CN106148259A

CN106148259A - 生产l-2-氨基丁酸的重组菌及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN106148259A
Application number: CN201510208576.1A
Authority: CN
Inventors: 温廷益; 温际富; 梁勇; 张芸; 刘树文; 商秀玲; 邓爱华; 刘茜
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2015-04-28
Filing date: 2015-04-28
Publication date: 2016-11-23
Anticipated expiration: 2035-04-28
Also published as: CN106148259B

Abstract

本发明公开了一种生产L‑2‑氨基丁酸的重组菌及其制备方法与应用，所述重组菌为同时过表达苏氨酸脱氨酶、转氨酶和谷氨酸脱氢酶的菌株。本发明提供的以苏氨酸为底物生产L‑2‑氨基丁酸的重组菌显著提高了L‑2‑氨基丁酸的产量和底物转化率，有效降低了副产物的积累，并且简化了生产工艺。

Description

生产L-2-氨基丁酸的重组菌及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及生产L-2-氨基丁酸的重组菌及其制备方法与应用。

背景技术

L-2-氨基丁酸是抑制人体神经信息传递的脂肪族氨基酸，具有降低血氨，加强葡萄糖磷酸酯酶的活性，促进脑细胞代谢等功能，临床可用于脑血管病后遗症的治疗和牙科的无痛去龋。此外，L-2-氨基丁酸还是一种重要的化工原料和医药中间体，已广泛应用于抗结核药物盐酸乙胺丁醇和抗癫痫药物左乙拉西坦等的合成。

L-2-氨基丁酸的生产方法主要分为化学法、酶法和微生物发酵法。化学法主要包括脱硫反应法、正丁酸卤代反应法、丁酮酸还原法等。化学法研究起步较早，虽然工艺成熟，但化学合成法存在耗能高、环境污染大、生产成本高等缺点，不利于工业化应用；微生物发酵法指利用大肠杆菌等微生物直接发酵生产L-2-氨基丁酸。目前，国外对于微生物发酵法合成L-2-氨基丁酸的研究有一篇报道(Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America,2010,107(14):6234-6239.)，该报道在传统诱变菌种大肠杆菌ATCC98082的基础上通过突变筛选谷氨酸脱氢酶及过表达苏氨酸脱氨酶构建了一株L-2-氨基丁酸的工程菌，但该工程菌L-2-氨基丁酸产量只有5.4g/L，与实现工业化应用存在较大差距。中国专利201210015308.4在苏氨酸高产菌株的基础上，通过过表达苏氨酸脱氨酶与氨基酸脱氢酶合成L-2-氨基丁酸，但该方法发酵60h，L-2-氨基丁酸产量只有20g/L，仍无法适应工业化生产需求；酶法制备L-2-氨基丁酸主要分为转氨酶法、脱氢酶法、氨基酰化酶法、氨基氧化酶法等。脱氢酶法是指2-酮丁酸在脱氢酶的催化作用下合成L-2-氨基丁酸。Galkin和Kulakova等利用大肠杆菌共表达L-亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶，其中L-亮氨酸脱氢酶能够催化丁酮酸和NH₃生产L-2-氨基丁酸，甲酸脱氢酶以甲酸铵为底物再生NADH，释放出二氧化碳和NH₃(Applied andEnvironmental Microbiology,1997,63(12):4651-4656.)，此法生产L-2-氨基丁酸浓度达到36g/L，转化率大于80％。但该方法以2-酮丁酸为原料，大大提高了原料成本，导致生产成本较高，限制了该工艺的工业化应用。中国专利201210066624.4和201010139227.6等报道了以L-苏氨酸为原料，先由苏氨酸脱氨酶转化成2-酮丁酸，再由亮氨酸脱氢酶催化2-酮丁酸合成L-2-氨基丁酸，反应中加入辅酶再生体系。由于专利中所用酶催化剂需要克隆表达后经细胞破碎提取或直接购买，大大增加了生产成本，不利于推广应用。转氨酶法是指2-酮丁酸在转氨酶的催化作用下合成2-氨基丁酸(图1)。1999年，Fotheringham等利用大肠杆菌K12菌株过表达酪氨酸转氨酶、苏氨酸脱氨酶及乙酰乳酸合成酶，以L-苏氨酸和L-天冬氨酸为底物通过转氨反应合成了L-2-氨基丁酸，同时通过乙酰乳酸合成酶消除副产物丙酮酸(Bioorganic&Medicinal Chemistry,1999,7(10):2209-2213.)。但是该法生产L-2-氨基丁酸的转化率仅为54％，产量仅为27.8g/L，且转化过程中产生副产物NH₃、L-丙氨酸和3-羟基-2-丁酮，由于L-2-氨基丁酸与副产物丙氨酸性质相似，导致该法制备的2-氨基丁酸纯化较为困难。

