发明内容
本发明所要解决的技术问题在于,提供一种适用于痰湿质的抗肺癌药物及其制备方法,该药物根据中医理论,以扶正祛邪、解郁散瘀为治则,可以明显抑制痰湿质肺癌肿瘤的增长和转移。
为了解决上述技术问题,本发明提供了一种适用于痰湿质的抗肺癌药物,所述药物包括以下原料药材:党参、蛇舌草、半枝莲、夏枯草、山慈菇、荔枝核、生薏米、浙贝、厚朴、半夏和甘草;所有所述原料药材均为炮制后的饮片。
所述药物由以下重量份数的原料药材制成:党参8-22份、蛇舌草27-35份、半枝莲27-32份、夏枯草18-24份、山慈菇20-28份、荔枝核20-26份、生薏米27-35份、浙贝15-20份、厚朴7-17份、半夏7-13份和甘草5-15份。
所述药物优选地由以下重量份数的原料药材制成:党参12-16份、蛇舌草28-31份、半枝莲28-32份、夏枯草23-25份、山慈菇22-25份、荔枝核22-25份、生薏米28-32份、浙贝15-19份、厚朴10-13份、半夏7-11份和甘草6-11份。
所述药物还可以优选为由以下重量份数的原料药材制成:党参15份、蛇舌草30份、半枝莲30份、夏枯草24份、山慈菇24份、荔枝核24份、生薏米30份、浙贝18份、厚朴12份、半夏9份和甘草9份。
所述药物又可以优选为由以下重量份数的原料药材制成:党参8份、蛇舌草35份、半枝莲27份、夏枯草24份、山慈菇20份、荔枝核20份、生薏米35份、浙贝15份、厚朴17份、半夏13份和甘草5份。
所述药物由以下重量份数的原料药材制成:党参22份、蛇舌草27份、半枝莲32份、夏枯草18份、山慈菇28份、荔枝核26份、生薏米27份、浙贝20份、厚朴7份、半夏7份和甘草15份。
所述药物优选地由以下重量份数的原料药材制成:党参16份、蛇舌草28份、半枝莲28份、夏枯草25份、山慈菇22份、荔枝核22份、生薏米32份、浙贝15份、厚朴10份、半夏7份和甘草6份。
为了更好的实现上述发明目的,本发明还提供了一种适用于痰湿质的抗肺癌药物的制备方法,其制备方法包括:
(1)按所述重量份数称取所有原料药材,加入凉水,浸泡2-3小时,然后煮沸2-3小时,过滤,得药液一,药渣备用;
(2)向步骤(1)中的药渣加温水,煎煮1-2小时,过滤,得药液二和药渣;
(3)将药液一和药液二合并后过滤,继续加热煎煮,在煎煮过程中并加入阿胶、黄酒和蜂蜜,并不断搅拌,煎煮至阿胶完全烊化,过滤后继续加热直至搅拌成膏滋;其中,阿胶、黄酒和蜂蜜的添加量分别为10-14重量份、9-11重量份和12-17重量份;优选地,阿胶、黄酒和蜂蜜的添加量分别为12重量份、10重量份和15重量份;
(4)将膏滋趁热倒入自动分装机内进行分装工作,按照每袋20g进行分装,得到成品,放置在干燥环境备取。
本发明的有益效果是:本发明的药物依据中医药理论,纵观全方,配伍合理,组方严谨,药精力专,符合中医药理论,诸药合用,共奏滋阴清热、化痰祛湿、扶正祛邪、抑癌抗瘤之效。
实施例4
本发明实施例提供了一种用于治疗痰湿质肺癌的药物,由以下重量份数的原料药材制成:党参160g、蛇舌草280g、半枝莲280g、夏枯草250g、山慈菇220g、荔枝核220g、生薏米320g、浙贝150g、厚朴100g、半夏70g和甘草60g;所有原料药材均为炮制后的饮片;
其制备方法为:
(1)按上述重量称取所有原料药材,加入凉水,浸泡2小时,然后煮沸2小时,过滤,得药液一,药渣备用;
(2)向步骤(1)中的药渣加温水,煎煮2小时,过滤,得药液二和药渣;
(3)将药液一和药液二合并后过滤,继续加热煎煮,在煎煮过程中并加入阿胶、黄酒和蜂蜜,并不断搅拌,煎煮至阿胶完全烊化,过滤后继续加热直至搅拌成膏滋;其中,阿胶、黄酒和蜂蜜的添加量分别为140g重量份、90g和120g;
(4)将膏滋趁热倒入自动分装机内进行分装工作,按照每袋20g进行分装,得到成品,放置在干燥环境备取。
