CN106146449A - 沙棘果渣中异鼠李素的制备及其应用方法 - Google Patents

Abstract

沙棘果渣中异鼠李素的制备方法，包括⑴冷提：定量称取沙棘果渣，加入乙醇常温浸提，之后将提取液真空抽滤，收集滤液；滤渣再加入乙醇，重复常温浸提二次，之后将提取液真空抽滤，收集滤液，弃滤渣；⑵浓缩：将两次提取的滤液抽入浓缩罐中，减压回收溶剂，浓缩得浸膏；⑶去油：将所得的浸膏，趁热用二氯甲烷去油，过滤，得粗晶体；⑷重结晶：将所得粗晶体，用有机溶剂溶解结晶，晶体烘干，即得异鼠李素。其应用方法是按照常规的制剂工艺直接制成降糖药物；或者作为原料药制备治疗糖尿病的中药复方制剂。本发明工艺简便、经济实用、成本低廉，能够用于工业化生产，实现资源综合利用，避免果渣污染环境，适用于加工沙棘果的企业。

Description

沙棘果渣中异鼠李素的制备及其应用方法

技术领域

本发明涉及黄酮类化合物，具体来说，涉及异鼠李素，尤其涉及沙棘果渣中异鼠李素的制备方法及其应用方法。

背景技术

众所周知，沙棘(Hippophae rhamnoides)富含多种维生素、氨基酸和酰胺类、有机酸和糖类、蛋白质、酚类和黄酮类、脂肪酸、微量元素等生物活性物质。沙棘中含有的黄酮类化合物，主要为异鼠李素、槲皮素、山奈酚及其苷类、氯原酸、黄芪苷、儿茶素、猪草苷、杨梅酮等；沙棘果肉中含量最高的三种黄酮苷元为异鼠李素、槲皮素、山奈酚。近年来，沙棘汁、油、叶茶等产品作为保健、药用和日化添加剂已广泛受到人们的重视。中国专利数据库中，已有涉及异鼠李素应用的专利申请件，如031172202号《异鼠李素及其衍生物在治疗肿瘤药物中的应用》、2012100396334号《异鼠李素作为酪氨酸酶抑制剂的应用》、2012101871015号《一种异鼠李素的新用途》、2013101465069号《异鼠李素在制备用于阿霉素辅助治疗药物中的应用》等。

为了实现沙棘资源的深度开发，人们对沙棘提取异鼠李素进行实验研究，得到的成果申请了一批中国专利，例如ZL2007101392240号《从沙棘果泥中提取精制异鼠李素的方法》、ZL201110296340X号《从沙棘果肉中连续提取分离沙棘油和异鼠李素的方法》和2013104234780号《一种异鼠李素的制备方法》。在加工沙棘果过程中产生的鲜果渣以及烘干得到干果渣，每年约有几百万吨。若不对其进行综合利用，将会污染环境，同时造成沙棘资源的严重浪费。

沙棘果渣中含有大量糖类、脂类、蛋白质、维生素、氨基酸、微量元素、黄酮类等多种生物活性物质。沙棘果渣中的黄酮含量丰富，因此对沙棘果渣进行深加工以使沙棘果渣变废为宝，合理利用自然资源。大量研究发现异鼠李素具有缓解心绞痛，抗心肌缺氧，抗心律失常，清除氧自由基，降低血清中胆固醇，促进血流通畅，抗肿瘤，调节免疫功能等多种生物活性及药理作用，应用前景十分广阔。

发明内容

本发明旨在提供沙棘果渣中异鼠李素的制备方法，实现沙棘果渣变废为宝，并使其能够在制药业中得到合理利用。

本发明的又一目的是提供异鼠李素在制备药物方面的应用方法，使其能够制备降血糖的药物，得以用于治疗糖尿病。

发明人提供的沙棘果渣中异鼠李素的制备方法包括以下步骤：

⑴冷提：

定量称取沙棘果渣置于桶中，加入乙醇常温浸提，之后将提取液倒入抽滤罐中真空抽滤，收集滤液；滤渣再加入乙醇，二次常温浸提，之后将提取液倒入抽滤罐中真空抽滤，收集滤液，弃滤渣；

