CN106163512A - 改善认知功能的植物提取物 - Google Patents

Abstract

本发明揭示留兰香(Mentha spicata)植物提取物改善记忆、推理、注意/专注和计划。

Description

改善认知功能的植物提取物

本申请要求2014年1月30日提交的美国专利申请系列号61/933,583的优先权，其全部内容并入本文作参考。

发明背景

本发明一般性涉及增强、改善或维持认知健康和功能的植物提取物，更特别涉及施用含有迷迭香酸的留兰香(Mentha spicata L.)提取物改善记忆、推理(reasoning)、注意/专注(attention/concentration)、计划(planning)以及相关行为。

对于可改善认知健康或功能的产品具有强烈需求，近年来尽管存在不利的经济压力但是这些产品的市场持续增长。这种增长有一些因素是老龄人群的增长，特别是在亚洲和美国。世界范围的认知健康产品成分销售额为大约是4亿5千5百万美元。Frost和Sullivan预测在这个领域2016至2019年的年增长率为12％。

认知健康产品的主要成分目前包括磷脂酰丝氨酸(PS)、CoQ10、Ω-3(海产品油(marine oil)/海藻油)、胞磷胆碱、银杏和人参。在最大的认知健康产品成分中，磷脂酰丝氨酸是FDA许可授权的唯一成分。随着支持该授予权的科学证据的增加，该成分的销售以两位数增长。在2010年，DHA和EPA对脑功能、心脏健康和视力的健康宣言获得欧洲EFSA的肯定评价。胞磷胆碱作为预防神经元退化及改善记忆的成分被推广。

迷迭香酸(RA)是在留兰香中发现的主要成分之一，由于其抗氧化能力而具有重要作用(Fletcher et al.Heat stress reduces the accumulation of rosmarinic acidand the total antioxidant capacity in spearmint(Mentha spicata L).Journal ofthe Science of Food and Agriculture 85:2429-2436,2005)。RA，一种天然发生的酚类化合物，是咖啡酸与3,4-二羟基苯基乳酸的酯。其结构由在两个酚环之间的羰基、不饱和双键及羧酸组成。RA示出一些生物学活性，如抗炎、抗诱变、抗细菌、抗抑郁、HIV-1抑制性、抗氧化及抗病毒性质。这些性质使得RA成为一种用于制药和化妆品工业的有吸引力的成分。RA在欧洲已经局部用作非类固醇抗炎药物(Ritschel et al.Percutaneous absorptionof rosmarinic acid in the rat.Methods and Findings in Experimental andClinical Pharmacology 11:345-352,1989)。由于其在食品工业中广泛用作芳香剂和防腐剂，因此RA被认为是日常摄取安全成分(Alkam et al.A natural scavenger ofperoxynitrites,rosmarinic acid,protects against impairment of memory inducedby Aβ25-35.Behavioural Brain Research 180:139-145,2007)。

RA的非特异性保护性质的证据已经在脑内发现。在为年老的小鼠施用RA后证实脑的改善的抗氧化活性，这导致脑中超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性增加，同时丙二醛(MDA)降低(Shou et al.Rosmarinic acid attenuates D-galactose inducedbehavior impairment in mice and its mechanism.2010,p.1723-1726)。这些数据证实RA作为抗氧化剂的非特异性保护性质，然而，没有先前数据证实RA在特定区域或在特定临床结果影响脑的能力。

在体内，三项研究评估了RA施用。这些研究在颅内损伤模型或者在用于表示特定认知疾病状态的应激模型中通过口服或IP施用RA(Alkam et al.A natural scavenger ofperoxynitrites,rosmarinic acid,protects against impairment of memory inducedby Aβ25-35.Behavioural Brain Research 180:139-145,2007；Park et al.Subchronicadministration of rosmarinic acid,a natural prolyl oligopeptidase inhibitor,enhances cognitive performances.Fitoterapia 81:644-648,2010；Zhou etal.Rosmarinic acid attenuates D-galactose induced behavior impairment in miceand its mechanism.Intl Conf BMEI 4:1723-1726,2010)。尽管RA在这些模型中示出益处，但是其不是评估正常衰老性认知改变的经验证的模型。此外，仍未知这种作用机制由于抗氧化作用是否是特异性或非特异性的。目前没有评估单独或者通过使用留兰香提取物补充RA的公开的人体研究。

学习和记忆可分为两个主要类别：陈述性与程序性。陈述性记忆具有暂时性、空间性和联想记忆成分。这涉及具有要求注意和警觉的意识成分的学习和记忆。在人体中，这涉及离散事件、地点、人和事实的习得、识别和记忆。当陈述性记忆任务成为常规或习惯时可以形成程序性学习和记忆，在目前的动物研究中通过压板试验(lever press)测量。这涉及不具有意识成分的学习与记忆，在人体中是习惯或技能，如骑自行车。程序性任务被认为是自海马区起始的，而程序性任务主要与脑的尾状核区域相联系。

记忆缺损可发生在健康个体、老年个体，被认为是衰老的正常结果。在老年对象中(>50岁)，Gallo等报道了自我报告记忆缺损发生率为大约20％(Gallo JJ,Morales KH,Bogner HR,Raue PG,Zee J,Bruce ML,Reynolds CF.Long term effect of depressioncare management on mortality in older adults:follow-up of cluster randomizedclinical trial in primary care.BMJ 2013；346:f2570)。令人感兴趣地，在一项服务年龄在65及以上的2,934个患者的17个普通医疗诊所的横向研究中，这些个体的23％在提示下自我报告记忆缺损；然而仅18％(在所述23％中)的人关于其记忆问题咨询医师(Waldorff FB,Rishoi S,Waldemar G.If you don’t ask(about memory),they probablywon’t tell.J Fam Pract 2008；57(1):41-4.)。认知减退通常被接受为衰老的自然结果；然而，其显著降低生活质量(Grossi D,Postiglione A,Schettini B,Trojano L,Barbarulo AM,Guigliano V,Ambron E,Aiello A.Autobiographical recall trainingin elderly adults with subjective memory complaint:a pilot study.Percept MotSkills 2007；104(2):621-8)。据估计五百四十万老年美国人具有无痴呆的认知缺损，大约12％的这些个体将逐年发展为痴呆(Plassman BL,Langa KM,Fisher GG,Heeringa SG,Weir DR,Ofstedal MB,Burke JR,Hurd MD,Potter GG,Rodgers WL,Steffens DC,McardleJJ,Willis RJ,Wallace RB.Prevalence of cognitive impairment without dementiain the United States.Ann Intern Med2008；148(6):427-34)。尽管针对痴呆可利用许多治疗方法，但是这种显著的健康问题需要探索增加、维持与衰老相关的认知功能或降低该认知功能衰退的方法。