发明内容

本发明的目的是提供能够提高L-2-氨基丁酸产量的重组菌及其制备方法，以及利用重组菌生产L-2-氨基丁酸的方法。

为此，本发明一方面提供一种生产L-2-氨基丁酸的重组菌,所述重组菌为同时过表达苏氨酸脱氨酶、转氨酶和谷氨酸脱氢酶的菌株。

在上述技术方案中，所述苏氨酸脱氨酶的氨基酸序列为SEQ ID No.2或SEQ ID No.5所示，所述转氨酶的氨基酸序列为SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID No.11或SEQ ID No.13所示，所述谷氨酸脱氢酶的氨基酸序列为SEQ ID No.15所示；所述苏氨酸脱氨酶的基因序列为SEQ ID No.1中10～1554位或SEQ ID No.3中10～999位所示，所述转氨酶的基因序列为SEQ ID No.6中22～951位、SEQ ID No.8中15～1208位、SEQID No.10中9～1388位或SEQ ID No.12中9～1262位所示，所述谷氨酸脱氢酶的基因序列为SEQ ID No.14中177～1520位所示。

在上述技术方案中，所述重组菌的出发菌为埃希氏菌属的细菌，优选为大肠杆菌(Escherichia coli)，更优选为E.coli BL21(DE3)。

本发明的另一方面，提供一种制备L-2-氨基丁酸重组菌的方法，包括如下步骤：同时过表达苏氨酸脱氨酶、转氨酶及谷氨酸脱氢酶，得到所述重组菌。

在上述技术方案中，所述过表达苏氨酸脱氨酶、转氨酶及谷氨酸脱氢酶通过如下步骤实现：增加出发菌中苏氨酸脱氨酶、转氨酶及谷氨酸脱氢酶基因的拷贝数。

在上述技术方案中，所述方法进一步包括将所述出发菌的谷氨酸脱氢酶基因的启动子替换为具有更强转录活性的元件，和/或将所述出发菌的苏氨酸脱氨酶基因的核糖体结合位点替换为具有更强翻译活性的元件。所述更强转录活性的元件和更强翻译活性的元件可为任何转录活性较高的元件和任何翻译活性较高的元件，例如本发明中使用的RBS(SEQ ID No.4中33-39bp核苷酸序列)和强启动子T7(SEQ ID No.14中85-109bp核苷酸序列)。

在上述技术方案中，通过携带所述苏氨酸脱氨酶、转氨酶及谷氨酸脱氢酶基因的质粒转化所述出发菌来增加所述出发菌中苏氨酸脱氨酶、转氨酶及谷氨酸脱氢酶基因的拷贝数；携带苏氨酸脱氨酶、转氨酶及谷氨酸脱氢酶基因的表达质粒没有限制，可以是任何能够高效表达目的蛋白的质粒；优选地，所述质粒为pET28a。

在上述技术方案中，所述苏氨酸脱氨酶的基因序列为SEQ ID No.1中10～1554位或SEQ ID No.3中10～999位所示，所述转氨酶的基因序列为SEQ ID No.6中22～951位、SEQ ID No.8中15～1208位、SEQ ID No.10中9～1388位或SEQ ID No.12中9～1262位所示，所述谷氨酸脱氢酶的基因序列为SEQ ID No.14中177～1520位所示。

其中，所述苏氨酸脱氨酶选自但不限于大肠杆菌、芽胞杆菌，转氨酶选自但不限于大肠杆菌、芽胞杆菌。谷氨酸脱氢酶选自但不限于，大肠杆菌。所述大肠杆菌苏氨酸脱氨酶可以为合成型苏氨酸脱氨酶IlvA或分解型苏氨酸脱氨酶TdcB；所述芽胞杆菌苏氨酸脱氨酶可以为枯草芽胞杆菌苏氨酸脱氨酶IlvA。所述大肠杆菌转氨酶可以为支链氨基酸氨基转移酶IlvE、丙氨酸氨基转移酶AvtA、酪氨酸氨基转移酶TyrB、腐胺氨基转移酶PatA。所述芽胞杆菌转氨酶可以为支链氨基酸氨基转移酶IlvK、转氨酶PatA或磷酸丝氨酸氨基转移酶SerC。谷氨酸脱氢酶为大肠杆菌谷氨酸脱氢酶GdhA。

在上述技术方案中，所述出发菌为选自埃希氏菌属的细菌，优选为大肠杆菌(Escherichia coli)，更优选为E.coli BL21(DE3)。

本发明的再一方面，提供一种利用上述任意一项所述的重组菌生产L-2-氨基丁酸的方法，包括如下步骤：

A)培养重组菌，在所述重组菌的对数生长期的中期，进行异丙基硫代半乳糖苷诱导，异丙基硫代半乳糖苷诱导浓度为0.01mmol/L～1mmol/L，继续培养至菌体对数生长后期或稳定期前期对培养的菌体进行离心，收集菌体；

