CN106214708A - 一种银杏的提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种银杏的提取方法，所述方法包括以下步骤：1)粉碎银杏叶，加入有机溶剂提取；2)将提取液浓缩成膏，加水洗涤并在低温下沉淀；3)取上清液过滤后通过柱层析进行分离和有效成分的富集；4)将层析洗脱液浓缩成膏后冷却并加入纯化水，调节pH至pH＝4‑6；5)静置后过滤，滤液浓缩成稠膏；6)干燥得到浸膏。

Description

一种银杏的提取方法
技术领域
本发明涉及中药领域，具体而言，涉及一种银杏的提取方法。
背景技术
银杏(Ginkgo biloba L.)，为银杏科、银杏属落叶乔木。银杏出现在几亿年前，是第四纪冰川运动后遗留下来的裸子植物中最古老的孑遗植物，现存活在世的银杏稀少而分散，上百岁的老树已不多见，和它同纲的所有其他植物皆已灭绝，所以银杏又有活化石的美称。变种及品种有：黄叶银杏、塔状银杏、裂银杏、垂枝银杏、斑叶银杏等26种。
银杏叶有广泛生物活性，含有多种化学成分，主要包括黄酮类、萜类、多糖类、酚类、有机酸、生物碱、氨基酸、甾体化合物、微量元素等。其中，维生素C、维生素E、胡萝卜素以及钙、磷、硼、硒等矿物元素含量也十分丰富，但最主要药用价值成分是黄酮类和萜类。
银杏叶的提取物常通过浓缩等沉淀制成浸膏并进行后续操作，而如何有效地提取银杏叶中的有效活性成分黄酮醇苷和银杏内酯，并且使得浸膏本身具有较好的物理性状便于后续加工工艺的进行，是本领域技术人员一直致力解决的问题。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种银杏的提取方法，所述方法通过使用冷水沉淀提取物浓缩成的膏，可以得到更加纯净的提取物，并且使得最终成品具有更好的可加工性，便于后续工艺中制备成各种所需剂型。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明涉及一种银杏的提取方法，所述方法包括以下步骤：
1)粉碎银杏叶，加入有机溶剂提取；
2)将提取液浓缩成膏，加水洗涤并在低温下沉淀；
3)取上清液过滤后通过柱层析进行分离和有效成分的富集；
4)将层析洗脱液浓缩成膏后冷却并加入纯化水，调节pH至pH＝4-6；
5)静置后过滤，滤液浓缩成稠膏；
6)干燥得到浸膏。
本申请的方法，通过对层析洗脱液进行二次水沉，并在水沉过程中调节酸碱度来得到更高的有效成分转化率。此外，经过二次水沉纯化后，终产物具有良好的物理性质，更利于后续的进一步处理。
优选地，所述步骤1)中将银杏叶粉碎至过20目筛。
优选地，所述有机溶剂为醇类溶剂的水溶液，优选地所述醇类溶剂包括甲醇、乙醇、异丙醇、异丁醇、叔丁醇中的一种或多种，更优选地，所述醇类溶剂是乙醇和异丙醇。
优选地，所述步骤3)中的柱层析是大孔树脂柱层析，优选地，所述柱层析的洗脱溶剂为水和醇类溶剂。
优选地，所述纯化水是去离子水，所述去离子水的温度为30-40℃。
优选地，所述步骤4)中加入浓度为5-10％的碱溶液调节pH。
优选地，所述碱溶液是弱碱溶液，优选地，所述弱碱溶液时碳酸氢钠溶液或碳酸氢钾溶液。
优选地，所述步骤2)中，将提取液浓缩成密度为1.1-1.2g/cm3的膏。
优选地，所述步骤5)中，在12-15℃的条件下进行静置。
优选地，所述步骤5)中，将滤液浓缩成密度为1.2-1.4g/cm3的膏。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明的方法可以更加充分地提取银杏中的有效成分；
(2)本发明的方法可以使得提取得到的银杏浸膏具有更好的可加工型，易于制备成其他有效剂型。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
按照以下步骤进行银杏叶的提取
1.洗净银杏叶，将银杏叶粉碎至过20目筛；
2.加入50％甲醇浸泡银杏叶进行提取，提取3次，每次使用银杏叶重量10倍量的溶剂进行提取，每次提取时间为45分钟，合并提取液后，将提取液减压浓缩为密度1.1g/cm3的膏；