证候是中医的核心和灵魂,而动物实验又是连接医学基础与临床的桥梁与纽带,因此开展以病证结合原则为指导的动物实验是中医基础研究的必经之路。但是由于动物和人体之间的差异性(如语言表述症状、舌象、脉象、肤色和情志症状等),决定了中医证候在动物身上模拟与判断的难度较大。因此,以中医证候诊断标准为纲,与动物身上特有的具有诊断意义的信息特征进行整合对比、等效关联,并结合精确、量化的现代生理病理生化指标,是评价中药对动物疾病与证候疗效的有效途径。因此,本发明通过动物模型进行以下对比试验,用于证明本发明的药物在治疗痰湿质肺癌具有明显优势。
对比试验
本实验主要试剂及药品如下:
干扰素-γ(IFN-γ)酶联免疫分析试剂盒:南京建成生物工程研究所;白细胞介素-2(IL-2)酶联免疫分析试剂盒:南京建成生物工程研究所中;南海牌香烟:北京卷烟厂生产,焦油量8mg,烟气烟碱量:0.8mg,烟气一氧化碳含量:10mg;氢化可的松注射液,购自天津药业焦作有限公司;盐酸肾上腺素注射液,规格1ml:1mg,购自上海禾丰制药有限公司;小鼠促甲状腺素(TSH)酶联免疫分析试剂盒;促肾上腺皮质激素(ACTH)酶联分析试剂盒,由南京建成生物工程研究所提供;睾酮(T)放射免疫试剂盒,由天津九鼎医学生物工程有限公司提供;环磷酸腺苷(cAMP)酶联免疫分析试剂盒:南京建成生物工程研究所;促卵泡素(FSH)酶联免疫分析试剂盒:南京建成生物工程研究所;高脂饲料,购于山东省疾病控制和预防中心;白细胞介素放射免疫测试试剂盒(IL-6),购自南京建成生物工程研究所;血管内皮生长因子C(VEGF-C)酶联免疫分析试剂盒:南京建成生物工程研究所;DAB显色剂:购于北京中杉金桥生物科技有限公司;OVA(Grade)、AI(OH)3购自Sigma,USA;0.9%氯化钠注射液,购自中国大冢制药有限公司。
实验器材如下:
超净工作台:北京长城空气净化工程公司
动物染毒箱:上海玉研科学仪器有限公司
高压灭菌锅:日本Sanyo公司
酶标仪:美国Thermo公司
倒置显微镜:日本Olympus公司
解剖显微镜:日本Nikon公司
CO2细胞培养箱:德国Teraeus公司
游标卡尺:上海实验测量设备公司
超速冷冻离心机:德国Hermle公司
精密分析天平:瑞士Mett ler公司
-80℃冰箱:日本Sanyo公司
普通冰箱:青岛海尔股份有限公司
细胞计数板:上海精密仪器仪表有限公司
微量移液器:德国Eppendor公司
自动血流变测试仪,由山东省疾病控制中心提供。
一、建立平和体质和痰湿体质模型
1实验动物
动物品系C57BL/6近交系小黑鼠,等级SPF级别,雄性,6-8周龄,体重18±2g,80只,质量检测单位:中国医学科学院医学实验动物研究所,出售单位:北京华阜康生物科技股份有限公司,许可证号:SCXK(京)2009-0004。
2试验方法
2.1喂养方法
喂养于SPF级动物房(山东省疾病控制中心动物房),室温(22±2)℃,湿度(55±5)%,人工光照明暗各12h,通风良好;小鼠维持饲料,购自北京科奥协力饲料有限公司,许可证号:SCXK(京)2009-0012;自由饮水;根据垫料情况及时更换垫料。
2.2分组及造模方法
2.2.1分组方法:
将80只Lewis小鼠随机分为两个实验组,每个实验组40只,分别为平和质组和痰湿质组。
2.2.2造模方法:
以不同的饲养条件分别饲养两组小鼠两周,两个实验组的饲养条件具体如下:
(1)平和质组:喂以普通饲料,自由饮水,室温(22±2)℃,湿度(55±5)%,人工光照明暗各12h。通风良好条件下,连续喂养14天。
(2)痰湿质组:在上述平和质组饲养环境相同的情况下,仅将普通饲料更改为小鼠高脂饲料,连续喂养14天。
3实验评价指标及结果
3.1小鼠体重观察
各实验组动物在实验开始前和实验结束后各测一次体重。体重测量时间为9:00am-10:00am,计算出两个实验组小鼠实验前后的平均体重,结果如表1所示。
表1两实验组小鼠实验前后平均重量对照表
