CN106167503B - 一种阿德福韦酯羟甲基杂质的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种阿德福韦酯羟甲基杂质的制备方法，包括以下依次进行的步骤：S1：阿德福韦酯羟甲基杂质粗制化合物的制备；所述阿德福韦酯羟甲基杂质粗制化合物由以下原料按以下重量配比制备而成：甲基吡咯烷酮2.5‑4.0重量份、阿德福韦A‑4 1.0重量份、三乙胺1.0‑1.5重量份以及特戊酸氯甲酯2.0‑3.6重量份；S2：阿德福韦酯粗制化合物溶液过滤提纯；S3：将步骤S2得到的阿德福韦酯粗制化合物干品二次结晶提纯。
Description
技术领域
本发明涉及一种阿德福韦酯羟甲基杂质的制备方法，属于药物化学合成技术领域。
背景技术
阿德福韦酯是5’-单磷酸脱氧阿糖腺苷的无环类似物，是核苷类病毒逆转酶抑制剂，是阿德福韦的前体，在体内水解为阿德福韦发挥抗病毒作用。阿德福韦酯由美国GileadSciences公司研发，并于2002年9月20日被FDA批准，规格为10mg/片，临床用于治疗成人慢性乙肝，商品名为Hepsera。2003年3月11日，欧盟批准该药上市，目前阿德福韦酯已在多个国家上市。2005年4月在中国首次上市，主要用于治疗乙型肝炎病毒活动复制和血清氨基酸转移酶持续升高的肝功能代偿的成年慢性乙型肝炎患者。
其中，阿德福韦酯的结构式如下：
阿德福韦酯是目前公认的乙肝抗病毒一线用药之一，具有较广的抗病毒作用，并具有长效、强效的抗病毒复制和独特的抗耐药性。在抗HBV方面，其特点是对临床上所有HBV均有效，包括拉米夫定耐药病毒，所以对阿德福韦酯的研究具有很大的临床价值。
其中，阿德福韦酯的主要杂质有以下几种：
1、杂质A(单酯):
2、杂质B：
3、杂质C(二聚体)：
4、杂质D(羟甲基杂质)：
目前，国内已多个厂家的阿德福韦酯上市销售，是一个较成熟的品种，各家公司对阿德福韦酯项目的专利布局也基本到位，然而在杂质方面的专利主要集中在阿德福韦酯单酯(杂质A)，其余的杂质相关专利几乎未见相关申报。
为了更好地研究阿德福韦酯的质量，就需要对各个杂质进行药学研究，所以就更有必要获得高纯度的杂质标准品，以便于定性、定量地研究杂质，并将其控制在一个安全、合理的限度范围之内，将直接关系到阿德福韦酯的质量及安全性。
基于上述情况，才有本发明关于阿德福韦酯杂质D(羟甲基杂质)的相关研究。
根据相关查阅文献和对生产工艺的了解，合成生产过程会有相应杂质生成，特别是杂质A(单酯)、杂质D(羟甲基杂质)、杂质C(二聚体)伴随着反应过程。因羟甲基杂质和阿德福韦酯只多了-CH2OH，极性接近，常规情况下，容易和阿德福韦酯主峰重叠在一起，不容易分辨，进而影响对产品纯度的判断。因此，制备高纯度的羟甲基杂质作为对照品来监控阿德福韦酯中羟甲基杂质的含量，和有效地分析方法对保证药品的质量，对安全用药具有重要意义。
根据文献和结构式分析，阿德福韦酯羟甲基杂质可以由阿德福韦酯和甲醛反应即可获得，然而这样浪费原料药的同时，又得另外引入甲醛进行反应才能获得。
基于上述不利因素，本发明利用羟甲基杂质伴随反应过程的情况，在不影响获得得到目标产品阿德福韦酯的前提下，从反应废液中提取出高纯度的羟甲基杂质，并开发出一个有效分离出杂质A(单酯)、杂质D(羟甲基杂质)、阿德福韦酯的分析条件。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种阿德福韦酯杂质羟甲基杂质的制备方法，该方法既可用于羟甲基杂质的质量控制，又可确保阿德福韦单酯、羟甲基杂质、阿德福韦酯的有效分离，从而控制阿德福韦酯的质量。
本发明的技术方案如下：
一种阿德福韦酯羟甲基杂质的制备方法，包括以下依次进行的步骤：
S1：阿德福韦酯羟甲基杂质粗制化合物的制备；所述阿德福韦酯羟甲基杂质粗制化合物由以下原料按以下重量配比，并经过S1-1和S1-2步骤制备而成：
S1-1：将上述重量配比的甲基吡咯烷酮、阿德福韦A-4、三乙胺、特戊酸氯甲酯依次投入至反应容器中，搅拌并加热至反应温度；
S1-2：在反应温度下保温反应后，冷却至30±5℃，得到阿德福韦酯粗制化合物溶液；
S2：阿德福韦酯粗制化合物溶液过滤提纯，其包括以下依次进行的子步骤：
S2-1：在反应容器中加入630重量份乙酸乙酯，搅拌1h，过滤；
S2-2：滤液转移至分液漏斗，加入400重量份饮用水洗，保留有机层,分出水层，将有机层转移至另一分液漏斗，水层用乙酸乙酯提取两次，每次乙酸乙酯用量360重量份，将提取物与另一分液漏斗内的有机层合并；
S2-3：将子步骤S2-2得到的合并后的有机层在分液漏斗中用400份饮用水洗两次，每次饮用水用量400重量份，弃水层；
S2-4：将子步骤S2-3得到的有机层用2mol/L盐酸提取两次，每次2mol/L盐酸用量400重量份，保留下层盐酸层,上层乙酸乙酯层浓缩至干；得到阿德福韦酯粗制化合物干品；
S3：将步骤S2得到的阿德福韦酯粗制化合物干品二次结晶提纯，其包括以下依次进行的子步骤：
S3-1：加入1.5-3倍阿德福韦酯粗制化合物干品重量份的良性溶剂加热至35±5℃使阿德福韦酯粗制化合物干品溶解，缓慢滴加非良性溶剂至刚好浑浊；
S3-2：冷却至10±5℃结晶2h，过滤烘干得到阿德福韦酯羟甲基杂质二次结晶体。
步骤S1-1中，所述反应温度为60±3℃。
步骤S1-2中，所述保温反应的反应时间为3h。
步骤S3-1中，所述良性溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯、乙醇、甲醇、四氢呋喃中的一种或者几种的任意混合物。
其中，所述的良性溶剂优选为丙酮。
步骤S3-1中，所述非良性溶剂为乙醚、丙醚、石油醚、异丙醚的一种或者几种的任意混合物。
其中，所述的非良性溶剂优选为异丙醚。
所述的一种阿德福韦酯羟甲基杂质的制备方法，还包括检测步骤，其包括以下子步骤：
S4-1：将步骤S3-2制备得到的阿德福韦酯羟甲基杂质二次结晶体采用Alltech混合式阴离子交换反相C8柱；以260nm的检测波长、1.0-1.5ml/min流速，5-10ul进样体积和20-30℃的检测柱温采用梯度洗脱的方式，以100％流动相A保持1分钟，所述流动相A采用0.2mol/L、pH6.0的磷酸盐缓冲液-乙腈＝70:30；