传统医学长期使用基于植物的疗法治疗许多疾病，最近在临床实验中对基于植物的药物如银杏(Wesnes KA,Ward T,Mcginty A,Petrini O.The memory enhancingeffects of a Ginkgo biloba/Panax ginseng combination in healthy middle-agedvolunteers.Psychopharmacology(Berl)2000；152(4):353-61；Snitz BE,O'meara ES,Carlson MC,Arnold AM,Ives DG,Rapp SR,Saxton J,Lopez OL,Dunn LO,Sink KM,Dekosky ST.Ginkgo biloba for preventing cognitive decline in older adults:arandomized trial.JAMA 2009；302(24):2663-70)、人参(Wesnes 2008；Reay JL,KennedyDO,Scholey AB.Single doses of Panax ginseng(G115)reduce blood glucose levelsand improve cognitive performance during sustained mental activity.JPsychopharmacol 2005；19(4):357-65；Kennedy DO,Haskell CF,Robertson B,Reay J,Brewster-Maund C,Luedemann J,Maggini S,Ruf M,Zangara A,Scholey AB.Improvedcognitive performance and mental fatigue following a multi-vitamin andmineral supplement with added guarana(Paullinia cupana).Appetite 2008；50(2-3):506-13)以及瓜拉那(Kennedy 2004；Haskell 2007)研究了其在健康志愿者中增强认知功能的潜力。近来13个随机对照实验的综合分析提示草药相对于安慰剂提供了小但一致的益处，在痴呆对象中改善认知功能与药物干预同样有效(May BH,Lit M,Xue CC,Yang AW,Zhang AL,Owens MD,Head R,Cobiac L,Li CG,Hugel H,Story DF.Herbal medicine fordementia:a systematic review.Phytother Res 2009；23(4):447-59)。此外，已经进行一些实验，提示摄取唇形科(薄荷)植物包括蜜蜂花(lemon balm)(Kennedy DO,Scholey AB,Tildesley NT,Perry EK,Wesnes KA.Modulation of mood and cognitive performancefollowing acute administration of Melissa officinalis(lemon balm).PharmacolBiochem Behav 2002；72(4):953-64)、薰衣草(Moss M,Cook J,Wesnes K,DuckettP.Aromas of rosemary and lavender essential oils differentially affectcognition and mood in healthy adults.Int J Neurosci 2003；113(1):15-38)、鼠尾草(Tildesley NT,Kennedy DO,Perry EK,Ballard CG,Savelev S,Wesnes KA,ScholeyAB.Salvia lavandulaefolia(Spanish sage)enhances memory in healthy youngvolunteers.Pharmacol Biochem Behav 2003；75(3):669-74；Tildesley NT,Kennedy DO,Perry EK,Ballard CG,Wesnes KA,Scholey AB.Positive modulation of mood andcognitive performance following administration of acute doses of Salvialavandulaefolia essential oil to healthy young volunteers.Physiol Behav 2005；83(5):699-709；Scholey AB,Tildesley NT,Ballard CG,Wesnes KA,Tasker A,Perry EK,Kennedy DO.An extract of Salvia(sage)with anticholinesterase propertiesimproves memory and attention in healthy older volunteers.Psychopharmacology(Berl)2008；198(1):127-39)及迷迭香(Pengelly A,Snow J,Mills SY,Scholey A,WesnesK,Butler LR.Short-term study on the effects of rosemary on cognitive functionin an elderly population.J Med Food 2012；15(1):10-7)在健康志愿者中可以促进认知功能。唇形科植物精油中的化合物如薄荷酮、胡椒酮氧化物、樟脑、芳樟醇及多酚可能与广泛报道的这些植物提取物的生物学活性相关(Mimica-Dukic N,Bozin B,Sokovic M,Mihajlovic B,Matavulj M.Antimicrobial and antioxidant activities of threeMentha species essential oils.Planta Med 2003；69(5):413-9；Hussain AI,Anwar F,Nigam PS,Ashraf M,Gilani AH.Seasonal variation in content,chemicalcomposition and antimicrobial and cytotoxic activities of essential oils fromfour Mentha species.J Sci Food Agric 2010；90(11):1827-36)。然而，特异性研究留兰香对认知功能的作用的随机对照实验限于少量研究，提示留兰香调味的口香糖在健康志愿者中改善记忆；虽然这证据是相矛盾的(Baker JR,Bezance JB,Zellaby E,AggletonJP.Chewing gum can produce context-dependent effects upon memory.Appetite2004；43(2):207-10；Tucha O,Mecklinger L,Maier K,Hammerl M,Lange KW.Chewing gumdifferentially affects aspects of attention in healthy subjects.Appetite2004；42(3):327-9；Miles C,Johnson AJ.Chewing gum and context-dependent memoryeffects:a reexamination.Appetite 2007；48(2):154-8；Johnson AJ,Miles C.Chewinggum and context-dependent memory:the independent roles of chewing gum andmint flavour.Br J Psychol 2008；99(Pt 2):293-306)。

对在目前先导实验中提议的留兰香提取物进行了功效研究以评估其在加速衰老的SAMP8小鼠模型中改善学习和记忆的潜力(美国专利申请号13/962,609，2013年8月8日申请，在此并入参考)。给SAMP8小鼠施用留兰香提取物或载体对照。此外，50％SAMP8回交品系作为对照，其也接受载体。在治疗90天后，将小鼠在3个行为测验中检测，包括T-迷宫电击足底逃避实验(T-maze foot shock avoidance)、物体识别和压板实验。留兰香提取物在T-迷宫中改善习得(在16和32mg活性成分/kg体重)和保持(在所有剂量)。此外，具有迷迭香酸的留兰香在16和32mg/kg体重改善物体识别。小鼠的16和32mg活性成分/kg体重的剂量相应于人体91-180mg迷迭香酸或者含有大约15％活性成分的600-1200mg留兰香提取物的等价剂量。结果表明来自留兰香的提取物对于在SAMP8小鼠中随着年龄发生的学习和记忆缺陷具有有益作用。

根据OECD和FDA Redbook 2000指导，在Vanta Biosciences(Chennai,India)对目前人体临床先导实验中使用的留兰香提取物进行了安全性研究(含有15.4％[w/w]迷迭香酸的留兰香提取物)。进行的研究包括Ames细菌回复突变测定、染色体畸变诱导测定，及14天和90天口服管饲毒性研究。通过Ames细菌回复突变测定测量，基因毒性检测结果证实留兰香提取物在直至5000μg/平板的浓度无诱变性。此外，留兰香提取物在直至5000μg/ml的剂量水平未证实染色体畸变诱导潜力(未致染色体畸变)。

为雄性和雌性Sprague Dawley大鼠每日经口服施用14天剂量直至600mg迷迭香酸/kg体重/天的留兰香提取物是良好耐受的。检测到无实验项目诱导的副作用。发现在实验条件下关于实验项目的“无观测到的副作用水平(NOAEL)”为3896.1mg/kg体重/天的留兰香提取物。后续为雄性和雌性Sprague Dawley大鼠通过口服施用90天直至1948mg迷迭香酸/kg体重/天的剂量的留兰香提取物的90天研究是良好耐受的。发现在使用的实验条件和剂量下关于实验项目的“未观测到副作用水平(NOAEL)”为300mg迷迭香酸/kg体重/天(相应于1948.2mg/kg体重/天的留兰香提取物)。利用100-倍安全因子，这相应于19.48mg留兰香提取物/kg体重/天的等价剂量或者对于70kg体重的人而言为1364mg的留兰香提取物剂量，这高于在目前研究中建议的剂量。

目前，留兰香在饮料和糖果中广泛用作添加剂，且在美国作为天然调味品/香味剂、精油或天然提取物已经通常被认为是安全的(FDA 2012a.通常被认为是安全的物质：精油、油树脂(无溶剂)及天然提取物(包括蒸馏物).12CRF182.20；FDA 2012b.通常为认为是安全的物质：香料及其它天然调味品和香味剂.12CRF182.10)。然而，当以高于典型作为香味剂或调味品摄取的剂量摄取时，留兰香在人体中的安全性和耐受性尚未评估。因此，这项先导实验的目的是评估摄取900mg留兰香提取物的安全性和耐受性，以及在自我报告记忆缺损的健康男性和女性中对认知功能的作用。

发明概述

本发明包括施用含有迷迭香酸的植物提取物以改善记忆、推理、注意/专注、计划和认知相关行为(即集中注意、警觉、探究、动机等)。具有迷迭香酸的留兰香提取物示出在自我报告记忆缺损(急性或慢性)的人中改善记忆、推理、注意/专注和计划行为。

氧化损伤被认为是衰老过程的标志之一。在与衰老相关的认知缺损中存在的神经元功能障碍被认为大部分是由于氧化应激所致。在认知障碍如阿尔兹海默病中存在线粒体结构和功能损伤，提示渗透细胞和线粒体的抗氧化剂将提供针对氧化应激的最大保护作用。目前的研究设计为检测一种新的专利的基于抗氧化剂成分的迷迭香酸标准化的留兰香提取物在自我报告记忆缺损人体中是否可以改善。

留兰香提取物标准化为含有15％迷迭香酸(最小13％)。将此提取物以两个450mg胶囊形式给每个对象施用以提供900mg/天留兰香提取物(135mg迷迭香酸)。在本申请中使用的留兰香提取物可商购自Kemin Industries,Inc.(Des Moines,Iowa)及包含在商业产品FORTRA^TM Dry和Neumentix^TM Phenolic Complex K110-42中。在第0天施用前及在施用后2小时和4小时(急性评估)以及实验最后一天即第30天施用前和施用后2小时和4小时(慢性评估)评估对象。回答主观整体改善问卷，对象报告在30天后主观改善。对于三个可能的组任一组的分析，在30天期间平均个体或复合胃肠耐受性评分无显著差异。

使用多种认可的记忆、推理、注意/专注和计划的测试评估对象。基于急性评估，对象组，调整意向治疗和符合方案的(both modified intent to treat and per protocol)二者均示出在推理、注意和计划方面显著改善(p<0.1)，基于慢性评估，调整意向治疗和符合方案的二者均示出记忆、推理、专注和计划的显著改善(p<0.1)。

目前的结果表明留兰香提取物(迷迭香酸)在人体中对于记忆、推理、注意/专注和计划具有有益作用，无副作用。

附图简述

图1表示用于获得报告数据的非盲(open-label)临床实验略图。

图2是留兰香提取物补充在基线和30天结束时认知功能评分图表。

发明描述

本发明研究设计为检测留兰香提取物(具有RA)在自我报告记忆缺损的人类对象中是否可以改善记忆、推理、注意/专注和计划。监测不利事件并在研究结束时进行血液分析。

并入美国专利申请号62/050,523(2014年9月15日申请)、13/962,609(2013年8月13日申请)、13/367,863(2012年2月7日申请)及13/367,888(2012年2月2日申请)的全部内容作参考。