由上述数据可知,痰湿质组与平和质组小鼠体重进行比较,经两独立样本的T检验,P<0.05,经统计学处理,各组数据体重存在差异性。其中,痰湿质组小鼠平均体重明显小于平和质组小鼠平均体重。
3.2小鼠宏观表征观察
每日观察并记录两个实验组小鼠的生活习性、精神状态、进食量、毛发情况、大小便情况、皮肤及脉络颜色、淤血改变等情况。观察结果如下:
(1)平和质组:小鼠表现为活泼好动,反应灵敏,背部毛色有光泽,进食水量正常;
(2)痰湿质组:小鼠表现为倦怠懒动,行动缓慢,体重增加较快,形体较平和组肥胖,前期毛色油亮发光,后期皮毛泛潮,小鼠逐渐进食、饮水量减少,且有挠口行为。
3.3血液指标检测及方法
于实验第15天,自两组小鼠各随机抽取5只小鼠,采用眼眶取血方法取血,取血后加入无抗凝剂的试管中,室温血液自然凝固10-20分钟,离心25分钟(2500转/分)。仔细收集上层血清,保存过程中如出现沉淀,应再次离心。将血清利用酶联免疫检测仪(酶标仪)检测TG、CHOL、LDL的含量。结果如表2所示。其中TG、CHOL、LDL由山东中医药大学第二附属医院检验科提供
表2两组小鼠血清中TG、CHOL、LDL含量对照表
组别 |
CHOL(mmol/L) |
TG(mmol/L) |
LDL(mmol/L) |
平和质组 |
1.61±0.30 |
0.38±0.10 |
0.27±0.10 |
痰湿质组 |
14.02±2.89* |
1.53±0.15** |
12.51±2.73*** |
由上述数据可知,痰湿质组与平和质组小鼠血清中TG、CHOL、LDL相比显著差异,且有意义(P<0.05)。
综上,由表1和表2的数据以及宏观表征观察可知,两组小鼠在体重和表征上出现明显差异,血清中TG、CHOL、LDL含量也存在显著差异,且痰湿质组小鼠从表征及测定数据均与痰湿体质小鼠特征相吻合,说明本体质建模实验稳定有效,建模成功。
二、建立平和体质和痰湿体质的肺癌模型
1实验动物及细胞株
于上述体质建模后的两个实验组小鼠(每组40只)作为本次建模的实验动物,且分别作为平和质组和痰湿质组。
Lewis肺癌细胞株,由山东省医学科学院提供并予以接种,接种用小鼠自鼠种随机抽取5只进行荷瘤。接种成功后送往实验室进行常规饲养。
2实验方法及步骤
2.1首次肿瘤细胞接种
取荷Lewis肺癌细胞的C57BL/6小鼠的肿瘤作为瘤源,将小鼠脱颈椎处死,超净工作台无菌条件下剥离出生长良好淡粉色无坏死的肿瘤组织。用组织剪剪成小块,按瘤(g):生理盐水(ml)1:3的比例用玻璃匀浆器单向研磨成匀浆,过200目尼龙网,成单细胞悬液,收集于离心管内。用超速冷冻离心机,1000r/min离心3min,弃上清,加入生理盐水,同法离心洗涤一次。取肿瘤细胞悬液,加入0.4%台盼蓝染液,台盼蓝拒染实验示活细胞大于95%,调整细胞浓度为
1.0*107/ml。
在无菌条件下,用注射器在两个实验组小鼠的腋窝处接种肿瘤细胞悬液
0.2ml/只(约含瘤细胞2.0*106个),每次接种前混匀悬液,细胞注射完成后稍适按压针孔,防止液体溢出。
接种后第5天,观察两试验组小鼠荷瘤成功与否,荷瘤成功小鼠即为肺癌建模成功。
三、药物实验
分别选取上述两组中荷瘤成功的小鼠30只,作为药物实验的动物模型,并每组30只小鼠随机分成两个小组,分别为平和质对照组、平和质给药物、痰湿质对照组和痰湿质给药组,每个小组15只小鼠。具体给药方法如表3所示:
表3各实验小组小鼠的给药方法
注:上述给药剂量相当于70kg成人按体表面积折算剂量的等效剂量,同时相当于单位体重人用量的10倍。
药效检测指标及结果:
(一)体重:按照上述给药方式连续用药四周后,用电子天平称各组小鼠体重并记录结果如表4所示;
表4给药后各实验小组小鼠平均体重对照表
由上述数据可以看出,单因素方差分析,大组间差异示:P<0.05,具有显著的差异性;进一步进行两两比较,每种体质分组的给药组与非给药组比较:P<0.05,具有显著差异性;不同体质给药组之间进行单因素方差分析:P>0.05,不具有差异性。