S4-2:在19分钟内线性变化到100％流动相B，所述流动相B为0.2mol/L、pH6.0磷酸盐缓冲液-乙腈＝50:50，保持100％流动相B直到分析结束。
本发明的制备和检测方法具有如下有益效果：
1、利用合成阿德福韦酯原料药反应的废液进行提取，无需利用其他原料去进行合成，节约成本；
2、提取过程中，可以回收乙酸乙酯，回收率约在70％以上，循环利用，节能减排，减少环保成本；
3、无需过柱提纯即可获得高纯度杂质，且提纯方法简单，可作为质量控制的对照品。
4、本发明的检测方法保证阿德福韦酯与其他杂质能分开，分离度大于2.0，且各峰峰型较好；
5、本发明的检测方法能够使磷酸盐缓冲液由pH4.0降低到pH6.0，降低对色谱柱的损害，延长色谱柱的使用寿命，对企业的成本控制更有利。
附图说明
图1为阿德福韦酯单酯样品的色谱图；
图2为羟甲基样品的色谱图；
图3为阿德福韦酯样品的色谱图；
图4为阿德福韦酯单酯样品、羟甲基样品以及阿德福韦酯样品的色谱的混合对照图。
具体实施方式
(一)具体实施方式如下：
一种阿德福韦酯羟甲基杂质，由以下原料按以下重量配比经过以下依次进行的步骤制备而成；
其化学反应式如下：
在反应瓶中依次投入N-甲基吡咯烷酮、阿德福韦，三乙胺，特戊酸氯甲酯，搅拌，加热，控制温度60±3℃，反应3h，反应完毕，冷却至室温。加入乙酸乙酯，搅拌，过滤。滤液用水洗，保留有机层,分出水层，水层再用乙酸乙酯提取两次，合并有机层。有机层用水洗两次，弃水层。乙酸乙酯层用2mol/L盐酸提取两次，下层盐酸层(往下制备阿德福韦酯),上层乙酸乙酯层(原先为废液层)浓缩至干(回收的乙酸乙酯可循环利用)，得到阿德福韦酯粗制化合物干品，用1.5-3倍重量份阿德福韦酯粗制化合物干品的丙酮加热至35±5℃溶解，缓慢滴加异丙醚至刚好浑浊，后冷却至10±5℃结晶2h，过滤，烘干得到目标固体即为阿德福韦酯羟甲基杂质二次结晶体，纯度高达99.0％以上。将制备得到的阿德福韦酯羟甲基杂质二次结晶体采用Alltech混合式阴离子交换反相C8柱；以260nm的检测波长、1.0-1.5ml/min流速，5-10ul进样体积和20-30℃的检测柱温采用梯度洗脱的方式，以100％流动相A保持1分钟，所述流动相A采用0.2mol/L、pH6.0的磷酸盐缓冲液-乙腈＝70:30；在19分钟内线性变化到100％流动相B，所述流动相B为0.2mol/L、pH6.0磷酸盐缓冲液-乙腈＝50:50，保持100％流动相B直到分析结束。
(二)实施例如下：
以下通过实施实例详细描述本发明，但是以下实施实例仅仅是示例性的，本发明的范围并不局限于下述实例。
实施例1
在250ml反应瓶中依次投入5.2gN-甲基吡咯烷酮、1.6g阿德福韦A-4，2.05g三乙胺，4.4g特戊酸氯甲酯，搅拌，加热，控制温度60±3℃，反应3h，冷却至30±5℃。加入70ml乙酸乙酯，搅拌1h，过滤。滤液转移至分液漏斗，加入20ml饮用水洗，保留有机层,分出水层，转移至分液漏斗，水层用乙酸乙酯提取两次(每次乙酸乙酯用量20ml)，合并有机层。有机层在分液漏斗中用饮用水洗两次(每次饮用水用量40ml)，弃水层。乙酸乙酯有机层用2mol/L盐酸提取两次(每次2mol/L盐酸用量20ml)，保留下层盐酸层(往下制备阿德福韦酯),上层乙酸乙酯层浓缩至干，用6g丙酮加热至35±5℃溶解，缓慢滴加异丙醚至刚好浑浊，后冷却至10±5℃结晶2h，过滤烘干得到0.23g目标固体(羟甲基杂质)，纯度99.4％。
并经质谱确证为目标物羟甲基杂质：ESI-MS(m/z)：554[M+Na]
仪器：安捷伦1260
色谱柱：Alltech混合式阴离子交换反相C8柱(7um，100A，250mm*4.6mm)
流动相：流动相A(0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0)-乙腈＝70:30)
流动相B(0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0)-乙腈＝50:50)
柱温：30℃流速：1.2ml/min检测波长：260nm
定位溶液配制：分别取阿德福韦酯单酯、羟甲基杂质、阿德福韦酯适量用稀释液(0.2mol/L磷酸盐缓冲液：乙腈＝1：4)配制成15ug/ml、15ug/ml、1mg/ml的溶液
样品溶液配制：分别取阿德福韦酯单酯、N6-羟甲基、阿德福韦酯适量用稀释液(0.2mol/L磷酸盐缓冲液：乙腈＝1：4)配制成15ug/ml、15ug/ml、1mg/ml的混合溶液；
测定法：取定位溶液和样品溶液各10ul注入液相色谱仪，记录色谱图。出峰顺序依次为：阿德福韦酯单酯、羟甲基杂质、阿德福韦酯。
具体图谱出峰情况详见附图1-4。
实施例2
在1L反应瓶中依次投入104gN-甲基吡咯烷酮、32g阿德福韦A-4，41g三乙胺，88g特戊酸氯甲酯，搅拌，加热，控制温度60±3℃，反应3h，冷却至30±5℃。加入700ml乙酸乙酯，搅拌1h，过滤。滤液转移至分液漏斗，加入400ml饮用水洗，保留有机层,分出水层，转移至分液漏斗，水层用乙酸乙酯提取两次(每次乙酸乙酯用量400ml)，合并有机层。有机层在分液漏斗中用饮用水洗两次(每次饮用水用量400ml)，弃水层。乙酸乙酯有机层用2mol/L盐酸提取两次(每次2mol/L盐酸用量400ml)，保留下层盐酸层(往下制备阿德福韦酯),上层乙酸乙酯层浓缩至干，用65g丙酮加热至35±5℃溶解，缓慢滴加异丙醚至刚好浑浊，后冷却至10±5℃结晶2h，过滤烘干得到6.5g目标固体(羟甲基杂质)，纯度99.5％。
并经质谱确证为目标物羟甲基杂质：ESI-MS(m/z)：532[M+H]
仪器：安捷伦1260
色谱柱：Alltech混合式阴离子交换反相C8柱(7um，100A，250mm*4.6mm)
流动相：流动相A(0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0)-乙腈＝70:30)