定义

如在本申请中所用，如下术语具有所示含义：

认知健康：认知健康是指总体脑、组织和血液供应的健康以及其在各种条件下适当发挥功能的能力。良好的认知健康对于脑以最佳表现进行所有意识过程是至关重要的；这些过程统称为认知，包括但不限于学习、直觉、判断、语言、注意、警觉、集中注意(focus)和记忆(长期和短期记忆)。由于衰老、疾病和/或其它认知损害导致的不良认知健康降低脑适当发挥功能的能力，导致认知功能和性能显著衰退。

认知功能：包含的神经学或符号运算的任何精神或智力过程，包括但不限于沟通、知觉、理解、推理、记忆、思考、意识、集中注意、注意、警觉、动机、下结论、执行功能、产生意象及判断能力。在动物模型系统中，认知功能可以本领域已知的各种常规方式测量，包括使用Morris水迷宫(MWM)、Barnes环形迷宫、高架放射臂迷宫、T-迷宫或者任何动物使用空间信息的其它迷宫。本领域已知的其它检测也可用于评定认知功能，如新物体识别和气味识别任务。

执行功能：调节、控制和处理其它认知过程的认知过程，如计划、工作记忆、注意、问题解决、语言推理、数学能力、抑制、心理灵活性、任务转换、起始、灵活性、视觉注意、算术技能、对新的及改变的环境的适应性以及行为监视。

学习：获得知识或技能的行为、过程或经验，特别是通过经验或条件的心理或行为修正。

记忆：得自贮存在个人意识中的过去的学习或经验的信息集合。一个信息片段，如经验的意识图像，贮存在记忆中。记住过去的经验或学习的信息的能力，包括高级的意识过程如学习、保留、回忆和识别以及得自在一些不同的脑部区域包括海马中神经元之间的化学改变。包括：(1)陈述学习或记忆，这是指可以自觉地回忆如事实或知识，(2)工作记忆，这是指主动操纵可操纵的意识中的多个瞬时信息片段，(3)参考记忆，这是指得自先前的(最近或遥远的)经验的信息，(4)识别记忆，这是识别先前遇到的事件、物体或人的能力，及(5)联想记忆，这是学习和记住不相关项目之间关系的能力。这些记忆均具有即时、短期和长期成分。即时记忆仅持续几秒钟。短期记忆贮存已经最低限度加工的信息，且只可持续几分钟，如记住电话号码只够使用其的时间长度。只有当重复使用该信息促进神经化学改变使其保留时，短期记忆被转移至长期记忆，其可持续多年。

治疗有效量：本发明的化合物或其组合物或衍生物当给对象施用时具有指定治疗作用的量。通过施用一次剂量不必需发生全部治疗作用，可以只在施用一系列剂量之后发生。因此，治疗有效量可以在一或多次施用中施用。为对象所需的精确的有效量依赖于例如对象的大小、健康和年龄、认知缺损的性质和程度，以及选择用于施用的治疗剂或治疗剂组合，以及施用模式。技术人员可通过常规实验易于确定指定情境的有效量。在一个实施方案中，至少一种如本文所述的唇形科植物提取物如RA以每日一次频率或者一日多次如每日2、3或4次施用。

治疗：尝试改变被治疗的个体、动物或细胞的自然进程的临床干预，可以预防性或者在临床病理学进程期间进行。希望的作用包括预防疾病的发生或复发，减轻症状，或者减小疾病的任何直接或间接的病理学结果，降低疾病进展速度，改善或缓和疾病状态，以及缓解或改善预后。条件或对象是指采取步骤以获得有益的或希望的结果，包括临床结果。有益的或希望的临床结果包括但不限于增强、改善或维持认知健康和/或功能，减轻或改善与轻度认知损伤或年龄相关认知损伤相关的一或多个症状，延缓或减慢这种损伤，减轻、缓和或稳定这种损伤，及其它有益结果，如在年龄相关认知损伤或处于该危险中的对象中改善认知功能或者降低认知功能衰退速度。在优选的实施方案中，这些术语包括预防或治疗认知障碍如阅读障碍、失用症、注意力缺陷多动症、注意力缺陷自闭症、阿尔兹海默病、帕金森症或者中风，或者其它执行功能障碍。

在本发明的优选实施方案中，迷迭香酸的剂量范围是9mg/天至7,000mg/天及在这个限度之间的所有数值，包括例如(没有限制或例外)10、10.4、13.2、21.7、33.6、48.9、137.7、433.2、913.2、1254.6、3555.3、5021.3和6990.9mg/天。换句话说，在本发明的优选实施方案中，剂量可以采用任何值“abcd”mg/天，其中a选自数字0、1、2、3、4、5、6和7，b、c和d单独地选自数字0、1、2、3、4、5、6、7、8和9，除外的是如果a、b和c均是0，d不能低于9。

在本文中使用的范围的情况下，仅描述范围的终点以避免冗长描述及描述在此范围内包含的每个和全部数值。可以选择在列举的终点之间的任何合适的中间值和范围。例如，如果引用范围在0.1-1.0之间，包括所有中间值(例如0.2、0.3.6.3、0.815等)及所有中间范围(例如0.2-0.5、0.54-0.913等)。

实施例1

氧化损伤被认为是衰老过程的标志之一[Harman D(2002)Alzheimer’s disease:role of aging in pathogenesis.Ann N Y Acad Sci.959,384-395]。与衰老相关的疾病如阿尔兹海默病中存在的神经元功能障碍被认为大部分是氧化应激所致[Markesbery WR(1997)Oxidative stress hypothesis in Alzheimer’s disease.Free Radic BiolMed.23,134-147；Polidori MC,Griffiths HR,Mariani E,Mecocci P(2007)Hallmarks ofprotein oxidative damage in neurodegenerative diseases:focus on Alzheimer’sdisease.Amino Acids.32,553-559]。在阿尔兹海默病中存在线粒体的结构和功能的双重损伤提示易于渗透细胞和线粒体的抗氧化剂将提供针对氧化应激最大的保护作用[Skulachev VP,Anisimov VN,Antonenko YN,Bakeeva LE,Chernyak BV,Erichev VP,Filendo OF,Kalinia NI,Kapelko VI,Kolosova NG,Kopin BP,Korshunova GA,Lichinitser MR,Obukhova LA,Pasyukova EG,Pisarenko OI,Roginsky VA,Ruuge EK,Senin II,Severina II,Skulachev MV,Spivak IM,Tashlitsky VN,Tkachuk VA,Vyssokikh MY,Yaguzhinsky LS,Zorov DB(2009)An attempt to prevent senescence:amitochondrial approach.Biochim Biophys Acta.1787,437-461；Suh JH,Shigeno ET,Morrow JD,Cox B,Rocha AE,Frei B,Hagen TM(2001)Oxidative stress in the agingrat heart is reversed by dietary supplementation with(R)-(alpha)-lipoicacid.FASEB J.15,700-706]。

已经发现迷迭香酸(RA)针对氧化应激具有神经保护性和预防性作用[Fadel O,ElKirat K,Morandat S(2011)The natural antioxidant rosmarinic acid spontaneouslypenetrates membranes to inhibit lipid peroxidantion in situ.Biochim BiophysActa 1808,2973-2980；Fallarini S,Miglio G,Paoletti T,Minassi A,Amoruso A,Bardelli C,Brunelleschi S,Lombardi G(2009)Clovamide and rosmarinic acidinduce neuroprotective effects in invitro models of neuronal death.Br JPharmacol 157,1072-1084。针对氧化应激和炎症的保护作用于衰老疾病中改善的记忆相关[Farr,et al.,2012]。迷迭香酸改善了Morris水迷宫空间任务中的记忆[Park DH,ParkSJ,Kim JM,Jung WY,Ryu JH(2010)Subchronic administration of rosmarinic acid,anatural prolyl oligopeptidase inhibitor,enhances cognitiveperformance.Fitoterapia 81,644-648]。

记忆分为两种主要类别，陈述性记忆(或外显记忆)和程序性记忆(或內隐记忆)。陈述性记忆进一步分为语义记忆(事实或含义)和情景记忆(特定经历)。语义记忆通常得自情景记忆。陈述性记忆被认为是由海马编码的，而程序性记忆被认为是由纹状体内的尾状核结构编码的。程序性记忆或內隐记忆来自学习应答与奖励之间的关联。程序性记忆通常以陈述性记忆开始直至其成为根深蒂固或习惯。

材料和方法

对象

在治疗开始时，实验对象是11个自我报告记忆缺损的50-70岁男性和女性。合格的参与者是73％女性和27％男性，平均年龄和体重指数(BMI)分别为58.7岁和27.4kg/m²。在Biofortis Clinical Research,Addison,IL进行这些研究。