(二)肿瘤体积:于接种后第7天、10天、13天、16天、19天、22天、25天、28天,用精度为0.1mm的游标卡尺测量并记录小鼠皮下瘤结节大小,计算肿瘤体积,计算公式:V(cm3)=0.52×ab2(a为瘤体最长径,b为最短径)。计算每小组小鼠肿瘤体积的平均值,结果如表5所示。
表5给药期间各小组小鼠肿瘤平均体积改变情况(cm3)
通过上述数据可以看出,平和质对照组、平和质给药组和痰湿质对照组的小鼠肿瘤体积增长速度基本相同,在药物作用下,自中期开始给药组体积增长速度逐渐放慢,而对照组组的肿瘤增长速度有较前增快的趋势。每种体制给药组和对照组进行统计学处理,P<0.05。
(三)瘤重及抑瘤率:于接种后28天后引颈脱臼处死各小组小鼠,迅速剥离小鼠皮下肿瘤,称瘤重,计算各组肿瘤抑制率,结果如表6所示。
其中,肿瘤抑制率的计算公式为:
肿瘤抑制率=(平和质对照组平均瘤重-待测组平均瘤重)/平和质对照组平均瘤重×100%。
表6各实验小组小鼠瘤体最终重量对照表(g)
组别 |
数量(只) |
瘤重(g) |
抑瘤率(%) |
平和质对照组 |
15 |
7.86±1.27 |
0 |
平和质给药组 |
15 |
5.91±1.43 |
24.81 |
痰湿质对照组 |
15 |
9.02±1.11 |
-14.76 |
痰湿质给药组 |
15 |
5.61±1.13 |
28.63 |
通过上述数据可以看出,每种体质两个小组经行比较:平和质给药组与平和质对照组比较:P<0.05,具有极显著差异性;痰湿质给药组与痰湿质对照组比较:P<0.05,具有显著差异性。各种不同体质给药组比较P>0.05,无明显差异。说明本发明的药物对小鼠肿瘤的生长有明显的抑制作用,且对两种体质模型小鼠肿瘤抑制效果均表现良好,两种体质小鼠抑瘤率无明显差异。
(四)肺转移抑制率:小鼠处死后,剥离出两侧肺脏。用4%多聚甲醛溶液固定24h。于解剖显微镜下计数肺转移瘤灶,转移灶为白色或者乳白色结节样的隆起。本试验采用计数在双盲条件下完成,结果如表7所示。
其中,肺转移抑制率的计算公式为:
肺转移抑制率(%)=(平和质对照组平均肺表面转移结节数-待测组各自平均肺表面转移结节数)/平和质对照组平均肺转移结节数×100%。
表7各实验小组小鼠肺转移灶个数及肺转移抑制率
组别 |
数量(只) |
肺转移灶个数(个) |
肺转移抑制率(%) |
平和质对照组 |
15 |
11.30±2.95 |
0 |
平和质给药组 |
15 |
8.35±1.78 |
26.10 |
痰湿质对照组 |
15 |
12.20±1.50 |
-7.96 |
痰湿质给药组 |
15 |
8.45±2.20 |
25.22 |
通过上述数据可以看出,每种体质两个小组进行比较:平和质给药组与平和质对照组比较:P<0.05,具有极显著差异性;痰湿质给药组与痰湿质对照组比较:P<0.05,具有显著差异;各种不同体质给药组比较P>0.05,无明显差异。说明本发明的药物可以降低小鼠肿瘤肺转移率,而且针对上述两种体质无明显差异。
(五)肿瘤组织的VEGF免疫组化检测
各实验小组随机抽取10只小鼠的肿瘤组织制成标本,并将其分别放入10%中性福尔马林溶液中固定24h,行4μM连续切片2张,行VEGF染色,微波抗原修复,常规脱水、透明、浸蜡、包埋。按照SABC法染色试剂盒的说明进行免疫组化的操作。
采用免疫组织化学法SP法计数检测VEGF-C表达,所有标本经固定、包埋、切片后常规行HE染色。一抗为兔抗鼠单克隆抗体,1:100稀释,生物素化二抗为山羊抗小鼠IgG。各实验小组VEGF免疫组化结果如表8所示。
表8各实验小组肿瘤组织中阳性细胞VEGF-C平均光密度对照表
组别 |
数量(只) |
平均光密度 |
平和质对照组 |
10 |
0.158±0.033 |
平和质给药组 |
10 |
0.131±0.040 |