⑵浓缩：

将两次提取的滤液抽入减压浓缩罐中，减压回收溶剂，浓缩得浸膏；

⑶去油：

将上一步所得的浸膏，趁热用二氯甲烷去油，过滤，得粗晶体；

⑷重结晶：

将步骤⑶所得粗晶体，用丙酮或石油醚等有机溶剂溶解结晶，晶体烘干，即得异鼠李素。

上述第⑴步中，所述使用的沙棘果渣中总黄酮含量超过1％，其中异鼠李素含量约为0.20％～0.60％；所述加入的乙醇质量分数为95％；所述两次常温浸提的时间均为24h。

上述第⑵步中，所述减压回收溶剂控制的真空度为0.08MPa。

上述第⑶步中，所述二氯甲烷的用量与浸膏质量的比例为20︰1～50︰1。

上述第⑷步中，所述异鼠李素晶体纯度的质量控制指标为70％～75％

本发明的沙棘果渣中异鼠李素的制备方法，是经过大量实验优化后制定的，对提取方式常温冷提、密封加热和超声波提取进行比较，发现密封加热法虽然提取效果较好，但提取过程中提取出较多油脂和其他杂质，影响异鼠李素进一步分离纯化；常温冷提法在提取时提取出油脂和其他杂质较少，分离纯化过程中异鼠李素结晶效果更好，故选用常温冷提法进行提取沙棘中异鼠李素。通过对去油溶剂无水乙醇、乙酸乙酯、乙醚、二氯甲烷的筛选，选用二氯甲烷去油可溶解油脂成份，且HPLC测定溶剂溶解浸膏中异鼠李素峰面积较小，故筛选二氯甲烷去油；然后对甲醇、乙醇、乙酸乙酯、水、乙醚、丙酮、氯仿、石油醚等重结晶溶剂进行筛选，发现丙酮或石油醚等有机溶剂溶解粗晶体重结晶，得到的异鼠李素含量高、回收率高，可获得具有明确降血糖药理作用的沙棘果渣中异鼠李素。

所得沙棘果渣中异鼠李素的成分分析：以纯度≥98％异鼠李素对照品采用TLC和HPLC分析方法定性鉴别，确定其中含有异鼠李素。

所得沙棘果渣中异鼠李素进行含量测定：

异鼠李素含量：以纯度≥98％的异鼠李素为对照品，采用高效液相法测定异鼠李素的含量。结果显示，沙棘果渣所提纯的晶体中异鼠李素含量为70％～75％。

色谱条件：C18(25cm×4.6mmID，5μm)，流动相：甲醇︰水︰磷酸为48︰52︰0.3，流速：0.8ml/min，检测波长360nm，柱温：45℃，HPLC-UV。

发明人提供的异鼠李素在制备药物方面的应用方法是按照常规的制剂工艺将沙棘果渣中异鼠李素直接制成剂型为片剂、或胶囊剂、或颗粒剂、或口服液的降糖药物；或者作为原料药制备治疗糖尿病的中药复方制剂。

为进一步说明在制备降糖药物中的应用，对沙棘果渣中异鼠李素进行α-葡萄糖苷酶的抑制活性实验与异鼠李素促进细胞葡萄糖消耗活性测定，结果表明，沙棘果渣中异鼠李素随着浓度的增加，对α-葡萄糖苷酶的抑制率呈现增加趋势，在异鼠李素浓度达到0.5mg/ml之后，抑制率基本趋于稳定；1mg/ml阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制率为55.86％，异鼠李素浓度在0.1mg/ml时，对α-葡萄糖苷酶的抑制率为52.5％，抑制率与1mg/ml阿卡波糖无显著差异；0.2μg/mL的异鼠李素促进HepG2细胞葡萄糖消耗的作用与0.17μg/mL的二甲双胍相当。

据报道,按每加工1000kg沙棘果，可产生鲜果渣400～500kg，烘干得120～165kg干果渣，每年约有果渣资源上百万吨。本发明的沙棘果渣中异鼠李素的制备方法具有工艺简便、经济实用、成本低廉的优点，能够用于工业化生产，本发明实现了对沙棘果渣资源的综合利用，避免了沙棘果渣对环境的污染，适用于加工沙棘果的企业。

附图说明

图1为不同浓度异鼠李素溶液的抑制效果图(n＝3)