研究设计

非盲研究包括一项电话筛选(TS；附件1–参考在美国专利申请号61/933,583中描述的那些附件，所述专利在此以其全部内容并入参考)；一项筛选访问(访问1a/b；第-7天)；一项基线访问(访问2；第0天)；及一项测试访问(访问3；第30天)。所有临床访问均具有±3天窗口期。在TS(附件1)，给予纸质记忆障碍调查问卷(MAC-Q；Crook 1992；附件3)以评估自我报告记忆缺损。合格的对象(MAC-Q评分≥25；Dunbar 2007)进入临床(访问1a，第-7天)，空腹(在开始抽血前10-14小时，仅饮水)，提供知情同意书并给予纸质简易精神状态量表(MMSE；Folstein 1975,Mitrushina 1991)。合格对象(MMSE评分≥24；Dunbar 2007)继续进行访问1b(第-7天)，经历其余的筛选访问程序，包括评估用药史、纳入和排除标准、之前和现有的药物/补剂使用情况、身高、体重及生命体征。如果对象正常服用降压药，该药物应在抽血之前在诊所服用。在施用降压药之后至少30分钟评估生命体征。在早晨收集空腹(10-14小时，仅饮水)血样，进行化学、血液学和脂质分析，样品备份以进行可能的进一步非遗传性代谢指征分析。小于60岁的女性对象在临床进行尿妊娠检测。对象进行至少两次计算机认知测试组合，每次～1小时，间隔≥1小时，以进行训练。允许最多四次测试组合，以在基线访问(访问2，第0天；附件5)时在第一次计算机认知测试之前保证对象熟悉测试程序及保证最佳性能水平(Owen 2010；附件5和6；美国专利申请号61/933,583图2-4)。提供书面研究说明[在每次测试访问之前和期间(访问2和3；第0和30天)遵守禁食(10-14小时，仅饮水)；避免剧烈身体运动(24小时)，避免摄取酒精饮料(24小时)，避免咖啡因摄取(10-14小时)和使用烟草(1小时)，及维持习惯饮食(包括摄取咖啡因和酒精)、身体活动模式、睡眠时间以及服用睡眠辅助药物/补剂]。此外，如果对象正常服用睡眠辅助药物/补剂，建议对象保持在每次测试访问(访问2和3；第0和30天)之前的晚上一致服用睡眠辅助药物/补剂。在离开诊所之前要求对象按期进行访问2(第0天)。

11个合格对象登记为900mg留兰香提取物组，随后给予纸质胃肠道(GI)耐受性问卷(附件8)及第一次计算机认知测试t＝-1.0小时±5分钟，其中t＝0小时是研究产品摄取时间。在t＝0小时，给对象施用所述研究产品，随后立即给予标准早餐食物。对象在15分钟内摄入全部食物。在访问3(第30天)重复这个标准早餐食物/量(即提供在第0天访问2的早餐的精确食物/量)。在完成标准早餐食物之后，为对象提供标准量的水。在整个测试访问期间允许对象任意饮水，除了正在进行计算机认知测试时。记录实际的水摄入量。

结果变量主要结果变量

联合主要结果变量是估计从基线(访问2，第0天)至治疗结束时(访问3，第30天)得自胃肠道(GI)耐受性问卷的胃肠道(GI)耐受性合成分数的变化(恶心，胀气/腹胀，胃肠胀气，GI痉挛，便秘，及腹泻/稀便)及评估在治疗结束时(访问3，第30天)获得的整体SGI合成分数(主观认知评估)。

次要结果变量

次要结果变量包括：(a)个体GI耐受性问卷评分从基线至治疗结束(第30天)时的变化(恶心，胀气/腹胀，胃肠胀气，GI痉挛，及腹泻/稀便)；及(b)急性(从t＝-1至t＝2.25和4.0小时的差异)和(c)慢性(从访问2第0天至访问3第30天的差异)认知功能个体测试得分变化[原始和表现(performance)(百分率)评级]，使用可公开获得的计算机认知评估工具，由Medical Research Council Cognition and Brain Sciences Unit设计和验证(Owen2010；cambridgebrainsciences.com)，包括记忆：数字广度和成对关联，推理：DoubleTrouble and Odd One Out，注意/专注(旋转和多边形)和计划(空间搜索和空间滑块)。在治疗结束时获取个体关于记忆、注意和思考速度的SGI评分(访问3，第30天)。

安全性和耐受性测量

安全性和耐受性通过评估治疗-突发性不利事件(AE)、体重、生命体征和临床实验室检测改变而评定。

分析

在数据库锁定之前产生统计学分析计划并许可。所有统计学分析均使用针对Windows的SAS进行(Cary,NC)。安全性人群包括登记进入研究并摄入至少一剂研究产品的所有对象。修改的意向治疗(MITT)人群包含安全性人群中包含的所有对象，其提供在治疗期间的至少一次治疗期结果数据点。此外，符合方案(PP)群体由MITT群的子集组成。由于如下原因将对象从PP群中排除：违反可影响反应评估的纳入或排除标准；不遵守方案的对象，包括但不限于失约、摄入低于80％或高于120％的研究产品，在任何测试访问(访问2和3，第0天和30天)时总体上不能摄入研究产品，及在研究期间使用被禁止的药物或认为改变结果变量的任何产品。

除非特别指出，所有的显著性测试均在α<0.1，双侧进行。使用配对t-检验或Wilcoxon符号秩检验，根据情况检验所述变化是否具有统计学意义。目的是获得在研究终点关于平均数/中位数和变异性信息。

安全性通过由对象在全部治疗期临床访问报告的AE以及生命体征测量、实验室数值及体重的变化而评定。AE由世界卫生组织(WHO)词典编码。估算缺失数据及仅将观测到的数据包含在统计学分析中。

样本大小.

11个对象样本登记在本研究中。

研究设计和程序

本研究设计的示意图在图1中示出。

这项非盲研究包括一项电话筛选(TS；附件1)；一项筛选访问(访问1a/b；第-7天)；一项基线访问(访问2；第0天)；及一项测试访问(访问3；第30天)。所有临床访问均有±3天窗口期。在TS，给予纸质记忆障碍调查问卷(MAC-Q；Crook 1992；附件3)以评估自我报告记忆缺损。合格的对象(MAC-Q评分≥25；Dunbar 2007)进入临床(访问1a，第-7天)，空腹(在开始抽血前10-14小时，仅饮水)，提供知情同意书并给予纸质简易精神状态量表(MMSE；Folstein 1975,Mitrushina 1991)。合格对象(MMSE评分≥24；Dunbar 2007)继续进行访问1b(第-7天)，经历剩余的筛选访问程序，包括评估用药史、纳入和排除标准、之前和目前的药物/补剂使用情况、身高、体重和生命体征。如果对象正常服用降压药，在抽血之前应在诊所服用该药。生命体征在施用降压药后至少30分钟评估。在早晨收集空腹(10-14小时，仅饮水)血样进行化学、血液学和脂质分析，样品备份贮存以进行可能的进一步分析非遗传性代谢指征。小于60岁的女性对象在临床进行尿妊娠检测。对象进行至少两次实践计算机认知测试组合，每次～1小时，间隔≥1小时，以进行训练。允许进行最多四次测试组合，以保证对象熟悉测试程序及在基线访问(访问2，第0天；附件5)时在第一次计算机认知测试(Owen2010)之前保证最佳性能水平。提供书面研究说明书[在每次测试访问之前和期间(访问2和3；第0和30天)遵守禁食(10-14小时，仅饮水)；避免剧烈身体运动(24小时)，避免摄取酒精饮料(24小时)，避免咖啡因摄取(10-14小时)和使用烟草(1小时)，及维持习惯饮食(包括摄取咖啡因和酒精)、身体活动模式、睡眠时间以及服用睡眠辅助药物/补剂]。如果对象的夜间平均睡眠时间存在大于±2小时的偏差(根据筛选访问报告)，测试访问可改期。此外，如果对象正常服用睡眠辅助药物/补剂，建议对象保持在每次测试访问(访问2和3；第0和30天)之前的晚上一致服用睡眠辅助药物/补剂。在离开诊所之前，要求对象按期进行访问2(第0天)。

在访问2(第0±3天)，合格对象空腹到达诊所(10-14小时，仅饮水，固定时间为06:00-09:30期间的t＝-1.25小时时间点。在临床访问程序之后(即评估纳入和排除标准、相伴的药物/补剂使用情况、体重和生命指征)，询问对象遵守前述研究说明书的情况。评估不利事件(AE)，询问睡眠时间，以评估对象的夜间平均睡眠时间是否具有超过±2小时偏差，根据筛选访问报告(访问1b；第-7天)。如果在访问2(第0天)之前那天对象没有100％遵守研究说明书，建议对象需要适当遵守剩余的测试访问及测试访问可以改期。如果对象在早晨正常服用降压药，在生命体征检测之前30分钟在临床服用该药物。合格对象登记为900mg留兰香提取物组，随后给予纸质胃肠道(GI)耐受性问卷(附件8)及在t＝-1.0小时±5分钟进行第一次计算机认知测试(附件5)，其中t＝0小时是摄入研究产品的时间。在t＝0小时，给对象施用研究产品，随后立即给予标准早餐食物(附件7)。对象在15分钟内摄入全部食物。在访问3(第30天)重复该标准早餐食物/量(即提供在访问2第0天早餐的精确食物/量。在完成标准早餐食物摄入后，为对象提供标准量的水。允许对象在整个测试访问期间随意饮水，除了当在进行计算机认知测试时。记录实际的水摄入量。