B)以缓冲液搅拌悬浮步骤A)中收集的重组菌，直接利用菌体细胞在底物苏氨酸和氨基供体谷氨酸存在下进行催化生产。

所述底物苏氨酸浓度为0.1～300g/L,谷氨酸为5～150g/L，催化条件为37℃、pH为6.0～7.5、DO为20％～60％。

本发明的实验证明，与现有的L-2-氨基丁酸生产方法相比具有以下优点：

(1)、本发明的重组菌通过过表达苏氨酸脱氨酶、转氨酶、谷氨酸脱氢酶，可以利用苏氨酸脱氨酶、转氨酶、谷氨酸脱氢酶三酶催化体系生产L-2-氨基丁酸，实现了催化副产物α-酮戊二酸的循环利用，进而提高了底物氨基供体的利用率，有效提高了L-2-氨基丁酸的产量和底物转化率。

(2)本发明全部采用过表达关键酶的全细胞进行催化反应，避免了酶催化剂的提取等过程，简化了生产工艺。

附图说明

参考以下附图，将有助于更好地理解本发明的方案及有益效果。

图1为转氨酶法制备L-2-氨基丁酸的反应原理图。

图2为本发明制备L-2-氨基丁酸的反应原理图。

图3为本发明实施例提供的表达质粒pET28a-tdcB的示意图。

图4为本发明实施例提供的表达质粒pET28a-tdcB-ilvE的示意图。

图5为本发明实施例提供的SDS-PAGE蛋白检测图。

图6为本发明实施例提供的表达质粒pET28a-tdcB-ilvE-gdhA的示意图。

具体实施方式

为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。

另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中如未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段和市售的常用仪器、试剂，可参见《分子克隆实验指南(第3版)》(科学出版社)、《微生物学实验(第4版)》(高等教育出版社)以及相应仪器和试剂的厂商说明书等参考。

以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。

实施例1、L-2-氨基丁酸初级工程菌ABA1和ABA2的构建

一、苏氨酸脱氨酶表达质粒的构建

苏氨酸脱氨酶催化苏氨酸脱氨生产2-酮丁酸，过表达苏氨酸脱氨酶，促进苏氨酸向2-酮丁酸的转化。

根据Genbank中E.coli K12W3110的ilvA基因设计引物，以E.coli K12W3110基因组为模板，分别以WY1423、WY1424为引物，使用高保真聚合酶KAPA HiFiTM HotStar进行PCR扩增，PCR按如下方式进行：94℃变性30s(秒)，54℃退火30s(秒)，以及72℃延伸30s(秒)(30个循环)，PCR扩增得到1560bp的PCR产物(序列1)，将PCR获得的DNA片段经琼脂糖凝胶电泳分离纯化，回收片段经Nde I和BamH I双酶切后，与同样双酶切处理的表达载体pET28a(购自Novagen公司)连接。连接产物采用化学转化法转化至E.coli DH5α，在含卡那霉素(50μg/mL)的LB平板上筛选转化子，转化子传代培养三代后，以WB923和WB924为引物，采用菌落PCR鉴定转化子，得到1845bp为阳性转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒，并对质粒进行Nde I和BamH I双酶切鉴定，得到1560bp酶切片段的为正确质粒。

将PCR和酶切鉴定正确的质粒送去测序，结果该质粒为将序列表中序列1所示的核苷酸插入载体pET28a中得到的重组质粒，命名为pET28a-ilvA。ilvA为合成型苏氨酸脱氨酶基因，其基因序列为序列表中序列1中10～1554位所示。

以E.coli K12W3110基因组为模板，分别以WY1422、WY997为引物，扩增得到1035bp的PCR产物(SEQID No.3)，按照上述同样的方法，构建苏氨酸脱氨酶表达质粒pET28a-tdcB(图3)。tdcB为分解型苏氨酸脱氨酶基因，其基因序列为序列表中序列3中10～999位所示。

上述所用的引物序列如下：

WY1423:GGAATTCCATATGGCTGACTCGCAACCCCT(Nde I)

WY1424:CGGGATCCCTAACCCGCCAAAAAGAACC(BamH I)

WB923:TAATACGACTCACTATAGGG

WB924:TGCTAGTTATTGCTCAGCGG

WY1422:GGAATTCCATATGCATATTACATACGATCTGCC(Nde I)

WY997:CGCGGATCCAGTACTCATATCCTATCCTC(BamH I)

二、支链氨基酸氨基转移酶表达质粒的构建

支链氨基酸转移酶催化2-酮丁酸转氨生成L-2-氨基丁酸。在脱氨酶催化苏氨酸生成2-酮丁酸的基础上，过表达支链氨基酸转移酶以催化2-酮丁酸生成L-2-氨基丁酸。

以E.coli K12W3110基因组为模板，以WY998、WY1403为引物，扩增得到979bp的PCR产物(SEQ IDNo.6)；按照实施例1中所述方法，构建苏氨酸转氨酶表达质粒pET28a-ilvE。ilvE基因编码支链氨基酸氨基转移酶，其基因序列为序列表中SEQ ID No.6中22～951位所示。