流动相B(0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0)-乙腈＝50:50)
柱温：30℃流速：1.2ml/min检测波长：260nm
定位溶液配制：分别取阿德福韦酯单酯、羟甲基杂质、阿德福韦酯适量用稀释液(0.2mol/L磷酸盐缓冲液：乙腈＝1：4)配制成15ug/ml、15ug/ml、1mg/ml的溶液
样品溶液配制：分别取阿德福韦酯单酯、N6-羟甲基、阿德福韦酯适量用稀释液(0.2mol/L磷酸盐缓冲液：乙腈＝1：4)配制成15ug/ml、15ug/ml、1mg/ml的混合溶液；
测定法：取定位溶液和样品溶液各10ul注入液相色谱仪，记录色谱图。出峰顺序依次为：阿德福韦酯单酯、羟甲基杂质、阿德福韦酯。
实施例3
在250ml反应瓶中依次投入5.2gN-甲基吡咯烷酮、1.6g阿德福韦A-4，2.05g三乙胺，4.4g特戊酸氯甲酯，搅拌，加热，控制温度60±3℃，反应3h，冷却至30±5℃。加入70ml乙酸乙酯，搅拌1h，过滤。滤液转移至分液漏斗，加入20ml饮用水洗，保留有机层,分出水层，转移至分液漏斗，水层用乙酸乙酯提取两次(每次乙酸乙酯用量20ml)，合并有机层。有机层在分液漏斗中用饮用水洗两次(每次饮用水用量40ml)，弃水层。乙酸乙酯有机层用2mol/L盐酸提取两次(每次2mol/L盐酸用量20ml)，保留下层盐酸层(往下制备阿德福韦酯),上层乙酸乙酯层浓缩至干，获得3.1g固体，用7.0g四氢呋喃回流溶剂，缓慢滴加异丙醚至刚好浑浊，后冷却至10±5℃结晶2h，过滤烘干得到0.2g目标固体(羟甲基杂质)。
仪器：安捷伦1260
色谱柱：Alltech混合式阴离子交换反相C8柱(7um，100A，250mm*4.6mm)
流动相：流动相A(0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0)-乙腈＝70:30)
流动相B(0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0)-乙腈＝50:50)
柱温：30℃流速：1.2ml/min检测波长：260nm
定位溶液配制：分别取阿德福韦酯单酯、羟甲基杂质、阿德福韦酯适量用稀释液(0.2mol/L磷酸盐缓冲液：乙腈＝1：4)配制成15ug/ml、15ug/ml、1mg/ml的溶液
样品溶液配制：分别取阿德福韦酯单酯、N6-羟甲基、阿德福韦酯适量用稀释液(0.2mol/L磷酸盐缓冲液：乙腈＝1：4)配制成15ug/ml、15ug/ml、1mg/ml的混合溶液；
测定法：取定位溶液和样品溶液各10ul注入液相色谱仪，记录色谱图。出峰顺序依次为：阿德福韦酯单酯、羟甲基杂质、阿德福韦酯。
实施例4
在1L反应瓶中依次投入104gN-甲基吡咯烷酮、32g阿德福韦A-4，41g三乙胺，88g特戊酸氯甲酯，搅拌，加热，控制温度60±3℃，反应3h，冷却至30±5℃。加入700ml乙酸乙酯，搅拌1h，过滤。滤液转移至分液漏斗，加入400ml饮用水洗，保留有机层,分出水层，转移至分液漏斗，水层用乙酸乙酯提取两次(每次乙酸乙酯用量400ml)，合并有机层。有机层在分液漏斗中用饮用水洗两次(每次饮用水用量400ml)，弃水层。乙酸乙酯有机层用2mol/L盐酸提取两次(每次2mol/L盐酸用量400ml)，保留下层盐酸层(往下制备阿德福韦酯),上层乙酸乙酯层浓缩至干，获得35.2g固体，用100g四氢呋喃加热至35±5℃溶解，缓慢滴加异丙醚至刚好浑浊，后冷却至10±5℃结晶2h，过滤烘干得到5.8g目标固体(羟甲基杂质)。
仪器：安捷伦1260
色谱柱：Alltech混合式阴离子交换反相C8柱(7um，100A，250mm*4.6mm)
流动相：流动相A(0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0)-乙腈＝70:30)
流动相B(0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0)-乙腈＝50:50)
柱温：30℃流速：1.2ml/min检测波长：260nm
定位溶液配制：分别取阿德福韦酯单酯、羟甲基杂质、阿德福韦酯适量用稀释液(0.2mol/L磷酸盐缓冲液：乙腈＝1：4)配制成15ug/ml、15ug/ml、1mg/ml的溶液
样品溶液配制：分别取阿德福韦酯单酯、N6-羟甲基、阿德福韦酯适量用稀释液(0.2mol/L磷酸盐缓冲液：乙腈＝1：4)配制成15ug/ml、15ug/ml、1mg/ml的混合溶液；
测定法：取定位溶液和样品溶液各10ul注入液相色谱仪，记录色谱图。出峰顺序依次为：阿德福韦酯单酯、羟甲基杂质、阿德福韦酯。
实施例5
在250ml反应瓶中依次投入5.2gN-甲基吡咯烷酮、1.6g阿德福韦A-4，2.05g三乙胺，4.4g特戊酸氯甲酯，搅拌，加热，控制温度60±3℃，反应3h，冷却至30±5℃。加入70ml乙酸乙酯，搅拌1h，过滤。滤液转移至分液漏斗，加入20ml饮用水洗，保留有机层,分出水层，转移至分液漏斗，水层用乙酸乙酯提取两次(每次乙酸乙酯用量20ml)，合并有机层。有机层在分液漏斗中用饮用水洗两次(每次饮用水用量40ml)，弃水层。乙酸乙酯有机层用2mol/L盐酸提取两次(每次2mol/L盐酸用量20ml)，保留下层盐酸层(往下制备阿德福韦酯),上层乙酸乙酯层浓缩至干，用6g丙酮加热至35±5℃溶解，缓慢滴加丙醚至刚好浑浊，后冷却至10±5℃结晶2h，过滤烘干。
仪器：安捷伦1260
色谱柱：Alltech混合式阴离子交换反相C8柱(7um，100A，250mm*4.6mm)
流动相：流动相A(0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0)-乙腈＝70:30)
流动相B(0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0)-乙腈＝50:50)
柱温：30℃流速：1.2ml/min检测波长：260nm
定位溶液配制：分别取阿德福韦酯单酯、羟甲基杂质、阿德福韦酯适量用稀释液(0.2mol/L磷酸盐缓冲液：乙腈＝1：4)配制成15ug/ml、15ug/ml、1mg/ml的溶液