在t＝2.25和4.0小时±5分钟，其中t＝0小时是摄入研究产品时间，给予计算机认知测试(Owen 2010；附件5和6)。在t＝4小时±5分钟认知功能测试后，评估AE，及提供书面研究说明书[在随后的访问之前和期间(访问3；第30天)遵守禁食(10-14小时，仅饮水)；避免剧烈身体运动(24小时)，避免摄取酒精饮料(24小时)，避免咖啡因摄取(10-14小时)和使用烟草(1小时)，及维持习惯饮食(包括摄取咖啡因和酒精)、身体活动模式、睡眠时间以及服用睡眠辅助药物/补剂]。如果对象夜间平均睡眠时间有高于±2小时的偏差，测试访问改期。此外，如果对象在访问2(第0天)之前服用睡眠辅助药物/补剂，建议对象在访问3(第30天)前夜间保持一致服用。

为对象分发具有说明书的研究产品瓶(从其中给予早晨服用剂量)，在早餐时服用两粒胶囊/天直至下一次访问(访问3，第30天)。也指导对象在每日研究日记(附件11)中记录研究产品摄入和睡眠时间，并提供一药丸盒以帮助每天遵守执行。此外，提醒对象在整个实验期间每周通过电话联系以保证遵守研究产品、研究说明书，及评估每日行为习惯的任何AE和/或改变(即药物/补剂、饮食、睡眠，和/或锻炼)。如果在随后测试访问的3天内错过服用研究产品剂量，则改期进行测试访问。

在访问3(第30±3天)，对象在06:00-09:30时间到达诊所。在t＝-1.25小时±5分钟收集空腹(10-14小时，仅饮水)血样，以进行化学、血液学和脂质分析。如果对象在早晨正常服用药物，该药物在生命体征测量之前30分钟在诊所服用。进行临床访问程序(即评估纳入和排除标准、相伴药物/补剂使用情况、体重和生命体征)，询问对象的研究说明书遵守情况及评估AE。收集研究产品和研究日记(附件11)，并确定遵守情况。在t＝-1.0小时±5分钟给予纸质GI耐受性问卷、纸质对象整体改善问卷(SGI；Dunbar 2011,Lieberman 2013；附件8和9)及计算机认知测试(Owen 2011；附件5和6)，其中t＝0是研究产品摄入时间。在t＝0小时，给对象施用指定的研究产品，随后立即给予标准早餐食物(提供在访问2第0天的食物/量)。对象在15分钟内摄入全部食物，包括研究产品。在访问3(第30天)的研究产品和标准早餐食物是在访问2(第0天)确定的t＝0小时的±30分钟内给予。在t＝2.25和4.0小时±5分钟，其中t＝0小时是研究产品摄入时间，进行计算机认知测试(Owen 2010；附件5和6)。在完成标准早餐食物后为对象提供标准量的水。允许对象在整个测试访问期间随意饮水，除了正在进行计算机认知测试时。记录实际水摄入量。在t＝4.0小时±5分钟认知测试之后，评估AE。

研究样本

每个对象均需要符合在基线所有如下纳入标准及无一排除标准以参与这项研究。

纳入标准

1.对象是男性或女性，年龄为50-70岁，包括50和70岁；

2.对象符合基于MAC-Q(评分≥25；Crook 1992)自我报告记忆缺损的标准；

3.在访问1b(第-7天)时对象体重指数(BMI)为18.5-35.0kg/m²，包括端点；

4.对象具有至少高中毕业或同等学历；

5.在研究期间对象愿意保持习惯饮食(包括咖啡因和酒精)和身体活动模式，除了在每次测试(访问2和3，第0和30天)之前24小时；

6.对象无阻止其实现研究要求的健康问题，由研究人员基于病史和常规实验室检测结果判断；

7.在测试访问之前至少1小时及整个期间[访问2和3(第0和30天)直至7小时]对象愿意舒适地戒除烟草制品；

8.对象愿意在测试访问时(访问2和3；第0和30天)及在整个研究期间在家每天吃早餐；

9.对象在所有临床访问(访问1b、2和3；第-7、0和30天)之前(10-14小时)及整个期间愿意且能舒适地戒除咖啡因；

10.对象在所有临床访问(访问1b、2和3；第-7、0和30天)之前24小时愿意戒除摄入酒精及避免剧烈身体运动；

11.对象由研究人员基于病史判断处于一般良好健康状况；

12.对象理解研究程序并在提供的知情同意书上签字以参与研究，及授权研究人员发布相关受保护的健康信息。

排除标准

1.对象具有临床意义的异常实验室检查结果，包括但不限于在访问1b(第-7天)时肌酐≥1.5mg/dL及ALT或AST≥1.5×正常高水平。临床相关实验室检测结果基于研究人员判断作为AE。劝告对象由其初级保健医生随访；

2.对象不能理解和/或完全进行实际测试；

3.对象在访问1b(第-7天；Folstein 1995；Mitrushina 1991,Dunbar 2007)的MMSE评分≤23；

4.对象经历精神错乱、思维混乱或者其它意识紊乱的迹象；

5.对象在访问1b(第-7天)之前2年具有经诊断的抑郁症；

6.对象具有可以产生认知退化的任何神经病学疾病，包括但不限于阿尔兹海默病、帕金森症、中风、颅内出血、局部脑损伤包括肿瘤，以及正常压力脑积水；

7.对象具有任何感染性或炎症性脑病病史，包括病毒、真菌或梅毒病原性脑病；

8.对象具有反复轻微脑损伤(例如在拳击中)或者单一损伤导致意识不清1小时或以上时间的病史；

9.对象在研究期间具有预约住院治疗计划(例如预约整容手术；

10.对象具有不可控的高血压(收缩压≥160mm Hg或者舒张压≥100mm Hg，根据在访问1b(第-7天)时测量的平均血压限定)。对于其血压超过在访问1b时的任一截止点的对象允许在访问2(第0天)之前单独一天进行重新检测，由研究人员判断进行；

11.对象具有临床相关心脏、肾、肝、内分泌(包括糖尿病)、肺、胆囊、胃肠、胰腺或者神经学疾病的病史或存在这些疾病；

12.对象在前两年具有癌症病史或存在癌症，除了非黑素瘤皮肤癌；

13.在任何临床访问时对象具有活动性感染或者感染迹象/症状。临床访问改期进行，允许对象无任何类型全身性感染的症状至少5天；

14.对象近期使用抗生素(在任何临床访问时的5天内)；

15.对象是重度烟民，根据在访问1b(第-7天)之前3个月内吸烟史>1包/天限定；

16.在访问1b(第-7天)的2周内对象是重度咖啡因饮料消费者(得自含有咖啡因产品的>400mg咖啡因/天)；

17.在每次测试访问(访问2和3；第0和30天)之前那天对象不一致地使用睡眠辅助产品。如果发生这种情况，改期进行测试访问；

18.对象具有睡眠障碍(例如睡眠呼吸暂停)或者在晚上睡眠时间不规律的职业(例如三班倒班的工人)；

19.对象在测试访问2和3(第0和30天)之前一夜与其正常睡眠时间具有±2小时偏差。发生这种情况应改期测试访问(个人通讯:Patrick O'Connor,University ofGeorgia,and Kevin Maki,Biofortis)；

20.对象对所述研究产品或提供的标准饮食的任何成分已知过敏或具有敏感性；

21.对象在访问1b(第-7天)的4周内及整个研究期间具有精神药物(包括抗抑郁药和镇定剂)使用史；

22.在访问1b(第-7天)的2周内及整个研究期间使用抗氧化剂或具有影响认知功能的潜力的其它补剂；

23.对象具有近期(访问1b第-7天的12个月内)滥用酒精或滥用药物历史或强烈可能性。酒精滥用定义为>14次饮酒/周(1次饮酒＝12盎司啤酒，5盎司葡萄酒，或者1¹/₂盎司蒸馏酒)。