WY998：CGCGGATCCAGAAGGAGATATACCATGACCACGAAGAAAGCTGA(BamH I)

WY1403：ACGCGTCGACCGTGCCGTCCCATTTTTTGT(Sal I)

三、苏氨酸脱氨酶及转氨酶串联表达质粒的构建

将已构建的质粒pET28a-tdcB和pET28a-ilvE分别用Sal I和BamH I双酶切，回收酶切片段pET28a-tdcB与ilvE进行连接。连接产物采用化学转化法转化至E.coli DH5α，在含卡那霉素(50μg/mL)的LB平板上筛选转化子，转化子传代培养三代后，以WY998和WB924为引物，采用菌落PCR鉴定转化子，得到1084bp为阳性转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒，并对质粒进行Sal I和BamH I双酶切鉴定，得到979bp酶切片段的为正确质粒。

将PCR和酶切鉴定正确的质粒送去测序，结果该质粒为将序列表中SEQ ID No.6所示核苷酸插入载体pET28a-tdcB中得到的重组质粒，命名为pET28a-tdcB-ilvE(图4)。

按照上述同样的方法，利用已构建质粒pET28a-ilvA和pET28a-ilvE，构建苏氨酸脱氨酶与转氨酶串联表达质粒pET28a-ilvA-ilvE。

四、L-2-氨基丁酸初级工程菌的构建

将已构建好的质粒pET28a-tdcB-ilvE电转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，将该菌株命名为ABA1(BL21/pET28a-tdcB-ilvE)。利用SDS-PAGE检测蛋白表达情况(图5)。SDS-PAGE检测结果显示，构建的表达质粒中苏氨酸脱氨酶与转氨酶均已表达。

按照上述同样的方法，构建L-2-氨基丁酸初级工程菌株ABA2(BL21/pET28a-ilvA-ilvE)。

实施例2、L-2-氨基丁酸初级工程菌全细胞催化生产L-2-氨基丁酸

利用L-2-氨基丁酸初级工程菌ABA1(BL21/pET28a-tdcB-ilvE)、ABA2(BL21/pET28a-ilvA-ilvE)催化生产L-2-氨基丁酸。

种子培养基具体如下：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L；卡那霉素50mg/L。

菌体生长阶段培养基具体如下：酵母粉，10.00g/L；K₂HPO₄·3H₂O，0.90g/L；KH₂PO₄，1.14g/L；(NH4)₂SO₄，10.00g/L；MgSO₄·7H₂O，0.30g/L；微量元素(TMS)储液，5.00mL/L。

其中TMS储液：FeSO₄·7H₂O，10.000g/L；CaCl₂，1.350g/L；ZnSO₄·7H₂O，2.250g/L；MnSO₄·4H₂O，0.500g/L；CuSO₄·5H₂O，1.000g/L；(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O，0.106g/L；Na₂B₄O₇·10H₂O，0.230g/L；CoCl₂·6H₂O，0.480g/L；35％HCl，10.000mL/L。

缓冲液：KH₂PO₄，1.36g/L；Na₂HPO₄，5.67g/L。

菌体催化阶段培养基具体如下：MgSO₄·7H₂O，0.50g/L；(NH₄)₂SO₄，5.00g/L；KH₂PO₄，1.36g/L；Na₂HPO₄，5.67g/L；苏氨酸，50.00g/L；谷氨酸，10.00g/L。

(一)、种子液的获得

将工程菌ABA1(BL21/pET28a-tdcB-ilvE)和ABA2(BL21/pET28a-ilvA-ilvE)接种到种子培养基中，种子液培养条件为培养温度37℃，摇床转速为220rpm，培养时间6h，得到种子液，OD₆₀₀为4.0。

(二)、菌体培养与收集

将种子液按5％的接种量接种到含有终浓度50μg/mL卡那霉素的上述菌体生长培养基中(1L摇瓶)，进行菌体培养，培养温度为37℃，摇床转速为220rpm。发酵过程中通过补加700g/L的葡萄糖，控制发酵体系中葡萄糖的浓度为5～10g/L。通过补加浓氨水调控pH，维持在6.9左右。当OD₆₀₀＝40时，加入IPTG(终浓度为0.4mmol/L)诱导重组质粒携带的基因表达。

菌体培养8h，OD₆₀₀约80，6000×g离心6min，收集菌体。

(三)、摇瓶催化实验生产L-2-氨基丁酸

将收集的菌体以缓冲液进行重悬浮，并全部接种到含有终浓度50μg/mL卡那霉素的摇瓶菌体催化培养基中。进行摇瓶催化实验，摇床温度为37℃，转速为220rpm。发酵过程中通过补加700g/L的葡萄糖，控制发酵体系中葡萄糖的浓度为5～10g/L。通过补加浓氨水调控pH，维持在6.9左右。菌体催化持续约36h。