样品溶液配制：分别取阿德福韦酯单酯、N6-羟甲基、阿德福韦酯适量用稀释液(0.2mol/L磷酸盐缓冲液：乙腈＝1：4)配制成15ug/ml、15ug/ml、1mg/ml的混合溶液；
测定法：取定位溶液和样品溶液各10ul注入液相色谱仪，记录色谱图。出峰顺序依次为：阿德福韦酯单酯、羟甲基杂质、阿德福韦酯。
实施例6
在1L反应瓶中依次投入104gN-甲基吡咯烷酮、32g阿德福韦A-4，41g三乙胺，88g特戊酸氯甲酯，搅拌，加热，控制温度60±3℃，反应3h，冷却至30±5℃。加入700ml乙酸乙酯，搅拌1h，过滤。滤液转移至分液漏斗，加入400ml饮用水洗，保留有机层,分出水层，转移至分液漏斗，水层用乙酸乙酯提取两次(每次乙酸乙酯用量400ml)，合并有机层。有机层在分液漏斗中用饮用水洗两次(每次饮用水用量400ml)，弃水层。乙酸乙酯有机层用2mol/L盐酸提取两次(每次2mol/L盐酸用量400ml)，保留下层盐酸层(往下制备阿德福韦酯),上层乙酸乙酯层浓缩至干，用65g丙酮加热至35±5℃溶解，缓慢滴加丙醚至刚好浑浊，后冷却至10±5℃结晶2h，过滤烘干。
仪器：安捷伦1260
色谱柱：Alltech混合式阴离子交换反相C8柱(7um，100A，250mm*4.6mm)
流动相：流动相A(0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0)-乙腈＝70:30)
流动相B(0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0)-乙腈＝50:50)
柱温：30℃流速：1.2ml/min检测波长：260nm
定位溶液配制：分别取阿德福韦酯单酯、羟甲基杂质、阿德福韦酯适量用稀释液(0.2mol/L磷酸盐缓冲液：乙腈＝1：4)配制成15ug/ml、15ug/ml、1mg/ml的溶液
样品溶液配制：分别取阿德福韦酯单酯、N6-羟甲基、阿德福韦酯适量用稀释液(0.2mol/L磷酸盐缓冲液：乙腈＝1：4)配制成15ug/ml、15ug/ml、1mg/ml的混合溶液；
测定法：取定位溶液和样品溶液各10ul注入液相色谱仪，记录色谱图。出峰顺序依次为：阿德福韦酯单酯、羟甲基杂质、阿德福韦酯。
实施例7
在250ml反应瓶中依次投入5.2gN-甲基吡咯烷酮、1.6g阿德福韦A-4，2.05g三乙胺，4.4g特戊酸氯甲酯，搅拌，加热，控制温度60±3℃，反应3h，冷却至30±5℃。加入70ml乙酸乙酯，搅拌1h，过滤。滤液转移至分液漏斗，加入20ml饮用水洗，保留有机层,分出水层，转移至分液漏斗，水层用乙酸乙酯提取两次(每次乙酸乙酯用量20ml)，合并有机层。有机层在分液漏斗中用饮用水洗两次(每次饮用水用量40ml)，弃水层。乙酸乙酯有机层用2mol/L盐酸提取两次(每次2mol/L盐酸用量20ml)，保留下层盐酸层(往下制备阿德福韦酯),上层乙酸乙酯层浓缩至干，用6g丙酮加热至35±5℃溶解，缓慢滴加异丙醚至刚好浑浊，后冷却至10±5℃结晶2h，过滤烘干得到0.23g目标固体(羟甲基杂质)，纯度99.4％。
并经质谱确证为目标物羟甲基杂质：ESI-MS(m/z)：554[M+Na]
仪器：安捷伦1260
色谱柱：Alltech混合式阴离子交换反相C8柱(7um，100A，250mm*4.6mm)
流动相：流动相A(0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0)-乙腈＝70:30)
流动相B(0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0)-乙腈＝50:50)
柱温：30℃流速：1.2ml/min检测波长：260nm
定位溶液配制：分别取阿德福韦酯单酯、羟甲基杂质、阿德福韦酯适量用稀释液(0.2mol/L磷酸盐缓冲液：乙腈＝1：4)配制成15ug/ml、15ug/ml、1mg/ml的溶液
样品溶液配制：分别取阿德福韦酯单酯、N6-羟甲基、阿德福韦酯适量用稀释液(0.2mol/L磷酸盐缓冲液：乙腈＝1：4)配制成15ug/ml、15ug/ml、1mg/ml的混合溶液；
测定法：取定位溶液和样品溶液各5ul注入液相色谱仪，记录色谱图。出峰顺序依次为：阿德福韦酯单酯、羟甲基杂质、阿德福韦酯。
实施例8
在1L反应瓶中依次投入104gN-甲基吡咯烷酮、32g阿德福韦A-4，41g三乙胺，88g特戊酸氯甲酯，搅拌，加热，控制温度60±3℃，反应3h，冷却至30±5℃。加入700ml乙酸乙酯，搅拌1h，过滤。滤液转移至分液漏斗，加入400ml饮用水洗，保留有机层,分出水层，转移至分液漏斗，水层用乙酸乙酯提取两次(每次乙酸乙酯用量400ml)，合并有机层。有机层在分液漏斗中用饮用水洗两次(每次饮用水用量400ml)，弃水层。乙酸乙酯有机层用2mol/L盐酸提取两次(每次2mol/L盐酸用量400ml)，保留下层盐酸层(往下制备阿德福韦酯),上层乙酸乙酯层浓缩至干，用65g丙酮加热至35±5℃溶解，缓慢滴加异丙醚至刚好浑浊，后冷却至10±5℃结晶2h，过滤烘干得到6.5g目标固体(羟甲基杂质)，纯度99.5％。
并经质谱确证为目标物羟甲基杂质：ESI-MS(m/z)：532[M+H]
仪器：安捷伦1260
色谱柱：Alltech混合式阴离子交换反相C8柱(7um，100A，250mm*4.6mm)
流动相：流动相A(0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0)-乙腈＝70:30)
流动相B(0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0)-乙腈＝50:50)
柱温：30℃流速：1.2ml/min检测波长：260nm
定位溶液配制：分别取阿德福韦酯单酯、羟甲基杂质、阿德福韦酯适量用稀释液(0.2mol/L磷酸盐缓冲液：乙腈＝1：4)配制成15ug/ml、15ug/ml、1mg/ml的溶液