具体实施方式

实施例1沙棘果渣中异鼠李素的制备

总黄酮含量超过1％、其中异鼠李素含量为0.20％～0.60％的沙棘果渣投料量为25kg，用250L质量分数为95％的乙醇常温浸提24h。准确称取5份沙棘果渣，每份5kg，置于5个塑料桶中，每个桶加入约50L 95％乙醇，常温浸提24h，将提取液倒入抽滤罐中真空抽滤，收集滤液。滤渣再加入约50L 95％乙醇，常温浸提24h，提取液倒入抽滤罐中抽滤，收集滤液，弃滤渣；将两次提取的滤液抽入减压浓缩罐中，真空度为0.08MPa下减压回收溶剂，浓缩得浸膏；趁热用二氯甲烷去油，二氯甲烷用量与浸膏质量的比例30︰1，过滤，得粗晶体；用丙酮或石油醚等有机溶剂溶解结晶，晶体烘干，即得沙棘果渣中异鼠李素晶体；所得异鼠李素晶体质量大于55g，其中异鼠李素含量达70％以上，异鼠李素回收率可达60％以上。

实施例2沙棘果渣中异鼠李素对α-葡萄糖苷酶抑制活性测定

1.实验目的

观察不同浓度异鼠李素对于α-葡萄糖苷酶的抑制活性，选取异鼠李素浓度与1mg/L阿卡波糖相当的抑制α-葡萄糖苷酶效果，为制备有效的降血糖药物提供依据。

2.实验用仪器及试剂

电子分析天平(BSA124S)：Sartorius；

酶标仪(MULTISKAN GO-1510-00816)：Thermo；

异鼠李素：由本实验制得，纯度为72.8％；

α-葡萄糖苷酶G0660(98％)：Sigma；

对硝基苯-α-D-葡萄糖吡喃苷PNPG(99％)：Aladdin；

阿卡波糖Acarbose(97.4％)：中国药品生物制品鉴定所；

磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、碳酸钠(分析纯)：成都金山化学试剂有限公司；

3.实验方法及结果

3.1不同浓度异鼠李素溶液对α-葡萄糖苷酶抑制活性测定

实验分为对照组、样品组、阳性组、空白组合背景组。各组分别加入缓冲液、阿卡波糖、样品和α-葡萄糖苷酶混匀，37℃保温10min后，再加2.5mmol/L的PNPG底物，37℃继续反应20min，最后加入0.2mol/LNa2CO3，2min后终止反应，在400nm波长处测定吸光度OD值并记录，计算抑制率。

抑制率(％)＝(对照组OD值一样品组OD值)/(对照组OD值)x 100

实验设置对照组、阳性组、样品组、空白组和背景组。实验组加入不同浓度(0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2mg/ml)的异鼠李素溶液，剩余四组按照表6.1所示加入所需的试剂。由于异鼠李素溶液有颜色干扰，因此每个样品需测背景吸收，并对最终测定结果进行校正，每组分别设置三个平行样，结果取平均值。具体操作和结果见下表1：

表1各组溶液配制

将采用酶标仪测定所得到的实验数据加以整理后，以剂量为横坐标，抑制率为纵坐标绘图，平行3次实验，取平均值绘图，所得结果见附图1。

由图1可知，随着异鼠李素浓度的增大，其对α-葡萄糖苷酶的抑制率也呈现增长趋势，异鼠李素浓度为0.001、0.005、0.01mg/ml时，对α-葡萄糖苷酶的抑制率无显著差异(P﹤0.05)，异鼠李素浓度在0.05、0.1、0.5mg/ml之间时，对α-葡萄糖苷酶的抑制率增长幅度较大，异鼠李素浓度在0.5、1、2mg/ml之间时，对α-葡萄糖苷酶的抑制率增长减缓，无显著差异(P﹤0.05)。

3.2异鼠李素与阿卡波糖对比

不同浓度的异鼠李素分别与1mg/ml阿卡波糖对比其对α-葡萄糖苷酶的抑制作用，每组分别设置三个平行样，结果取平均值后见表2：

表2不同浓度异鼠李素与阿卡波糖对比结果(n＝3)

表2数据表明：异鼠李素溶液浓度在0.5、1、2mg/ml时，其对α-葡萄糖苷酶的抑制率大于1mg/ml阿卡波糖，且差异显著(P﹤0.05)；异鼠李素浓度在0.1mg/ml时，其对α-葡萄糖苷酶的抑制率与1mg/ml阿卡波糖无显著差异(P﹤0.05)。说明异鼠李素溶液浓度在0.1mg/ml及以上时，即可达到与1mg/L阿卡波糖相当的抑制α-葡萄糖苷酶效果。