24.对象是妊娠女性、计划在研究期间妊娠、哺乳期，或者可能分娩及在研究期间不愿意使用医学许可的避孕形式。避孕方法必须记录在源文件中；

25.对象在筛选访问(访问1a，第-7天)之前30天内或者5个消除半衰期(无论哪个更长)已经暴露于尚未注册的药物；

26.个体具有研究人员认为干扰其提供知情同意、遵守研究方案的能力的病症，这些病症可以扰乱研究结果或者置对象于不合理危险之中。

排除的药物和产品

治疗精神疾病的药物在访问1b(第-7天)的4周内不被允许(附件2)。此外，在访问1b(第-7天)的2周内及在整个研究期间排除使用具有影响认知功能的潜力的抗氧化剂或其它补剂。抗生素治疗需要在任何临床访问(访问1b、2和3；第-7、0和30天)之前至少5天内完成。对象也被指示在任何临床访问(访问1a/1b、2和3；第-7、0、30天)之前10-14小时及在每次临床访问期间避免咖啡因和含有咖啡因的产品。此外，建议对象在任何测试访问(访问2和3；第0和30天)之前及期间避免酒精(24小时)、剧烈身体运动(24小时)和使用烟草(1小时)。

“根据需要”服用的药物在任何临床访问(访问1b至3；第-7天至30天)的早上不服药。对象正常在早上服用的任何必需的药物在诊所在研究人员面前根据研究人员的判断及如下关于降压药的指导而服用：

·访问1b(第-7天)：如果对象正常服用降压药，该药物在诊所在抽取血液进行化学、血液学和脂质分析之前服用。生命体征在给予药物后至少30分钟评定。

·访问2和3(第0天和30天)：如果对象正常在早上服药，该药物在生命体征测量之前30分钟在诊所服用。如果当评定生命体征时对象血压升高，在服用降压药后大约30分钟重复测量血压。监测服药时间。

研究产品

描述

每天900毫克(900mg/d)专利留兰香提取物(2个450mg胶囊)标准化为含有67.5mg迷迭香酸/胶囊。

第一次和最后一次施用研究产品在临床在访问2和3(第0天和30天)与标准早餐一起给予。剩余的研究产品(两个胶囊)在家自己服用。关于研究产品的信息可见于附件10。

研究产品的贮存和分发/使用

将研究产品贮存在锁闭的干燥的安全位置(59-86°F)。研究产品仅根据这个方案及在研究人员的监督下使用。在研究完结时，所有未使用的研究产品返给赞助者。

对象在访问2(第0天)接受80个胶囊。这将为对象提供足够的研究产品以允许灵活按计划进行后续的临床访问。要求对象在访问3(第30天)返回所有未使用的研究产品。

临床测量

实验室测量

所有临床实验室测量的程序均在Elmhurst Memorial Hospital Laboratory(Elmhurst,IL)及其它实验室供应商的实验手册中详细描述。正常的参考范围在实验室说明书中提供。

进行如下分析作为空腹(10-14小时)化学分析的一部分：葡萄糖、钠、钾、氯化物、CO₂、BUN、肌酐、钙、渗透性、AST、ALT、碱性磷酸酶、总胆红素、总蛋白、白蛋白(附件4)。将样品备份冷冻贮存以进行可能的随后非遗传性标志物的分析。

进行如下分析作为空腹(10-14小时)血液学测量的一部分：WBC、分化WBC、RBC、血红蛋白、血细胞比容和血小板计数。

分析空腹(10-14小时)脂质(TC、LDL-C、HDL-C、非-HDL-C和TG)，根据疾病控制和预防中心及国家心、肺及血液学会的标准化程序进行。LDL-C及浓度(mg/dL)根据如下Friedewald等式(Friedewald 1972)计算：

LDL-C＝TC–HDL-C–TG/5

由于当TG浓度高于400mg/dL时这个等式是无效的，因此在这些情况下无LDL-C值计算。将样品冷冻备份贮存以进行可能的后续非遗传性标志的分析。

临床相关实验室检测结果根据研究人员的判断作为AE。

临床访问

临床访问评估包括身高(仅访问1b)、体重、相伴使用的药物/补剂，及在适当情况中评估纳入/排除标准。临床访问具有±3天窗口期。

标准化生命体征测量包括静息血压和脉搏，每次测量均使用自动血压测量装置使用同一上臂测量。在对象坐下至少5分钟后获得血压。要求对象在测量前60分钟期间避免吸烟。使用合适大小的袖带(袖带内气囊必须环绕≥80％上臂)测量两次收缩压和舒张压，间隔至少1分钟。记录两次测量结果。如果在筛选访问(访问1b,第-7天)时发生血压升高，允许在另一天再检测。使用自动血压测量装置测量两次心率。

筛选记忆问卷

在电话筛选期间(访问1a第-7天的2周内)，给予对象纸质MAC-Q，设计6-点问题以评定自我报告记忆缺损(排除评分≤24的对象；附件3；Crook 1992,Dunbar 2007)。合格对象继续进行访问1a(第-7天)，提供知情同意书，随后给予纸质MMSE(访问1a；第-7天；Folstein 1975,Mitrushina1991)。

MMSE是简单的30-点问卷测试，用于筛选认知缺损。该问卷将筛选排除具有痴呆的个体(排除评分≤23；Dunbar 2007)。该问卷花费大约10分钟用算术、记忆和方向领域支配和测量认知功能。

研究说明/问询

在每次临床访问结束时提供书面研究说明[在每次临床访问(访问1a、2和3；第-7、0和30天)之前及期间遵守空腹(10-14小时，仅饮水)；避免剧烈身体运动(24小时)、避免摄入酒精饮料(24小时)、避免咖啡因摄入(10-14小时)和烟草使用(1小时)，维持习惯饮食(包括摄取咖啡因和酒精)、身体运动模式、睡眠时间和摄入睡眠辅助药物/补剂]为随后的临床访问做准备。如果夜间对象平均睡眠时间具有超过±2小时偏差(根据筛选访问报告)，改期进行测试访问。此外，如果对象在访问2(第0天)前夜服用睡眠辅助药物/补剂，建议对象在访问3(第30天)保持一致服用。在每周一次电话联系回顾该研究说明书。

不利事件评定

AE评定在基线和最终测试访问(访问2和3；第0天和30天)开始时进行，及在t＝4.0小时完成最终认知测试后在这些访问结束时评定。在每周一次的电话联系中评定AE。使用开放式问题询问发生的AE。在访问2和3(第0天和30天)开始时，研究人员询问关于任何重大改变/生活压力事件。在重大生活改变/压力情况中(例如家族成员死亡)，如果根据研究人员的见解可能影响认知功能，则访问可以改期进行。

认知测试熟悉

每期实践测试费时大约1小时，每个间隔≥1小时。实践测试是为训练目的，以使得每个对象熟悉测试程序。

认知测试

Cambridge Brain Sciences计算机测试是可公开获得的认知评估工具，由Medical Research Council and Brain Sciences Unit认证(Cambridge,UK；Owen 2010)。认知测试包括在t＝-1.0、2.25和4.0小时±5分钟评定记忆(数字广度和成对关联)，推理(Double Trouble and Odd One Out)，注意/专注(旋转和多边形)及计划(空间搜索和空间滑块；附件5和6)，共三次认知测试组合，其中t＝0小时是研究产品摄入时间。每次测试给予和测试访问，对象在相同房间内检测。测试及测试访问期间的环境条件如灯光、供热和噪音尽可能保持一致。

研究产品/标准早餐给予

在测试当天(访问2和3；第0天和30天)，合格的对象空腹(10-14小时)在06:00-09:30时间到达诊所。在临床访问程序和认知功能测试/问卷调查之后，在t＝0小时给予对象其指定的研究产品，随后立即给予标准早餐食物。对象在15分钟内摄入全部食物，包括研究产品。在访问3(第30天)的研究产品和标准早餐食物在访问2(第0天)确定的t＝0小时时间的±30分钟内给予，菜单是重复的(即访问3的精确食物/量是第0天的早餐)。在标准早餐食物之后，为对象提供标准量的水。允许对象在整个测试访问期间随意饮水，除了当进行计算机认知测试时。记录实际水摄入量。

研究日记

对象完成每日的研究日记以记录睡眠时间和研究产品摄入(在访问2第0天直至研究结束；附件11)。

胃肠道耐受性问卷

在访问2和3(第0天和第30天；Maki 2008)在摄入标准早餐食物/研究产品之前给予纸质GI耐受性问卷。对象回答问题以评定选择的GI症状的存在及严重度，包括胀气/腹胀、恶心、胃肠胀气、腹泻/稀便、便秘和GI痉挛。

对象整体改善问卷

在访问3(第30天；附件9)在t＝-1.0小时±5分钟给予对象纸质SGI问卷(Dunbar2011,Lieberman 2013)，其中t＝0小时是研究产品摄入时间。要求对象回答与记忆、注意和思考速度相关的整体改善的问题。

分发研究产品

为对象分发研究产品(从中给予早上剂量)与说明书，在30天治疗期每天与早餐一起服用两粒胶囊。在访问2(第0天；附件11)为对象分发每日研究日记。指示对象记录研究产品摄入情况。为每个对象提供药丸盒以帮助每日遵守方案。

电话联系

在实验期间每周一次与对象电话联系，以保证遵守研究产品、研究说明，及评定每日行为习惯中的任何AE和/或改变(即药物/补剂、饮食、睡眠和/或运动)。电话联系的文件记录在对象源文件和个案报告形式中(CRF)。