3.加水洗涤所述膏，并在低温下进行沉淀，取上清液；
4.使用大孔树脂柱层析进行分离和有效成分的富集，先后用水和乙醇洗涤大孔树脂柱；
5.加入30℃的去离子水进行纯化，加入5％的碳酸氢钠溶液调节pH至pH＝4后，在12℃的恒温下静置1h；
6.过滤，对滤液进行减压浓缩，得到密度为1.2g/cm3的膏；
7.干燥得到提取物浸膏。
实施例2
按照以下步骤进行银杏叶的提取
1.洗净银杏叶，将银杏叶粉碎至过20目筛；
2.加入50％乙醇浸泡银杏叶，使用大孔树脂除酸后，进行提取，提取3次，每次使用银杏叶重量10倍量的溶剂进行提取，每次提取时间为45分钟，合并提取液，后将所述提取液减压浓缩至密度1.2g/cm3的膏；
3.加水洗涤所述膏，并在低温下进行沉淀，取上清液；
4.使用大孔树脂柱层析进行分离和有效成分的富集，先后用水和乙醇洗涤大孔树脂柱；
5.加入40℃的去离子水进行纯化，加入5％的碳酸氢钠溶液调节pH至pH＝6后，在15℃的恒温下静置1h；
6.过滤，对滤液进行减压浓缩，得到密度为1.4g/cm3的膏；
7.干燥得到提取物浸膏。
实施例3
按照以下步骤进行银杏叶的提取
1.洗净银杏叶，将银杏叶粉碎至过20目筛；
2.加入乙醇异丙醇体积比1:1的70％水溶液浸泡银杏叶，使用大孔树脂除酸后进行提取，提取4次，每次使用银杏叶重量10倍量的溶剂进行提取，每次提取时间为45分钟，合并提取液后，进行减压浓缩为密度1.1g/cm3的膏；
3.加水洗涤所述膏，并在低温下进行沉淀，取上清液；
4.使用大孔树脂柱层析进行分离和有效成分的富集，先后用水和乙醇洗涤大孔树脂柱；
5.加入35℃的去离子水进行纯化，加入10％的碳酸氢钠溶液调节pH至pH＝4后，在12℃的恒温下静置1h；
6.过滤，对滤液进行减压浓缩，得到密度为1.2g/cm3的膏；
7.干燥得到提取物浸膏。
实施例4
按照以下步骤进行银杏叶的提取
1.洗净银杏叶，将银杏叶粉碎至过20目筛；
2.加入乙醇异丁醇体积比1:1的70％水溶液浸泡银杏叶，使用大孔树脂除酸后进行提取，提取3次，每次使用银杏叶重量10倍量的溶剂进行提取，每次提取时间为50分钟，合并提取液后，进行减压浓缩为密度1.15g/cm3的膏；
3.加水洗涤所述膏，并在低温下进行沉淀，取上清液；
4.使用大孔树脂柱层析进行分离和有效成分的富集，先后用水和乙醇洗涤大孔树脂柱；
5.加入30℃的去离子水进行纯化，加入10％的碳酸氢钾溶液调节pH至pH＝5后，在12℃的恒温下静置1h；
6.过滤，对滤液进行减压浓缩，得到密度为1.3g/cm3的膏；
7.干燥得到提取物浸膏。
实施例5
按照以下步骤进行银杏叶的提取
1.洗净银杏叶，将银杏叶粉碎至过20目筛；
2.加入80％乙醇浸泡银杏叶，使用大孔树脂除酸后进行提取，提取3次，每次使用银杏叶重量10倍量的溶剂进行提取，每次提取时间为60分钟，合并提取液后，进行减压浓缩为密度1.2g/cm3的膏；
3.加水洗涤所述膏，并在低温下进行沉淀，取上清液；
4.使用大孔树脂柱层析进行分离和有效成分的富集，先后用水和乙醇洗涤大孔树脂柱；
5.加入30℃的去离子水进行纯化，加入5％的碳酸氢钠溶液调节pH至pH＝4后，在12℃的恒温下静置1h；
6.过滤，对滤液进行减压浓缩，得到密度为1.4g/cm3的膏；
7.干燥得到提取物浸膏。
对比例1
按照以下步骤进行银杏叶的提取
1.洗净银杏叶，将银杏叶粉碎至过20目筛；
2.加入乙醇异丁醇体积比1:1的70％水溶液浸泡银杏叶，使用大孔树脂除酸后进行提取，提取3次，每次使用银杏叶重量10倍量的溶剂进行提取，每次提取时间为50分钟，合并提取液后，进行减压浓缩为密度1.15g/cm3的膏；
3.加水洗涤所述膏，并在低温下进行沉淀，取上清液；
4.使用大孔树脂柱层析进行分离和有效成分的富集，先后用水和乙醇洗涤大孔树脂柱；
5.加入30℃的去离子水进行纯化，并在12℃的恒温下静置1h；
6.过滤，对滤液进行减压浓缩，得到密度为1.3g/cm3的膏；
7.干燥得到提取物浸膏。
对比例2
按照以下步骤进行银杏叶的提取
1.洗净银杏叶，将银杏叶粉碎至过20目筛；
