为1mL/min，进样量为40μL，监测波长220nm；以2.5mmol/L甲基磺酸和乙腈(90:10，v/v)为流动相等度洗脱，依据各目标组分的保留时间进行馏分收集。其中，Ustiloxin B的收集时间段为：28～30min，Ustiloxin F的收集时间段为14～15min，Ustiloxin A的收集时间段为39～42min，Ustiloxin C的收集时间段为15～15.6min，Ustiloxin D的收集时间段为22.8～23.5min，以此获得5种稻曲病菌毒素的单一馏分；

步骤5，将上述单一馏分分别于旋转蒸发仪中50℃下旋转蒸发浓缩至约10mL，加入甲酸，并调整甲酸含量为5％，并过PCX柱，其余操作过程与步骤2相同。得到单一稻曲病菌毒素净化溶液各25mL；

步骤6，将上一步得到的各25mL单一溶液，分别数次注入半制备反相C18柱纯化，以水和甲醇为色谱流动相(体积比为80:20)等度洗脱，流动相流速为1.5mL/min，进样量为600μL，监测波长220nm，依据各目标组分的保留时间进行馏分收集，其中，Ustiloxin B和F的收集时间段均为：5.5～6.5min，Ustiloxin A的收集时间段为6.8～8.1min，Ustiloxin C的收集时间段为6.5～8min，Ustiloxin D的收集时间段为8.3～9.5min；

步骤7，将步骤6收集到的5种单一稻曲病菌毒素纯溶液，分别经真空冷冻干燥后，最终获得5种稻曲病菌毒素白色粉末状标准品。经高效液相色谱检验，峰面积归一化法测定Ustiloxin A、B、C、D和F的纯度分别为97.7％、94.4％、92.1％、88.5％和88.1％。

表1 5种稻曲病菌毒素的保留时间和监测离子

Claims

1.一种制备五种稻曲病菌毒素的方法，五种稻曲病菌毒素为Ustiloxins A、B、C、D、F，其特征在于，包括以下步骤：1)在容器内加入1重量份的稻曲球，然后再加入5重量份的水进行提取得到提取液，提取液采用聚合物阳离子交换树脂净化后获得稻曲球提取物净化溶液；2)以反相色谱-高分辨质谱联用技术为一维制备色谱，采用柱后分流方式，在质谱选择离子峰指导下，以甲醇-水为流动相进行梯度洗脱，对稻曲球提取物净化溶液进行组分切割，获得3组稻曲病菌毒素混合馏分；3)基于220nm紫外色谱峰，以阳离子交换柱为二维制备色谱，乙腈和2.5mmol/L甲基磺酸洗脱，对3组稻曲病毒素混合馏分进行组分切割，获得单一稻曲病菌毒素馏分；4)单一稻曲病菌毒素馏分分别经聚合物阳离子交换树脂净化以去除甲基磺酸，再分数次注入一维制备色谱进行纯化，获得单一稻曲病菌毒素纯品；5)单一稻曲病菌毒素纯品经减压浓缩及真空冷冻干燥，最终获得五种稻曲病毒素标准品。

2.根据权利要求1所述的一种制备五种稻曲病菌毒素的方法，其特征是，所述的步骤1)中，提取液的净化采用以下步骤：a)在稻曲球提取液中加入甲酸，使提取液中甲酸含量为5％；b)取其中5-10mL过PCX萃取柱，依次用5mL 5％甲酸-水和5mL甲醇淋洗；c)用15mL 5％氨水甲醇洗脱小柱；d)收集洗脱液，在50℃下减压浓缩，得到稻曲球提取物净化溶液。

3.根据权利要求1所述的一种制备五种稻曲病菌毒素的方法，其特征是，所述的步骤2)中，一维制备色谱采用以下步骤：h)以半制备反相C18柱对稻曲球提取物净化溶液进行第一次分离，以水和甲醇为色谱流动相梯度洗脱；i)洗脱液经柱后分流，其中小流份进入高分辨质谱进行实时监测；j)大流份依据保留时间进行馏分收集；k)Ustiloxin B和Ustiloxin F单独收集，Ustiloxin A、C和D则一起收集，以此获得3组稻曲病菌毒素混合馏分。

4.根据权利要求3所述的一种制备五种稻曲病菌毒素的方法，其特征是，所述的步骤h)中，一维色谱的流动相为水和甲醇，流动相流速为1.5mL/min，进样量600μL，梯度洗脱程序为：0～5min，90％水；5～20min，90％～80％水；20～30min，80％～35％水；30.1～40min，10％水；40.1～50min，90％水。

5.根据权利要求3所述的一种制备五种稻曲病菌毒素的方法，其特征是，所述的步骤k)中，各组分最佳收集时间段为：Ustiloxin B于13.6～15.1min时间段收集，Ustiloxin F于15.8～17.5min时间段收集，Ustiloxin A、C和D则在20.0～24.5min时间段一起收集。

6.根据权利要求1所述的一种制备五种稻曲病菌毒素的方法，其特征是，所述的步骤3中，稻曲病毒素单一馏分的二维制备色谱采用以下步骤：r)将步骤2获得的3组稻曲病毒素馏分分别浓缩至5mL，分别数次注入阳离子交换柱进行第二次分离；s)阳离子交换柱进行第二次分离中，监测波长220nm；t)以甲基磺酸和乙腈为流动相等度洗脱，依据各目标组分的保留时间进行馏分收集，获得5种稻曲病菌毒素的单一馏分，其中甲基磺酸和乙腈的体积比为90:10，所述的甲基磺酸浓度为2.5mmol/L。

7.根据权利要求6所述的一种制备五种稻曲病菌毒素的方法，其特征是，所述的步骤t)中，Ustiloxin B的最佳收集时间段为：28～30min，Ustiloxin F的收集时间段为14～15min，Ustiloxin A的收集时间段为39～42min，Ustiloxin C的收集时间段为15～15.6min，Ustiloxin D的收集时间段为22.8～23.5min。

8.根据权利要求1所述的一种制备五种稻曲病菌毒素的方法，其特征是，所述的步骤4)中，各稻曲病菌毒素馏分中甲基磺酸的去除步骤如下：u)在各稻曲病菌毒素的单一馏分中加入甲酸，使甲酸含量为5％；v)取其中5-10mL过PCX萃取柱，依次用5mL 5％甲酸-水和5mL甲醇淋洗；w)用15mL 5％氨水甲醇洗脱小柱；x)收集所得的洗脱液，在50℃下减压浓缩，得到单一稻曲病菌毒素净化馏分。

9.根据权利要求8所述的一种制备五种稻曲病菌毒素的方法，其特征是，所述的步骤x)中获得的单一稻曲病菌毒素净化馏分分别注入半制备反相C18柱进行分离，其步骤如下：y)以半制备反相C18柱对稻曲球提取物净化溶液进行分离纯化，以体积比为80:20的水和甲醇为色谱流动相等度洗脱；监测波长220nm；z)依据各目标组分的保留时间进行馏分收集，其中，Ustiloxin B和F的收集时间段均为：5.5～6.5min，Ustiloxin A的收集时间段为6.8～8.1min，Ustiloxin C的收集时间段为6.5～8min，Ustiloxin D的收集时间段为8.3～9.5min，各馏分分别经减压浓缩，得到进一步净化的单一稻曲病菌毒素净化馏分。

10.根据权利要求8或9所述的一种制备五种稻曲病菌毒素的方法，其特征是，将得到的单一稻曲病菌毒素净化馏分真空冷冻干燥后，获得白色粉末状五种稻曲病菌毒素标准品。