测试当天时间表

数据分析和统计学方法

结果分析

除非特别指出，所有测试的统计学意义均在α<0.1、双侧进行。

在所有时间点和所有变化(在检验当天和期间)的数值进行描述性统计。使用配对t-检验或Wilcoxon符号秩检验，根据情况检验所述变化是否具有统计学意义。然而，这是先导性研究，应理解这个检验功效对于统计学检验是不足够的。目的是获得关于在研究终点的平均数/中位数和变异性的信息。

安全性和耐受性分析

安全性和耐受性通过在所有治疗期临床访问时对象报告的AE以及生命体征测量、实验室数值和体重变化来评定。AE由世界卫生组织(WHO)词典编码。缺失数据不估算及仅将观测到的数据包含在统计学分析中。

结果

总之，在这个实验中筛选20个参与者，11个对象符合纳入标准且无一符合排除标准。在研究中登记的11个对象中，一个对象在基线测试访问后由于不能理解认知功能测试而撤回同意书，从PP样本中除去。第二个对象由于134％摄入研究产品而从PP样本中除去。一个不利事件-背痛-在治疗期间报告，编码为与研究产品摄入无关。

探索性结果分析中包含的MITT样本(N＝11)和对象子集(n＝5)的基线特征包括在表2中。

表2：总体和子集样本中对象的基线特征

样本包含27％男性和73％女性，平均年龄和BMI分别为58.7±1.6岁和27.4±1.0kg/m²。对于MITT和子集样本，研究产品摄入平均整体顺从性分别为103.2±1.6％和98.3±1.0％。在MITT样本中符合MAC-Q和MMSE的平均得分分别为29.7±1.0％和28.9±0.4％。

得自评估在30天治疗期GI症状的存在与严重度的变化的GI耐受性问卷的平均得分在表3中示出。

表3：在基线、治疗结束时的胃肠道耐受性问卷得分及应答留兰香补剂自基线的变 化 ¹

缩写：EOT，治疗结束；SEM，平均数标准误差。

¹GI耐受性问卷合成分数是根据每个测试条件以每个参数的评级总和计算，编码为：-2＝低于平时；-1＝略低于平时；0＝未经历/平时，1＝略高于平时，2＝远高于平时。

²基线是指在第0天给药前数值。

³治疗结束(EOT)是指在第30天给药前数值。

⁴P-值是从配对t-检验或Wilcoxon符号秩检验中在基线与治疗结束之间计算。

⁵合成分数是高于或等于0的所有评级的总和。

留兰香提取物的摄入不显著改变在基线与治疗结束之间的个体GI症状(便秘、痉挛、胃肠胀气、胀气/腹胀、稀便和恶心)(对于所有对比P＝1.000)。此外，GI耐受性合成分数在基线与治疗结束之间不显著改变(P＝1.000)。在三个认知领域(记忆、注意和思考速度)评定从基线的变化的SGI问卷的平均得分在表4中示出。

表4：在治疗结束时应答留兰香补剂的对象认知问卷整体印象量表得分 ¹

缩写：SEM，平均数标准误差。

¹在30天治疗结束时给予对象认知问卷整体印象量表(SGI)，要求对象对比其目前状况与纳入研究之前的状况。得分编码为：1＝非常多的改善，2＝较多改善，3＝最低程度改善，4＝无变化，5＝最低程度恶化，6＝较多恶化，7＝非常多的恶化。

²P-值从Wilcoxon符号秩检验中计算，检验在治疗结束时与4(无变化；n＝10)的差异。

在留兰香提取物治疗30天后SGI问卷的平均合成分数略微改善(3.5±0.3，得分4表示“无变化”；P＝0.063)。在PP样本中平均合成分数中的差异不再显著(与得分4相比)(P＝0.125)。在SGI问卷中个体评级中无显著差异。

关于在基线和治疗结束时生命体征、空腹脂蛋白脂质的平均数和中位数及自基线的改变在表5中示出。

表5：在基线、治疗结束时的生命体征和空腹脂蛋白脂质及应答留兰香补剂的自基 线的变化

缩写：bpm，每分钟心跳；DBP，舒张压；HDL-C，高密度脂蛋白胆固醇；LDL，低密度脂蛋白胆固醇；SBP，收缩压；TC，总胆固醇。

¹基线是指在第0天的给药前数值。

²治疗结束(EOT)是指在第30天给药前数值。

³P-值是在基线与治疗结束之间从配对t-检验或Wilcoxon符号秩检验计算。

在30天治疗期MITT样本中脂质参数无显著差异是明显的。在治疗期间PP样本中LDL胆固醇增高是明显的(8.9±4.4mg/dL，基线＝137.0mg/dL；P＝0.079)。在30天治疗期心率略微增加(3.65±1.8bpm；P＝0.077)；然而，在PP样本中这种变化不再显著(P＝0.155)。在PP样本中在30天治疗期间体重增加仅为0.6±0.3kg(P＝0.062；基线＝77.0±3.2kg)。在基线和治疗结束时的血液化学和血液学数值及自基线的变化在表6和7中示出。

表6：在基线、治疗结束时的绝对化学分析数值及应答留兰香补剂自基线的变化

缩写：ALP，碱性磷酸酶；ALT，丙氨酸转氨酶；AST，天冬氨酸转氨酶；BUN，血尿素氮；EOT，治疗结束。

¹基线是指在第0天给药前数值(N＝11)。

²治疗结束(EOT)是指在第30天给药前数值(n＝10)。

³P-值是在基线与治疗结束之间从配对t-检验或者Wilcoxon符号秩检验计算。

表7：在基线、治疗结束时的绝对血液学分析数值及应答留兰香补剂自基线的变化

缩写：EOT，治疗结束；MCH，平均血球血红蛋白；MCV，平均血细胞体积；RBC，红细胞；WBC，白细胞。

¹基线是指在第0天给药前数值(N＝11)。

²治疗结束(EOT)是指在第30天给药前数值(n＝10)。

³P-值是在基线与治疗结束之间从配对t-检验或Wilcoxon符号秩检验计算。

来自血液化学分析的数值表明在基线与治疗结束之间钙(-0.15±0.04mg/dL，P＝0.068)、阴离子间隙(-0.9±0.4mmol/L；P＝0.007)和总蛋白(-0.2±0.1g/dL；P＝0.055)降低。在30天的治疗期对于全血血液学分析数值显然无显著差异。

来自基线和治疗结束时的认知功能任务的平均分在图2中示出。来自推理1、注意/专注2和计划2认知功能任务的得分在基线与治疗结束之间显著改善，在给药前(t＝-1小时)评定时分别为6.4±4.2(P＝0.023)、22.9±5.3(P＝0.001)和11.3±5.9(P＝0.088)点。在PP样本中计划2任务得分中的变化不再显著(P＝0.169)。来自认知功能任务的所有其它得分在基线和治疗结束之间无显著差异。

在基线与治疗测试访问结束期间给予的急性及急性-慢性(acute-on-chronic)给予后认知功能任务的平均分和中位数得分在表8中示出。

表8：在急性留兰香给予测试后在基线的认知功能得分及在急性-慢性给予测试后 在30天留兰香补剂结束时的认知功能得分

缩写：EOT，治疗结束。

¹P-值在给药前(t＝-1小时)与给药后2.25小时原始得分之间从配对t-检验或Wilcoxon符号秩检验计算。

²P-值在给药前(t＝-1小时)与给药后4小时原始得分之间从配对t-检验或Wilcoxon符号秩检验计算。

在基线测试访问时，注意/专注1任务的平均分在给药前与给药后时间点(2.25和4小时)分别增加19.0±8.2点(P＝0.042)和29.1±6.6点(P＝0.001)。相似地，在基线测试访问时，注意/专注2任务的平均分在给药前与给药后时间点(2.25和4小时)评定分别增加16.8±6.4点(P＝0.025)和21.8±5.3点(P＝0.002)。在基线测试访问时，在给药后4小时时间点相对于给药前评定的计划2任务的平均分也显著增高至11.7±3.2(P＝0.004)。在基线测试访问时，在PP样本中推理1任务的平均分在给药前和给药后评定(2.25和4小时)之间仅分别增加3.4±1.7点(P＝0.082)和4.9±2.0点(P＝0.041)。这些认知功能的急性改善在急性-慢性给予测试之后不明显。然而，急性-慢性效果在给药后4小时评定推理1任务中是显著的，得分相对于给药前评定改善4.40±2.1点(P＝0.070)。这种差异在PP样本中不再显著(P＝0.115)。