样品溶液配制：分别取阿德福韦酯单酯、N6-羟甲基、阿德福韦酯适量用稀释液(0.2mol/L磷酸盐缓冲液：乙腈＝1：4)配制成15ug/ml、15ug/ml、1mg/ml的混合溶液；
测定法：取定位溶液和样品溶液各5ul注入液相色谱仪，记录色谱图。出峰顺序依次为：阿德福韦酯单酯、羟甲基杂质、阿德福韦酯。
实施例9
在250ml反应瓶中依次投入5.2gN-甲基吡咯烷酮、1.6g阿德福韦A-4，2.05g三乙胺，4.4g特戊酸氯甲酯，搅拌，加热，控制温度60±3℃，反应3h，冷却至30±5℃。加入70ml乙酸乙酯，搅拌1h，过滤。滤液转移至分液漏斗，加入20ml饮用水洗，保留有机层,分出水层，转移至分液漏斗，水层用乙酸乙酯提取两次(每次乙酸乙酯用量20ml)，合并有机层。有机层在分液漏斗中用饮用水洗两次(每次饮用水用量40ml)，弃水层。乙酸乙酯有机层用2mol/L盐酸提取两次(每次2mol/L盐酸用量20ml)，保留下层盐酸层(往下制备阿德福韦酯),上层乙酸乙酯层浓缩至干，用6g丙酮加热至35±5℃溶解，缓慢滴加异丙醚至刚好浑浊，后冷却至10±5℃结晶2h，过滤烘干得到0.23g目标固体(羟甲基杂质)，纯度99.4％。
并经质谱确证为目标物羟甲基杂质：ESI-MS(m/z)：554[M+Na]
仪器：安捷伦1260
色谱柱：Alltech混合式阴离子交换反相C8柱(7um，100A，250mm*4.6mm)
流动相：流动相A(0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0)-乙腈＝70:30)
流动相B(0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0)-乙腈＝50:50)
柱温：20℃流速：1.2ml/min检测波长：260nm
定位溶液配制：分别取阿德福韦酯单酯、羟甲基杂质、阿德福韦酯适量用稀释液(0.2mol/L磷酸盐缓冲液：乙腈＝1：4)配制成15ug/ml、15ug/ml、1mg/ml的溶液
样品溶液配制：分别取阿德福韦酯单酯、N6-羟甲基、阿德福韦酯适量用稀释液(0.2mol/L磷酸盐缓冲液：乙腈＝1：4)配制成15ug/ml、15ug/ml、1mg/ml的混合溶液；
测定法：取定位溶液和样品溶液各10ul注入液相色谱仪，记录色谱图。出峰顺序依次为：阿德福韦酯单酯、羟甲基杂质、阿德福韦酯。
实施例10
在1L反应瓶中依次投入104gN-甲基吡咯烷酮、32g阿德福韦A-4，41g三乙胺，88g特戊酸氯甲酯，搅拌，加热，控制温度60±3℃，反应3h，冷却至30±5℃。加入700ml乙酸乙酯，搅拌1h，过滤。滤液转移至分液漏斗，加入400ml饮用水洗，保留有机层,分出水层，转移至分液漏斗，水层用乙酸乙酯提取两次(每次乙酸乙酯用量400ml)，合并有机层。有机层在分液漏斗中用饮用水洗两次(每次饮用水用量400ml)，弃水层。乙酸乙酯有机层用2mol/L盐酸提取两次(每次2mol/L盐酸用量400ml)，保留下层盐酸层(往下制备阿德福韦酯),上层乙酸乙酯层浓缩至干，用65g丙酮加热至35±5℃溶解，缓慢滴加异丙醚至刚好浑浊，后冷却至10±5℃结晶2h，过滤烘干得到6.5g目标固体(羟甲基杂质)，纯度99.5％。
并经质谱确证为目标物羟甲基杂质：ESI-MS(m/z)：532[M+H]
仪器：安捷伦1260
色谱柱：Alltech混合式阴离子交换反相C8柱(7um，100A，250mm*4.6mm)
流动相：流动相A(0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0)-乙腈＝70:30)
流动相B(0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0)-乙腈＝50:50)
柱温：20℃流速：1.2ml/min检测波长：260nm
定位溶液配制：分别取阿德福韦酯单酯、羟甲基杂质、阿德福韦酯适量用稀释液(0.2mol/L磷酸盐缓冲液：乙腈＝1：4)配制成15ug/ml、15ug/ml、1mg/ml的溶液
样品溶液配制：分别取阿德福韦酯单酯、N6-羟甲基、阿德福韦酯适量用稀释液(0.2mol/L磷酸盐缓冲液：乙腈＝1：4)配制成15ug/ml、15ug/ml、1mg/ml的混合溶液；
测定法：取定位溶液和样品溶液各10ul注入液相色谱仪，记录色谱图。出峰顺序依次为：阿德福韦酯单酯、羟甲基杂质、阿德福韦酯。
实施例11
在250ml反应瓶中依次投入2.5gN-甲基吡咯烷酮、1.0g阿德福韦A-4，1.0g三乙胺，2.0g特戊酸氯甲酯，搅拌，加热，控制温度60±3℃，反应3h，冷却至30±5℃。加入35ml乙酸乙酯，搅拌1h，过滤。滤液转移至分液漏斗，加入10ml饮用水洗，保留有机层,分出水层，转移至分液漏斗，水层用乙酸乙酯提取两次(每次乙酸乙酯用量10ml)，合并有机层。有机层在分液漏斗中用饮用水洗两次(每次饮用水用量20ml)，弃水层。乙酸乙酯有机层用2mol/L盐酸提取两次(每次2mol/L盐酸用量10ml)，保留下层盐酸层(往下制备阿德福韦酯),上层乙酸乙酯层浓缩至干，用3g丙酮加热至35±5℃溶解，缓慢滴加异丙醚至刚好浑浊，后冷却至10±5℃结晶2h，过滤烘干得到0.11g目标固体(羟甲基杂质)，纯度99.4％。
并经质谱确证为目标物羟甲基杂质：ESI-MS(m/z)：554[M+Na]
仪器：安捷伦1260
色谱柱：Alltech混合式阴离子交换反相C8柱(7um，100A，250mm*4.6mm)
流动相：流动相A(0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0)-乙腈＝70:30)
流动相B(0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0)-乙腈＝50:50)
柱温：30℃流速：1.2ml/min检测波长：260nm
定位溶液配制：分别取阿德福韦酯单酯、羟甲基杂质、阿德福韦酯适量用稀释液(0.2mol/L磷酸盐缓冲液：乙腈＝1：4)配制成15ug/ml、15ug/ml、1mg/ml的溶液