收集菌体催化产物，12000×g离心2min，收集上清液。

(四)、检测L-2-氨基丁酸的含量

在不同的发酵时间取发酵产物离心取上清液，使用高压液相色谱法(HPLC)进行检测。

具体方法如下(2,4-二硝基氟苯柱前衍生高效液相法)：取10μL上述上清液于2mL离心管中，加入200μL NaHCO₃水溶液(0.5mol/L，pH 9.0)和100μL 1％的2,4-二硝基氟苯-乙腈溶液(体积比)，于60℃水浴中暗处恒温加热60min，然后冷却至25℃，加入700μL KH₂PO₄水溶液(0.01mol/L，pH 7.20±0.05，用NaOH水溶液调整pH)，放置15min过滤后可进样，进样量为15μL。

所用色谱柱为C18柱(ZORBAX Eclipse XDB-C18，4.6×150mm，Agilent，USA)；柱温：40℃；紫外检测波长：360nm；流动相A为0.04mol/L KH₂PO₄水溶液(pH 7.20±0.05，用40g/L KOH水溶液调整pH)，流动相B为55％乙腈水溶液(体积比)，流动相流速为1mL/min，洗脱过程如下表1所示：

表1流动相洗脱程序

时间(min)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0	86	14
2	88	12
			4	86	14
10	70	30
			20	30	70
24	10	90
			27	0	100

结果如下表2所示，摇瓶催化18h，工程菌ABA1(BL21/pET28a-tdcB-ilvE)的L-2-氨基丁酸产量为3.72g/L，ABA2(BL21/pET28a-ilvA-ilvE)的L-2-氨基丁酸产量为2.82g/L。

表2菌株ABA1和ABA2的L-2-氨基丁酸产量

菌株	L-2-氨基丁酸产量(g/L)
		ABA1	3.72±0.51
ABA2	2.82±0.03

由上表可以看出，苏氨酸脱氨酶TdcB的催化效果优于IlvA，过表达TdcB的菌株ABA1的L-2-氨基丁酸产量较过表达IlvA的菌株提高了31.91％。

实施例3、L-2-氨基丁酸工程菌ABA3、ABA4、ABA5的构建

一、多种转氨酶表达质粒的构建

酪氨酸氨基转移酶TyrB催化芳香族氨基酸转氨反应，腐胺氨基转移酶PatA催化腐胺的转氨反应，缬氨酸丙酮酸氨基转移酶AvtA催化缬氨酸和丙酮酸生成丙氨酸及3-甲基-2-酮丁酸，为比较三种转氨酶催化2-酮丁酸生成2-氨基丁酸的催化能力的差别，分别构建含三种转氨酶的表达质粒和菌株。

以E.coli K12W3110基因组为模板，以WY1405、WY1406为引物，扩增得到1256bp的PCR产物(SEQID No.8)；以WY1408、WY1409为引物，扩增得到1436bp的PCR产物(SEQ ID No.10)；以WY1411、WY1412为引物，扩增得到1314bp的PCR产物(SEQ ID No.12)。按照实施例1中所述方法，分别构建苏氨酸转氨酶表达质粒pET28a-tyrB、pET28a-patA和pET28a-avtA。tyrB为酪氨酸氨基转移酶基因，基因序列为SEQ ID No.8中15-1208位所示，patA为腐胺氨基转移酶基因，基因序列为SEQ ID No.10中9-1388位所示，avtA为缬氨酸丙酮酸氨基转移酶基因，基因序列为SEQ ID No.12中9-1262位所示。

按照实施例1中的方法，利用已构建质粒pET28a-tdcB和pET28a-tyrB，构建苏氨酸脱氨酶与转氨酶串联表达质粒pET28a-tdcB-tyrB。利用已构建质粒pET28a-tdcB和pET28a-patA，构建苏氨酸脱氨酶与转氨酶串联表达质粒pET28a-tdcB-patA。利用已构建质粒pET28a-tdcB和pET28a-avtA，构建苏氨酸脱氨酶与转氨酶串联表达质粒pET28a-tdcB-avtA。

WY1405：CATGCCATGGGACATCGCGTGTTTCAAAAAGT(Nco I)

WY1406：ACGCGTCGACAATTTCACTGCAGGCTGGGT(Sal I)

WY1408：CATGCCATGGGATTGAACAGGTTACCTTCGAG(Nco I)

WY1409：CCGCTCGAGAAAAGATCGGATGGCGACGT(Xho I)

WY1411：CATGCCATGGGCATGACATTCTCCCTTTTTGG(Nco I)

WY1412：ACGCGTCGACTGCAGAAATCATGTAGGCCT(Sal I)