讨论：

在这个非盲先导性实验中，每天摄入900mg/天的留兰香提取物共30天是良好耐受的。尽管在LDL胆固醇、阴离子间隙、钙、总蛋白、心率和体重方面具有显著差异，但是这些范围在正常生物可变性范围内且可能不具有临床意义。对象认知功能的适度改善在补充30天后是明显的。这个实验的结果提示留兰香提取物补剂可以改善认知功能，包括在慢性补充时改善推理、注意/专注及计划，及急性改善注意/专注和计划。

据我们所知，先前没有公开的研究已经评估在超出典型作为添加剂、调味剂或芳香剂摄取的剂量的剂量水平的留兰香提取物在人体中的安全性和耐受性。然而，一些研究已经评估了留兰香在动物模型中的毒性。特别地，在Akodogan等的研究中，大鼠(n＝12/组)随意摄入留兰香茶(20和40g/L)或者载体水共30天(Akdogan M,Kilinc I,Oncu M,KaraozE and Delibas N.Investigation of biochemical and histopathological effects ofMentha piperita L.and Mentha spicata L.on kidney tissue in rats.Human andExperimental Toxicology.2003；22:213-219)。在摄入留兰香茶之后，这两个剂量水平相对于对照的血浆尿素和肌酐浓度显著增高(P<0.003)。相似地，利用相同研究设计在大鼠中进行的二次研究也报道在这两个剂量水平肝脏酶天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)的活性相对于对照显著增加(P<0.016)(Akdogan M,Ozguner M,Aydin G and GokalpO.Investigation of biochemical and histopathological effects of Menthapiperita Labiatae and Mentha spicata Labiatae on liver tissue in rats.Humanand Experimental Toxicology.2004；23:21-28)。在这些研究中，估计留兰香摄入量为每天2.2g/kg体重(20g/L)和4.4g/kg体重(40g/L)，大概是在70kg人体中25-50g/天的剂量(Reagan-Shaw S,Nihal M and Ahmad N.Dose translation from animal to humanstudies revisited.FASEB J.2008；22:659-661)。尽管这些动物研究中留兰香估计的摄入水平比本发明研究中摄入量高3倍，但是这些发现未证实。

关于留兰香及其对认知功能的作用存在冲突和有限证据。在随机的对照实验中，健康年轻参与者(平均年龄＝24.6岁；n＝25/组)分为三个治疗组之一：咀嚼无糖留兰香口香糖、模拟咀嚼口香糖或者避免咀嚼(对照)(Wilkinson L,Scholey A and WesnesK.Chewing gum selectively improves aspects of memory in healthyvolunteers.Appetite.2002；38:235-236)。在给予认知功能任务的计算机测试组合期间实施这些条件。结果示出咀嚼留兰香口香糖相对于对照组改善对象的记忆(P<0.05)，但是未提示在注意/专注方面的任何差异。在二次研究中，健康年轻参与者(平均年龄＝22.9岁；n＝20-23/组)随机分为四个治疗条件之一：咀嚼留兰香口香糖、咀嚼无味口香糖、模拟咀嚼口香糖，或者无咀嚼(对照)(Tucha O,Mecklinger L,Maier K,Hammerl M and LangeKW.Chewing gum differentially affects aspects of attention in healthysubjects.Appetite.2004；42:327-329)。这些条件也在认知功能任务的计算机测试组合期间实施。与第一次研究的结果相反，相对于对照，咀嚼留兰香口香糖未改善记忆，但是改善了持久注意/专注(P<0.01)。从这些研究中未确定记忆及注意/专注的改善是否是留兰香或者咀嚼作用的结果。进一步地，鉴于缺少一致的剂量水平、给药时间、人群和使用的认知功能评定工具，难以解释这些结果。记忆任务中特定的急性改善在本发明研究中未鉴别，但是在注意/专注任务中使用留兰香补剂可见急性改善是显著的。

总之，留兰香提取物在自我报告记忆缺损的年老对象(50-70岁)中是良好耐受的，且可以急性和慢性正面影响认知功能。

前文描述和图表包含本发明的举例的实施方案。本文描述的前述实施方案和方法基于本领域技术人员的能力、经验和偏好可以改变。仅以一定顺序列出的方法步骤对所述方法的步骤顺序无任何限制。前文描述和图表仅是解释和举例说明本发明，本发明不限于此，本发明限于权利要求书所述。本领域技术人员在不偏离本发明范围基础上可以对本发明进行修改和变化。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种增强、改善或维持哺乳动物的认知健康和/或功能的方法，包括口服施用有效量的唇形科(Lamiaceae)薄荷属(Mentha)植物的提取物，并且其中主要活性成分是迷迭香酸和植物多酚。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物选自人和陪伴动物。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述提取物的所述有效量在0.1-100mg/kg/天之间。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述提取物包含重量百分比为最少8％的迷迭香酸。

5.根据权利要求4所述的方法，其中认知健康和/或认知功能是指记忆、推理、注意/专注和计划。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物选自罗勒、薄荷、鼠尾草、香薄荷、马郁兰、牛至、百里香、薰衣草、留兰香和迷迭香。

7.根据权利要求4所述的方法，用于预防或治疗认知疾病如阅读障碍、失用症、注意力缺陷多动症、注意力缺陷自闭症、阿尔茨海默病、帕金森病或中风，或者其它执行功能障碍。

8.根据权利要求4所述的方法，用于预防或治疗与正常衰老相关的认知障碍或缺陷。

9.根据权利要求4所述的方法，用于维持在压力条件下的正常认知功能，所述压力条件如在选自时差、时区改变、妊娠、药物治疗、日常工作变化和轮班条件下发生的生物周期节律破坏。

10.根据权利要求7所述的方法，用于维持在压力条件下的正常认知功能，所述压力条件如在选自时区改变、妊娠、药物治疗、日常工作改变和轮班条件下发生的生物周期节律破坏。

11.一种治疗或预防哺乳动物的认知健康和/或功能衰退的方法，包括口服施用有效量的唇形科薄荷属植物的提取物，并且其中主要活性成分是迷迭香酸和植物多酚。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述提取物施用给人类对象，所述人类对象示出认知功能改善，所述改善使用计算机认知评估工具通过旋转和/或多边形评估注意/专注的评估而测量。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述提取物在至少30天的时间每日一次施用给人类对象，所述人类对象示出通过如下至少一种评估而测量的认知功能改善：对认知功能问卷的主观反应，通过数字广度和/或成对关联评估记忆的计算机认知功能评估工具，通过Double Trouble和/或Odd One Out评估推理的计算机认知功能评估工具，通过旋转和/或多边形评估注意/专注的计算机认知功能评估工具，以及通过空间搜索和/或空间滑块评估计划的计算机认知功能评估工具。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物是留兰香(Mentha spicata)，其在干重基础上包含重量百分比高于8％的迷迭香酸和重量百分比高于20％的总多酚。

Claims (14)

1.一种增强、改善或维持哺乳动物的认知健康和/或功能的方法，包括口服施用有效量的唇形科(Lamiaceae)植物的提取物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物选自人和陪伴动物。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述提取物的所述有效量在0.1-100mg/kg/天之间。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述提取物包含迷迭香酸。

5.根据权利要求4所述的方法，其中认知健康和/或认知功能是指记忆、推理、注意/专注和计划。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物选自罗勒、薄荷、鼠尾草、香薄荷、马郁兰、牛至、百里香、薰衣草、留兰香和迷迭香。

7.根据权利要求4所述的方法，用于预防或治疗认知疾病如阅读障碍、失用症、注意力缺陷多动症、注意力缺陷自闭症、阿尔茨海默病、帕金森病或中风，或者其它执行功能障碍。

8.根据权利要求4所述的方法，用于预防或治疗与正常衰老相关的认知障碍或缺陷。

9.根据权利要求4所述的方法，用于维持在压力条件下的正常认知功能，所述压力条件如在选自时差、时区改变、妊娠、药物治疗、日常工作变化和轮班条件下发生的生物周期节律破坏。

10.根据权利要求7所述的方法，用于维持在压力条件下的正常认知功能，所述压力条件如在选自时区改变、妊娠、药物治疗、日常工作改变和轮班条件下发生的生物周期节律破坏。

11.一种治疗或预防哺乳动物的认知健康和/或功能衰退的方法，包括口服施用有效量的唇形科植物的提取物。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述提取物施用给人类对象，所述人类对象示出认知功能改善，所述改善使用计算机认知评估工具通过旋转和/或多边形评估注意/专注的评估而测量。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述提取物在至少30天的时间每日一次施用给人类对象，所述人类对象示出通过如下至少一种评估而测量的认知功能改善：对认知功能问卷的主观反应，通过数字广度和/或成对关联评估记忆的计算机认知功能评估工具，通过Double Trouble和/或Odd One Out评估推理的计算机认知功能评估工具，通过旋转和/或多边形评估注意/专注的计算机认知功能评估工具，以及通过空间搜索和/或空间滑块评估计划的计算机认知功能评估工具。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物是留兰香(Mentha spicata)，其在干重基础上包含重量百分比为高于8％的迷迭香酸。