样品溶液配制：分别取阿德福韦酯单酯、N6-羟甲基、阿德福韦酯适量用稀释液(0.2mol/L磷酸盐缓冲液：乙腈＝1：4)配制成15ug/ml、15ug/ml、1mg/ml的混合溶液；
测定法：取定位溶液和样品溶液各10ul注入液相色谱仪，记录色谱图。出峰顺序依次为：阿德福韦酯单酯、羟甲基杂质、阿德福韦酯。
实施例12
在250ml反应瓶中依次投入4.0gN-甲基吡咯烷酮、1.0g阿德福韦A-4，1.5g三乙胺，3.6.0g特戊酸氯甲酯，搅拌，加热，控制温度60±3℃，反应3h，冷却至30±5℃。加入70ml乙酸乙酯，搅拌1h，过滤。滤液转移至分液漏斗，加入20ml饮用水洗，保留有机层,分出水层，转移至分液漏斗，水层用乙酸乙酯提取两次(每次乙酸乙酯用量20ml)，合并有机层。有机层在分液漏斗中用饮用水洗两次(每次饮用水用量40ml)，弃水层。乙酸乙酯有机层用2mol/L盐酸提取两次(每次2mol/L盐酸用量20ml)，保留下层盐酸层(往下制备阿德福韦酯),上层乙酸乙酯层浓缩至干，用6g丙酮加热至35±5℃溶解，缓慢滴加异丙醚至刚好浑浊，后冷却至10±5℃结晶2h，过滤烘干得到0.18g目标固体(羟甲基杂质)，纯度99.4％。
并经质谱确证为目标物羟甲基杂质：ESI-MS(m/z)：554[M+Na]
仪器：安捷伦1260
色谱柱：Alltech混合式阴离子交换反相C8柱(7um，100A，250mm*4.6mm)
流动相：流动相A(0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0)-乙腈＝70:30)
流动相B(0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0)-乙腈＝50:50)
柱温：30℃流速：1.2ml/min检测波长：260nm
定位溶液配制：分别取阿德福韦酯单酯、羟甲基杂质、阿德福韦酯适量用稀释液(0.2mol/L磷酸盐缓冲液：乙腈＝1：4)配制成15ug/ml、15ug/ml、1mg/ml的溶液
样品溶液配制：分别取阿德福韦酯单酯、N6-羟甲基、阿德福韦酯适量用稀释液(0.2mol/L磷酸盐缓冲液：乙腈＝1：4)配制成15ug/ml、15ug/ml、1mg/ml的混合溶液；
测定法：取定位溶液和样品溶液各10ul注入液相色谱仪，记录色谱图。出峰顺序依次为：阿德福韦酯单酯、羟甲基杂质、阿德福韦酯。
对比实施例组(层析柱的选择)
对比实施例1
在250ml反应瓶中依次投入5.2gN-甲基吡咯烷酮、1.6g阿德福韦A-4，2.05g三乙胺，4.4g特戊酸氯甲酯，搅拌，加热，控制温度60±3℃，反应3h，冷却至30±5℃。加入70ml乙酸乙酯，搅拌1h，过滤。滤液转移至分液漏斗，加入20ml饮用水洗，保留有机层,分出水层，转移至分液漏斗，水层用乙酸乙酯提取两次(每次乙酸乙酯用量20ml)，合并有机层。有机层在分液漏斗中用饮用水洗两次(每次饮用水用量40ml)，弃水层。乙酸乙酯有机层用2mol/L盐酸提取两次(每次2mol/L盐酸用量20ml)，保留下层盐酸层(往下制备阿德福韦酯),上层乙酸乙酯层浓缩至干，用6g丙酮加热至35±5℃溶解，缓慢滴加异丙醚至刚好浑浊，后冷却至10±5℃结晶2h，过滤烘干得到0.23g目标固体(羟甲基杂质)，纯度99.4％。
并经质谱确证为目标物羟甲基杂质：ESI-MS(m/z)：554[M+Na]
仪器：安捷伦1260
色谱柱：CN-3化学键合硅胶氰基柱(4.6*250mm，5um)
流动相：流动相A(0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0)-乙腈＝70:30)
流动相B(0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0)-乙腈＝50:50)
柱温：30℃流速：1.2ml/min检测波长：260nm
定位溶液配制：分别取阿德福韦酯单酯、羟甲基杂质、阿德福韦酯适量用稀释液(0.2mol/L磷酸盐缓冲液：乙腈＝1：4)配制成15ug/ml、15ug/ml、1mg/ml的溶液
样品溶液配制：分别取阿德福韦酯单酯、N6-羟甲基、阿德福韦酯适量用稀释液(0.2mol/L磷酸盐缓冲液：乙腈＝1：4)配制成15ug/ml、15ug/ml、1mg/ml的混合溶液；
测定法：取定位溶液和样品溶液各10ul注入液相色谱仪，记录色谱图。出峰顺序依次为：阿德福韦酯单酯、羟甲基杂质、阿德福韦酯。
对比实施例2
在250ml反应瓶中依次投入5.2gN-甲基吡咯烷酮、1.6g阿德福韦A-4，2.05g三乙胺，4.4g特戊酸氯甲酯，搅拌，加热，控制温度60±3℃，反应3h，冷却至30±5℃。加入70ml乙酸乙酯，搅拌1h，过滤。滤液转移至分液漏斗，加入20ml饮用水洗，保留有机层,分出水层，转移至分液漏斗，水层用乙酸乙酯提取两次(每次乙酸乙酯用量20ml)，合并有机层。有机层在分液漏斗中用饮用水洗两次(每次饮用水用量40ml)，弃水层。乙酸乙酯有机层用2mol/L盐酸提取两次(每次2mol/L盐酸用量20ml)，保留下层盐酸层(往下制备阿德福韦酯),上层乙酸乙酯层浓缩至干，用6g丙酮加热至35±5℃溶解，缓慢滴加异丙醚至刚好浑浊，后冷却至10±5℃结晶2h，过滤烘干得到0.23g目标固体(羟甲基杂质)，纯度99.4％。
并经质谱确证为目标物羟甲基杂质：ESI-MS(m/z)：554[M+Na]
仪器：安捷伦1260
色谱柱：ODSC18柱(4.6*200mm，5um)
流动相：流动相A(0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0)-乙腈＝70:30)
流动相B(0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0)-乙腈＝50:50)
柱温：30℃流速：1.2ml/min检测波长：260nm
定位溶液配制：分别取阿德福韦酯单酯、羟甲基杂质、阿德福韦酯适量用稀释液(0.2mol/L磷酸盐缓冲液：乙腈＝1：4)配制成15ug/ml、15ug/ml、1mg/ml的溶液