二、转氨酶相应工程菌株的构建

按照实施例1中的方法，利用已构建质粒pET28a-tdcB-tyrB、pET28a-tdcB-patA、pET28a-tdcB-avtA分别构建L-2-氨基丁酸工程菌株ABA3(BL21/pET28a-tdcB-tyrB)，ABA4(BL21/pET28a-tdcB-patA)，ABA5(BL21/pET28a-tdcB-avtA)。

实施例4、工程菌ABA3、ABA4、ABA5催化生产L-2-氨基丁酸

利用构建的过表达不同转氨酶的工程菌ABA3(BL21/pET28a-tdcB-tyrB)、ABA4(BL21/pET28a-tdcB-patA)、ABA5(BL21/pET28a-tdcB-avtA)进行L-2-氨基丁酸的全细胞催化实验。

种子培养及菌体生长阶段培养基如上述实施例2中所述。

种子液的获得、菌体培养及摇瓶催化方法如实施例2中所述。

按照实施例2中所述的方法，检测催化液中L-2-氨基丁酸的含量。催化液检测结果如下：

摇瓶催化18h，工程菌ABA1的L-2-氨基丁酸产量为3.72g/L，工程菌ABA3的L-2-氨基丁酸产量为2.60g/L，工程菌ABA4的L-2-氨基丁酸产量为0.66g/L，工程菌ABA5的L-2-氨基丁酸产量为0.87g/L。

表3菌株ABA1、ABA3、ABA4和ABA5的L-2-氨基丁酸产量

菌株	L-2-氨基丁酸产量(g/L)
		ABA1	3.72±0.51
ABA3	2.60±0.03
		ABA4	0.66±0.01
ABA5	0.87±0.08

由上表3可以看出，转氨酶TyrB、PatA及AvtA均可用于催化2-酮丁酸生成2-氨基丁酸，支链氨基酸氨基转移酶IlvE的催化效果优于TyrB、PatA及AvtA。

实施例5、L-2-氨基丁酸工程菌ABA6的构建

为考察不同强度基因表达元件对L-2-氨基丁酸催化效果的影响，构建携带优化的核糖体结合位点(RBS)的苏氨酸脱氨酶表达质粒及其相应的L-2-氨基丁酸工程菌。

以E.coli K12W3110基因组为模板，分别以WY1433、WY997为引物，扩增得到1072bp的PCR产物(SEQID No.4)，其携带有大肠杆菌苏氨酸脱氨酶自身RBS序列(SEQ ID No.4中33～39bp核苷酸)，按照实施例1中的方法，构建苏氨酸脱氨酶表达质粒pET28a-RBStdcB。利用已构建质粒pET28a-RBStdcB和pET28a-ilvE，构建携带自身RBS序列的苏氨酸脱氨酶和转氨酶串联表达质粒pET28a-RBStdcB-ilvE。

利用已构建质粒pET28a-RBStdcB-ilvE构建L-2-氨基丁酸工程菌株ABA6(BL21/pET28a-RBStdcB-ilvE)。

WY1433：TGCTCTAGACGGTTACCTACATATTTAAT(Xba I)

实施例6、工程菌ABA6和ABA1催化产L-2-氨基丁酸

按照实施例2中的方法，利用工程菌ABA6催化生产L-2-氨基丁酸。催化液HPLC检测结果如下：

摇瓶催化18h，工程菌ABA1(BL21/pET28a-tdcB-ilvE)的L-2-氨基丁酸产量为3.72g/L，工程菌ABA6(BL21/pET28a-RBStdcB-ilvE)的L-2-氨基丁酸产量为4.18g/L。

表4菌株ABA1和ABA6的L-2-氨基丁酸产量

菌株	L-2-氨基丁酸产量(g/L)
		ABA1	3.72±0.51
ABA6	4.18±0.03

结果显示，通过优化tdcB基因的RBS，L-2-氨基丁酸的产量提高12.37％。

实施例7、L-2-氨基丁酸高级工程菌的构建

一、苏氨酸脱氨酶、转氨酶及谷氨酸脱氢酶串联表达质粒的构建

谷氨酸脱氢酶催化α-酮戊二酸生成谷氨酸。在表达苏氨酸脱氨酶及转氨酶的基础上，利用谷氨酸脱氢酶实现氨基供体谷氨酸的循环利用。

以E.coli K12W3110基因组为模板，以WY1426、WY1420为引物，扩增得到1398bp的PCR产物(SEQID No.14中所示175～1572bp核苷酸序列)，按照实施例1中所述方法，构建谷氨酸脱氢酶表达质粒pET28a-gdhA。gdhA为谷氨酸脱氢酶基因，基因序列为SEQ ID No.14中177-1520位所示。