实施例3沙棘果渣中异鼠李素促进细胞葡萄糖消耗活性测定

1.实验目的

观察沙棘果渣中异鼠李素促进细胞葡萄糖消耗活性，为制备有效的降血糖药物提供依据。

2.实验用仪器及试剂

异鼠李素：由本实验制得，纯度为72.8％；

牛血清蛋白BSA(96％)：GEN-VIEW；

二甲基亚砜：美国Sigma公司；

3.筛选模型

葡萄糖消耗试验(人肝癌HepG2细胞模型)

3.1模型原理

本试验采用HepG2细胞，培养一定时间后，通过测定细胞培养上清液中葡萄糖含量，来判断样品是否促进细胞对葡萄糖的消耗。

3.2计算公式

葡萄糖消耗率(GC％)＝[(培养基葡萄糖含量－试验组葡萄糖含量)/培养基葡萄糖含量]×100

样品促进细胞葡萄糖消耗率(％)＝[(对照组葡萄糖含量－样品组葡萄糖含量)/对照组葡萄糖含量]×100

4.实验方法及结果

异鼠李素晶体样0.1g(72.8％)，样品准确称量，用DMSO溶解；阳性对照二甲双胍，分子量为165.63，其摩尔浓度为：1×10^-6mol/L。试验样品每个浓度平行3次，重复2次，试验结果以M±SD表示。结果见表3：

表3测定结果(n＝3)

结果表明：异鼠李素促进细胞消耗葡萄糖的作用与阳性药物二甲双胍相当。

实施例4沙棘果渣中异鼠李素片剂的制备

取沙棘果渣中异鼠李素10g，粉碎过100目筛，加入糊精3g混合均匀，再加入10％淀粉浆适量制成软材，20目筛网制粒，50℃干燥，过30目筛整粒，加入羟丙基纤维素3g和硬脂酸镁1g充分混匀，压片，薄膜包衣，制得片剂300片。

实施例5沙棘果渣中异鼠李素胶囊剂的制备

取沙棘果渣中异鼠李素10g，粉碎过100目筛，加入糊精3g，微晶纤维适量，用稀乙醇制粒，20目筛网制粒，50℃干燥，整粒，加入硬脂酸镁适量，用30目筛混合均匀，采用胶囊板灌装，即得胶囊剂300粒。

实施例6沙棘果渣中异鼠李素颗粒剂的制备

取沙棘果渣中异鼠李素10g，粉碎过100目筛，加入糊精100g，加入10％淀粉浆适量，制成颗粒，50℃下干燥，分装，即得颗粒剂。

Claims (6)

1.沙棘果渣中异鼠李素的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

⑴ 冷提：

定量称取沙棘果渣置于桶中，加入乙醇常温浸提，之后将提取液倒入抽滤罐中真空抽滤，收集滤液；滤渣再加入乙醇，二次常温浸提，之后将提取液倒入抽滤罐中真空抽滤，收集滤液，弃滤渣；

⑵ 浓缩：

将两次提取的滤液抽入减压浓缩罐中，减压回收溶剂，浓缩得浸膏；

⑶ 去油：

将上一步所得的浸膏，趁热用二氯甲烷去油，过滤，得粗晶体；

⑷ 重结晶：

将步骤（3）所得粗晶体，用丙酮或石油醚等有机溶剂溶解结晶，晶体烘干，即得异鼠李素。

2.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于第⑴步中，所述使用的沙棘果渣中总黄酮含量超过1%，其中异鼠李素含量为0.20%～0.60%；所述加入的乙醇质量分数为95%；所述两次常温浸提的时间均为24 h。

3.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于第⑵步中，所述减压回收溶剂控制的真空度为0.08 MPa。

4.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于第⑶步中，所述二氯甲烷的用量与浸膏质量的比例为20︰1～50︰1。

5.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于第⑷步中，所述异鼠李素的质量控制指标为70%～75%。

6.按照权利要求1制备的沙棘果渣中异鼠李素的应用方法，其特征在于按照常规的制剂工艺将沙棘果渣中异鼠李素直接制成剂型为片剂、或胶囊剂、或颗粒剂、或口服液的降糖药物；或者作为原料药制备治疗糖尿病的中药复方制剂。