样品溶液配制：分别取阿德福韦酯单酯、N6-羟甲基、阿德福韦酯适量用稀释液(0.2mol/L磷酸盐缓冲液：乙腈＝1：4)配制成15ug/ml、15ug/ml、1mg/ml的混合溶液；
测定法：取定位溶液和样品溶液各10ul注入液相色谱仪，记录色谱图。出峰顺序依次为：阿德福韦酯单酯、羟甲基杂质、阿德福韦酯。
对比实施例组(流动相的选择)
对比实施例3
在250ml反应瓶中依次投入5.2gN-甲基吡咯烷酮、1.6g阿德福韦A-4，2.05g三乙胺，4.4g特戊酸氯甲酯，搅拌，加热，控制温度60±3℃，反应3h，冷却至30±5℃。加入70ml乙酸乙酯，搅拌1h，过滤。滤液转移至分液漏斗，加入20ml饮用水洗，保留有机层,分出水层，转移至分液漏斗，水层用乙酸乙酯提取两次(每次乙酸乙酯用量20ml)，合并有机层。有机层在分液漏斗中用饮用水洗两次(每次饮用水用量40ml)，弃水层。乙酸乙酯有机层用2mol/L盐酸提取两次(每次2mol/L盐酸用量20ml)，保留下层盐酸层(往下制备阿德福韦酯),上层乙酸乙酯层浓缩至干，用6g丙酮加热至35±5℃溶解，缓慢滴加异丙醚至刚好浑浊，后冷却至10±5℃结晶2h，过滤烘干得到0.23g目标固体(羟甲基杂质)，纯度99.4％。
并经质谱确证为目标物羟甲基杂质：ESI-MS(m/z)：554[M+Na]
仪器：安捷伦1260
色谱柱：Alltech混合式阴离子交换反相C8柱(7um，100A，250mm*4.6mm)
流动相：流动相A(0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0)-乙腈＝70:30)
流动相B(0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0)-乙腈＝50:50)
柱温：30℃流速：1.2ml/min检测波长：260nm
定位溶液配制：分别取阿德福韦酯单酯、羟甲基杂质、阿德福韦酯适量用稀释液(0.2mol/L磷酸盐缓冲液：乙腈＝1：4)配制成15ug/ml、15ug/ml、1mg/ml的溶液
样品溶液配制：分别取阿德福韦酯单酯、N6-羟甲基、阿德福韦酯适量用稀释液(0.2mol/L磷酸盐缓冲液：乙腈＝1：4)配制成15ug/ml、15ug/ml、1mg/ml的混合溶液；
测定法：取定位溶液和样品溶液各10ul注入液相色谱仪，记录色谱图。出峰顺序依次为：阿德福韦酯单酯、羟甲基杂质、阿德福韦酯。
对比实施例4
在250ml反应瓶中依次投入5.2gN-甲基吡咯烷酮、1.6g阿德福韦A-4，2.05g三乙胺，4.4g特戊酸氯甲酯，搅拌，加热，控制温度60±3℃，反应3h，冷却至30±5℃。加入70ml乙酸乙酯，搅拌1h，过滤。滤液转移至分液漏斗，加入20ml饮用水洗，保留有机层,分出水层，转移至分液漏斗，水层用乙酸乙酯提取两次(每次乙酸乙酯用量20ml)，合并有机层。有机层在分液漏斗中用饮用水洗两次(每次饮用水用量40ml)，弃水层。乙酸乙酯有机层用2mol/L盐酸提取两次(每次2mol/L盐酸用量20ml)，保留下层盐酸层(往下制备阿德福韦酯),上层乙酸乙酯层浓缩至干，用6g丙酮加热至35±5℃溶解，缓慢滴加异丙醚至刚好浑浊，后冷却至10±5℃结晶2h，过滤烘干得到0.23g目标固体(羟甲基杂质)，纯度99.4％。
并经质谱确证为目标物羟甲基杂质：ESI-MS(m/z)：554[M+Na]
仪器：安捷伦1260
色谱柱：Alltech混合式阴离子交换反相C8柱(7um，100A，250mm*4.6mm)
流动相：乙腈：0.025mol/L磷酸盐缓冲液(ph4.0)(体积比为33：67)
柱温：30℃流速：1.2ml/min检测波长：260nm
定位溶液配制：分别取阿德福韦酯单酯、羟甲基杂质、阿德福韦酯适量用稀释液(0.2mol/L磷酸盐缓冲液：乙腈＝1：4)配制成15ug/ml、15ug/ml、1mg/ml的溶液
样品溶液配制：分别取阿德福韦酯单酯、N6-羟甲基、阿德福韦酯适量用稀释液(0.2mol/L磷酸盐缓冲液：乙腈＝1：4)配制成15ug/ml、15ug/ml、1mg/ml的混合溶液；
测定法：取定位溶液和样品溶液各10ul注入液相色谱仪，记录色谱图。出峰顺序依次为：阿德福韦酯单酯、羟甲基杂质、阿德福韦酯。
(一)一种阿德福韦酯羟甲基杂质制备阶段的实验数据
1、结晶溶剂的筛选(良性溶剂以及非良性溶剂)
表1-1—重结晶阶段阿德福韦酯粗制化合物干品在不同良性溶剂溶清情况下的用量
| 项目 | 溶剂种类 | 用量 | 反应效果 |
| 实施例1 | 丙酮 | 2倍 | 溶清 |
| 实施例2 | 丙酮 | 2倍 | 溶清 |
| 实施例3 | 四氢呋喃 | 2.2倍 | 溶清 |
| 实施例4 | 四氢呋喃 | 2.2倍 | 溶清 |
从表1-1的实验数据可以明显看出：四氢呋喃在1.5-3倍重量份阿德福韦酯粗制化合物干品用量下可实现溶清，但其溶清情况下的用量超过丙酮，另外，二氯甲烷熔点较低，三氯甲烷具有毒性，而在步骤S2阿德福韦酯粗制化合物溶液过滤提纯中，溶剂为乙酸乙酯，当甲醇、乙醇作为良性溶剂时，获得的产品纯度较低；故优选丙酮为良性溶剂。
表1-2—重结晶阶段阿德福韦酯粗制化合物干品在不同非良性溶剂的用量
从表1-2的实验数据可以明显看出：丙醚的用量大于异丙醚；而石油醚、乙醚所需用量较丙醚更大。
综上所述，本发明优选用丙酮+异丙醚作为结晶溶剂。
(二)一种阿德福韦酯羟甲基杂质检测阶段各实施例的实验数据
1、层析柱的选择：
表2-1：的实验数据
从表2-1的实验数据可以明显看出：对比实施例组使用CN-3化学键合硅胶氰基柱(4.6*250mm，5um)，主峰在8min左右出峰，出峰时间整体偏快，导致ADV与N6-羟甲基无法分离，甚至PEMA与其中的一个未知杂质都无法完全分离；虽然用ODSC18柱(4.6*200mm,5um)能够很好的分离主峰和阿德福韦酯单酯，但无法很好分离N6-羟甲基。说明使用这两种色谱柱都无法完全分离阿德福韦酯及其相关杂质。
本发明优选Alltech混合式阴离子交换反相C8柱(7um,100A，250mm*4.6mm)。该柱由于结合反相柱与离子交换柱的特点，对于同时存在电离和未电离物质的情况，有较好的分离效果。