根据已构建的质粒pET28a-gdhA的核苷酸序列设计引物，扩增含T7启动子的gdhA片段。以pET28a-gdhA为模板，分别以WY1427、WY1420为引物，扩增得到1572bp的PCR产物(SEQ ID No.14)，为含T7启动子的gdhA片段，将PCR获得的DNA片段经琼脂糖凝胶电泳分离纯化，回收片段经Sal I和Xho I双酶切后，与同样双酶切处理的表达载体pET28a-tdcB-ilvE连接。连接产物采用化学转化法转化至E.coli DH5α，在含卡那霉素(50μg/mL)的LB平板上筛选转化子，转化子传代培养三代后，以WY1427和WB924为引物，采用菌落PCR鉴定转化子，得到1656bp为阳性转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒，并对质粒进行Sal I和Xho I双酶切鉴定，得到1572bp酶切片段的质粒为阳性质粒。

将PCR和酶切鉴定正确的质粒送去测序，结果该质粒为将序列表中SEQ ID No.14所示核苷酸插入载体pET28a-tdcB-ilvE中得到的重组质粒，命名为pET28a-tdcB-ilvE-gdhA(图6)

WY1426：CATGCCATGGATCAGACATATTCTCT(Nco I)

WY1420：CCGCTCGAGCCCATTTGTAGGCCTGATAA(Xho I)

WY1427：ACGCGTCGACCGCCAGCAACCGCACCTGTG(Sal I)

二、L-2-氨基丁酸高级工程菌ABA7的构建

将已构建好的质粒pET28a-tdcB-ilvE-gdhA电转化至E.coli BL21(DE3)中，将该菌株命名为ABA7(BL21/pET28a-tdcB-ilvE-gdhA)。利用SDS-PAGE检测蛋白表达情况(图5)。

SDS-PAGE检测结果显示，构建的串联表达质粒携带的苏氨酸脱氨酶、转氨酶和谷氨酸脱氢酶均已表达。

实施例8、高级工程菌ABA7催化生产L-2-氨基丁酸

利用菌株ABA7(BL21/pET28a-tdcB-ilvE-gdhA)进行发酵罐催化生产L-2-氨基丁酸实验。

发酵罐菌体生长阶段培养基具体如下：酵母粉，10.00g/L；K₂HPO₄·3H₂O，0.90g/L；KH₂PO₄，1.14g/L；(NH₄)₂SO₄，10.00g/L；MgSO₄·7H2O，0.30g/L；TMS储液，5.00mL/L。

其中TMS储液：FeSO₄·7H2O，10.000g/L；CaCl₂，1.350g/L；ZnSO₄·7H₂O，2.250g/L；MnSO₄·4H₂O，0.500g/L；CuSO₄·5H₂O，1.000g/L；(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O，0.106g/L；Na₂B₄O₇.10H₂O，0.230g/L；CoCl₂.6H₂O，0.480g/L；35％HCl，10.000mL/L。

缓冲液：KH₂PO₄，1.36g/L；Na₂HPO₄，5.67g/L。

发酵罐菌体催化阶段培养基具体如下：MgSO₄·7H₂O，0.50g/L；(NH₄)₂SO₄，5.00g/L；KH₂PO₄，1.36g/L；Na₂HPO₄，5.67g/L；苏氨酸，100.00g/L；谷氨酸，10.00g/L。

(一)、种子液的获得

将工程菌ABA1(BL21/pET28a-tdcB-ilvE)和ABA7(BL21/pET28a-tdcB-ilvE-gdhA)接种到种子培养基中，种子液培养条件为培养温度37℃，摇床转速为220rpm，培养时间6h，得到种子液，OD₆₀₀为4.0。

(二)、发酵罐菌体培养与收集

将种子液按照5％的接种量接种到含有终浓度50μg/mL卡那霉素的发酵罐菌体生长培养基中。

采用的发酵罐为7.5L发酵罐(BioFlo115，NBS)：内置定速可编程控泵，可以实现恒速补料。发酵过程中通过蠕动泵补加700g/L的葡萄糖，控制发酵体系中葡糖糖的浓度为5～10g/L。通过加热套和冷却水控制发酵温度维持在37℃；通入空气提供溶氧，转速与溶氧信号级联控制溶氧维持在30％；补加浓氨水调控pH，维持在6.9左右。菌体培养持续约7h，OD₆₀₀约80。当OD₆₀₀＝40时，加入IPTG(终浓度为0.4mmol/L)诱导重组质粒携带的基因表达。

收集发酵罐培养的菌体，6000×g离心8min，以缓冲液进行重悬浮，6000×g离心8min收集菌体。

(三)、发酵罐催化生产L-2-氨基丁酸

将收集的菌体全部接种到含有终浓度50μg/mL卡那霉素的发酵罐菌体催化培养基中。

采用的发酵罐为7.5L发酵罐(BioFlo115，NBS)：内置定速可编程控泵，可以实现恒速补料。发酵过程中通过蠕动泵补加700g/L的葡萄糖，控制发酵体系中葡萄糖的浓度为5～10g/L。通过加热套和冷却水控制发酵温度维持在37℃；通入空气提供溶氧，转速与溶氧信号级联控制溶氧维持在30％；补加浓氨水调控pH，维持在6.9左右，菌体催化持续约48h。