2.加入乙醇异丁醇体积比1:1的70％水溶液浸泡银杏叶，使用大孔树脂除酸后进行提取，提取3次，每次使用银杏叶重量10倍量的溶剂进行提取，每次提取时间为50分钟，合并提取液后，进行减压浓缩为密度1.15g/cm3的膏；
3.加水洗涤所述膏，并在低温下进行沉淀，取上清液；
4.使用大孔树脂柱层析进行分离和有效成分的富集，先后用水和乙醇洗涤大孔树脂柱；
5.过滤洗脱液，对滤液进行减压浓缩，得到密度为1.3g/cm3的膏；
6.干燥得到提取物浸膏。
实验例
一、组分测定的方法
1.原花青素含量测定
1.1供试品溶液：精密称取试样粉末100mg，置50ml容量瓶中，精密加甲醇30mL，超声处理20min，放冷至室温后，加甲醇至刻度，摇匀，取上清液，即得。
1.2原花青素对照品标准曲线制备：取原花青素对照品30mg，精密称定，置50ml容量瓶中，精密加甲醇30mL，超声处理20min，放冷至室温后，加甲醇至刻度，摇匀，吸取原花青素对照品溶液0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL，分别置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。分别取1ml入10ml西林瓶中，再依次加入0.2ml硫酸铁铵溶液，6ml盐酸-正丁醇(5：95，V/V)，摇匀，密封，置沸水浴水解40min，水解结束立即置冰水中冷却，于546nm波长处测吸光度值。以吸光度为纵坐标，对照品浓度为横坐标(mg/mL)，绘制标准曲线。
1.3样品测定：精密吸取供试品溶液1mL，照“1.2”自“入10ml西林瓶中”起，在546nm波长处测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中含原花青素的浓度，计算样品中原花青素的含量。
2.总黄酮含量测定
2.1供试品溶液：精密称取试样粉末100mg，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷至室温，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，离心，取上清液作为供试品溶液。
2.2芦丁对照品标准曲线制备：精密吸取芦丁对照品溶液0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0mL，分别置25mL量瓶中，加水至6mL，加入5％亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，放置6min，加10％硝酸铝溶液1mL，摇匀放置6min，加氢氧化钠试液10mL，摇匀，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟，以0.0mL对照品溶液制得的溶剂为空白，在波长510nm处分别测定吸收度值。以吸光度为纵坐标，对照品浓度为横坐标(mg/mL)，绘制标准曲线。
2.3样品测定：精密吸取供试品溶液2mL，至25mL量瓶中，照“2.2”自“加水至6mL”起，在510nm波长处测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中含总黄酮的浓度，计算样品中总黄酮的含量。
3.总黄酮醇苷含量测定
3.1供试品溶液的制备：精密称取试样粉末35mg，置250ml茄型瓶，加甲醇-25％盐酸(4：1)混合液25ml，90℃加热回流30分钟，回流结束时取出放冷，提取液转移至50ml容量瓶中，甲醇定容，摇匀，即得。
3.2对照品溶液制备：分别精密称取经五氧化二磷干燥过夜的槲皮素对照品、山奈素对照品、异鼠李素对照品(中国药品生物制品检定所)，加甲醇制成每1ml分别含30ug、30ug、20ug的混合液，即得。
3.3HPLC测定(理论板数按槲皮素峰计算不低于2500)：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.4％磷酸溶液(50：50)为流动相；检测波长：360nm；进样量：10ul；
3.4含量计算：总黄酮苷含量＝(槲皮素含量+山奈素含量+异鼠李素含量)×2.51