痰湿质对照组 |
10 |
0.184±0.032 |
痰湿质给药组 |
10 |
0.143±0.015 |
通过上述数据可以看出,每种体质两个小组进行比较:平和质给药组与平和质对照组比较:P<0.05,具有极显著差异性;痰湿质给药组与痰湿质对照组比较:P<0.05,具有显著差异性。两种不同体质给药组间比较:P>0.05,无明显差异。说明本发明药物能够降低VEGF表达减少肿瘤血管生成,进而抑制肿瘤生长。
(六)血清检测指标(TC、TG、LDL-C含量)
在实验结束后处死之前,在洁净的环境下分别对痰湿质对照组和痰湿质给药组的小鼠眼底取血,并将血样放在抗凝血试管中。用酶联免疫法测定外周血血清中TC、TG、LDL-C含量,结果如表9所示。
表9两实验小组小鼠血清中TC、TG、LDL-C含量(pg/ml)
由上述数据可知,痰湿质给药组的小鼠血清中TC、TG、LDL-C含量明显低于痰湿质对照组,且结合体质造模的数据可知,痰湿质给药组小鼠血清中的TC、TG、LDL-C含量非常接近体质造模中平和质组小鼠的数值,说明本发明的药物具有降低总胆固醇、三酰甘油和低密度脂蛋白胆固醇的效果,进而抑制肿瘤的生长,起到抗癌的作用。
(七)EGFR基因的18,19,20,21号外显子测序
1.1材料和试剂
1)组织样本:每小组随机抽取10只lewis荷瘤小鼠,取出瘤体称重后,每个瘤体取2块米粒大小的肿瘤组织,同一瘤体选取其中一个肿瘤组织作为待测样品,将待测样品分别放入标好号的进口无RNA酶的EP管中,立刻放入液氮中;
2)Taq DNA聚合酶:宝生物公司产品
3)DNA分子量Marker:宝生物公司产品
4)测序试剂:ABI BigDye3.1
1.2仪器设备
1)PCR仪:ABI 9700
2)凝胶成像分析仪:BIO-RAD
3)电泳仪(DYY-6C型):北京六一仪器厂
4)测序仪:ABI 3730XL
1.3实验方法
(1)引物序列
fw-18:TCAGGTCTGCTCCCTTCTTC
rs-18:CAGCTACATTCCCAGTCTACGT
fw-19:TTGGATTTGTAATGTAGAGCCC
rs-19:AACTAAGGAAGCAAGATTGACC
fw-20:AGTCTTGCATAACCTGACACTTG
rs-20:TCATCCTTGCTGCTTTTCTT
fw-21:AGGATGCCCAGATGGTTCA
rs-21:GCTGGTCTTTTGAGGGGTG
(2)PCR扩增
1)PCR反应体系(50ul)
10×PCR Buffer 5μl
dNTP(10uM)1ul
primer-fw(10μM)2μl
primer-rs(10μM))2μl
Template 2μl
DMSO 1.5μl
ddH2O 37.5μl
Total 50μl
2)PCR反应条件
95℃5min 1cycle
95℃30s
50℃30s 35cycles*
72℃30s
72℃10min 1cycle
1.4测序结果及分析
测序结果如图1和图2所示,40个样品的18,19,20,21号外显子均测序合格;其中20号外显子含poly A和poly G结果,已经进行加测反应;40个样品均显示无明显突变。
通过对四组肿瘤组织的EGFR基因的18,19,20,21号外显子测序,最终比对结果(参见图1和图2)显示无明显突变,表明无论是平和质对照组、痰湿质对照组,还是痰湿质给药组、痰湿质给药组,均无EGFR基因突变,表明肺抑瘤膏对EGFR非突变的非小细胞性肺癌亦有较显著疗效。
综上,通过上述动物模型试验,能够看出本发明的药物能够降低VEGF表达,减少肿瘤血管生成以及降低总胆固醇、三酰甘油和低密度脂蛋白胆固醇的效果,具有降低痰湿质小鼠的体重和明显的抑瘤抗癌的效果,即本发明的药物对痰湿质肺癌人群能够具有非常好抑瘤抗癌的功效。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。