收集菌体催化产物，12000×g离心2min，收集上清液。

采用实施例2中所述的方法进行HPLC检测，结果如下表所示，工程菌ABA7的L-2-氨基丁酸产量为57.23g/L，生产强度为1.43g/L/h；对照菌ABA1的L-2-氨基丁酸产量为18.53g/L；生产强度为0.62g/L/h。

表5ABA1和ABA7的L-2-氨基丁酸产量

菌株	L-2-氨基丁酸产量(g/L)	催化时间(h)
			ABA1	18.53±4.57	30
ABA7	57.23±7.90	40

本实施例的结果显示，苏氨酸脱氨酶、转氨酶及谷氨酸脱氢酶三酶共表达的工程菌ABA7较对照菌株ABA1的L-2-氨基丁酸产量提高了2.09倍。

Claims

1.一种生产L-2-氨基丁酸的重组菌，其特征在于，所述重组菌为同时过表达苏氨酸脱氨酶、转氨酶和谷氨酸脱氢酶的菌株。

2.如权利要求1所述的生产L-2-氨基丁酸的重组菌，其特征在于，所述苏氨酸脱氨酶的氨基酸序列为SEQ ID No.2或SEQ ID No.5所示，所述转氨酶的氨基酸序列为SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID No.11或SEQ ID No.13所示，所述谷氨酸脱氢酶的氨基酸序列为SEQ ID No.15所示；

所述苏氨酸脱氨酶的基因序列为SEQ ID No.1中10～1554位或SEQ ID No.3中10～999位所示，所述转氨酶的基因序列为SEQ ID No.6中22～951位、SEQ ID No.8中15～1208位、SEQ ID No.10中9～1388位或SEQ ID No.12中9～1262位所示，所述谷氨酸脱氢酶的基因序列为SEQ ID No.14中177～1520位所示。

3.如权利要求1所述的生产L-2-氨基丁酸的重组菌，其特征在于，所述重组菌的出发菌为埃希氏菌属的细菌，优选为大肠杆菌(Escherichia coli)，更优选为E.coli BL21(DE3)。

4.一种制备生产L-2-氨基丁酸的重组菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：同时过表达苏氨酸脱氨酶、转氨酶及谷氨酸脱氢酶，得到所述重组菌。

5.如权利要求4所述的制备生产L-2-氨基丁酸的重组菌的方法，其特征在于，所述过表达苏氨酸脱氨酶、转氨酶及谷氨酸脱氢酶通过如下步骤实现：

增加出发菌中苏氨酸脱氨酶、转氨酶及谷氨酸脱氢酶基因的拷贝数。

6.如权利要求5所述的制备生产L-2-氨基丁酸的重组菌的方法，其特征在于，所述方法进一步包括将所述出发菌的谷氨酸脱氢酶基因的启动子替换为具有更强转录活性的元件，和/或将所述出发菌的苏氨酸脱氨酶基因的核糖体结合位点替换为具有更强翻译活性的元件。

7.如权利要求5所述的制备生产L-2-氨基丁酸的重组菌的方法，其特征在于，通过携带所述苏氨酸脱氨酶、转氨酶及谷氨酸脱氢酶基因的质粒转化所述出发菌来增加所述出发菌中苏氨酸脱氨酶、转氨酶及谷氨酸脱氢酶基因的拷贝数；优选地，所述质粒为pET28a。

8.如权利要求5所述的制备生产L-2-氨基丁酸的重组菌的方法，其特征在于，所述苏氨酸脱氨酶的基因序列为SEQ ID No.1中10～1554位或SEQ ID No.3中10～999位所示，所述转氨酶的基因序列为SEQ ID No.6中22～951位、SEQ ID No.8中15～1208位、SEQ ID No.10中9～1388位或SEQID No.12中9～1262位所示，所述谷氨酸脱氢酶的基因序列为SEQ ID No.14中177～1520位所示。

9.如权利要求5所述的制备L-2-氨基丁酸的重组菌的方法，其特征在于，所述出发菌为选自埃希氏菌属的细菌，优选为大肠杆菌(Escherichia coli)，更优选为E.coli BL21(DE3)。

10.一种利用权利要求1～3中任意一项所述的重组菌生产L-2-氨基丁酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：

B)以缓冲液搅拌悬浮步骤A)中收集的重组菌，直接利用菌体细胞在底物苏氨酸和氨基供体谷氨酸存在下进行催化生产；

其中，所述底物苏氨酸浓度为0.1～300.0g/L,谷氨酸为5.0～150.0g/L，催化条件为37℃、pH为6.0～7.5、DO为20％～60％。