4.总萜内酯的含量测定
4.1供试品溶液制备：精密称取试样粉末150mg，置10ml容量瓶中，加甲醇适量，超声处理30min，取出放冷后甲醇定容；精密量取5ml，过酸性氧化铝柱(200-300目，3g，内径1cm，甲醇湿法装柱)，用甲醇25ml洗脱；收集洗脱液，回收至干，残渣用5ml甲醇转移至10ml容量瓶中，加水约4.5ml，超声30min；超声结束后取出放冷，加甲醇定容，摇匀即得。
4.2对照品溶液制备：取内酯对照品适量，精密称定，加50％甲醇分别制成每1ml含银杏内酯A 0.14mg、银杏内酯B 0.08mg、银杏内酯C 0.06mg、白果内酯0.20mg的混合溶液，即得。
4.3HPLC测定：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-四氢呋喃-水(25：10：65)为流动相；检测器：蒸发光散射检测；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；进样量：对照品溶液10ul、20ul，供试品溶液10-20ul。理论板数按白果内酯峰计算应不低于3000。
4.4含量计算：用外标两点对数方程分别计算银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C和白果内酯的含量，即得。
二、实施例及实验例中相关化合物的转移率测定
由上表可见，使用本发明中的提取方法提取银杏叶粉碎物，可以达到很高的转移率，相对于对比例中的方法，本发明在原花青素、总黄酮、总黄酮醇苷和总萜内酯四个方面的转移率均有着显著的提高。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (10)

1.一种银杏的提取方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)粉碎银杏叶，加入有机溶剂提取；
2)将提取液浓缩成膏，加水洗涤并在低温下沉淀；
3)取上清液过滤后通过柱层析进行分离和有效成分的富集；
4)将层析洗脱液浓缩成膏后冷却并加入纯化水，调节pH至pH＝4-6；
5)静置后过滤，滤液浓缩成稠膏；
6)干燥得到浸膏。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中将银杏叶粉碎至过20目筛。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂为醇类溶剂的水溶液，优选地所述醇类溶剂包括甲醇、乙醇、异丙醇、异丁醇、叔丁醇中的一种或多种，更优选地，所述醇类溶剂是乙醇和异丙醇。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中的柱层析是大孔树脂柱层析，优选地，所述柱层析的洗脱溶剂为水和醇类溶剂。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纯化水是去离子水，所述去离子水的温度为30-40℃。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4)中加入浓度为5-10％的碱溶液调节pH。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述碱溶液是弱碱溶液，优选地，所述弱碱溶液时碳酸氢钠溶液或碳酸氢钾溶液。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中，将提取液浓缩成密度为1.1-1.2g/cm3的膏。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤5)中，在12-15℃的条件下进行静置。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤5)中，将滤液浓缩成密度为1.2-1.4g/cm3的膏。
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