2、流动相的选择
1)溶剂的选择
表2-2——种阿德福韦酯羟甲基杂质溶解阶段各实施例的阿德福韦酯羟甲基杂质在不同非良性溶剂中结晶溶解情况(1、2)
从表2-2的实验数据可以明显看出：
相对于乙腈来说，甲醇对阿德福韦酯洗脱能力明显比较差，导致阿德福韦酯出峰时间较晚，且峰型不对称，拖尾较严重。虽然加入弱酸对拖尾有所改变，PH低对柱子损伤较大，不利于工厂长期检测，另外使用该流动相也不能解决N6-羟甲基和阿德福韦酯的分离问题，
本发明流动相采用：乙腈：0.025mol/L磷酸盐缓冲液(ph4.0)(体积比为33：67)
2)流动相的进一步优化选择
釆用梯度洗脱的方式，以:100％流动相A保持1分钟后，在19分钟内线性变化到100％流动相B，保持100％流动相B直到分析结束。
表3-3：柱层析过程中流动相A和流动相B的进一步优化选择(4)
从表3-3的实验数据可以明显看出：
优选流动相A:0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH6:0)-乙腈(70:30)
流动相B:0:2mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0)-乙腈(50:50)产物与杂质分离度好(最佳实施例2)。
(三)柱层析阶段各实施例的进样体积的实验数据
进样体积影响实验结果汇总
从表3的实验数据可以明显看出：
本次测定最大的难点是阿德福韦酯与N6-羟甲基的分离，在确定进样体积时，也重点考察不同体积对阿德福韦酯与N6-羟甲基的分离的影响，优选进样体积为5ul和10ul；其中，5ul和10ul对检测结果影响不大，分离度均能达到要求，10ul分离度更好些，优选进样体积10ul。
(四)柱层析阶段各实施例的柱温的实验数据
柱温影响实验结果汇总
从表4的实验数据可以明显看出：在确定柱温的时候，也重点考察不同体积对阿德福韦酿与N6-羟甲基的分离的影响，优选柱温为20℃和30℃作为考察对象。以上结果表明20℃和30℃对检测结果影响不大，分离度均能达到要求，但在30℃-拖尾因子和分离度更好些，进一步，优选进样温度为30℃。
综合上述的筛选，本发明提供的用高效液相检测N6-羟甲基含量的方法，其特征在于用Alltech混合式阴离子交换反相C8柱(7um，100A，250mm*4.:6mm)流动相A(0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0)-乙腈＝70:30)，流动相B(O.:；2mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0)-乙腈＝50:50)采用梯度洗脱的方式，以100％流动相A保持1分钟后，在19分钟内线性变化到100％流动相B，保持100％流动相B直到分析结束260nm的吸收峰作为本方法检测时的特定检测波长；以1.2ml/min流速，10ul进样体积和30℃的进样温度；采用本发明的优化技术方案，可以制得纯度95.0％以上的二聚体杂质对照品。
本发明的各个实施例所制备的阿德福韦酯羟甲基杂质所测得的质谱图如附图2和附图4所示，证明本发明的各个实施例所制备的阿德福韦酯羟甲基杂质的结构式如下：
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (4)
1.一种阿德福韦酯羟甲基杂质的制备方法，其特征在于：包括以下依次进行的步骤：
S1：阿德福韦酯羟甲基杂质粗制化合物的制备；所述阿德福韦酯羟甲基杂质粗制化合物由以下原料按以下重量配比，并经过S1-1和S1-2步骤制备而成：
S1-1：将上述重量配比的甲基吡咯烷酮、阿德福韦A-4、三乙胺、特戊酸氯甲酯依次投入至反应容器中，搅拌并加热至反应温度；
S1-2：在反应温度下保温反应后，冷却至30±5℃，得到阿德福韦酯粗制化合物溶液；
S2：阿德福韦酯粗制化合物溶液过滤提纯，其包括以下依次进行的子步骤：
S2-1：在反应容器中加入630重量份乙酸乙酯，搅拌1h，过滤；
S2-2：滤液转移至分液漏斗，加入400重量份饮用水洗，保留有机层,分出水层，将有机层转移至另一分液漏斗，水层用乙酸乙酯提取两次，每次乙酸乙酯用量360重量份，将提取物与另一分液漏斗内的有机层合并；
S2-3：将子步骤S2-2得到的合并后的有机层在分液漏斗中用400份饮用水洗两次，每次饮用水用量400重量份，弃水层；
S2-4：将子步骤S2-3得到的有机层用2mol/L盐酸提取两次，每次2mol/L盐酸用量400重量份，保留下层盐酸层,上层乙酸乙酯层浓缩至干；得到阿德福韦酯粗制化合物干品；
S3：将步骤S2得到的阿德福韦酯粗制化合物干品二次结晶提纯，其包括以下依次进行的子步骤：
S3-1：加入1.5-3倍阿德福韦酯粗制化合物干品重量份的丙酮加热至35±5℃使阿德福韦酯粗制化合物干品溶解，缓慢滴加异丙醚至刚好浑浊；
S3-2：冷却至10±5℃结晶2h，过滤烘干得到阿德福韦酯羟甲基杂质二次结晶体。
2.如权利要求1所述的一种阿德福韦酯羟甲基杂质的制备方法，其特征在于：步骤S1-1中，所述反应温度为60±3℃。
3.如权利要求1所述的一种阿德福韦酯羟甲基杂质的制备方法，其特征在于：步骤S1-2中，所述保温反应的反应时间为3h。
4.如权利要求1所述的一种阿德福韦酯羟甲基杂质的制备方法，其特征在于：还包括检测步骤，其包括以下子步骤：
S4-1：将步骤S3-2制备得到的阿德福韦酯羟甲基杂质二次结晶体采用Alltech混合式阴离子交换反相C8柱；以260nm的检测波长、1.0-1.5ml/min流速，5-10ul进样体积和20-30℃的检测柱温采用梯度洗脱的方式，以100％流动相A保持1分钟，所述流动相A采用0.2mol/L、pH6.0的磷酸盐缓冲液-乙腈＝70:30；
S4-2:在19分钟内线性变化到100％流动相B，所述流动相B为0.2mol/L、pH6.0磷酸盐缓冲液-乙腈＝50:50，保持100％流动相B直到分析结束。
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